成肌细胞

成肌细胞（共4篇）

成肌细胞 篇1

体外培养的成肌细胞是通过酶消化后从肌肉中分离出来的单核细胞, 具有肌肉形成能力, 进行移植后可以作为一种治疗遗传性肌病和基因转染载体的方法, 但到目前为止尚未取得满意的应用效果。Kuang 等[1]的研究结果显示根据干细胞表达标志分离出来的成肌细胞可以显著提高移植后细胞的存活率。 近些年的研究表明, 从表达分子标记的角度看, 肌肉中不同表型的细胞可以认为是处于静止、激活、增殖及分化等不同的肌肉形成阶段。Pax7特异性地表达在静止和新激活的肌肉卫星细胞中, 具有对干细胞库维持作用[2]。M-cadherin也经常被用来标记肌肉卫星细胞。然而, Wróbel 等[3]的研究提示这种分子参与肌肉卫星细胞的分化。CD34阳性细胞存在于肌肉间充质组织中, 在刚从肌肉中分离出来的细胞中, CD34+/45-肌上皮前体细胞仅表达c-met mRNA, 不表达其它成肌相关的标记分子, 然而3 d后MyoD、Myf-5、M-cadherin和 Pax-7等成肌分子在这种细胞上相继表达[4]。

研究者们经常利用细胞的差速贴壁能力来纯化体外培养的成肌细胞, 但是对其机制尚不明了。我们假设细胞的这种能力不仅与成熟程度有关, 同时也受到细胞物理性状的影响, 由此可以建立一种方法, 即根据某一物理性状来分离纯化具有干细胞特征的肌肉形成细胞。本研究通过2 个部分来验证这一假设。第一部分是将体外培养的成肌细胞按照差速贴壁方法进行传代, 分别在不同的时间点收集细胞。流式细胞仪检测所收集细胞的大小和所含颗粒等物理特征, 以及CD34、 Pax7 、M-cadherin等成肌细胞标记的表达;第二部分是采用多步Percoll密度梯度离心法分离直接从肌肉中获得的单核细胞, 流式细胞仪观察CD34、Pax7 及M-cadherin 阳性细胞的分布特征。

1 材料和方法

1.1 成肌细胞准备

1.1.1 成肌细胞体外培养与传代

常规分离制备7 d龄雄性SD大鼠后肢肌肉组织[5], 分别采用0.2%Ⅱ型胶原酶 (Worthington Biochemicals) 及0.25%胰蛋白酶 (Sigma) 消化, 100目滤网过滤, 离心后收集细胞, 接种在未包被多聚赖氨酸的培养瓶中使细胞预贴壁20 min, 2 次, 去除成纤维细胞。将未贴壁的细胞按照5×104接种在预先包被多聚赖氨酸的培养瓶中, 加入增殖培养基 (Dulbecco's modified Eagle's medium, 加入20%胎牛血清及浓度为100 U/ml的青链霉素, Gibco) 进行体外培养;或者随即进行Percoll密度梯度离心分离。

体外培养的成肌细胞生长到铺满培养瓶底80%左右后传代。在细胞第3 次传代时采用差速贴壁法进行, 分别在20 min、1、2、26 h收获贴壁细胞;并收获在2 h 和26 h未贴壁的细胞, 流式细胞仪检测每组细胞不同成肌分子的表达。

1.1.2 直接从肌肉中分离单核细胞

Percoll密度梯度离心方案采用的是Kästner 等[6]的修订方案, 如图1所示。将含有70%、55%、40%、35%、 25% 和15% Percoll (Amersham Biosciences) 的生理盐水溶液, 各2 ml, 依次置于15 ml 离心管中, 形成六步密度梯度离心体系, 从顶端缓慢加入从肌肉中直接分离出来的细胞混悬液, 室温下1 250 g水平离心20 min后, 分别在不同的密度界面间收集细胞, 如图 1, 包括15%～25%界面及 25%～35%界面, 35%～40%界面间的细胞层次不清, 所以与40%～55%界面间的细胞合并为35%～55%组, 生理盐水洗2 次去除Percoll 颗粒后进行流式细胞仪检测。

1.2 流式细胞仪检测

1.2.1 成肌细胞的分子标记表达

体外培养的第3 代成肌细胞经差速贴壁传代后获得的不同细胞亚群及Percoll密度梯度离心后分离的新鲜肌肉细胞的不同亚群, 按照1×106/ml密度悬于500 μl的PBS中, 分别加入CD34 (Santa Cruz 1∶50) 、Pax7 (R&D SYSTEM, Inc 1∶30) 、M-cadherin (Santa Cruz 1∶50) 一抗, 37 ℃下孵育30 min, PBS清洗2 次, 再加入FITC标记的荧光二抗 (Santa Cruz) , 室温下孵育30 min, PBS清洗2 次, 上流式细胞仪 (BD公司) 检测各组细胞相应的抗体表达, 设立荧光对照。

1.2.2 成肌细胞不同亚群的大小及颗粒分布特征

流式细胞仪可以依据光电系统记录的细胞散射光信号快速检测分析细胞的多物理特性, 即细胞的大小和内部结构。前向角散射 (FSC) 检测的是激光束照射方向与收集散射光信号的光电倍增管轴向方向的散射光信号, 与被测细胞的大小和面积有关。侧向角散射 (SSC) 收集与激光束正交90°方向的散射光信号, 与被测细胞的颗粒密度和内部结构有关。采用流式细胞仪检测差速贴壁的成肌细胞不同亚群在FSC和SSC一定阈值内的阳性细胞比率, 以此反映细胞相应的大小及颗粒分布, 如图 2所示。

a:显示的是1 h贴壁细胞的散点分布图;b, c:显示的随FSC和SSC变化细胞数量分布的柱形图, 各图中分别设立相应的计算阈值

1.3 统计分析

采用四格表卡方检验2 组阳性细胞率是否具有统计学意义, 以P<0.01为标准。

2 结 果

2.1 成肌细胞不同亚群的成肌分子标志表达

流式细胞仪检测差速贴壁传代的成肌细胞不同亚群的成肌分子标志表达结果见表 1。从表 1中可以看出, CD34 阳性细胞主要出现在2 h未贴壁细胞和26 h贴壁与未贴壁细胞中, 而Pax7 阳性细胞主要富集于2 h贴壁细胞中。除了26 h未贴壁细胞, 其余各组细胞中M-cadherin 阳性细胞率均有统计学意义。

(1) 与荧光对照组相比, P<0.01

2.2 成肌细胞不同贴壁亚群的大小及颗粒分布特征

流式细胞仪检测体外培养第3 代的成肌细胞差速贴壁法传代后不同亚群细胞FSC和SSC分布结果见表 2, 从表 2中可以看出快速贴壁细胞在阈值范围内FSC的阳性细胞少, SSC的阳性细胞多, 而贴壁较慢的细胞则反之;26 h后还未贴壁的细胞在阈值范围内FSC、SSC细胞分布更少;说明早期贴壁细胞小, 所含颗粒多, 稍晚贴壁细胞面积大, 所含颗粒少, 26 h后还未贴壁是更为幼稚的细胞。

2.3 不同密度单核细胞的成肌分子标记表达

流式细胞仪检测肌肉细胞不同密度亚群CD34、Pax7 和M-cadherin等的表达, 从未进行分离的总细胞组到35%～55%Percoll界面间细胞组, 结果见表 3。从表 3中可以看出, CD34 和Pax7 阳性细胞主要出现在15%～25% 和 25%～35%Percoll界面间, 而M-cadherin阳性细胞主要富集于25%～35%Percoll界面间, 35%～55% Percoll界面间细胞组中Pax7 、CD34和M-cadherin阳性细胞与对照组相比无统计学意义。

(1) 与荧光对照组相比, P<0.01

3 讨 论

很多研究旨在获得大量的具有干细胞特征的肌肉形成细胞, 在体外培养过程中差速贴壁法常用于肌肉形成细胞的分离纯化。Huard 的研究小组建立了一种以24 h为间隔的序列贴壁技术[7], 肌肉来源的细胞被分为早期贴壁细胞、晚期贴壁细胞和肌肉来源的干细胞。连续3 个24 h贴壁获得的细胞经流式细胞仪检测显示Sca-1 和CD34表达呈阴性, Desmin表达阴性, M-cadherin 的阳性细胞率介于40% 和80%之间; 4 个24 h后仍未贴壁细胞表现为Sca-1和CD34阳性, M-cadherin阴性, Desmin阳性细胞率低于30%。

Rouger 等[8]采用免疫细胞化学染色法检测M-cadherin、 Pax7 和 Desmin的表达来判断细胞的成肌进程, 结果显示早期贴壁细胞M-cadherin阳性细胞率高于晚期贴壁细胞, 而晚期贴壁细胞的Pax7 阳性细胞率明显高于早期贴壁细胞。本实验中流式细胞仪的检测结果显示体外培养传代后的成肌细胞CD34和Pax7 阳性细胞贴壁较晚, 而M-cadherin的阳性细胞在26 h前贴壁的细胞中都有表达。

最近的一些研究结果提示, 细胞的物理性状与它们的成熟度相关。从形态学的观察来看, 肌肉细胞中可以分辩出Round 和 Thick 2 种细胞[9], Round细胞高水平表达Pax7 , 而Thick 细胞表达相应的成肌分化信号。从肌肉中获得的细胞也表现出细胞大小的差异, 从4～10 μm不等[10], 并与特定的成肌分子标记表达相关。本研究中流式细胞仪对肌肉细胞FSC和SSC的分析显示, 细胞贴壁的速度与其大小及所含颗粒状态有关, 由此推测可能与细胞密度相关。

密度梯度离心是一种按照细胞密度分离不同细胞亚群的方法。Kastner 等[6]采用五步密度梯度离心法分离在体外培养8 d的肌肉卫星细胞, 以MyoD/MEF2A作为阳性细胞标志, 结果发现在55% Percoll组分中阳性率最高, 而在25%～35% 和35%组分中阳性率显著降低。这些年来研究者们逐渐认识到Pax7 和CD34阳性细胞比MyoD/MEF2A 阳性细胞更加具有干细胞特征[11]。因此我们增加15% Percoll 组分, 以分离更具有干细胞特征的肌肉形成细胞, 结果显示Pax7 和CD34阳性细胞主要富集于15%～25% 和25%～35% Percoll 界面间;而处于稍晚成肌阶段, 表达 M-cadherin的阳性细胞主要富集于25%～35% Percoll 界面间;表达这些标志的阳性细胞在35%～55% Percoll 界面间的细胞中均为阴性。因此, 可以采用15%～25% Percoll 密度梯度离心法快速分离肌肉来源的干细胞。

参考文献

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成肌细胞 篇2

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康成年雄性SD大鼠 (体质量280~320 g, 辽宁医学院动物实验中心提供) , 标准饲料喂养, 自由摄取水和食物, 普通光照。

大鼠Shh、Ptc1及Gli1引物 (上海生工生物工程技术有限公司) ;兔抗desmin、Shh、Gli1及Ptc1一抗 (武汉博士德生物工程有限公司) ;CY3标记的羊抗兔二抗 (Chemicon, 美国) ;PVDF膜 (Millipore公司) 。

1.2 仪器与设备

Z233MK-2超速冷冻离心机 (德国Eppendorf公司) ;Ultrospec 2100pro型紫外/可见分光光度仪 (Amersham Biosciences公司) ;凝胶成像分析系统 (美国Bio Rad公司) ;DYY-Ⅲmini型电泳仪 (北京六一仪器厂) 。

1.3 实验方法

1.3.1 成肌细胞的分离培养及传代

参考BAE等的研究方法[6], 取大鼠大腿部骨骼肌标本, 将其剪成1~2 mm3的碎片, 用混合酶消化液 (2.4 u/m L的dispase、1%的CollagenaseⅡ和2.5 mmol/L的Ca Cl2) 在37℃条件消化45min。加入2倍体积的含10%FBS (GIBCO-BRL) 的DMEM液中止消化。200目筛网过滤, 1500 r/min离心5 min, 生长液重悬。生长液组成:50%DMEM、50%Ham's F-10、20%FBS、2.5 ng/m L b FGF、20 mmol/L L-Glutamine和1%青链霉素。调整细胞浓度后, 以5×105个/m L浓度接种于涂有0.1%Poly-L-Lysine的直径为6 cm的培养皿。放入37℃、5%二氧化碳 (CO2) 孵箱中培养。采用有限稀释法[7]对所得原代培养细胞进行克隆培养, 选取Desmin免疫细胞化学染色阳性的单细胞克隆进行扩增培养。实验选用第3代细胞。

1.3.2 RT-PCR法检测成肌细胞中Shh、Ptc1及Gli1m RNA的表达

RT-PCR分析:用Trizol试剂提取诱导前、后骨骼肌干细胞的总RNA, 紫外吸收定量后, 取2μg的RNA样品用于后续的RT-PCR反应。RT-PCR采用的试剂盒为Ta Ka Ra公司的Bca BestTMRNA PCR Kit Ver1.1, 分反转录和PCR两步反应。以反转录生成的c DNA为模板, 以针对大鼠Shh上游引物5'-GGCTGGATTCGATTCGACTGGGTCTACTA-3'和下游引物5'-AACTTGGTGCCACCCTGCTC-3', Ptc1上游引物5'-TTGAACGGTGGATGTCAAGGTTTA-3'和下游引物5'-CATGGTTTGCAGGGCATGAG-3', 以及Gli1上游引物5'-GAGAGACTGCTTCATTTCC-3'和下游引物5'-TCGGGTAGGGCTTCTTGCT-3'进行PCR扩增。反应条件:94℃变性5 min, 然后依次94℃1 min, 58℃1 min, 72℃1 min。经过30个循环, 最后72℃10 min。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.3成肌细胞中Shh、Ptc1及Gli1蛋白免疫荧光细胞化学染色

成肌细胞接种于预先置有盖玻片的24孔板, 培养3 d, PBS缓冲液冲洗3次, 4%多聚甲醛固定30 min, PBS缓冲液洗涤3次;0.3%Triton-X-100破膜30 min, PBS缓冲液洗涤3次;正常血清封闭20 min, 吸去血清, 不洗;分别加入兔抗大鼠desmin、兔抗大鼠Shh (1︰100) 、兔抗大鼠Gli1 (1︰200) 及兔抗大鼠Ptc1 (1︰200) 一抗, 对照组用PBS液代替一抗, 4℃过夜, PBS缓冲液洗涤3次;加入羊抗兔二抗-Cy3 (1︰200) 室温孵育2 h, 50%甘油封片, 激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.3.4 Western blotting法检测成肌细胞中

Shh、Ptc1及Gli1蛋白表达0.25%胰酶消化细胞, 100μL蛋白裂解液, 加入1μL蛋白酶抑制剂, 超声破碎, 离心后提取蛋白, 考马斯亮蓝法测蛋白浓度, 蛋白上样量为60μg, 体系为20μL, 配制10%或8%聚丙烯酰胺凝胶, 煮样后电泳转膜封闭 (5%脱脂牛奶) , 一抗4℃孵育过夜 (各抗体均为1︰1 000稀释) , 洗膜45 min, 加入过氧化物酶标记的二抗, 室温孵育2h, 化学发光法检测。

2 结果

2.1 细胞培养及其纯化

在原代培养的第2天可见培养皿底有梭形细胞出现, 随着时间的延长, 梭形细胞数量逐渐增多, 成簇排列, 到第10~14天时见梭形或纺锤形细胞已占皿底面积的70%~80%, 其中含有少量呈多形性的细胞, 传代后的细胞生长速度较快, 平均每5~7天传代1次。克隆培养的细胞在大约2~3周后长满96孔培养板中的小孔, 转移到24孔、6孔板及25cm2培养瓶时生长较快, 约3~5 d转移1次。细胞形态均一, 呈梭形 (见图1) 。克隆培养的免疫细胞化学染色鉴定, 阳性为细胞核蓝染, desmin阳性着色于细胞浆, 呈均匀红色, 所有的细胞均呈desmin免疫反应阳性 (见图2) 。

2.2 成肌细胞中Shh、Ptc1、Gli1 m RNA的表达

RT-PCR产物经2.0%琼脂糖电泳, 结果显示目的条带清晰, 没有杂带, 证实成肌细胞有Shh、Ptc1及Gli1 m RNA的表达 (见图3) 。

2.3 成肌细胞中Shh、Ptc1及Gli1蛋白的表达

免疫荧光细胞化学染色结果显示大鼠成肌细胞有Shh (见图4) 、Ptc1 (见图5) 及Gli1 (见图6) 蛋白的阳性表达, 免疫阳性着色部位位于细胞浆内, 呈现均匀一致的红色荧光, 而细胞核内未见阳性着色。Western blotting也检测到成肌细胞表达Shh、Ptc1及Gli1的蛋白条带。

1~4分别为Shh、Ptc1、Gli1和β-actin的c DNA产物

3 讨论

Shh基因是hedgehog (hh) 基因家族成员之一, 于1980年在果蝇中被发现, 编码一种高度保守的分泌型糖蛋白。在哺乳动物中, HEDGEHOG[8]基因家族至少含有Shh、Ihh、Dhh 3种成分, 分别编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。Shh蛋白是早期胚胎发育的成行素, 与左右不对称性、中枢神经系统和体节的背腹模式及肢体和其他器官的发生和发育有关, Shh决定细胞命运, 促进增殖, 抑制神经细胞的分化, 调控血管的生长和发育, 影响基质细胞分泌众多的血管新生因子等。在脊椎动物, Shh信号传递通路由Shh、Patched (Ptc) 、Smoothened (Smo) 、Hedgehog-interactingprotein (Hip) 、Vitronectin、丝氨酸/苏氨酸激酶fused (Fu) 、Suppressoroffused (Su[Fu]) 、Costal2 (cos2) 、蛋白激酶A (PKA) 以及下游的锌指转录因子Gli蛋白 (Gli1、Gli2和Gli3) 等组成。

Shh受体Ptc由肿瘤抑制基因Patched编码, 是由12个输水跨膜结构区和两个较大的胞外环状结构构成的单一肽链, 能与配体直接结合, 对Shh信号起负调控作用。在脊椎动物中存在2个Ptc的同源基因:Ptc1和Ptc2, 两者与Shh的亲和力相似。其中, Ptc1受Shh信号上调, 缺陷时将失去对靶细胞内靶基因表达的抑制作用;Ptc2可与Shh同时表达, 其转录不依赖于Shh[9]。

Ci蛋白是一种比较大的多功能转录因子, 存在于果蝇中。Gli蛋白是Ci的类似物, 在脊椎动物中, Gli至少由Gli1、Gli2、Gli3 3种成分组成, 主要分布于胞浆内, 部分固定于微管。

成肌细胞是指胞浆中含有肌丝的肌组织前体细胞, 来源于中胚层干细胞, 在胚胎发育过程中先由间充质细胞分化为成肌细胞, 然后分裂、融合成多核肌纤维, 形成肌小管, 再进一步分化为成熟的骨骼肌细胞。成肌细胞具有自我更新和促进肌纤维再生的能力, 研究发现, 成肌细胞具有多系分化潜能, 可向骨骼肌、骨、软骨脂肪、内皮、造血及神经方向分化[10,11,12]。其应用于组织器官再生、修复的研究正在广泛开展。

本实验利用RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学染色等技术检测到大鼠成肌细胞共表达Shh、Ptc1及Gli1, 蛋白表达位于细胞浆。结果表明Shh信号通路存在于成肌细胞中。该信号通路在大鼠成肌细胞的增殖、分化及转分化中是否起作用, 还需进一步的深入研究。

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成肌细胞 篇3

1 材料和方法

1.1 细胞培养

C2C12成肌细胞系购于美国ATCC,冻存、复苏后培养于含有10%胎牛血清高糖DMEM培养基(Gibco公司),置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的二氧化碳培养箱中(Forma Scientific,美国),隔天换液1次。当细胞相互汇合达到约80%的生长密度时,用2.5 g/L胰蛋白酶消化分散细胞,以1∶3比例传代进行次代培养,并留取适当细胞冻存。

1.2 应力加载及分组

美国Flexercell公司生产的细胞柔性基底加载装置(FX 4000tension)的作用机理是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜,形成负压而使培养膜产生拉伸应变,从而使黏附生长的细胞受到张力的作用,细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率(%),可以施加0%～20%细胞表面拉伸率。根据本实验要求,我们对细胞分别施加0%、5%、10%、15%和20%/10cycles/min的力,即细胞拉长3s,放松3 s共6 s为1个周期,每分钟10个周期。施力时间为24 h,整个加力过程中细胞均在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下培养。分5组:第1组细胞拉伸率0%(对照组),24 h;第2组:细胞拉伸率5%,24 h;第3组:细胞拉伸率10%,24 h;第4组:细胞拉伸率15%,24 h;第5组:细胞拉伸率20%,24h。

1.3 台盼蓝拒染细胞计数法

细胞首先等量稀释,取1/10用于细胞计数。

1.4 MTT比色实验

将上述实验的细胞消化离心后,稀释接种至96孔培养板中,每个处理孔接种3孔,每孔体积200μL。在孵箱中37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下培养4 h待细胞贴壁而又不发生增殖。每孔加入MTT溶液20 m L,37℃继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入150 m L的DMSO,震荡10 min,使甲瓒充分溶解。比色:用Synergy HT多功能酶标仪选择490 nm波长,测定光吸收值(A),比较各组之间细胞的相对数目。

1.5 Western Blot

提取总蛋白,定量,SDS-PAGE电泳,转膜,封闭,一抗孵育,二抗孵育,蛋白检测。

1.6 DNA La dde r收集含凋亡细胞的细胞

裂解细胞:加400μL细胞裂解液,充分混匀再加蛋白酶K100μL,置65℃水浴消化2 h或过夜;蛋白处理:加75μL 8 mol/L的醋酸钾,4℃15 min,再加750μL氯仿,充分混匀后,10 000 r/min离心10min后,将上清移至一新的Eppendorf管中;沉淀、洗涤、溶解DNA、测定DNA浓度;2%琼脂糖凝胶电泳80 V 2 h。

1.7 统计方法

电泳结果用BIO RAD凝胶成像系统拍照,BIO RAD Quantity One 4.4软件分析电泳条带光密度值。SPSS11.0统计软件,ANOVA方差分析。

2 结果

2.1 细胞活力检测结果

对体外培养成肌细胞在施加不同条件的牵张应力后,台盼蓝拒染实验和MTT法检测细胞的存活情况,MTT结果显示(图1)低幅度的拉伸力(5%和10%)使得细胞存活数目增多(5%拉伸条件下细胞数目较10%多,P>0.05),而随着拉伸力的增加,细胞数目转而出现下降,当拉伸条件为15%及20%时,细胞数目显著降低并低于对照组(P<0.05)。

2.2 P ARP剪切实验

Western Blot结果显示不同条件下,随着牵张应力的增大,剪切型的PARP逐渐增多,提示凋亡细胞逐渐增多。图2为利用BIO RAD Quantity One4.4软件分析电泳条带光密度值统计图。

2.3 DNA la dde r实验

DNA ladder实验显示当应力作用大于15%时凋亡特征的带型逐渐出现,并且随着拉伸幅度的增加,凋亡带型越来越明显。该结果提示在较强拉伸应力作用下,通过细胞凋亡引起细胞数目的减少。

3 讨论

颌骨牵张成骨过程是颌面软硬组织的适应性改建及平衡以期修复创伤和整复畸形的过程。从微观而言,各种细胞受到一系列精密而复杂的分子调控从而表现为增殖、分化、凋亡等一系列细胞学行为[2]。

成肌细胞是肌组织的前体细胞,在骨骼肌的稳态维持和肌肉组织创伤修复过程中扮演十分重要的作用。这类成肌细胞在组织原位为卫星细胞,正常状况下肌卫星细胞处于相对静止和转录不活跃状态,但当机体遇到生长、重塑或肌肉损伤等刺激时,卫星细胞就被激活,增殖并分化成肌肉细胞[3]。这些细胞再融合进已存在的骨骼肌纤维中,或者彼此融合,形成新的肌纤维。而细胞系C2C12具有与成肌细胞类似的生物学行为和特征,常被用来进行成肌细胞功能学的实验[4]。

细胞增殖、分化、凋亡是器官发生和组织床上修复和重建的重要的细胞行为,在应力条件下组织合理的重建对于矫形医学至关重要。在组织重建过程中,笔者一方面需要通过细胞增殖实现对缺损和损伤组织的修复,另一方面增殖的细胞又必须是有功能的,也就是说,新增殖的细胞必须经过成熟分化,否则这种增殖是无意义的[5]。

细胞凋亡是一个主动参与并受控于基因指导下的死亡过程[6]。至今,仍没有一个可靠的判断凋亡的生物化学标志,电镜下凋亡细胞的形态特征仍然是确定细胞凋亡最可靠的定性方法。细胞凋亡的形态特征有:(1)凋亡起始:该时期特征主要为:骨架杂乱,细胞间接触消失,细胞间黏附力下降;细胞质和核浓缩,显微镜下观察可发现细胞膜发泡,染色质凝集,沿着核膜形成新月形帽状结构;内质网腔膨胀,核糖体从内质网上脱落,伴随着这些变化凋亡小体逐渐形成。(2)凋亡小体形成:随着细胞膜内折,染色质断裂成片断,染色质片断及线粒体等细胞器反折的细胞膜包围并逐渐分开,形成单个的凋亡小体。(3)凋亡小体消失:凋亡小体被邻近的细胞或巨噬细胞识别吞食及消化。单个细胞凋亡过程一般较快,从凋亡开始到凋亡小体形成不过几分钟的时间,整个组织凋亡过程大约持续几个小时。在组织重建过程中,细胞的凋亡也是必不可少的,因为有些丧失功能的细胞以及非必须部位的细胞必须通过细胞凋亡的方式清除掉。总的来说,细胞增殖、分化、凋亡的和谐统一是组织重建的需要。为此,在临床实践过程中,必须采用适当大小和频率的牵张力,使得细胞的增殖、分化和凋亡向着需要的方向发展。本部分的实验提示,只有当外界牵张力处于不同范围时,细胞倾向于不同的增殖、分化、凋亡的命运。换言之,在临床牵张成骨过程中,根据治疗的不同阶段,选择不同的牵张应力,可能对于提高临床疗效具有重要意义。

本研究检测了凋亡通路的一个重要分子PARP的检测。PARP在DNA受损时被激活,PARP的激活与DNA的损伤程度呈正相关,DNA损伤后诱发聚ADP糖基化反应,再由另一种PARP甘油水解酶将多ADP-核糖长链降解。经过这种ADP-核糖循环机制,PARP在DNA的损伤修复、DNA复制、细胞增殖分化调控、细胞凋亡、基因组的稳定方面发挥着重要的作用。Caspase-3可以将分子量为116 kD的PARP水解,其中的85KD降解产物已被证实可看作是Caspase-3介导的细胞凋亡的早期标志性产物。因此,本实验通过对每组细胞剪切型的PARP的蛋白含量的测定,间接反映出Caspase-3活性的变化,可以推测Caspase-3在应力引起的成肌细胞凋亡过程中起着重要作用,这可能是应力条件下细胞凋亡的重要信号通路[6,7,8]。

尽管如此,本部分实验只是体外的细胞学实验,具有一定局限性[9]。首先,本部分实验仅仅采用C2C12细胞系,该细胞系被认为是成肌细胞,而它能否代表体内绝大多数的终末分化的肌肉细胞,需要进一步实验证明[10]。其次,在临床实践过程中,矫形力的作用十分复杂,除了对组织的拉伸以外,更有对组织的压迫作用[11],以及组织拉伸后,其后方组织空间位阻的减少,这些力学行为下细胞行为的改变都值得在今后进一步研究。

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成肌细胞 篇4

黄芪(Radix Astragali)又称为黄耆,是豆科多年生草本植物,有蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge var mongholicus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge。分离黄芪,初步提取得到黄芪总黄酮(Total Flavonoids of Astragalus,TFA)、黄芪总皂苷(Total Saponins of Astragalus,TSA)和黄芪总多糖(Total Polysaccharides of Astragalus,TPA)三种成分(见图1)。黄芪总黄酮(TFA)能直接清除超氧阴离子自由基O-·2和羟自由基·OH,有效防止活性氧所致细胞膜损伤。黄芪注射液中分离纯化出14个化合物,6个异黄酮化合物、1个9,10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D吡喃葡萄糖、1个2’-羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-吡喃葡萄糖、另外6个黄芪皂苷类化合物[1,2]。国内外均致力于动物心肌细胞和骨髓间充质细胞研究[3,4,5]。本实验首次通过模拟生物有机体自由基损伤,在体外摸索黄芪注射液修复过氧化氢对大鼠成肌细胞损伤的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

L6大鼠成肌细胞株(L6 rat myoblast cell),购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂:

胎牛血清(Fetal bovine serum)购自GIBCO公司;胰蛋白酶(Trypsin)、青霉素(Penicillin G sodium salt)、链霉素(Streptomycin sulfate)、RNase、PI(Propidium iodide)均购于Sigma公司;BA0315Bax、BA0412Bcl-2抗体购自Boster公司。

1.1.3 主要仪器:

SANYO公司生产的MLS-3020灭菌锅和MCO-17AIC二氧化碳培养箱;苏州安泰空气技术有限公司生产的SW-CJ-2C超净工作台;日本生产Nikon荧光倒置显微镜;美国宝特Bio-Tek ELX800 全自动酶标仪;美国BD公司生产的流式细胞仪。

A黄芪总黄酮total flavonoids of Astragalus;B黄芪总皂苷total Saponins of Astragalus;C黄芪总多糖total polysaccharides of Astragalus。

1.1.4 培养基:

DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagel Medium)购自GIBCO公司。

1.2 方法[6]

1.2.1 细胞传代培养和H2O2损伤L6大鼠成肌细胞模型:

1.2.2 黄芪注射液对L6大鼠成肌细胞的增殖和H2O2化学损伤的修复:存活率(%)=(实验组OD值/ 对照组OD值)×100%

1.2.3 流式细胞仪检测

收集L6大鼠成肌细胞浓度至1×105以上。0.25%胰酶消化细胞90s。形成L6成肌细胞悬液。移入1.5mL离心管,离心1 000r/min,5min。弃去上清液。形成0.1mL 的L6大鼠成肌细胞株。加入预冷的无水冰乙醇1mL ,4℃固定30min,离心1 000r/ min,5min。去乙醇,用PBS洗2次,形成0.1mL 的L6成肌细胞悬液。加0.1mL RNase,37℃水浴40min。4℃终止反应。加PI均匀染色30min,用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。

1.2.4 SABC-cy3免疫细胞化学荧光染色法检测Bcl-2和Bax

将收集的各组细胞用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定30min,0.01mol / L PBS洗2min,重复3次;山羊血清封闭液室温10min,甩去多余液体。滴加一抗(1:200)孵育1～2h,37℃,PBS洗2min,重复3次;滴加二抗孵育30min,PBS洗2min,重复3次;滴加PBS 1:100稀释的SABC-cy3染色30min,PBS洗5min,重复4次。对样品进行荧光镜检,激发波长554nm,发射波长568～574nm,L6大鼠成肌细胞呈鲜红色。取2块培养板的各4个象限视野共计8个样本,计算阳性细胞数作为定量依据。

1.3 统计学处理[6]

应用SPSS 15.0统计软件处理相关数据。都采用平均数±标准差undefined,组间比较用t检验。P<0.05,统计学上有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 不同浓度H2O2的损伤模型

正常的L6大鼠成肌细胞呈梭形或纺锤形,细胞核圆形或椭圆形。经H2O2损伤的细胞形态发生明显变化,且随着H2O2浓度增加,异常形态成肌细胞数目增加并有大量细胞凋亡(见图2)。采用MTT法检测成肌细胞存活率和凋亡率。通过对结果的分析发现细胞经过H2O2损伤后其存活率明显降低。随着实验采用0.05、0.1、0.5、1mmol/mL的H2O2增加,大鼠成肌细胞的存活率明显从45.1±4.5%降至13.6±2.3%。

2.2 黄芪注射液对L6大鼠成肌细胞增殖影响

实验发现剂量2 000、1 000、500、250、125、62.5mg/mL黄芪注射液对L6大鼠成肌细胞生长有明显促进作用。且浓度为500mg/mL黄芪注射液对细胞促进作用最为显著(图3)。

2.3 黄芪注射液对H2O2 损伤L6大鼠成肌细胞存活率和凋亡率

以0.1mmol/L H2O2制作L6大鼠成肌细胞损伤模型作为研究对象,检测发现对正常细胞有较好增殖作用剂量为1 000、500、250mg/mL黄芪注射液,对损伤模型保护修复作用也较强。实验发现三种不同剂量黄芪药物保护的细胞存活率为64.5±4.8%～82.2±9.6%,比模型组32.6±3.8%提高,其中保护效果依次是250mg/mL>1 000mg/mL>500mg/mL黄芪注射液(见表1)。并且三种不同损伤浓度应用中成药物保护修复效果呈现同样的规律。

a对照组Control group;b与对照组比较P<0.05 bcompared with control group P<0.05;c与模型组比较P<0.05 ccompared with model group P<0.05。

A:对照组Control group;B:0.05 mmol/L H2O2;C:0.1 mmol/L H2O2;D:0.5 mmol/L H2O2;E:1.0 mmol/L H2O2;F:各组成肌细胞存活率比较Comparison of myoblast cell viability of the various group.a对照组a;b与对照组比较b

用流式细胞仪检测L6大鼠成肌细胞各周期的DNA含量。结果显示,0.1mmol/L H2O2化学损伤细胞各周期的时相发生改变,在二倍体峰前出现了亚二倍体峰,DNA合成前期(G1)、S期细胞从19.39%减少到1.63%,G2+M期细胞从22.11%增加到41.89%,出现细胞凋亡。DNA合成减少,大量细胞堆积在G2+M期,H2O2损伤促使大量细胞进入分裂期,抑制其增殖。用黄芪注射液保护修复后,细胞存活率增高,从模型组的32.6±3.8%增加到64.5±4.8%～82.2±9.6%之间。模型组保护修复效果最好是250 mg/mL剂量黄芪注射液(图4)。经黄芪注射液处理细胞G1,S期细胞增加,而G2+M细胞减少,说明药物对细胞损伤有显著的保护修复作用。模型组细胞凋亡率32.45%说明H2O2对细胞损伤作用明显,而经过药物保护作用后细胞凋亡率减少到2.96±0.5%～9.29±2.7%之间,说明三种剂量药物均有保护修复机能。且结果与MTT法检测统计存活率的结果相一致。

2.4 SABC-cy3荧光免疫细胞化学染色法检测Bcl-2和Bax

通过荧光免疫细胞化学染色法检测到H2O2化学损伤模型组细胞凋亡抑制因子bcl-2表达减少,凋亡促进因子bax表达增加,即细胞凋亡增加。而黄芪注射液能够阻遏这一现象。经黄芪注射液保护修复的L6大鼠成肌细胞和模型组相比较,凋亡抑制因子bcl-2表达增加,而凋亡促进因子bax表达减少,即凋亡减少了。该结果与流式细胞仪检测是一致的,依次是250mg/mL>1 000 mg/mL>500 mg/mL黄芪注射液。Bcl-2阳性细胞数从模型组33.6±4.1增高至黄芪保护组57.7±4.3～74.2±6.9,而Bax阳性细胞数从模型组80.6±7.2减少到黄芪保护组42.3±4.0～60.2±5.1(见表2和图5、6)。采用黄芪注射液保护修复细胞Bcl-2阳性细胞数较模型组有所升高,但是达不到对照组的水平;Bax阳性细胞数较模型组减少,但是仍然高于对照组。

只有DNA发生断裂才出现此峰,即峰1:亚二倍体峰;峰2:G1期DNA峰即二倍体峰;峰3:G2期+M期峰。This peak only DNA breaks Peak 1:hypodiploid peak;Peak2:G1phase DNA peak diploid peak;Peak 3:G2phase+M phase peak.A:对照组:G1(峰2)=58.50%,G2(峰3)=22.11%,S=19.39%,AP=0.A:Control group:G1(peak 2)=58.50%,G2(peak 3)=22.11%,S=19.39%,AP=0.B:0.1mmol/L H2O2损伤模型:G1(峰2)=56.47%,G2(峰3)=41.89%,S=1.63%,AP=32.45%.B:0.1mmol/L H2O2injury model:G1(peak 2)=56.47%,G2(peak 3)=41.89%,S=1.63%,AP=32.45%.C:黄芪高浓度(1000 mg/mL):G1(峰2)=47.82%,G2(峰3)=25.44%,S=26.74%,AP=6.73%.C:astragalus high concentration(1000 mg/mL):G1(peak 2)=47.82%,G2(peak 3)=25.44%,S=26.74%,AP=6.73%.D:黄芪中浓度(500 mg/mL):G1(峰2)=46.21%,G2(峰3)=24.55%,S=29.24%,AP=9.29%.D:astragalus medium concentration(500 mg/mL):G1(peak 2)=46.21%,G2(peak 3)=24.55%,S=29.24%,AP=9.29%.E:黄芪低浓度(250 mg/mL):G1(峰2)=54.70%,G2(峰3)=24.90%,S=20.40%,AP=2.96%.E:astragalus low concentration(250 mg/mL):G1(peak 2)=54.70%,G2(peak 3)=24.90%,S=20.40%,AP=2.96%.

A:对照组Control group;B:0.1mmol;C:250 mg/mL黄芪astragalus+0.1mmol/L;D:500mg/mL黄芪astragalus+0.1mmol/L;E:1 000mg/mL黄芪astragalus+0.1mmol/L。

A:对照组Control group;B:0.1mmol;C:250 mg/mL黄芪astragalus+0.1mmol/L;D:500mg/mL黄芪astragalus+0.1mmol/L;E:1 000mg/mL黄芪astragalus+0.1mmol/L。

3 讨论

H2O2是有机体氧化代谢的产物,可由超氧阴离子自发岐化生成,并能进一步生成羟自由基。H2O2易穿透细胞膜到达细胞内位点,也可作用于膜脂质形成脂质过氧化物,导致细胞膜损伤,还可通过脂质过氧化物分解代谢产物丙二醛(MDA),促使蛋白质交联聚合反应引起细胞损伤[6]。本实验利用H2O2损伤作为模型,是因为H2O2是有机体氧化代谢产物,同时是一种活性氧,氧自由基化学性质活泼,破坏机体正常氧化/还原的动态平衡,造成生物大分子(核酸、蛋白质、脂质)氧化损伤,干扰正常的生命活动,形成严重的氧化应激。与国内外其他学者应用各种浓度的H2O2模拟体内化学损伤的结果是一致的,即随浓度增加,损害也增大[7,8]。

以阳性细胞数计算;a对照组;b与对照组比较P<0.05;C与模型组比较P

<0.05.Positive cells;acontrol group;bcomparison with the control group,P<0.05;ccompared with model group,P<0.05.

Bcl-2基因为原癌基因,它可以抑制细胞程序性死亡。其作用机理:(1)抑制Ca2+ 释放。(2)促凋亡基因信号被阻止传递,或诱导基因产物被阻止而发挥抗细胞凋亡机能。(3)通过抗凋亡来抑制自由基,同时具有抗氧化剂作用,抑制超氧化物产生而抑制细胞凋亡发生[9,10]。细胞凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离,细胞质浓缩,细胞膜和核膜皱曲,核断裂形成片段,最后形成数量不等的凋亡小体。流式细胞仪可以进行DNA含量分析,通过二倍体细胞G0 /G1期峰值前的亚二倍体峰来检测。黄芪注射液能够减少H2O2产生亚二倍体峰值,保护成肌细胞的效果依次为250mg/mL>1 000mg/mL>500mg/mL。

p38通路是真核生物中已经确定的MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号转导通路中的一条[11,12]。MAPK家族在细胞分化、发育、存活及死亡等生理过程中发挥着重要调节作用。目前已经发现p38 MAPK有4个异构体,它们分别为p38α、p38β、p38γ和p38δ。p38信号转导通路可简化为:H2O2、脂多糖(LPS)等→PAK(p21活化蛋白激酶)→MLK→MKK3/MKK6→p38 MAPK→细胞因子表达。p38可被应激刺激(紫外线、H2O2与缺氧等)、炎性因子(TNF-α、IL-1和IL-6等)、LPS及革兰氏阳性细菌细胞壁成分激活。本实验MTT检测、流式细胞仪及荧光抗体Bax和Bcl-2的结果均表明黄芪注射液对大鼠成肌细胞H2O2损伤经由p38MAPK信号通路修复保护。

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