微裂缝发育（共4篇）
微裂缝发育 篇1
经过多年的勘探与研究,四川南部志留统龙马溪组泥页岩是重要的生、储页岩气源的场所[1,2,3]。国内外有机质页岩勘探开发的认识表明,泥页岩经人工压裂改造可形成网状裂缝系统,从而泥页岩在很大程度上成为页岩气的有效储集层。因此裂缝的发育水平决定页岩气的开采效益同时决定页岩气的品质和数量。富有机质页岩中天然气主要来自于原油的裂解,同时有机质在生烃演化过程中改善了页岩的储集物性[4,5]。因此研究天然裂缝的发育对龙马溪组页岩储气量具有一定的影响。
目前众多学者在页岩裂缝成因、裂缝分布规律及成藏条件页岩裂缝发育特征及裂缝发育主控因素等方面已进行了大量的研究并取得了重大突破[6,7];但是对微裂缝可含气体体积空间计算的研究方面仍存在不足。以重庆市涪陵地区JY1井和YC4井为例,通过X射线衍射仪、扫描电子显微镜和原子力显微镜分析裂缝的发育,研究裂缝发育对储气量的影响,同时分析两口井现场解析气量和微裂缝占空比之间的关系,进而探究JY1井和YC4井储气量存在差异的原因。
1 四川志留统龙马溪页岩储层特征
四川地区志留统页岩气储层多为黑色、富含有机碳的页岩,厚度较大,主要集中在其下部———龙马溪组。经研究发现,龙马溪组主要分布在川东南、川东北、鄂西渝东、中扬子区受局部地质背景的控制,具有一定的沉积分异性[8]。
1.1 页岩脆性矿物成分分析
页岩裂缝发育主控因素除地质构造影响以外,还与脆性岩石的含量有直接关系[9]。当页岩膨胀性黏土矿物含量较少,硅质、碳酸盐岩和长石等矿物较多时,岩石脆性较大,造缝能力强,容易产生裂缝。在矿物组分相同的页岩中,岩石颗粒越细,越有利于裂缝的发育,相反,岩石颗粒越粗越不利于裂缝形成[9]。因此岩石的矿物成分及其含量对裂缝发育和储气量有重要影响。通过对JY1井和YC4井岩石样品的矿物含量分析,得知其主要成分为石英、斜长石、方解石、钾长石和黄铁矿,伴有一定量的白云石和菱铁矿,同时含有少量的重晶石、石膏等,两者的各组分含量有显著的不同。二者黏土矿物相对含量可知主要为伊利石和绿泥石,含量最少为钾长石,并且伊利石和蒙皂石层间比含量较高,两口井的各组分含量存在显著差异。
JY1井石英平均含量为44.2%,脆性矿物品平均总含量为71.5%,黏土矿物平均总含量25.3%[图1(a)];YC4井石英平均含量34.9%,脆性矿物平均总含量为57.4%,黏土矿物平均总含量37.8%[图1(b)]。
页岩裂缝发育与脆性矿物含量呈正比[9],JY1页岩裂缝发育程度高于YC4井,其气体富集程度,气体运移和气体解析应较YC4井有优势。
1.2 页岩微观结构
国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)按照孔径的大小分为极微孔(<1.5 nm)超微孔(0.5~2.0nm)、介孔(2.0~50 nm)和大孔(>50 nm)。通过对JY1井和YC4井不同井段的扫描电镜图片和原子力显微镜图片发现龙马溪组页岩的总体特点:孔隙类型丰富多样,主要有原生孔隙、有机质孔隙、黏土矿物层间微孔隙、溶蚀孔、基质孔隙以及大量天然层间裂缝、其中有机质孔隙和黏土矿物层间微孔隙是页岩储集空间的主要提供者[10]。页岩中裂缝分布广泛,交叉性明显,且具有形状类型多样化的特点。
2 裂缝发育特征及其对含气量影响
页岩内部天然裂缝为页岩气的赋存提供良好的储集空间,同时又是页岩气运移的重要通道[4,11]。页岩中裂缝越发育越有利于气体富集和解析,越有利于成藏[12]。王玉满[13]等人按照裂缝宽度将其分为五级,即微裂缝(缝宽小于0.1 mm)、小裂缝(缝宽0.1~1 mm)、中裂缝(缝宽1~10 mm)、大裂缝(缝宽10~100 mm)和巨裂缝(缝宽大于100 mm)。本文所涉及的裂缝都为微裂缝,缝宽均在0.1 mm以下。微观裂缝是页岩在构造作用下发生脆性变形产生的,其发育程度受到区域构造应力及局部构造的影响,在构造应力的作用下,页岩中可能形成不同方向和不同性质的纳米级微裂缝。
2.1 裂缝发育主控因素
裂缝的形成主要受外力作用和内力作用:外力使页岩破裂,层间滑动,圧溶等作用产生天然裂缝,而内力则主要受成岩,流体压力,地层温度,气体游离与解析相互转化等的作用形成内部裂缝[14]。裂缝发育程度的高低和诸多环境因素以及内在发展因素有关。如地层的埋藏深度越深、埋藏时间越久、内部压强越低、体系温度越低,地层内部的裂缝比例相对减少。而当地层缓慢抬升、内部温度升高、内部有机质生气量逐渐增多会导致裂缝开裂,或者是裂缝通过有效孔喉连接成相对大些的裂缝,或形成微裂网。
2.2 页岩微裂缝发育及储气影响
裂缝的发育特征包括裂缝发育程度和裂缝展布规律,裂缝发育程度主要由裂缝基本参数和裂缝密度来描述,裂缝展布规律主要是指裂缝在平面上的分布状态[15]。
裂缝的发育程度越高,其储气量越大,越有利于页岩气的富集和解析,越有利于页岩气的成藏[9]。但是页岩气的开采量和诸多因素有关,微裂缝是页岩气的重要储集空间,微裂缝的发育对游离页岩气的增加和页岩气的解析有重要的意义[16]。
2.3 JY1井和YC4井微裂缝发育对比
虽然JY1井和YC4井同处在重庆市涪陵地区,但产气量有较大差异。对比发现JY1井微裂缝分布广泛,矿物颗粒细小且分散,连通性良好,走向分散,微裂缝的宽度可达10μm,其内充填物莓状黄铁矿、方解石和有机质为主,矿物颗粒排列相对稀疏,因此生烃量大,可储气空间大,渗透性较强[图2(a),2(b),2(c)]。从YC4井岩石样本信息中发现矿物的颗粒较大,微裂缝量极少,孔隙较少,虽然能观察到星星点点黄铁矿,但在外围却很少有有机质的存在,因此实际有效的储气空间相对较少[图2(d),2(e),2(f)]。
通过大量的SEM图片发现JY1井岩样中微裂缝分布更为广泛,但得不到具体深度,因此对每个样品进行抛光处理后在AFM显微镜下进行扫描成图,将得到的图片进行处理将其转化为三维立体形式,如图3、图4所示。综合分析JY1井AFM显微镜图像发现样品矿物颗粒细小,周围孔隙较密集,微裂缝高低起伏落差大,彼此间可相互交汇,走向发散,连通广泛(图3)。相比较JY1井,YC4井矿物颗粒稍大,微裂缝高低起伏高峰和底谷落差较小,微裂缝存在汇聚空间,但气流聚集较难,微裂缝与孔隙连通性较差(图4)。
为描述方便在图3和图4中(d),(e),(f)上标注①表示三维图像中最高峰,②表示三维图像中最低谷,③表示狭缝纵向宽度,④表示狭缝长度。
图中(a)长宽均为28μm,最大深度0.43μm;(b)长宽均为25.3μm,最大深度1.5μm;(c)长宽均为40μm,最大深度1.05μm
(a)长宽均为11μm,最大深度0.51μm;(b)长宽均为60μm,最大深度1.2μm;(c)长宽均为45.7μm,最大深度1.3μm
图3(a)为JY1井中的平整狭长微裂缝,微裂缝最大宽度为10.4μm,缝长31.5μm,高低落差值为0.43μm,3D为其三维立体图,图中①和②的垂直高度差0.43μm,③的长度为7.56μm,④的有效长度为21.95μm。图4(a)为YC4井相对平整的微裂缝,最大缝宽0.69μm,缝长10.2μm,高低落差0.59μm,4(d)为其三维图像,图中①和②的垂直高度差为0.52μm,③的有效长度为0.46μm,④的有效长度为8.95μm。由3(a),3(d)和4(a),4(d)对比发现3(d)的裂缝空间远大于4(d),且裂缝表面平整更易气体运移。3(b)为JY1井不规则微裂缝图片,其缝长22.79μm,缝深1.5μm,从图中发现微裂缝可作为联通周围孔隙的重要通道。从3(e)中得到狭缝宽③为5.24μm,狭缝长④为19μm,纵向深度1.35μm同时观察到有较大颗粒但在大颗粒周围均有小颗粒矿物和细小孔隙作为连接通道,扩大了有效储气空间和运移空间。4(b)为YC4井不规则矿物颗粒AFM图像,主要有两个储气微裂缝,其中最大微裂缝长20.2μm,深1.2μm,4(e)中③有效长度为5.65μm,④的有效长度为18.4μm,虽然大颗粒矿物上附着小颗粒矿物但过于密集导致微裂缝之间无法连通,且尺寸大有效储气空间比例小,储气空间减少。3(c),3(f)为JY1井相对较规则簇状矿物AFM图像,矿物颗粒较小,缝宽③为5.04μm,缝长④为22.92μm,深0.95μm,微裂缝交错排布,而YC4井的4(c),4(f)矿物颗粒层叠排布,颗粒大且密集,缝宽③为4.5μm,缝长④为12.3μm,深1.3μm。
通过图3和图4对比观察可以发现YC4井岩石表面起伏落差小,高峰和低谷高度差值较JY1井小,使其储集空间小,连通性能较差。而JY1井表面凹凸错落,内部高峰和低谷参差分布,使其流通性较好,同时极大的增加了气体的储集空间。因此,JY1井比YC4井更适合页岩气的富集成藏。
3 实际裂缝空间与解析气量关系
发育较好的微裂缝,连通广泛,内部有效储集空间变大,可储气量增加[16]。通过MATLAB软件,对图像进行积分处理计算得到微裂缝的有效空间体积占最大空间比例。图5(b)为5(a)中黑色曲线纵向上的像素点值,其中横坐标为横方向上像素点个数,竖坐标为像素点值,深度为194,由于最大深度0.43μm对应像素点255,所以实际深度0.33μm;宽度233,横向像素点总数为486,实际线长度33.18μm,因此实际宽度为15.91μm,1个像素点长为0.07μm,计算出5(b)中阴影的面积再乘以一个像素点的实际长度就是该条曲线在一个像素点上的立体体积。由于图像是二维矩阵,要经过累加后方能得到实际空间体积。
裂缝空间占页岩体积与裂缝和的百分比P,简称微裂缝占空比,简称微裂缝占空比计算方法如下式所示
l为原子力显微镜所采图片有效长度;w为有效宽度;h为图片最高峰值;n为将图片转换为8进制图片长方向上的像素点个数;m为宽方向上的像素点个数;X(i,j)为图像数据生成矩阵中像素点灰度值。
对数据进行统计和整理,最终发现微裂缝的占空比与现场解析气量具有较好的正相关关系(如图6)。
4 结论
(1)通过对JY1井和YC4井的矿物成分进行分析,得出JY1井脆性矿物含量大于YC4井,其中JY1井脆性矿物平均总含量为71.5%;YC4井脆性矿物平均总含量为57.4%。这说明JY1井比YC4井更有利于微裂缝的发育。
(2)结合SEM图像和AFM图像发现JYC4井岩石表面起伏落差小,高峰和低谷高度差值较JY1井小,使其储集空间小,连通性能较差。而JY1井表面凹凸错落,内部高峰和低谷参差分布,使其流通性较好,同时极大的增加了气体的储集空间。因此,JY1井比YC4井更适合页岩气的富集成藏。
(3)通过MATLAB软件,对AFM图像进行积分处理,计算出微裂缝的有效空间体积占实际页岩体积与裂缝空间体积和的平均比值(简称微裂缝占空比)。发现现场解析气量与微裂缝占空比具有良好的正相关关系。
多属性裂缝发育区预测 篇2
关键词：地震反射特征,裂缝发育区
1 地震反射特征及地震合成记录标定
本次使用的地震资料有效频带宽为5~80H z, 目的层主频为10~40H z。地震剖面信噪比、分辨率较高, 波组特征基本清晰, 断点、断面基本可分辨, 基本可进行对比追踪。
主要层位为N层, 各个地层由于地质时代、岩性组合及岩石物理特征不同, 进而在地震剖面上也具有不同的反射特征。建立准确的时深关系是进行构造研究、储层预测及地震属性分析等工作的基础。利用合成地震记录进行地震层位标定, 是地震与地质相结合的重要桥梁。此次标定主要在Land Mark中制作合成地震记录, 将合成地震记录与井旁地震道反复对比, 不断调整速度, 使得二者波组能量、相位对应良好、波形特征尽可能一致。
2 裂缝发育区预测
2.1 构造应力场分析
FRS应力场分析技术就是对古应力场进行模拟, 进而预测与构造有关的断裂分布及发育程度。从区域角度讲, 构造应力是影响断裂发育的最主要因素, 构造应力的大小、方向、性质及其组合关系控制着断裂发育程度、发育范围、产状及其与构造空间组合特征。本次研究应用了该应力场分析技术, 预测了断裂的主要特征。
FRS应力场分析技术就是从构造力学出发, 利用地层的几何及岩性信息, 利用数值模拟反演出地层的古应力场, 包括地层面的变形张量、曲率张量和应力场张量, 从而得到表征应力场的应力方向玫瑰图。
应力方向玫瑰图:玫瑰图色标值代表古应力方向。X井和Y井的钻井统计主应力方向均为近北东-南西方向, 和预测的N层最大主应力方向北东-南西向的结果基本吻合 (图1) 。
2.2 裂缝发育区预测
裂缝与断裂的最大区别就是前者没有明显断距, 但大尺度裂缝与断层的发育有着十分密切的关系, 我们可以把微小的断裂看作是大尺度的裂缝, 所以可以利用预测微小断层的体曲率、相干体等属性, 来预测裂缝。
相干体可以突出地震数据间的不连续性, 达到检测断裂的目的。从N层相干体平面图 (图2) 可以看出, 区块内的许多中、大型断裂的效果反映很明显, 基本可以看出整个三维工区大断裂的发育展布情况。
曲率体的原理就是受应力作用岩层发生弯曲变形, 弯曲程度大的部位是应力较集中处, 而对于碳酸盐岩这种易破裂的脆性岩层, 应力集中处微裂缝发育, 因此曲率的大小能够反映岩层构造微裂缝相对发育程度和分布特征, 曲率越大, 裂缝越发育。本次应用VVA软件对N层进行曲率体计算, 从N层曲率体平面分布图 (图3) 来看, 红色区域为主要的裂缝发育区, 裂缝发育区与相干体属性预测的断裂带基本吻合, 在近北东-南西方向主应力的作用下, 裂缝发育区以北西向呈条带状分布 (图3) 。
3 结论
(1) 应用FRS应力分析技术预测工区主应力方向为近北东-南西方向。
(2) 通过预测微小断层的体曲率和相干体属性可很好地预测裂缝发育区。裂缝发育区以北西向为主, 在工区内呈条带状分布。
参考文献
[1]肖序常.新疆北部及其邻区大地构造[M].北京:地质出版社, 1992[1]肖序常.新疆北部及其邻区大地构造[M].北京:地质出版社, 1992
[2]张恺.新疆三塘湖盆地板块构造演化特征及其含油气远景评价[J].新疆石油地质, 1993, 14 (1) :1-13[2]张恺.新疆三塘湖盆地板块构造演化特征及其含油气远景评价[J].新疆石油地质, 1993, 14 (1) :1-13
微裂缝发育 篇3
目前有关玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫相互间的血缘关系,以及玉米螟微孢子虫能否感染家蚕的分子机制研究的报道不多,本文拟通过扫描电镜 (SEM) 和投射电镜 (TEM) 两种方法对其超微结构进一步观察的基础上,结合16S r DNA基因序列分析方法,探讨本课题组收集的玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫之间的结构异同及其相互间的血缘关系,为经济昆虫微孢子虫的防治,及昆虫微孢子虫资源的开发利用提供实验参考。
1 材料
1.1 家蚕微孢子虫和玉米螟微孢子虫
家蚕微孢子虫 (Nosema bombycis) 为华南农业大学国家蚕桑产业技术体系亚热带蚕病防控岗位实验室继代保存,玉米螟微孢子虫 (Nosemasp.) 收集自广州市生物防治站玉米螟繁殖实验室,由汤力站长提供。
1.2 主要仪器
数码显微镜 (深圳爱科学和华南农业大学联合研制),离心机,血细胞计数板,环境扫描电子显微镜 (SEM) (荷兰FEI电子光学有限公司产品),分析型透射电子显微镜 (TEM) (荷兰FEI电子光学有限公司产品),离心机,显微镜,基因扩增仪。
2 方法
2.1 微孢子虫孢子悬浮液的计数
取由本实验室用Percoll细胞分离液纯化好的微孢子虫孢子 (约1010 个/m L孢子液),并在涡旋振荡器上混匀,稀释到合适的浓度,然后用血细胞计数板在数码显微镜下观察并计数,最后无菌水将计数好的孢子液配制成1.0×108个/m L备用。
2.2 微孢子虫 SEM 样品制备与观察
(1) 取样:分别取家蚕微孢子虫和玉米螟微孢子虫 (浓度为1×108个/m L孢子) 的孢子悬浮液各100μL于1.5 m L离心管中4 000 r/min离心5min,弃上清。
(2) 固定:用2.5 %戊二醛于4℃冰箱固定过夜,然后4 000 r/min离心5 min,弃上清;
(3) 漂洗:用0.1 mol/L的PBS缓冲液洗涤4次,每次20 min,4 000 r/min离心5 min,弃上清;
(4) 脱水:依次用30 %乙醇脱水2次,每次10 min;用50 %乙醇脱水2次,每次10 min;用70 %乙醇脱水1次,每次10 min;用90 %乙醇脱水1次,每次10 min;用100 %乙醇脱水2次,每次10 min;
(5) 过渡:用醋酸异戊酯处理2次,每次10min;
(6) 干燥:二氧化碳临界点干燥3 h;
(7) 喷金,然后在SEM下观察。
2.3 微孢子虫 TEM 样品制备与观察
(1) 取样:分别取家蚕微孢子虫和玉米螟微孢子虫 (浓度为1×108个/m L孢子) 的孢子悬浮液各100μL于1.5 m L离心管中4 000 r/min离心5min,弃上清。
(2) 固定:用4 %戊二醛固定液在4℃冰箱中固定过夜,4 000 r/min离心5 min,弃上清;
(3) 漂洗:用0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液洗涤3次,每次10 min,然后用1 %锇酸固定2h;用0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液洗涤3次,每次10min;
(4) 脱水:依次用30 %、50 %、70 %、80% 、90 % 的乙醇脱水1次,每次10 min,再用100 %乙醇脱水2次,每次10 min,最后100 %丙酮脱水2次,每次15 min;
(5) 渗透:用丙酮与树脂包埋剂的混合液进行梯度渗透,2种化合物的体积比梯度为3:1、1:1、1:3纯包埋剂,渗透时间依次为4 h、过夜、6 h;
(6) 包埋:将样品切成大小适宜的长方形小块,用纯树脂包埋于模板中;
(7) 将包埋好的微孢子虫样品直接放入恒温箱中45℃聚合24 h、60℃聚合24 h,将聚合好的包埋块取出置于干燥器中保存备用;
(8) 染色:将超薄切片用醋酸双氧铀-柠檬铅酸双重染色;
(9) 观察:在TEM下观察微孢子虫的超微结构。
2.4 玉米螟微孢子虫的分子系统发育分析
2.4.1 微孢子虫基因组 DNA 的提取
采用CTAB法[8]抽提昆虫微孢子虫基因组DNA。
(1) 取200μL微孢子虫孢子液于无菌的1.5m L离心管中,12 000 r/min离心5 min,弃上清;
(2) 沉淀用400μL的2 % CTAB缓冲液重悬,加入20 u L蛋白酶K (20 mg/m L),然后在振荡器上振荡20 s-30 s,55℃水浴4 h或者过夜;
(3) 将酶消化后的抽提液从水浴锅中取出,室温下冷却,加入300μL氯仿,混匀后12 000 r/min离心10 min,取上清;
(4) 加入300μL室温保存的异丙醇,混合后4℃放置1 h以上,然后12 000 r/min离心10min,弃上清;
(5) DNA沉淀用300μL 70 %酒精洗涤1次2次,然后将离心管倒置,让其自然晾干;
(6) 加入30μL dd H2O溶解DNA沉淀,4℃冰箱保存过夜后,置-20℃冰箱保存备用。
2.4.2 PCR 扩增和测序
为检测提取的玉米螟微孢子虫及家蚕微孢子虫模板DNA的有效性,参照文献[8],选择通用引物V1f:5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTAAC-3’;530 r: CCGCGGCTGCTGGCAC -3’,对微孢子虫的16S r DNA模板基因进行PCR扩增检测,反应条件为94℃5 min;94℃30 s;55℃45 s;72℃45 s;72℃8 min,32个循环。微孢子虫16S r DNA基因测序使用的引物参照文献[9],选择18f:5’-CACCAGGTTGATTCTGCC -3’; 1537r: TTATGATCCTGCTAATGGTTC -3’对微孢 子虫的16Sr DNA模板基因进行PCR扩增检测,反应条件为:94℃5 min;94℃30 s;56℃60 s;72℃90 s;72℃8 min,35个循环。PCR产物用1.2 % EB染色的1 %琼脂糖凝胶电泳 (110 V,40 min) 检测。
2.5 系统发育分析
将目的PCR扩增产物送上海生工测序,得到的玉米螟微孢子虫的16S r DNA基因序列与美国国立卫生研究院 (NCBI,www.ncbi.nlm.nih.gov/) 上Gen Bank数据库进 行BLast序列同源 比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),并运用系统发育分 析软件MEGA5.1 (Tamura P. et al.,2011) 的邻位相接法 (NJ) 进行系统发育分析,选取穷举值Bootsrap为1 000。
3 结果与分析
3.1 玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫的 SEM 结果
对玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫两种微孢子虫孢子在6 400倍下的扫描电镜观察 (SEM) 的结果如图1、图2所示。
由图1上可以看出,家蚕微孢子虫孢子大小相对整齐,个体多为椭圆形,两端钝圆;玉米螟微孢子虫孢子大小相对开差大些,形态多为长椭圆形 (图2),个别也有椭圆形的,相对家蚕微孢子虫孢子来说,显得个体稍长些。
3.2 玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫超微结构的比较观察
对玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫两种微孢子虫孢子超薄切片进行投射电镜 (TEM) 的观察,比较两者在超微结构上异同。结果如图3-5所示。
从图3-5的投射电镜TEM的图片可以观察到,玉米螟微孢子虫和家蚕微孢子虫的内部结构基本相似,都有双细胞核 (N),整齐排列的极丝管 (PF),坚硬的孢子外壁 (EX) 和孢子内壁(EN) 等;但玉米螟微孢子虫的孢子外壁 (EX)明显比家蚕微孢子虫的孢子壁 (EX) 粗糙,凸起窄且明显,类锯齿状,家蚕微孢子虫孢子外壁相对平滑些;玉米螟微孢子虫的极丝约为9圈-12
由图6a和图6b可知,通用引物V1 f/530 r和针对微孢子虫16Sr DNA全长基因的引物18 f/1 537r对玉米螟微孢子虫和家蚕微孢子虫的PCR扩增结果均为阳性,各自在目的片段410 bp和1 300 bp处均出现了相应大小的扩增条带,由此,将各自的PCR扩增产物进行测序分析。
3.4 基于 16Sr DNA 基因序列的微孢子虫系统发育分析
根据引物V1 f/530 r和18 f/1 537 r对玉米螟微孢子虫和家蚕微孢子虫的PCR扩增产物的测序结果,进行了NCBI在线的Blast同源比对分析,对相关的序列用Mega软件中的邻近法 (NJ),构建了玉米螟微孢子虫与其它近缘微孢子虫的系统进化树。见图7.
从图7可以看出,玉米螟微孢子虫与家蚕来源的不同地理株家蚕微孢子虫GX1、YN1、GD1、SC1和3种昆虫来源的微孢子虫均聚在同一树枝上,但显然未命名的筛豆龟椿? (M. cribraria) 微孢子虫Nosema sp. MC和报喜斑粉蝶 (Delias pasithoe) Nosema sp. Dp与家蚕微孢子虫Nosemabombycis的亲缘关系更近,本研究的玉米螟微孢子虫与家蚕微孢子虫各个地理株及Nosema sp.MC和Dp亲缘关系稍远,但与亚洲玉米螟微孢子虫Nosema furnacalis (gi | 857488) 聚在一起,关系很近,可能是亚洲玉米螟微孢子虫N. furnacalis的亚种 (sub-species) 或不同的血清型,但与gi |62003354 | Nosema_pyrausta显然是不同的种。这暗示本实验室收集的玉米螟微孢子虫在种属水平上与家蚕典型微孢子虫Nosema bombycis是属于不同的种 (species)。因此,综上其超微结构的特点及系统分析的结果,特将本研究室收集的玉米螟微孢子虫命名为Nosema sp. GZ
4 讨论
自1857年,Nageli第一次报道并命名了家蚕微粒子病 病原Nosema bombycis至今 , 人们对Nosema属微孢子虫的认识是逐渐深入的,对微孢子虫的分类也逐渐的细致和提高,早期许多基于孢子寄主来源、孢子形态和超微结构的特点归为Nosema属的微孢子虫,后来都分别形成了独立的属。本研究通过对家蚕微孢子虫和玉米螟微孢子虫电镜观察比较,两者都是双核的,尽管缺少了玉米螟微孢子虫在寄主体内的超微结构的观察结果,但从孢子的外观和内部结构等形态学上的特征应该是同一个属的,但16s DNA的数据分析表明,两者差异均明显,分别属于不同的种群,而与报道的亚洲玉米螟微孢子虫Nosema furnacalis(gi | 857488) 聚在一起,因此,建议将本研究收集的玉米螟微孢子虫命名为Nosema sp. GZ。相比较昆虫来源的Nosema sp. Dp和MC两种孢子,玉米螟微孢子虫在分类树枝上的位置与N.bombycis的关系稍远,这也许暗示其不能感染家蚕的缘由。
微裂缝发育 篇4
1 能源微藻概况
小球藻属于能源微藻的一种, 也被称之为绿藻, 属于绿藻门 (Chlorophyta) 绿球藻目 (Chlorococcales) 卵囊藻科 (ocytaceae) 小球藻属的单细胞真核生物, 出现于20多亿年前, 是地球上最早的生物之一, 其外形多为圆球形或椭球形, 细胞直径2~12μm。小球藻通过自身产生孢子的方式进行生长繁殖, 在自然条件下个体存在数量不多, 但如果通过人工调节给予其适宜的生长条件可在短时间内快速生长繁殖。
小球藻体内富含多糖、脂类、蛋白质、核酸、矿物质、维生素、胡萝卜素和食物纤维等人体生长发育所必需的营养物质[1]。有研究表明:小球藻体内蛋白质含量约8%, 碳水化合物约7%, 脂类含量一般可高达80%以上, 在生物柴油研究领域中, 以小球藻为原料提取生物柴油是当前热点研究之一, 成为一种极具开发潜力的生物能源材料[2];小球藻中的藻类蛋白早在20世纪60年代就被研究开发, 投入生产;小球藻作为光能自养型植物, 它可以利用生物体释放的二氧化碳, 产生出供人类和生物体呼吸的氧气, 从而可以形成一个可重复循环利用的碳—氧循环系统, 这在航天科技中得到了广泛应用, 主要是利用小球藻进行光合作用过程中合成有机产物和释放氧气, 供给宇航员能量补给和呼吸氧气;此外, 小球藻中富含的许多活性物质也是不少疾病临床治疗中所需的重要辅助药物[3]。
2 能源微藻藻体培养研究
2.1 国外研究现状
国外能源微藻的培养和研究已经达到了一个相对成熟的阶段。美国Martek公司主要利用工业化发酵技术培养微藻来生产DHA成品, 成为该行业的领军者[4]。Chen等研究了C/N比对异养群孢小球藻生化产物含量和生长的影响, 得出的结论是, 当C/N比值为20时, 在从受碳限制向氮限制转变时细胞的脂质含量最低。当C/N比增大或者减小都会使细胞脂质含量增加, 较低的C/N比有利于提高三烯脂肪酸的含量[5]。Chen等还研究发现, 当通气量加大时会促进异养群孢小球藻的生长, 促进不饱和脂肪酸的合成, 但脂类的总量会下降[6]。Swaaf等人用葡萄糖作为碳源成功异养了寇氏隐甲藻 (Crypthecodinium cohnii) , 其异养生物量远远高于光合自养时的生物量[7]。同样的道理, 异养寇氏隐甲藻在温度较低时虽然生长慢, 但其DHA含量却比高温时要高[8]。卡德藻 (Tetraselrnis sp.) 在兼养时的最大细胞密度可以达到自养时的3.2倍, 大于自养和无光异养的密度之和[9]。
2.2 国内研究现状
目前, 我国对能源微藻的研究和应用也处于如火如荼的阶段。尹建云等人通过利用玉米淀粉在高温下的淀粉酶和糖化酶的酶解后产生的酶解糖, 来代替葡萄糖作为碳源, 达到了小球藻高密度大批量的试验性异养生产[10]。缪晓玲等人从异养小球藻中提取大量油脂后获得的生物柴油的各项指标特征与传统柴油相当, 具有很高的推广意义。其还在异养培养原始小球藻 (C.Protothecoides) 时以淀粉、葡萄糖、二氧化碳和有机废水等作为复合碳源, 在节省了成本的同时, 实现了微藻的高密度培养, 还减轻了废物对环境的压力[11]。张丽君等人在试验中发现, C/N比在4∶1~5∶1时可以获得最大的生物量。在异养发酵时藻细胞生物量随着通气量的增加而增加, 通过增大通气量可获得最大生物量[12]。Stephen等人研究发现, 温度对异养隐匿小环藻的总脂含量没有明显影响, 但随着温度的降低, 饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比值却在减小[4]。陈涛等从人胎盘组织中克隆出人红细胞葡萄糖转运基因 (Glut1) , 通过电击转化法转化盐藻, 最终使Glut1得到表达[13], 这为盐藻的进一步异养化培养打下了基础。
3 研究的目的和意义
当前, 随着经济的快速发展, 能源的用量越来越大, 人们日益增长的生产生活需要对能源的需求越来越多。面对化石能源储量的日益减少和造成环境污染限制利用的困境, 用生物质能源代替化石能源已成为未来的趋势。小球藻是一种集多方面经济价值于一身, 有着极大开发和应用潜力的自然能源。人工选育基因优良的藻株, 探索其培养条件, 改良培养设备, 改善不同培养基营养配方, 进而推进小球藻大规模生产是当下缓解能源危机的重要良策。本研究以普通小球藻为材料, 研究其最适培养温度, 构建最佳培养条件, 为小球藻油脂工业化的大规模生产, 绿色农业与生物能源的开发利用起到积极的促进作用。
4 试验材料及方法
4.1 材料及主要仪器
4.1.1 试验材料
以实验室选育的小球藻 (Chlorella) 为试验材料。
4.1.2 主要仪器
振荡器:HY-ZA调速多用振荡器;恒温干燥箱:KH-55AS电热恒温干燥箱;超净工作台:BJ-CD SERIES超净工作台;分光光度计:UV-1200分光光度计;灭菌器:YM75立式压力蒸汽灭菌器;光照培养箱:SPX-250B-G型光照培养箱。
4.2 试验方法
4.2.1 接种
(1) 准备工作:提前30 min打开无菌操作台电源, 检查设备参数和设备状态, 将实验用具经灭菌后放入无菌操作台内。
(2) 杀菌:打开紫外灯杀菌30 min, 完成后关闭仪器30 min, 待工作台内臭氧转化为氧气, 打开日光灯和风机。
(3) 消毒:使用75%酒精进行双手和工作台面的消毒, 酒精灯灼烧进行接种环消毒, 操作在酒精灯附近进行, 以避免杂菌滋生。
(4) 接种:揭下培养皿上的密封条, 酒精灯灼烧培养皿边缘, 将培养皿盖打开20°左右的小口, 将灼烧过的接种环伸入轻轻划取小球藻菌落, 在空白培养基边缘用三区划线法力度均匀地轻划折线, 开始密集逐渐稀疏。划完后酒精灯灼烧接种环消毒后放回原处。
(5) 存放:将接好藻的培养皿密封后放于适宜条件培养, 定期观察记录。
实验完毕, 整理工作台, 用质量分数75%酒精擦拭工作台面, 关闭风机、照明灯, 打开紫外灯灭菌15 min, 最后关闭总电源。
4.2.2 培养基配置
本试验采用实验室已测定的BG11培养基, 配方配置如表1~表6。
按此配方配置后, 在蒸汽灭菌器中121℃灭菌20 min后备用。
4.2.3 小球藻的培养
(1) 将培养皿中的藻落用三区划线法接种到GB11固体培养基的空白培养皿中, 密封, 日光灯照射, 光照周期12∶12, 室温培养。
(2) 待藻落长出后, 选取单藻落接种到锥形瓶中以110 r/h震荡, 日光灯照射, 光照周期12∶12, 室温培养24 h。
(3) 24 h后, 转移到GB11培养液培养瓶中培养, 滤菌通气, 日光灯照射, 光照周期12∶12, 室温培养。每天震荡培养瓶, 顺时针震荡3圈, 逆时针震荡3圈。
4.2.4 小球藻最适培养温度的筛选
试验在电热恒温培养箱内进行, 采用双因素分析试验。使用GB11培养液, 日光灯照射周期为12∶12, 温度设置:以30℃为基数, 分别向更高和更低以5℃为公差设置两个梯度, 每个试验组设3个平行重复。每天定时取样测定其吸光度值, 并计算相对生长率如公式 (1) 。
式中:No———培养初始藻细胞密度;
Nt———经过t时间后培养液中的藻细胞密度;
t———培养时间。
4.2.5 小球藻生物量的测定———分光光度计法
分光光度计法是通过测定一定波长范围内或特定波长下光穿过物质后, 该物质对光的吸收度, 从而定性或定量地对该物质进行分析。分光光度计由显示和存储系统、光源、样品室、单色器、检测器和信号处理器等部分组成。分光光度计的光源可产生多个波长的光, 经过分光装置分离出特定波长的光源, 透过待测物质, 部分光可以通过, 部分光被吸收, 由此计算出待测物质的吸光度。分光光度计法常用蛋白、核酸及多数微生物的定量检测, 已经成为现代分子生物实验室必不可缺的实验仪器。在特定物质最大吸收波长条件下, 测得的吸光度值和被测组分的浓度成正比, 本试验以680 nm条件下, 每天测得的藻液吸光度值作为其生物量指标进行计算分析。
(1) 启动:打开分光光度计的电源开关, 启动仪器, 预热20 min, 预热时应保持比色皿暗箱箱盖为打开状态, 切断光路, 防止电管连续光照造成疲劳。
(2) 设定波长:设定波长680 nm (查阅相关文献得出小球藻在680 nm处吸光度达到峰值) 。
(3) 上样:清洗比色皿, 将盛有空白培养液和3分待测藻液 (稀释10倍) 的比色皿分别放入比色皿架座的第一二三四格, 盖上比色皿暗箱盖。
(4) 调零:使比色皿座架处于第1档位, 按下“ZERO”键, 调节“0”点和T值=100%。
(5) 测定:轻轻向外拉动比色皿座架拉杆于第2档位, 记录所得吸光度值, 同理依次测定第3、4档位的吸光度。
(6) 关机:测量完毕, 切断电源。打开暗箱盖, 取出比色皿, 擦净比色皿架和暗箱内的残液, 并将比色皿清洗晾干放回盒内存放。
5 结果与分析
温度是影响微藻生长的重要生态因子之一, 每一种微藻均有其生长最适宜的温度范围, 当培养的温度超出该藻适应范围的低限和高限时, 该藻的生长和细胞分裂活动就会受到抑制。在培养温度低于最适温度时, 小球藻的生长速率随着温度的升高而增加, 达到最适温度时, 小球藻的生长速率达到最大, 之后, 随着温度的增加, 其生长速率逐渐下降。
5.1 不同温度下小球藻生物量的比较
在特定物质最大吸收波长条件下, 测得的吸光度值和被测组分的浓度成正比, 本试验以680 nm条件下, 每天测得的藻液吸光度值作为其生物量指标进行计算分析。
由图1可知, 在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下培养小球藻, 以30℃条件下小球藻的生长速率最快, 为小球藻生长发育的最适培养温度;20℃条件下其生长速度最为缓慢;而在40℃、35℃、25℃等培养条件下, 其生长速率变化不明显, 呈现趋势为:35℃>25℃>40℃。在所记录的小球藻20 d的生长期内, 前期小球藻的吸光度值缓慢增加, 小球藻缓慢生长;在第14、15、16、17、18 d小球藻的吸光度值急剧增加, 小球藻的生长速度达到对数生长期;在第19 d以后小球藻的吸光度值增量趋于平缓, 相对生长率开始下降, 小球藻生长缓慢, 进入衰落期。
通过对不同温度下, 第15、16、18和20 d的小球藻的生物量进行无重复双因素方差分析 (α=0.01) , 结果表明该实验的培养天数和温度间差异极显著, 说明培养温度和培养天数都是影响小球藻的生长速率快慢重要因素。
5.2 不同温度下小球藻相对生长率的比较
每天定时取样测定不同温度因素下培养的小球藻的吸光度值, 并计算分析其相对生长率。
由图2和图3可知, 小球藻在30℃时平均相对生长率为最大值, 30℃是小球藻生长的最适温度;35℃和25℃时其平均相对生长率较低, 小球藻生长较为缓慢;20℃和40℃平均相对生长率为最小值, 表明在此温度条件下, 小球藻生长最为缓慢。在小球藻生长第1 d、2 d、3 d、4 d, 小球藻相对生长率较低;第14 d、15 d、16 d、17 d、18 d相对生长率最高, 小球藻达到对数生长期;第19 d、20 d相对生长率逐渐下降, 小球藻的生长速度已经逐渐下降。
通过对不同温度下, 第15 d、16 d、18 d和20 d的小球藻的相对生长率进行无重复双因素方差分析, 结果表明不同培养天数和培养温度间差异极显著, 说明培养温度和培养天数都是影响小球藻的生长速率快慢的重要因素。
6 结论与讨论
本试验采用双因素分析试验, 研究了不同温度对小球藻生长速率的影响, 探究了小球藻的基本生长规律和最适培养温度。保持其他条件相同, 在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下培养小球藻, 结果分析表明不同培养天数和培养温度间差异极显著, 培养温度和培养天数都是影响小球藻的生长速率快慢重要因素。以30℃条件下小球藻的生长速率最快, 为小球藻生长发育的最适培养温度;20℃条件下其生长速度最为缓慢;而在40℃、35℃、25℃等培养条件下, 其生长速率变化不明显, 呈现趋势为:35℃>25℃>40℃。在对不同生育期小球藻的生物量测定试验中, 发现处于生育前期时, 其生长速率较为缓慢;达到中后期 (约第13、14、15、16 d) 时, 小球藻的生物量急剧增加, 进入了对数生长期, 并达到峰值;随后进入生长后期 (大约第17 d以后) , 其生长速率和生物量的积累都逐渐呈缓慢下降趋势。
本研究采用温度双因素分析试验, 以30℃为基数, 分别向更高和更低以5℃为公差设置两个梯度, 进行小球藻最适培养温度的探究, 得出不同培养天数和培养温度间差异极显著, 培养温度和培养天数都是影响小球藻的生长速率快慢重要因素, 小球藻在30℃时生长速率最快。Zhang等报道绿藻 (Chlorococcum sp.) 在30℃时生长最快, 与本文结果相同。欧阳峥嵘等报道了小球藻 (Chlorococcum sp.XQ-200419) 和海洋小球藻 (Ch.marina NJ-016) 的适宜温度范围均为25℃~42.5℃, 最适温度为37.5℃。杨桂娟等指出蛋白核小球藻 (Ch.pyrenoidosa) 最适生长温度为25℃。本研究中的小球藻的最适培养温度低于小球藻 (Chlorococcum sp.XQ-200419) 和海洋小球藻 (Ch.marina NJ-016) , 但高于蛋白核小球藻。