肾小球损伤

肾小球损伤（共7篇）

肾小球损伤 篇1

一定剂量的复合肥剂可致实验动物一些器官损伤, 如经静脉注射及口腔灌食途径给药造成[1~4]。经静脉途径对实验动物施加一定剂量的复合肥剂会造成怎样" 损伤" 未见报道, 本项工作用静脉点滴法对实验兔施用复合肥剂, 观察尿蛋白变化, 探讨其肾小球基底膜损伤状况。

1 材料与方法

1. 1 实验动物

选用北京白兔8 只, 每只体重 ( 2000 ± 50) g, 健康灵活, 正常进食。随机编号① ~ ⑧。

1. 2 主要试剂及仪器

环氧树脂812#为美国 ( Structure Probe. Inc. ) 生产; 锇酸试剂为英国生产 ( Johnson Matthey Chemicals Ltd. ) ; 戊二醛、乙醇及电子染色试剂均为国产;复合肥市场随机采购; 电子显微镜 ( JEO - 1200EX型) ; 超薄切片机 ( KCQ - 2 型) 上海产; 尿蛋白检测仪 ( H - 800 urine analyzer) 。

1. 3 方法

a. 尿样检测: 实验前尿样与实验后尿样尿蛋白对比。施加实验条件前对每只实验兔连续3 天采集尿样 ( 尿样标记① ~ ⑧) , 进行尿蛋白检查, 尿样4℃保存。采集尿样前确定实验兔膀胱充盈度, 以保证可采集尿样量。b. 施加实验条件: 将25% 复合肥剂去杂质, 高温灭菌。用乙醚分别将8 只兔轻度麻醉, 而后将实验兔绑定在兔台, 重点固定好兔头。兔耳缘静脉静点25% 复合肥剂20m L, 持续1h, 前半小时滴速设定每分钟10 滴, 后半小时可适当加快滴速 ( 不低于1h滴完成) 。如此静点持续3 周。前2 周间隔1 天给药 ( 周末休息) , 即每周给3 次药剂。最后1 周连续给药。动物室常规饲养。c. 实验期间尿样检测: 8 只实验兔每周采集尿样1 次, 进行尿蛋白检测。d. 实验兔肾小球基底膜检查: 第4 周终止实验条件。取出4 只双号兔 ( 处死) , 进行肾组织取材, 肾小球基底膜组织结构检查; 单号实验兔继续常规饲养, 每周采集尿样1 次, 监测尿蛋白变化。

2 结果

a. 实验前8 只实验兔尿样: 颜色呈尿黄色, 清澈透明, 经检测未见尿蛋白。b. 实验期间实验兔尿样:实验第一周、二周尿样未见尿蛋白, 第三周8 只实验兔尿样均检测出尿蛋白, 呈1 + ; 终止实验, 第四、五周, ③、⑤、⑦号实验兔尿蛋白为- , ①号兔尿蛋白仍为1 + 。c. 肾小球基底膜组织学检查: 光镜检查, ②、④、⑥、⑧号实验兔肾小球结构正常, 基底膜未见增厚; 电镜检查, ②、⑥、⑧号实验兔肾小球基底膜未见增厚, 未见病理学改变 ( 见图1、2、3) , ④号实验兔肾小球基底膜可见病理学改变, 明显改变是局灶性免疫复合物沉积, 根据病理学分型, 属轻微病变型肾小球肾炎 ( 见图4) 。经过实验前尿样与实验后尿样尿蛋白对比, 对实验兔施加25% 复合肥剂20m L静脉静点, 持续几周, 可使实验兔肾基底膜电学屏障功能减弱或消失, 使其通透性增加, 产生蛋白尿。

3 讨论

我们选择兔作为实验对象, 是因为兔对尿生成及药物实验比较敏感, 对实验条件没有特别要求[5]。静点途径给药特点, 给药直接, 不受消化系统干扰, 在实验动物体内作用时间长, 药理反应明显, 如, 致炎、致敏。从尿蛋白及肾小球基底膜结构变化分析, 初步得出结论, 复合肥剂对实验兔肾小球基底膜电学屏障有损伤机制, 这是化学物质刺激作用结果; ④号兔肾小球基底膜可见病理学改变, 有免疫复合物沉积 ( 见图4) , 说明存在致敏反应。本项工作以施加实验条件后, 检测尿蛋白变化、检查肾小球基底膜改变为主要指标, 这是本实验核心思想。从实验结果看, 检测出尿蛋白是确定的; 形态学, ②、⑥、⑧号实验兔肾小球基底膜超微结构未见典型病理学改变, ④号兔肾小球基底膜略有改变, 可见免疫沉积物, 呈电子高密度, 限于局灶, 系膜区未见免疫沉积物。故此, 从总体讲, 本实验导致蛋白尿的成因是肾小球基底膜电学屏障功能 ( 静电学屏障理论) [6]在实验条件作用下受到破坏, 使其负电性减弱或消失, 基底膜通透性增加, 血液中白蛋白透过基底膜进入尿液, 导致蛋白尿 ( 白蛋白带负电荷) 。①、③、⑤、⑦号实验兔, 终止实验条件后, 继续常规饲养, 检测尿蛋白变化。第五周, ③、⑤、⑦号兔尿蛋白消失为- ( 与实验前尿样对比) , ①号兔仍检测出尿蛋白呈1 + ( 与实验前尿样对比) , 说明受损基底膜电学屏障功能修复是缓慢的。本实验尿蛋白检查方法采用医用尿分析仪 ( H - 800) 。因人尿蛋白正常值与兔有差异, 故本项工作只做尿蛋白定性, 没有进行定量分析及尿蛋白分类, 如组织蛋白 ( 在炎症或药物作用下, 由泌尿系统分泌的蛋白质) 。实验周期3 周并非人为设计, 以检测到尿蛋白为准, 如果没有尿蛋白生成且基底膜又没有改变, 说明复合肥剂对实验兔肾小球基底膜电学屏障功能没有损伤机制。

参考文献

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肾小球损伤 篇2

关键词：肝细胞生长因子 (HGF) ,醋酸铅,人肾小球系膜细胞 (HMC) ,凋亡

铅中毒是目前最常见的职业中毒, 其作用机制以及防治日益成为研究者关注的焦点。肾脏是铅代谢的重要器官, 同时是铅中毒除脑外的第2个重要的靶器官。铅性肾病早期和急性期以近曲小管上皮细胞变性、毛细血管充血和间质中炎性细胞浸润为主要病变;慢性期则可观察到肾小球和间质纤维化增生等不可逆性结构性改变。本研究通过用肝细胞生长因子 (HGF) 蛋白防护醋酸铅处理人肾小球系膜细胞 (HMC) 的毒性作用, 进而为探索铅中毒的防护提供一种理论依据, 为铅性肾中毒的机制研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人肾小球系膜细胞 (HMC) (本实验室保存) 、醋酸铅 (天津凯通) , HGF蛋白 (北京军事科学院) , DF-12细胞培养基 (美国Sigma公司) 、胎牛血清 (杭州四季青) , 噻唑蓝 (MTT) 、碘化丙啶 (PI) (美国Sigma公司) , Takara逆转录试剂盒、Takara荧光定量试剂盒 (大连宝生物) , 荧光定量PCR仪 (美国ABI) 、细胞凋亡检测试剂盒 (凯基生物) 、台式离心机 (德国GAMR公司) , PCR仪 (美国ABI) , 酶标仪 (南京华东电子) , 分光光度仪 (UV1100) (德国Beckman公司) , 流式细胞仪 (美国BD公司) 。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HMC进行常规培养传代。培养液为含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DF-12培养液。

将液氮冻存的HMC 39℃水浴溶解, 迅速转移至离心管中以1 300 r/min离心5 min (离心半径=8.0cm) , 弃上清后, 加入4 ml完全DF-12培养液 (10%FBS) , 接种于25 cm2培养瓶中, 置37℃、5%CO2细胞培养箱中生长, 细胞贴壁后换液, 待培养细胞处于对数生长期时将其用胰酶消化, 完全培养液终止并吹打成单细胞悬液, 用于以下实验。

1.2.2 实验分组

实验分正常对照组、10μmol/L醋酸铅处理组 (Pb 10μmol/L组) 和HGF+Pb 10μmol/L醋酸铅组, HGF (20μl/ml) 加入HMC细胞共同孵育30min, 再加入10μmol/L醋酸铅后48 h处理细胞。

1.2.3 细胞存活率的检测

将上述单细胞悬液接种于96孔细胞培养板上, 每孔5×103个/孔。将培养板置于细胞培养箱中, 待细胞贴壁后换无血清培养液培养12 h使细胞同步化;吸去培养液, 加入200μl/孔DF-12完全培养基, 并在Pb 10μmol/L组和HGF+Pb10μmol/L组按2μl/100μl加入HGF蛋白, 37℃培养30 min;之后在HGF+Pb 10μmol/L组中加入终浓度为10μmol/L的醋酸铅溶液;之后37℃继续培养, 于染铅后6、12、24、48 h, 每孔分别加入20μl MTT溶液 (5 mg/ml) , 37℃继续培养4 h后, 终止培养;小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入200μl二甲亚矾 (DM-SO) , 振荡10 min, 使蓝紫色结晶物充分溶解, 在酶联免疫检测仪上测定各孔570 nm处吸光度 (A) 值, 记录结果。根据实验测得的A值计算细胞生长存活率。细胞生长存活率 (%) =实验组A值/对照组A值×100%。

1.2.4 细胞凋亡率的检测

将HMC单细胞悬液接种于25 cm2的培养瓶 (1×105个/瓶) 中, 待细胞贴壁并同步化后, 各组分别加入4 ml DF-12细胞培养液, HGF+Pb 10μmol/L组加入20μl/ml的HGF蛋白, 37℃继续培养30 min后, Pb 10μmol/L组和HGF+Pb 10μmol/L组各瓶分别加入浓度为10μmol/L醋酸铅, 留对照组, 继续培养6、12、24、48 h后, 用不含乙二胺乙酸 (EDTA) 的胰酶消化细胞, 离心 (2 000 r/min, 离心5 min, 离心半径8.0 cm) 收集细胞, 用PBS洗涤2次, 同样离心收集5×105细胞, 加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞, 再加入5μl Annexin V-FITC混匀后, 然后加入5μl Propidium Iodide, 混匀;室温、避光、反应5~15 min, 在流式细胞仪上检测, 流式细胞仪分析条件:激发波长Ex=488 nm, 发射波长Ex=530 nm。

1.2.5 醋酸铅染毒对HMC Caspase-3 mRNA的转录的影响

HMC单细胞悬液接种于25 cm2培养瓶 (1×105个/瓶) 中, 待细胞贴壁同步化后, 吸去培养液, 加入200μl/孔DF-12完全培养基, 并在Pb 10μmol/L组和HGF+Pb 10μmol/L组按20μl/ml加入HGF蛋白, 37℃培养30 min, 之后在HGF+Pb 10μmol/L组中加入终浓度为10μmol/L的醋酸铅溶液, 之后37℃继续培养48 h。提取细胞总RNA。实验步骤:PBS清洗贴壁细胞2次后, 按每瓶细胞量加入1 ml Trizol, 放置融解2~5 min后转移至1.5 ml dorf管中, 加入200μl氯仿充分混匀, 静止5 min后4℃12 000 r/min离心10 min, 转移上清至另一干净dorf管中, 加入等体积异丙醇充分混匀, 室温静置30 min后4℃12 000 r/min离心10 min, 弃去异丙醇, 加入500μl 75%乙醇洗涤RNA沉淀, 4℃12 000 r/min离心5min, 弃上清, 待沉淀晾干后加入30μl DEPC水溶解RNA沉淀。反转录实验步骤:在20μl反应体系中加入10μl RNA, 2.5 mmol/L的d NTP2μl, Olig (d T) 151μl, 反转录酶 (200 U/μl) 0.5μl, 5×RT-Buffer 4μl, 无Rnase水2.5μl, 42℃温浴90 min, 65℃加热5 min结束反应。将提取的总RNA吸取2μl稀释50倍, 在紫外分光光度计上测量260和280 nm下的A值。总RNA的浓度= (A260/A280) ×稀释倍数×0.04μg/μl。选取A260/A280在1.8~2.0之间者进行下一步实验。提取的总RNA逆转录为c DNA:用Ta KaRa Prime Script TM RTreagent Kit进行逆转录操作。反应体系:5×Prime Script TM buffer 4μl、Oligo d T Primer (50μmol/L) 1μl、Random 6 mers (100μmol) 1μl、Prime Seript TM RT Enzyme MixⅠ1μl、TotalRNA 1μg、Rnase-free水补齐至20μl;反转录反应:37℃, 15 min, 85℃, 5s, 反应结束后将此逆转录产物置-20℃保存。Caspase-3的c DNA序列设计特异性引物 (引物均由大连宝生物公司合成) :上游为5-CCATGAAGTGT-GACGTTGCATC-3, 下游为5-CCTAGAAGCATTTGCG-GTGC-3, 产物大小为284 bp。

将逆转录的各时间点c DNA进行Real time PCR反应。用Ta KaRa SYBR Preix EX Taq TMⅡ (Perfect Real Time) 在ABI7300 Real Time PCR仪上进行PCR反应。反应体系:SYBRPreix EXTaq TMⅡ10μl, PCRForward引物 (10μmol/L) 0.8μl、PCRReverse引物 (10μmol/L) 0.8μl、ROXReferenee Dye11 (50×) 0.4μl、c DNA溶液2μl、灭菌蒸馏水6μl;反应条件:预变性95℃, 30 sec;Stage2 (40 cyele) :95℃, 5 s, 60℃, 31 s;融解阶段:95℃, 15 s, 60℃60 s, 95℃, 15 s。结果采用2-△△ct法进行分析。

1.3 统计方法

实验数据用±s表示, 用SPSS 17.0统计软件进行方差分析, 以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞生长存活率

经不同浓度10μmol/L醋酸铅染毒HMC 6、12、24、48 h, Pb 10μmol/L组HMC细胞生长存活率较对照组均显著降低 (P<0.01) , HGF+Pb 10μmol/L组HMC细胞生长存活率较Pb 10μmol/L组均明显增加 (P<0.05) , 且存在时间依赖关系。见图1。

注:各时间点Pb 10μmol/L与对照组比较, P<0.01;Pb 10μmol/L组与HGF+Pb 10μmol/L组比较, P<0.05。HGF—肝细胞生长因子;HMC—肾小球系膜细胞。

2.2 细胞凋亡率

在10μmol/L醋酸铅染毒HMC的6、12、24和48 h后, 流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示, HGF+Pb 10μmol/L组在各个时间点细胞凋亡率显著低于Pb 10μmol/L组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。见图2。

注:HGF+Pb 10μmol/L组与对照组比较, P<0.01;HGF+Pb 10μmol/L组与Pb 10μmol/L组比较, P<0.01。HGF—肝细胞生长因子;HMC—肾小球系膜细胞。

4.3荧光定量检测结果

实时荧光定量 (PCR) 检测HMC铅染毒48 h后Caspase-3的表达量的变化结果显示, 对照组表达量为1.8056±0.5142, HGF+Pb 10μmol组Caspase-3的表达量 (0.0014±0.0001) 显著低于Pb 10μmol/L组 (26.7996±4.6895) , 差异有统计学意义 (P<0.01) 。

3讨论

铅是一种社会生活中广泛使用的重金属, 铅中毒严重危害人类尤其是儿童健康, 且铅中毒在众多职业病中占有重大的比例。铅对神经系统、造血系统、消化系统、泌尿系统等都具有不同程度的毒害作用, 而肾脏是进入机体的铅的主要代谢器官, 是仅次于肝脏组织之后的第二大铅储存室, 当进入机体的铅的量超过了肾脏对铅的代谢能力时, 就会使肾脏代谢功能发生紊乱, 进而发生病理性损伤, 严重威胁机体健康。

HMC是肾小球内非常活跃的细胞, 能够分泌细胞基质, 产生细胞因子, 吞噬和清除大分子物质及类似于平滑肌的收缩功能。铅能够干扰肾脏细胞内钙离子的动员, 抑制肾脏细胞对钙离子的吸收, 进而影响循环中Vit D水平。体外铅处理的肾脏细胞后肾脏细胞金属硫蛋白 (MT) mRNA表达增加而MT蛋白的表达无变化, 这表明Pb对MT的表达发挥着双重作用, 促进肝脏和肾脏MT基因的转录, 抑制肾脏MT mRNA的翻译, 抑制MT蛋白的表达, 从而对肾脏造成损伤[1]。乙酸铅能造成HK-2细胞乳酸脱氢酶 (LDH) 外漏增加, 细胞上清液丙二醛 (MDA) 水平上升, 细胞内活性氧 (ROS) 生成增加, 还原型谷胱甘肽 (GSH) 水平改变, 线粒体内膜心磷脂 (CL) 氧化损伤, 诱发HK-2细胞凋亡及坏死, 且凋亡率远较坏死率高。氧化应激介导HK-2细胞线粒体损伤, 从而启动线粒体途径的细胞凋亡可能是铅致肾细胞毒作用机制之一[2]。而本研究中, MTT以及流式结果显示, Pb 10μmol/L组较对照组在各个时间点细胞的存活率显著降低 (P<0.01) , 凋亡率显著升高 (P<0.01) 。

HGF又称离散因子 (scatter factor, SF) , 是一种多效应生物活性因子, 最初作为肝细胞有丝分裂原从肝部分切除大鼠的血液中分离, 其活性不具种属特异性并可刺激肝细胞合成DNA[1]。HGF表达于正常的肾脏的肾小球系膜细胞、间质成纤维细胞核内皮细胞。HGF作为肾脏的保护因子, 可在肾纤维化中发挥特异作用, 肾纤维化的发生并非单一机制作用, 涉及到炎症、凋亡和纤维化等多个阶段[3]。

HGF作为一种抗纤维化细胞因子在多种慢性肾脏病中能够阻止肾脏的纤维化发生和发展。在肾纤维化中HGF能通过核转运阻断活化的Smad2/3, 从而阻止其结合到靶基因的启动区[4]。在单侧肾切除和急性肾衰竭中HGF的mRNA的表达和血浆中HGF的水平显著升高;其通过促进肾脏上皮的再生并抑制有肾毒素、肾缺血和单侧肾切除术引起的肾脏衰竭综合征, 促进由于服用抗癌药物引起的肾损伤的肾上皮细胞的再生并通过抗凋亡作用抑制上皮细胞和内皮细胞的死亡。

而本研究MTT检测统计结果显示, Pb 10μmol/L组的细胞的存活率在6、12、24、48 h均显著于低于HGF+Pb 10μmol/L组 (P<0.01) , 同时流式凋亡检测结果显示, Pb 10μmol/L组的凋亡率在6、12、24、48 h均显著于高于HGF+Pb 10μmol/L组 (P<0.01) , 表明HGF蛋白对铅中毒引起的肾脏损伤具有一定的保护作用。

Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡的研究热点之一, Caspase被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者, 而Caspase-3是检测早期细胞凋亡的活性或其表达的重要指标[9]。PI3-kinase-Akt信号通路是一种存活信号同时在调节MC细胞的凋亡中发挥着关键的作用, 而NF-γB或Bad是PI3-kinase-Akt通路下游重要的信号成员, HGF能够促进PI3K活化[10], 抑制TGFβ1表达, 从而抑制Caspase-3, 而抑制细胞凋亡;Akt诱导NF-γB的激活和Bad磷酸化从而促进细胞的凋亡[11]。本研究中荧光定量检测凋亡基因Caspase-3显示, HGF+Pb 10μmol/L组Caspase-3基因的表达水平显著低于Pb 10μmol/L组 (P<0.01) , 提示HGF在铅中毒引起的肾脏损伤中具有较好的抗凋亡作用。

综上所述, 多效应细胞因子HGF对铅引起的肾脏毒性有较好的保护作用, HGF有可能成为防治铅以及其他病理因素引起的肾脏的损伤的一种新的策略。

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肾小球损伤 篇3

1 肾小管上皮细胞凋亡

凋亡即程序化细胞死亡, 肾小管上皮细胞、间质细胞均存在凋亡。凋亡的发生与糖尿病代谢状态对凋亡调节基因的影响以及氧化应激、血管紧张素、多种细胞因子的共同作用有关。Verzola等[1]对2型糖尿病并发肾病的患者肾活检组织进行凋亡分析, 发现肾小球及肾小管细胞凋亡程度均明显升高, 且肾小管细胞凋亡程度与糖尿病病程和低密度脂蛋白胆固醇相关。

2 肾小管上皮细胞肥大、肾小管基底膜受损及细胞外基质 (ECM) 堆积

肾小管基底膜是保持肾小管上皮细胞完整性的重要部分。高血糖能诱导肾小管上皮细胞肥大, 并刺激各种基质成分的合成, 从而改变肾小管基底膜的结构, 而且能打破ECM代谢的平衡。高糖导致肾小管上皮细胞肥大、ECM堆积的主要因素如下。

2.1 转化生长因子-β (TGF-β1) 早期研究表明, 高糖能显著升高肾小管细胞的TGF-β1蛋白及mRNA水平, 在糖尿病模型中也发现肾小管上皮细胞的TGF-β1及mRNA水平均明显升高。 Liu等[2]研究表明, 正常状态下肾小管上皮细胞通过细胞间粘附机制紧密连接在一起, E-钙粘蛋白是组成肾小管上皮细胞间紧密连接的重要成分, 对保持细胞完整性和极性起重要作用。TGF-β抑制E-钙粘蛋白表达, 破坏细胞间紧密连接, 上皮细胞丧失粘附特性, 从基底膜上脱落下来, 破坏肾小管基底膜。Yung等[3]研究发现高糖能促进人近端肾小管上皮细胞血小板反应素-1 (TSP-1) 的合成, TSP-1能增强TGF-β1的活化, 引发纤维连接素的集聚, 而TGF-β1亦能调节TSP-1的合成, 形成TSP-1与TGF-β1的自分泌环, 共同促进肾小管的损伤。

2.2 血管紧张素 (AngⅡ) Ang II除了血流动力学作用促进细胞生长外, 还可以直接作用于肾间质纤维化及肾小管上皮细胞。在TGF-β1诱导肾小管上皮细胞发生表型转化过程中AngⅡ显示了强大的促进作用[4]。AngⅡ能通过多种机制刺激肾脏TGF-β表达, 上调TGF-β受体。Langham等[5]应用培哚普利对DN患者进行干预治疗, 发现干预后肾脏活检组织中TGF-β1mRNA明显下降, 故推断阻断肾素-血管紧张素系统 (RAS) 能降低TGF-β1的活性。Brezniceanu等[6]研究发现, TGF-β1能刺激AngⅡ基因表达, 与活性氧簇 (ROS) 的产生、p38 MAPK活化及 p53的表达有关, 提示AngⅡ与TGF-β1可能形成一种正反馈机制以加强各自的基因表达。Liu等[7]研究发现结缔组织生长因子 (CTGF) 介导了AngⅡ的促人近端肾小管细胞肥大作用, 同时发现厄贝沙坦能明显抑制糖尿病鼠肾小管CTGF的高表达, 进而验证了CTGF在AngⅡ导致肾小管细胞肥大、ECM增生中的作用。Han等[8]研究发现, 糖尿病鼠基质金属蛋白酶组织抑制因子-2 (TIMP-2) 及其mRNA水平均明显升高, 而且高糖及AngⅡ能升高近端肾小管上皮细胞TGF-β1及TIMP-2的表达水平, 降低基质金属蛋白酶-2 (MMP-2) 的活性及基因表达。应用外源性TGF-β1可产生与高糖及AngⅡ相同的作用, 提示AngⅡ引起的MMP-2及TIMP-2的变化是TGF-β1依赖性的。

2.3 晚期糖基化终末产物 (AGEs) AGEs是指蛋白质、脂质或核酸等大分子在没有酶的参与条件下, 自发地与葡萄糖或其他还原单糖反应所生成的稳定的共价产物。Yamagishi等[9]研究发现, AGEs能上调肾小管上皮细胞TGF-βmRNA水平, 并能增加细胞间的活性氧自由基。应用AGEs阻断剂干预自发性糖尿病鼠能阻止其肾小管损伤及肾小管间质纤维化, 也进一步验证了AGEs对肾小管损伤。Ozdemir等[10]最近应用单层细胞培养的极化肾近端小管上皮细胞对甲基乙二醛修饰后的牛血清白蛋白和未修饰的牛血清白蛋白的处理方式明显不同, 推测体内AGEs修饰蛋白的存在在一定程度上影响了肾小管的早期功能, 并引起肾小管肥大。

2.4 ROS 线粒体是产生ROS的重要器官, 高血糖通过蛋白激酶C (PKC) 依赖的NADPH氧化酶的激活以及线粒体代谢诱导细胞间ROS的产生。AGEs、AngⅡ、TGF-β1均能增加肾小管上皮细胞间ROS, 而ROS能促进ECM的降解。体外研究表明, 人肾近端小管细胞在过氧化物损伤后, 表皮生长因子 (EGF) 促其增殖的能力下降, 且能对抗胰岛素样生长因子 (IGF-1) 的促增殖能力, 从而影响肾小管损伤后的恢复[11]。

3 炎症反应

炎症反应是DN肾小管及肾小管间质损伤的一个重要方面。有研究表明, 糖尿病db/db鼠肾小球及肾小管细胞间粘附分子-1 (ICAM-1) 表达增多, 且巨噬细胞浸润明显增加, 表明ICAM-1介导的炎症反应在糖尿病肾损伤中起一定作用[12]。骨桥蛋白 (OPN) 属巨噬细胞趋化因子, Hsieh等[13]研究发现, 高糖环境下, 糖尿病鼠肾近端小管OPN mRNA表达上调, 高糖、AngⅡ、TGF-β1呈剂量、时间依赖方式刺激OPNm RNA的表达。Qi等[14]研究发现, 高糖和TGF-β1能上调HK-2细胞CC趋化因子--巨噬细胞炎性蛋白-3α (MIP-3α) 的mRNA和蛋白表达水平, 而应用siRNA技术使HK-2细胞TGF-β1基因沉默, MIP-3α的表达明显下降, 说明高糖上调MIP-3α的表达依赖于TGF-β1。

4 肾小管间质纤维化

肾小管间质纤维化上DN的突出表现, 与DN恶性程度密切相关。TGF-β1能促进ECM合成, 抑制ECM降解, 从而打破肾间质ECM代谢的动态平衡, 促其向纤维化方向发展。除TGF-β外下列因素也影响肾小管间质纤维化。

4.1 CTGF 肾间质成纤维细胞 (NRK-49F) 、肾小管上皮细胞以及由二者分化而来的肌成纤维细胞是肾间质纤维化发生中的ECM的主要来源。体外实验发现, CTGF可直接刺激NRK-49F的增殖并促进其表达Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白 (FN) 和α5整合素, 也可联合血管紧张素Ⅱ协同作用介导AGEs诱导的有丝分裂和Ⅰ型胶原的合成, 还可通过与IGF-Ⅰ结合上调Ⅲ型胶原和血小板反应蛋白 (TSP-1) 的表达。研究发现, 高糖诱导鼠近曲小管细胞产生的CTGF可明显刺激鼠肾脏成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的合成及FN、纤溶酶原激活物抑制剂-1基因的表达, 此过程是TGF-β依赖的[15]。在体外, 高糖可上调人肾脏成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的合成, 且是非TGF-β依赖的, 抗CTGF中和抗体可部分抑制此反应, 表明外界CTGF可直接介导高糖诱导的ECM的合成;另外观察到CTGF必须与IGF-Ⅰ结合才可明显上调非高糖环境下的人肾脏成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达, 但在高糖环境下却无此作用[16]。另有研究发现, CTGF单独作用并不能促进肾脏肌成纤维细胞的分化和FN的合成, 而是通过低密度脂蛋白受体相关的蛋白酪氨酸的磷酸化和细胞外信号调节激酶途径激活, 而非TGF-β诱导的Smad 2途径[17]。体外研究发现, 在肾间质细胞中, CTGF不仅诱导ECM的合成, 而且能介导TGF-β刺激的蛋白酶抑制剂的产生, 从而导致ECM合成增加和降解减少[18]。

4.2 其他。AGEs能促进肾小管上皮细胞转分化 (TEMT) , 从而促进肾小管间质纤维化, 其促TEMT作用能被AGEs受体抗体或TGF-β抗体阻断, 提示TEMT是AGEs与AGEs受体结合后激活TGF-β1所致。另外, AngⅡ能促进TGF-β1的表达, 从而影响TGF-β1的下游效应因子CTGF及其他促纤维化分子的表达, 而且AngⅡ能影响肾小管ECM的代谢, 促进肾小管间质向纤维化发展, 故AngⅡ在肾小管间质纤维化过程中同样起关键作用。ROS亦能促进TEMT, 并能使近端肾小管 AngⅡ的生成增加, 共同促进肾小管间质纤维化的进程。

总之, 在糖代谢紊乱的基础上, 上述各种因素相互作用, 共同促进肾小管病变的发生、发展, 具体机制尚有待进一步探讨, 以求DN的治疗措施, 延缓肾功能恶化, 提高患者的生活质量, 延长患者寿命。

肾小球损伤 篇4

1 资料与方法

1.1 临床资料

我科收治按世界卫生组织1982年诊断标准确诊的IgA肾病患者45例。男性32例，女性13例;平均年龄(24.9±10.3)岁。均除外紫癜性肾炎、乙肝病毒相关性肾炎、狼疮性肾炎等继发性疾病。45例患者均施以经皮肾活检术，肾活检组织经升汞-苦味酸固定，切片厚度2μm，分别行HE、PAS、PASM和Masson三色染色。由病理医师在单盲情况下观察病理形态学改变。IgA肾病的肾组织病变在光镜下按LEE等[4]组织学改变分为I～V级，其中I～III级27例，IV、V级18例。10例肾小球轻微病变型患者为对照组。

1.2 免疫组织化学染色

小鼠抗人WT1单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)、PV-9000(北京中山第二代通用型二步法检测)试剂盒，购自北京中山生物技术工程公司。所有患者肾活检组织经丙酮固定，3μm石蜡切片，常规脱蜡水化后，3%过氧化氢灭活，胃蛋白酶抗原修复后，加入稀释的一抗(1∶400),4℃过夜后，再加入二抗试剂A,37℃孵育20 min后，再加入二抗试剂B,37℃孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)发色5～7 min，苏木素复染后，脱水、透明、封片，每组染色设以PBS液替代一抗的阴性对照。

1.3 计算机图像分析

足细胞缺失定量分析采用IMS-2000图像分析软件，分别测量10个非硬化肾小球总面积及每个肾小球内WT1阳性细胞所占的面积，计算每个肾小球WT1阳性细胞所占面积比，计算出足细胞密度取其平均值[5]。

1.4 肾小球系膜增殖和肾小球硬化程度判定

光学显微镜计算机图像分析系统，计算每例正切肾小球中系膜增殖或肾小球硬化面积与肾小球总面积的百分比;再按照OKADA等[6]介绍的方法进行评分，病变累及肾小球面积小于30%为1分，30%～60%为2分，大于60%为3分;取其平均值作为每例患者肾小球病变的平均值。

1.5 肾小管间质病变程度判断

根据Banff分级[7]半定量分为4级，0级：正常;1级：肾小管上皮细胞轻度萎缩、变性，呈灶性分布，纤维组织增生呈小灶性，少量分布病变范围<25%;2级：肾小管上皮细胞中度萎缩、变性，坏死轻，纤维组织中度增生，病变范围<26%～50%;3级：肾小管上皮细胞萎缩、变性，坏死重，成片分布，纤维组织增生成束状，多灶或网状成片，病变范围>50%。

1.6 肾小球TGF-β1免疫组织化学阳性面积测定

采用IMS-2000图像分析系统，计算每张切片中肾小球的阳性面积与整个肾小球阳性面积的比值，取其平均值作为该切片肾小球阳性表达的比较值以%表示。

1.7 肾小管间质区域TGF-β1半定量分析

选择DAB染色阳性的切片，在200倍高倍视野下，每张切片注意选取5个不含肾小球的皮质视野，采用IMS-2000图像分析系统，计算每个视野的阳性面积占该视野面积的比值，然后取其平均值作为该切片的阳性面积率，以%表示。

1.8 尿标本检测

禁食12 h后收集尿液，测尿β2-微球蛋白(β2-MG)(RIA法)。

1.9 统计学分析

应用SPSS11.0统计软件进行统计分析，计量资料数值以均数±标准差表示，两样本比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，变量间的相关关系采用直线相关分析或Sperman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IgA肾病与对照组WT1和TGF-β1表达量的比较

结果显示：IgA肾病肾小球WT1表达较对照组减少明显(P<0.01)，见图1、2，而TGF-β1在肾小球(见图3、4)、肾小管间质(见图5、6)中的表达较对照组明显增多(P<0.01)。

注:与对照组比较,P<0.01

结果显示：IgA肾病肾组织TGF-β1主要表达于肾小管上皮细胞，肾小球内很少表达，且TGF-β1表达与WT1呈负相关(r=-0.51,P<0.05)，与肾小球系膜的增殖程度和肾小球硬化程度呈正相关(r=0.61,r=0.70,P<0.05)，见表2。

2.2 IgA肾病肾小管间质病变与肾组织WT1、TGF-β1及尿β2-MG活性水平的关系

注:两组比较,P<0.01

结果显示：随着Ig A肾病肾小管间质病变的加重，肾组织WT1表达减少越明显，肾小管间质TGF-β1表达及尿β2-MG活性水平越高，差异具有统计学意义(P<0.01)。且肾组织WT1表达与肾小管间质损害程度分级呈负相关(r=-0.81,P<0.01)。肾小管间质TGF-β1表达与肾小球系膜的增殖程度、肾小球硬化程度也呈正相关(r=0.71,r=0.67,P<0.01)。见表3。

注：1)与1级比较，P<0.01;2)与1级比较，P<0.01;3)与2级比较，P<0.01

3 讨论

脏层上皮细胞即足细胞，位于肾小球基底膜的最外层，是肾小球滤过屏障的重要构成成分，WT1表达于足细胞核，是足细胞表面特异性标志之一，目前人们发现，足细胞损伤是导致肾小球硬化的关键因素。本研究显示，IgA肾病肾小球TGF-β1表达与WT1呈负相关，与肾小球系膜的增殖程度和肾小球硬化程度呈正相关。已有研究[8]证实，足细胞凋亡发生在TGF-β1转基因小鼠肾小球硬化发展过程的早期。NF-KB在活体内和不同的细胞培养模型中均具有抗凋亡作用，足细胞内Smad7的表达能抑制抗凋亡的核因子NF-KB的活化，TGF-β1可能通过促进Smad7的合成而抑制NF-KB的转录活性，最终导致足细胞凋亡[9,10]。p38mAPK激酶活化是一个主要的凋亡启动因子。TGF-β1还能使足细胞内P38快速磷酸化激活来诱导足细胞的凋亡[11,12]。

既往人们比较注重于肾小球性病变，而忽视肾小管间质损伤，通常认为系膜增殖、小球硬化、新月体形成等肾小球因素是决定Ig A肾病预后的主要因素。近年大量临床病理学研究显示，肾小管间质损害是决定IgA肾病预后的重要因素。肾小管间质损伤是促进肾脏病进行性进展的重要诱因。TGF-β共分5种同分异构体TGF-β1～TGF-β5，它们的生物学特性基本相同，其中以TGF-β1最为重要，TGF-β1是公认的致纤维化因子。本研究还发现，Ig A肾病患者随着肾小管间质病变加重，肾小管间质TGF-β1表达及尿β2-MG活性水平越高，肾组织WT1表达减少越明显，且与肾小管间质病变程度呈良好等级相关性，肾小管间质TGF-β1表达与肾小球系膜的增殖程度和肾小球硬化程度也呈正相关，提示肾小管在疾病状态下TGF-β1的高表达可能对足细胞损伤及肾小球硬化起重要作用。TGF-β1是介导足细胞损伤的关键细胞因子，通过改善肾小管间质损害可能成为治疗IgA肾病足细胞损伤的一个新途径，对于探讨Ig A肾病进展机制和延缓措施具有重要意义。

摘要：目的 探讨肾小管间质损害在IgA肾病足细胞损伤中的意义。方法 45例IgA肾病患者根据Banff分级半定量进行分组,采用免疫组织化学法,检测各组肾组织足细胞表面特异性标记物Wilms'肿瘤蛋白(WT1)及转化生长因子(TGF-β1)的表达变化,并和患者尿β2-微球蛋白(β2-MG)水平进行比较。结果 IgA肾病患者肾组织TGF-β1表达与肾小球系膜的增殖程度、肾小球硬化程度呈正相关,且随着肾小管间质病变逐渐加重,肾组织WT1表达减少越明显,肾小管间质TGF-β1表达及尿β2-MG活性水平也越高,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 改善肾小管间质损害可能成为治疗IgA肾病足细胞损伤的一个新途径。

关键词：IgA肾病,足细胞,转化生长因子

参考文献

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肾小球损伤 篇5

右美托咪啶(Dexmedetomidine,Dex)是一种新型的、特异性、高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有镇静、镇痛、抗交感、稳定血流动力学和利尿作用[2,3],目前主要用于ICU镇静和临床麻醉。本实验通过观察Dex注射对受损肾小管的保护作用及其机制,旨在为临床围手术期防治AKI发生提供新的理论和应用依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

昆明小鼠60只,清洁级,体重20~25 g,由徐州医学院实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂

兔抗免疫组织化学染色测定低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),β-Tubulin(美国Santa Cruz公司),兔抗单核细胞趋化蛋白1(mononuclear macrophage antigen 1,MCP1)单克隆抗体(Boster Biotechnology公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备与分组

将60只小鼠随机分为对照组、IR模型组和Dex组,每组20只。对照组:不做任何处理;IR模型组:用1.5%异氟烷诱导麻醉小鼠后将其放置于变温毯上,维持体温(36.0±0.1)℃。常规备皮、消毒。沿腹部正中剪开皮肤,暴露腹白线,沿之剪开后暴露腹腔。轻轻推移肾周组织后分别用微血管夹夹闭左、右侧肾蒂,可以看到两侧肾脏颜色由鲜红变成暗红。然后将肾周组织归位,开放的腹腔用湿纱布覆盖。待双侧肾脏缺血25 min后,移除微血管夹,让肾脏重获血液灌注,可以看到肾脏颜色由暗红变成鲜红。缝合关闭腹腔。24 h后处死小鼠,取出肾组织备检。Dex组:在IR模型组中肾脏获得再灌注后立即给予腹腔注射Dex 25.0μg/kg。

1.2.2 肾组织形态学检查

常规石蜡包埋,组织切片进行苏木素-伊红(hematoxylin-esosin,HE)染色,光学显微镜观察。肾小管损伤程度分析:每个标本随机选取10个视野,每个视野分别测量肾小管间质相对面积,按照DJUDJAJ等[4]方法,按肾小管损伤程度将组织学评分分为0~3:0=正常肾组织;1=中等程度损伤;3=肾小管坏死病变。进行组织学评分。

1.2.3 HIF-1α及MCP1的表达

标本石蜡包埋,连续切片,厚度3μm。贴附于载玻片上,60℃烤箱烘烤3 h。常规脱蜡至水后,分别经3%过氧化氢H2O2封闭,消除内源性过氧化物酶的活性。一抗:兔抗HIF-1α多克隆抗体(1∶100)、兔抗MCP1单克隆抗体(1∶100);二抗:Ig G即用型M.0.M.TM免疫组织化学试剂盒,按ABC法进行染色,DAB显色。均采用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选取5个高倍视野(×400),利用Image-Pro Plus 6.0软件计算其积分光密度值(integral optical density,IOD),取其平均值。

1.2.4 Western blot检测HIF-1α表达

取新鲜肾组织加裂解液后匀浆、离心、取上清液测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭,加一抗、二抗,显色剂显色处理。以β-Tubulin为参照,测定HIF-1α蛋白的相对表达量,即各组HIF-1α/β-Tubulin ratio值之间比较。

1.2.5 肾功能变化

在处死小鼠同时每只取静脉血2 ml,在高速离心机上离心,吸取血清,在全自动生化分析仪上检测BUN及Scr。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)描述;组间均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准,当P<0.05时,差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏形态学变化

各组小鼠肾组织HE染色显示:对照组小鼠肾组织结构形态正常;IR模型组出现不同程度的肾小管扩张萎缩、空泡变性,肾小管上皮细胞扁平、核染色缺失、炎症细胞浸润;Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组明显减轻。见图1。

各组小鼠肾脏组织组织学评分结果显示:对照组(0.23±0.01),IR模型组(4.46±0.11),Dex组(1.51±0.04),3组间比较差异有统计学意义。见图2。

2.2 肾组织HIF-1α免疫组织化学染色

对照组肾小管上皮细胞基本正常,HIF-1α表达微弱。IR模型组肾小管上皮细胞低氧严重,HIF-1α表达显著增多。Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组明显减轻,HIF-1α表达较IR模型组显著减少。见图3。

各组小鼠肾组织HIF-1α染色IOD值比较,IR模型组肾小管HIF-1α大量表达,而Dex组HIF-1α较IR模型组表达显著减少。3组标本IOD值间比较差异有统计学意义。见图4。

2.3 肾组织MCP1免疫组织化学染色

对照组肾小管上皮细胞基本正常,MCP1表达微弱。IR模型组肾小管损伤严重,炎症细胞浸润,MCP1表达显著增多。Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组显著减轻,MCP1表达较IR模型组显著减少。见图5。

与对照组比较,IR模型组肾小管MCP1大量表达(P=0.042)。而Dex组MCP1较IR模型组表达显著减少(P=0.031)。3组标本IOD值间比较差异有统计学意义。见图6,表1。

A:对照组;B:IR模型组;C:Dex组

1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05

2.4 HIF-1α蛋白表达

对照组HIF-1α蛋白表达微弱,IR模型组HIF-1α蛋白大量表达,而Dex组HIF-1α蛋白表达水平较IR模型组显著降低。见图7。

A:对照组;B:IR模型组;C:Dex组

1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05

A:对照组;B:IR模型组;C:Dex组

1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05

各组HIF-1α/β-Tubulin ratio值之间比较:对照组HIF-1α蛋白表达微弱,HIF-1α/β-Tubulin ratio值小,IR模型组HIF-1α蛋白大量表达,HIF-1α/β-Tubulin ratio值显著增加,而Dex组HIF-1α蛋白表达水平较IR模型组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图8。

2.5 肾功能变化

双肾缺血25 min再灌注24 h后,血浆肌酐水平从(30.62±2.55)μmol/L升高至(78.34±5.17)μmol/L(P=0.004),血尿素氮水平从(6.26±0.34)mmol/L升高至(23.39±4.15)mmol/L(P=0.006)。缺血再灌注后应用Dex 25μg/kg,可显著改善IR之后的肾功能,肌酐(54.09±3.27)μmol/L(P=0.035);尿素氮(18.33±4.07)mmol/L(P=0.023)。见表2。

注:1)与同期对照组比较,P<0.05;2)与同期IR模型组比较,P<0.05

1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05

注:1)与同期对照组比较,P<0.05;2)与同期IR模型组比较,P<0.05

3 讨论

肾脏缺血再灌注损伤是一个复杂的过程,休克、体外循环术后、围产期窒息等过程常发生肾缺血性损伤,严重者将导致急性肾功能衰竭的发生,也是患者入住ICU的主要原因。肾IR损伤病变的本质包括肾小管可逆性非致死性功能障碍和致死性损伤[5]。近年来,研究认为,凋亡和炎症反应在肾IRI的病理生理过程中占有核心地位[6]。HUANG等[7]认为,炎症反应是IRI最为主要的特征之一。而剧烈的炎症反应导致急性肾小管坏死,坏死后的小管碎屑作为一种危险信号在循环中进一步激发炎症反应,使肾小管上皮细胞处于缺氧状态。因此,针对急性肾损伤的早期抗炎治疗具有重要的价值[8]。

Dex是新一代α2AR激动剂,分布半衰期为约5 min,消除半衰期约2 h,不良反应相对轻且少。临床上主要作为手术麻醉辅助药和ICU镇静。此外,Dex还具有镇痛、抑制交感兴奋、抗焦虑、稳定血流动力学和利尿效应[3]。BILLINGS等[9]研究发现,Dex可以维持小鼠肾髓质血流从而防止造影剂肾病发生。KOCOGLU等[2]在肾缺血再灌注损伤大鼠研究中发现,Dex预处理可降低肾缺血再灌注损伤,提高肾脏对缺血的耐受性。因此,笔者推测,Dex能够通过减轻肾损伤后炎症反应、阻止肾小管上皮细胞凋亡加剧从而降低缺血再灌注后肾损伤的程度。

本实验通过HE染色发现,对照组小鼠肾组织结构形态正常,而IR模型组出现不同程度的肾小管扩张、萎缩、空泡变性,肾小管上皮细胞扁平、核染色缺失、炎症细胞浸润。但Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组明显减轻。说明Dex本身对肾脏不会造成损伤,Dex能够减轻IR后受损肾脏的病变程度,从一定程度上维持肾脏结构与形态的稳定,进而改善肾脏功能。

HIF-1α是迄今为止发现的唯一一个在缺氧状态下发挥活性的特异性转录因子,是细胞低氧的可靠标记物,是反映低氧状态的一个敏感指标[10]。HAUCK等[11]认为,缺氧导致细胞死亡的主要方式是通过诱导细胞凋亡来实现的。细胞内氧浓度对HIF-1α的表达进行着精细的调节,随着氧浓度的下降,其表达增加。本研究发现,对照组HIF-1α表达较微弱,IR模型组HIF-1α大量表达,而Dex组HIF-1α较IR模型组表达显著减少。说明Dex能够减轻肾IR后受损肾小管上皮细胞低氧状态,从而减轻肾脏损害。

MCP1是趋化因子CC亚家族中的一员,在正常情况下肾组织中仅有少量表达。然而,在病理状态下,MCP1在肾小管间质中可广泛表达。刘雷等[5]认为,MCP1启动并放大炎症反应过程,在肾IRI中发挥重要作用。本实验通过研究发现,对照组MCP1表达较微弱,IR模型组MCP1大量表达,而Dex组MCP1蛋白表达水平较IR模型组显著减少。说明Dex能够通过减轻IR后肾组织炎症反应,从而保护肾脏功能。从表2可以看出,Dex组小鼠肾功能较IR模型组明显改善。

IR的炎症反应始于缺血阶段,再灌注之后补体系统被激活,引发后天免疫系统的级联反应,促进炎症的发展[8],炎症反应的发展可能会导致肾小管上皮细胞处于缺氧状态加剧。因此,针对ARF/AKI的早期抗炎治疗具有重要的价值。通过以上研究结果,笔者推测Dex参与肾脏IRI后的病理生理过程,主要通过下调MCP1和HIF-1α的表达,从而减轻肾脏炎症反应,降低肾小管上皮细胞缺氧程度,进而保护肾脏功能。希望能够为临床早期防治IR后肾损伤及其他脏器损伤提供新的治疗思路。

摘要：目的 缺血再灌注肾损伤(IR)是围手术期常见的疾病,本研究通过构建缺血再灌注肾损伤模型,观察右美托咪啶(Dex)注射对受损肾小管的保护作用及机制。方法 将60只小鼠随机分为对照组、IR模型组和IR+Dex组(简称Dex组),制备IR模型后24 h分别处死3组小鼠取肾组织。用全自动生化分析仪测定血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)。采用HE染色观察各组小鼠肾组织的形态,评定肾小管损伤程度;免疫组织化学染色测定低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达。结果 对照组的肾小管结构与形态均正常。IR模型组肾小管损害明显、HIF-1α及MCP-1表达均增高。而Dex组肾小管损害程度较轻,HIF-1α及MCP-1表达均较IR模型组减低,肾小管上皮细胞低氧程度及炎症反应均较IR模型组明显减轻。Dex组小鼠的血肌酐及尿素氮水平较IR模型组明显降低。结论 Dex可以通过抑制炎症反应、减轻肾小管上皮细胞低氧程度从而减轻IR小鼠肾小管的损害,保护肾脏功能。

关键词：缺血再灌注损伤,肾小管上皮细胞,右美托咪啶

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肾小球损伤 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年10月-2013年1月本院收治的老年2型糖尿病肾病患者120例为临床研究对象,所有患者均经过临床确诊为2型糖尿病肾病。根据Mogensen对糖尿病肾病的分类标准进行分类。120例患者中,Ⅰ期糖尿病肾病患者30例,其中男19例,女11例,年龄60~78岁,平均年龄(66.75±4.13)岁。Ⅱ期30例,其中男17例,女13例,年龄61~77岁,平均年龄(67.16±4.58)岁。Ⅲ期30例,其中男18例,女12例,年龄63~78岁,平均(68.99±5.34)岁。IV期30例,其中男16例,女14例,年龄63~79岁,平均(69.89±6.02)岁。

同时随机选择此阶段在本院进行健康体检的100例体检者作为对照组,其中男66例,女34例,年龄60~75岁,平均(68.28±8.98)岁。各组患者的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 方法

使用全自动生化分析仪对患者的尿胱抑素C进行检查,方法使用颗粒免疫比浊的方法。患者均取清晨尿液,高速离心2000 r/min,共10 min,取上清液进行检测,并避免剧烈震动。对比四组患者的检查结果。

1.3 统计学处理

使用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理,计量资料以(±s)表示,比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

老年2型糖尿病肾病组的尿胱抑素C均值为(2.42±0.42)mg/L,明显高于健康对照组的(0.94±0.14)mg/l,差异有统计学意义(P<0.05);糖尿病肾病组Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期的尿胱抑素C随疾病严重程度增加而不断上升,Ⅳ组尿胱抑素C均值为(3.51±1.02)mg/L,Ⅲ组为(2.29±0.36)mg/L,Ⅱ组为(1.81±0.41)mg/L,Ⅰ组为(1.56±0.33)mg/L,各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

糖尿病肾病是由于糖尿病自身导致的肾脏损伤,患者多会出现有持续的蛋白尿,并伴有肾小管和肾小球的损伤[2]。既往临床多认为糖尿病肾病主要病理改变为肾小球的改变,但是随着临床的研究笔者发现,糖尿病肾病患者也同时伴有尿α1-MG、尿NAG、尿β2-MG的损害[3],提示患者伴有肾小管的早期损伤。而糖尿病肾病组患者在早期的临床症状多不明显,当出现有临床症状时,多已经为中晚期[4],并会进展为终末期肾病。

胱抑素C是近年来发现的对肾小管损伤诊断较为敏感的指标。胱抑素C的分子量达到13 359道尔顿,PI为9.3,其中有氨基酸残基120个,为碱性低分子量蛋白[5,6],且非糖基化。胱抑素C在有核细胞中能够恒定地进行持续的转录,进而表达,生成速度也较为稳定,是一种典型的分泌型蛋白[7]。同时,胱抑素C不会受到炎性因子、甘油三酯和溶血的影响,与肌肉量和性别等均无明显的关系[8],与患者的饮食、运动等均无关系,在所有的体内均能够检测出。临床研究发现,脑脊液内胱抑素C的浓度最高,而在尿液中的浓度则最低。在肾脏内,胱抑素C由肾小球滤过,且由近曲小管做重吸收和分解代谢。而肾小管不分泌胱抑素C。因此,尿胱抑素C可以作为肾小管损伤的一个敏感指标。

同时,糖尿病患者当中,约有40%比例的患者最终会发展成为糖尿病肾病。糖尿病肾病患者传统意义上所使用的常规方法如果检出临床蛋白尿,一般会在10年时间内发展成为终末期肾病,此状态下的肾病往往具有不可逆转的特点,最终不得不选取血液透析,或者是肾移植替代治疗的方案,不但给患者的身心健康带来了极为不利的影响,同时也加重了患者及其家属的经济负担。相关研究发现:若能够在糖尿病肾病早期得到及时且确切的诊断,采取针对性的治疗方案,则对于延缓、甚至逆转糖尿病肾病疾病的发展而言是至关重要的。为此,本文中试验了肾小管早期损伤在糖尿病肾病早期诊断中的标志物,取得了良好效果。同时,由于现阶段有关糖尿病肾病患者所采取的检测指标多表现为:α1微球蛋白、以及β2微球蛋白。上述两项指标被认为是评估患者肾小管功能的最关键指标。但对于α1微球蛋白而言,定量检测的操作流程相对复杂,对于仪器设备的要求较高,因此在临床实践应用中存在一定的局限性。与此同时,对于β2微球蛋白而言,在酸碱度高于7.0的反应环境下,该指标极有可能被尿酸性蛋白酶分解。因此,为确保监测数据的准确性,往往需要对监测标本进行预先的碱化处理。而相对于此,尿胱抑素C参与糖尿病肾小管早期损伤诊断中表现出了极为突出的优势。具体包括以下几个方面:(1)尿胱抑素C在人体体内的表达相对问题,不具备明显的组织特异性。与此同时,尿胱抑素C水平未表现出明显性的时相规律;(2)尿胱抑素C在尿液当中的稳定程度较高,受到样本存放时间、存放环境温度、湿度、以及环境酸碱度等因素的影响较小,且所产生的波动干扰始终维持在较小水平内;(3)尿胱抑素C水平定量检测方法相对较多,且应用比较成熟,检测过程当中所需要应用的各种诊断试剂商品化趋势显著。结合上述分析,不难发现:将尿胱抑素C引入对2型糖尿病肾小管早期损伤的诊断过程中,意义突出。

本次实验首先对120例2型糖尿病肾病患者与健康组的尿胱抑素C进行了对比,从结果看,2型糖尿病肾病患者的尿胱抑素C有明显的提高,差异有统计学意义(P<0.05),说明2型糖尿病肾病患者已经伴有早期的肾小管损伤。其次,笔者比较了不同严重程度的2型糖尿病肾病,从结果看,疾病越严重的患者,其尿胱抑素C越高,说明随着患者的病情进展,尿胱抑素C会不断增加。进一步地说明了在糖尿病肾病发生早期,就有可能出现了肾小管的损伤。

综上所述,使用尿胱抑素C对老年2型糖尿病肾小管早期损伤具有较高的诊断价值,是一种较好的检测指标。临床对尿胱抑素C的检测也较为成熟,包括颗粒增强散射免疫比浊方法、颗粒增强免疫透射比浊方法等,成本费用较低,可以作为一个常规的检查指标。

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肾小球损伤 篇7

关键词：缺血后处理,上皮细胞间质转变,肾纤维化

肾缺血再灌注损伤不仅可以在短期内引起肾功能不全、衰竭, 而且还可以导致慢性肾小管间质纤维化。肾小管间质纤维化是各种病因的肾脏疾病进展到终末期肾病的必要环节, 而肾小管上皮细胞间质转变 (EMT) 在肾纤维化过程中扮演重要角色。因此, 本研究利用笔者已经建立的成熟的体外模型, 研究体外缺血后处理是否对缺血再灌注损伤导致肾小管EMT产生影响, 现报道如下:

1 材料与方法

1.1 实验细胞

肾小管上皮细胞系NRK-52E购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心, 培养于培养皿中, 95%空气/5%CO2、p H 7.4、37°C条件下, 每2天更换培养液。所有细胞均在实验前用无血清的培养基培养24 h。

1.2 主要药物、试剂

DMEM培养基, 胎牛血清 (美国, Hyclone) ;Annexin V-FICT/PI双染试剂盒 (美国, Bender, B MS1031) ;三气细胞培养箱 (美国, REVCO公司) ;α平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) 单克隆抗体, 转化生长因子-β1 (TGF-β1) 单克隆抗体, 结缔组织生长因子 (CTGF) 单克隆抗体 (cell signaling) , β-actin单克隆抗体 (Santa cruz)

1.3 实验方法

1.3.1 细胞模型的建立

1.3.1. 1 对照 (COS) 组

同步化24 h后, 用对照缓冲液1 m L, 培养3 h, 然后更换DMEM培养基2 m L, 在正常条件下 (5%CO2+95%空气、37℃) 培养至指定的时间点。

1.3.1. 2 缺血再灌注损伤 (IRI) 组

同步化24 h后, 用p H 7.4的无血清DMEM培养液1 m L冲洗已汇合成片的大鼠肾小管上皮细胞, 接着用p H 7.4的无糖DMEM培养液1 m L冲洗细胞, 再用无血清、无糖的缺血培养液1 m L在缺氧条件下 (0.5%O2+5%CO2+94.5%N2、37℃) 培养3 h, 再灌注时换用完全DMEM培养基2 m L, 在正常条件下 (5%CO2+95%空气、37℃) 培养至指定的时间点。

1.3.1. 3 缺血后处理 (IPO) 组

同步化24 h后, 更换缺血缓冲液1 m L, 并在缺氧条件下 (0.5%O2、5%CO2、饱和湿度) 条件下培养3 h, 然后添加0.5 m L新鲜的完全培养基, 在正常条件下 (空气氧浓度、5%CO2、饱和湿度、37℃) 培养10 min, 模拟再灌注环境, 再在缺血条件下 (0.5%O2、5%CO2、饱和湿度) 培养10 min, 模拟缺氧环境, 此20 min为1个循环, 共计3个循环。最后添加完全培养基2 m L在正常条件下 (空气氧浓度、5%CO2、饱和湿度、37℃) 培养至指定的时间点。

1.3.2 观察指标与测定方法

肾小管上皮细胞NRK-52E在缺血再灌注损伤和缺血后处理后3、6、12、24 h各时间点, 收集细胞提取总蛋白, 行Western blot检测肾小管上皮间质变相关指标, 如α-SMA、TGF-β1、CTGF蛋白表达。

1.3.3 HOECHST检测细胞凋亡

用预温1×PBS缓冲液, 洗涤细胞2次。加入5μL Hoe chst 33342染色液于各组细胞, 轻轻晃动混匀, 然后孵育箱避光孵育10 min。加入5μL PI染色液, 轻轻混匀, 室温避光孵育10 min, 用荧光显微镜检测各组细胞。Hoechst33342的最大激发波长350 nm, 最大发射波长为460 nm, PI的最大激发和最大发射波长分别为488 nm和615 nm。

1.3.4 Western blot测定方法

提取细胞总蛋白。SDS-PAGE进行蛋白质分离, 电转至NC膜, 5%脱脂奶粉封闭1 h后, TBS洗膜。封闭液中按1∶1000加一抗, 即相应单克隆抗体 (β-actin作参照) , 缓慢摇动4℃过夜, 弃去一抗, TBST洗膜, 加羊抗兔Ig G二抗, 缓慢摇动1 h, TBST洗膜。化学发光法曝光, 显影定影, 拍照观察胶片上的条带, Quantity One软件分析灰度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD-t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hochest检测各组细胞凋亡

Hochest检测显示, COS组肾小管上皮细胞没有明显凋亡, IRI组肾小管上皮细胞凋亡明显, 而IPO组凋亡明显减少 (图1) 。

A:COS组;B:IRI组;C:IPO组;与COS组相比, IRI组与IPO组的凋亡细胞数量增多;同时, 与IRI组相比, IPO组凋亡细胞数量明显降低;箭头表示凋亡细胞

2.2 Western blot检测结果

肾小管上皮细胞α-SMA蛋白表达结果如图2所示:IRI组α-SMA随时间延长表达逐渐增强, 且24 h时表达最强;而IPO组α-SMA随时间延长表达逐渐减弱, 24 h表达最弱。在12 h和24 h时间点, IRI组α-SMA表达明显较COS组高, IPO组表达明显较IRI组低 (P<0.05) 。

肾小管上皮细胞TGF-β1蛋白表达结果如图3所示:IRI组TGF-β1在缺血再灌注3、6 h时表达最强, 之后减弱;而IPO组表达方式与IRI组相似, 但表达量明显弱于IRI组 (P<0.05) 。在3 h和6 h时间点, IRI组和IPO组TGF-β1蛋白表达较COS组高, IPO组表达较IRI组低 (P<0.05) 。

肾小管上皮细胞CTGF蛋白表达结果如图4所示:IRI组CTGF在缺血再灌注3、6 h表达最强, 之后减弱;而IPO组表达方式与IRI组相似, 但表达量明显弱于IRI组 (P<0.05) 。在3 h时间点, IRI组和IPO组CTGF蛋白表达明显较COS组高, IPO组较IRI组低 (P<0.05) 。

与IRI组比较, *P<0.05;与COS组比较, #P<0.05;α-SMA:α-平滑肌肌动蛋白

与IRI组比较, *P<0.05;与COS组比较, #P<0.05;TGF-β1:转化生长因子-β1

与IRI组比较, P<0.05;与COS组比较, P<0.05;CTGF:结缔组织生长因子

3 讨论

肾缺血再灌注损伤随着时间的推移, 肾功能以及肾脏的病理改变会逐步恢复, 但是由损伤导致的肾小管会发生不可逆性改变, 表现为肾小管纤维化, 从而导致肾小管浓缩功能下降, 肾功能不全[1,2,3]。既往的观点认为再灌注期间, 肾小管有很强的增殖修复能力, 缺血再灌注可以完全逆转[4]。但近年来有研究发现, 肾小管上皮细胞的增殖修复能力是有限的, 它依赖于小管细胞存活的数量和基底膜是否完好。一旦损伤程度超过某一临界值, 肾小管的损伤就是不可逆的, 肾小管的结构和功能就不能完全恢复[5]。有研究发现, 中度的肾小管间质纤维化病变虽然没有引起血尿素氮 (BUN) 、肌酐 (Cr) 等指标异常升高, 但是可以破坏肾小管的尿液重吸收功能, 使夜尿增多, 出现蛋白尿[5]。EMT的过程最初被描述是作为在胚胎发育授予原始上皮细胞形成中胚层和原始神经上皮转变为神经脊细胞的能力中的早期事件[6,7]。过去10年, 越来越多的研究表明, EMT是肌成纤维母细胞在纤维化过程中招募的一个重要直接路径:在导致局部因子成分改变的损伤条件下, 成熟的上皮细胞特殊形态消失, 穿过肾小管基底膜到间质, 最终“分化”为肌成纤维细胞表型, 具备合成和沉积细胞外基质能力[8,9]。此外, Iwano等[10]的研究发现, 在肾损伤引起的肾纤维化过程中肾小管上皮EMT起了主导作用。IPO的定义是一系列间断、快速、反复的缺血应用在缺血的器官或组织长期缺血之后, 长时间再灌注之前。IPO有更多的临床应用价值, 许多研究报道证实, IPO可以减轻系统炎症反应, 抑制凋亡分子的表达, 激活内源性保护分子。因此, 本研究利用笔者前期已经建立的体外模型, 研究模拟的缺血后处理对肾小管EMT的影响, 明确在体外IPO是否能减轻EMT。

α-SMA是肌成纤维细胞的标志, 而肌成纤维细胞是成纤维细胞的活化形式, 同时也是细胞外基质胶原成分的主要来源[11,12]。在正常肾组织中α-SMA仅在动脉平滑肌细胞中表达, 而在本研究中可以看到其表达在IRI组随再灌注时间的延长逐渐增加, 且在24 h时最强;而在IPO组表达却随时间延长, 逐渐减弱, 在24 h时表达最弱;说明在体外缺血再灌注损伤也能够诱导α-SMA表达, 诱导肾小管上皮细胞获得间质极性, 以及EMT的发生。缺血后处理可以减轻α-SMA表达。

肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏进行性损害导致肾功能不全的共同通路。TGF-β1被认为是众多的致纤维因子中的重要一个, 它的主要功能为增加细胞外基质的合成, 抑制其降解, 整合素基质黏附分子的上调[13,14]。有许多对TGF-β1/Smad通路的研究发现, 拮抗TGF-β1活化可以减轻肾间质纤维化[14]。Azuma等[15]研究发现, 通过上调TGF-β1可以使肾小管细胞外的基质增加, 说明TGF-β1的持续增高有促进纤维化的可能。本研究中肾小管上皮细胞缺血再灌注后3、6 h TGF-β1表达明显增强, 而缺血后处理显著减弱其激活表达, 表明IPO能够抑制缺血再灌注肾小管上皮细胞内TGF-β1的蛋白表达。

CTGF是一种基质蛋白, 在病理性纤维化中扮演重要角色。体内和体外实验研究证实, CTGF表达于肾小管上皮细胞, 暗示其参与肾脏纤维化和肾小管上皮EMT。CTGF是慢性移植肾病中EMT的潜在生物标志[16,17]。本研究发现, 肾小管上皮细胞缺血再灌注3 h后CTGF表达明显增强, 而缺血后处理能减弱其激活表达, 表明IPO能够抑制缺血再灌注肾小管上皮细胞内CTGF的蛋白表达。