肿瘤形态（精选3篇）
肿瘤形态 篇1
近年来,河南省信阳地区鸡的肿瘤性病例不断增多,并且恶性肿瘤比良性肿瘤多见。这不仅给养鸡业造成了严重的经济损失,同时也给鸡肉及其制品质量安全和人的食品卫生带来严重威胁。笔者分别从信阳市养鸡场(户)送检的病鸡中和屠宰检疫中收集鸡肿瘤性病例38例,通过大体剖检和病理切片技术进行病理形态学观察,并作出准确的病理学诊断,现报道如下。
1 材料
共收集鸡肿瘤病例38例,其中9例来自屠宰场和集贸市场,29例来自养鸡场。分别采取病鸡体表肿瘤疑似物、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、胃肠、肾脏、性腺等备用。
10%中性福尔马林溶液、二甲苯、梯度乙醇溶液、苏木素染液、醇溶性伊红染液、中性树胶等,实验室自备。
2 方法
所检病例首先通过大体剖检,然后切取小块肿瘤疑似物,在10%中性福尔马林溶液中固定,石蜡包埋切片,H.E.染色,显微镜下进行病理形态学观察。在收集病例的同时登记病鸡的品种、性别、发病年龄及病鸡的发病情况,以便进行病因分析,探讨其发病原因和防控措施。
3 观察结果
通过大体剖检和切片镜检进行病理形态学分析,38例肿瘤病例中共检出7种不同的肿瘤,包括鸡马立克氏病、鸡淋巴细胞白血病、鸡卵巢腺癌、鸡小圆形细胞肉瘤、鸡间皮瘤、鸡骨骼肌瘤、鸡肠系膜脂肪瘤等,几种鸡肿瘤病的病理形态学特征见295页彩图1,其中A系列为眼观病变,B系列为显微组织学病变(H.E.,10×40)。现将各种肿瘤病鸡的发病情况和病理形态学变化特点描述如下。
3.1 鸡马立克病
3.1.1 发病情况
38例病鸡中共检出鸡马立克氏病21例。其中3月龄以下病例1例,3~6月龄病例16例,7~12月龄病例3例,12月龄以上病例1例。本地土杂鸡发病率较低(占比3/21),外来品种鸡发病率显著偏高;雌性病例居多(占比18/21)。鸡马立克氏病可根据临床表现分为神经型、内脏型、皮肤型和眼型等四种类型。21例病例中,除没有发现眼型病例外,其余三型均有,其中有2例为神经型,死前出现翼、肢麻痹,翅膀下垂,站立不稳,两腿前后伸展,呈“劈叉”姿势;有4例为皮肤型,病鸡皮肤上形成大小不等、数量不一的丘状肿块;其余15例均为内脏型,患鸡死前表现为精神沉郁,腹部膨大。
3.1.2 病理变化
剖检见神经型病鸡腰荐神经丛一侧性肿大变粗,皮肤型病鸡皮肤上形成大小不等、数量不一的丘状肿块,肿块多以毛囊为中心,主要分布在耳部周围、颈胸、大腿周围等处皮肤,个别病例胸肌上形成单个或多个灰白色肿瘤结节,切面呈鱼肉色。内脏型病例可见多个内脏器官出现肿瘤性病变,其病变呈灰白色结节状,质脆易碎,可见于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、性腺、腺胃和肠等器官组织上,肝脏、脾脏病变最为多见(见295页彩图1A1)。
镜检见各内脏器官的组织学变化均以淋巴组织增生和形成肿瘤性病变为主要特征。各脏器的肿瘤病变基本相同,主要表现为淋巴样细胞的弥漫性或局灶性增生与浸润(见295页彩图1B1),肿瘤细胞病理核分裂象多见;受侵害的组织还伴有出血、细胞变性或坏死等变化。
3.2 鸡白血病
3.2.1 发病情况
38例中共检出鸡白血病7例,全为母鸡。6月龄以下病例1例,6~12月龄病例5例,12月龄以上病例1例;7例中有艾维茵父母代肉种鸡3例,有罗曼褐蛋鸡2例,肉蛋兼用型黄羽鸡1例,本地土杂鸡1例。患病鸡死前精神不振,喜欢蹲卧,体格消瘦但腹部肥大,触摸病鸡腹部透过腹膜可摸到肿大的肝脏。
3.2.2 病理变化
剖检可见病变主要侵害肝脏,剖开腹腔可见肝脏极度肿大,几乎布满整个腹腔。病变肝脏多呈一致性肿大,表面粗糙,隐约可见灰白色斑点(见295页彩图1A2)。少数病例病变肝脏呈局灶性肿大,见粟粒大至碗豆大的灰白色圆形肿瘤样结节。瘤组织切面呈灰白色,均质,肝实质脆弱易碎。少数病例可见脾脏、肾脏、心脏、法氏囊肿大,有大小不等、数量不一的灰白色圆形肿瘤结节。
镜检见肝脏的组织学变化均以大量肿瘤细胞增生和浸润为主要特征,瘤细胞在肝脏组织中成片聚集或呈散在性分布,细胞形态、大小由较一致的淋巴样细胞(成淋巴细胞)构成,其胞浆少,呈强嗜碱性,核大而浓染,有核分裂象(见295页彩图1B2)。受侵的脾脏、肾脏、心脏、法氏囊等肝脏外组织也呈现为淋巴样细胞增生和浸润。
3.3 鸡卵巢腺癌
3.3.1 发病情况
38例中共检出鸡卵巢腺癌4例,其中有3例为外来品种罗曼褐蛋鸡,1例为本地土杂鸡,4例均为成年鸡。患鸡初期无明显症状,后期表现为渐进性消瘦,冠、髯和可视黏膜发白,产蛋逐渐减少直至停产。
3.3.2 病理变化
剖检见病鸡消瘦,腹围增大,腹腔内蓄积有大量的淡黄或黄色腹水。卵巢中有大小不等、数量不一的原发性肿块,小的有绿豆大,大的则有核桃大。肿块呈灰白色团块状或菜花状,质地较硬,其表面粗糙不平,无光泽也无包膜,呈细颗粒状(见295页彩图1A3)。多数病例卵巢都伴有慢性卵巢炎病变,主要表现为卵子变性,呈灰白色、褐色、淡绿色或铅黑色椭圆形或不规则形。在腺胃、肌胃、肠及输卵管等器官织组浆膜和肠系膜表面形成广泛性的结节状或菜花状续发癌病变,其病变呈丘状隆起,单个分布或密集成堆,表面粗糙,颜色灰白无光泽,没有包膜和根蒂,质地较硬。
镜检见卵巢原有构造消失,癌细胞呈低柱状或立方形,胞核大而明显。癌细胞呈单层或复层排列,形成明显的腺管样,具有清楚的腺腔,腺腔周围有或多或少的结缔组织(见295页彩图1B3)。卵巢原有结构严重被破坏,残存的腺管上皮发生变性或坏死。腹腔浆膜上的续发癌病变与上述卵巢的原发癌病变结构相似。
3.4 鸡小圆形细胞肉瘤
3.4.1 发病情况
38例中检出小圆形细胞肉瘤3例,其中2例为本地成年土杂母鸡,另1例为罗曼褐4月龄小公鸡,患鸡死前无明显症状。
3.4.2 病理变化
剖检见3例鸡小圆形细胞肉瘤病例,肿瘤均长在病鸡的颜面部,瘤体呈圆形,接近于龙眼大小,质地较实,瘤组织切面呈灰白色,均质(见295页彩图1A4)。
镜检见肿瘤由小圆形、卵圆形和短梭形细胞构成。瘤细胞胞质少甚至缺如,淡染或呈细颗粒状,在光镜下显示一片蓝色。核圆形,常具有多形性,染色质粗,融合成小块状,核仁小或不明显(见295页彩图1B4)。
3.5 鸡间皮细胞瘤
3.5.1 发病情况
38例中检出鸡间皮细胞瘤1例。患鸡死前消瘦,腹部稍有膨大,无其他明显症状。
3.5.2 病理变化
剖检眼观可见肿瘤呈圆形或椭圆形结节状,遍布于肠浆膜及肠系膜上,瘤体有绿豆大至玉米粒大,有明显的蒂。肿瘤结节质地较实,有完整的包膜,表面光滑,切面呈灰白色,均质(见295页彩图1A5)。
镜检见结节中充满大量肿瘤细胞,瘤细胞体积大,呈椭圆形或多角形,排列较密集,多被少量间质结缔组织分隔成腺泡样或岛屿状。胞浆丰富,弱嗜碱性,胞核呈圆形、椭圆形或梭形,核分裂象易见(见295页彩图1B5)。
3.6 鸡骨骼肌瘤
3.6.1 发病情况
38例中检出鸡骨骼肌瘤1例,为罗曼褐蛋鸡淘汰母鸡,患鸡死前消瘦,胸前隆起,无其他明显症状。
3.6.2 病理变化
剖检见病鸡胸前形成一土豆大小的肿瘤,其质地较实,无包膜,切面呈灰白色、均质(见295页彩图1A6)。
镜检见瘤细胞呈多角形、椭圆形,核大,核膜不整齐,核分裂象多见,胞浆丰富,瘤细胞呈条索状或团块状排列。
3.7 鸡肠系膜脂肪瘤
3.7.1 发病情况
38例中检出鸡肠系膜脂肪瘤1例。患鸡死前消瘦,无其他明显症状。
3.7.2 病理变化
剖检眼观可见肠浆膜附近的肠系膜表面布满较多的淡黄色肿瘤结节,瘤体呈扁圆形,质地柔软,体积有高粱米大至黄豆大,有完整的包膜和蒂,与周围组织界限清楚(见295页彩图1A7)。
镜检见脂肪瘤组织结构与正常脂肪组织极为相似,瘤细胞呈空泡状,胞核被排挤到细胞的边缘,整个瘤组织呈网泡状结构。
4 讨论与分析
通过对38例鸡肿瘤性病例进行统计,结果显示鸡马立克氏病的发病率位居鸡肿瘤病之首位,鸡白血病位居第二,第三是鸡卵巢腺癌,其余4种均为少见。
从病因学角度分析,生物性因素是引起鸡肿瘤性病变的首要因素。现已发现的600多种动物病毒中,约有1/4以上的病毒具有致肿瘤性,它们可能引起包括两栖类、鸟类及哺乳类动物的多种肿瘤[1]。特别是鸡马立克氏病毒、鸡白血病病毒等病毒性因素是引起鸡肿瘤病的罪魁祸首。细菌及其细菌毒素也是引起鸡肿瘤病的重要因素,有研究认为鸡白痢沙门氏菌的隐性感染可引起成年鸡卵巢的慢性炎症,可成为鸡卵巢癌的直接原因[2]。还有研究发现鸡对黄曲霉毒素较为敏感,主要是损害肝脏,严重时诱发原发性肝癌[3]。
从发病学角度分析,不同品种或品系的动物由于其遗传基因的不同,肿瘤的发生差异颇大。有研究检查了13 000只母鸡,确定有条纹的芦花鸡比爱尔兰鸡、白色芦花鸡和来航鸡患的白血病更为严重[4]。本调查分析发现,外来品种鸡较本地土杂鸡肿瘤发病率高。分析认为外来品种鸡群多为鸡场规模化养殖,特别是蛋鸡多采取笼养,饲养密度高,为提高产蛋率,增加了光照等诸多因素,均可长期地作用于鸡群,造成鸡群持续性的应激反应,可能成为诱导外来品种鸡群高发肿瘤病的重要因素。本地土杂鸡多采取平地放养,自由采食,对当地环境高度适应,接触上述应激作用较少,所以其肿瘤病的发生率低。
有关鸡肿瘤病的防控措施在未明了各种肿瘤病确切的发病原因之前还难以制订。鉴于鸡肿瘤病发病率不断上升、危害愈加严重的情况,应该引起行业的高度重视。一是要加强对鸡肿瘤病的病因学与发病学研究,进一步明确其发病原因和发病规律,为鸡肿瘤病的有效防控提供更确切的科学依据;二是要加强对鸡肿瘤病的综合防控措施研究,积极完善其防控措施。
注:A系列为眼观病变,B系列为显微组织学病变(H.E.,10×40)
参考文献
[1]陈怀涛,赵德明.兽医病理学[M].2版.北京:中国农业出版社,2013.
[2]陈宏智,迪里拜尔·阿木提,吾斯曼·司马义.鸡卵巢癌的病理形态学与病因学研究[J].塔里木农垦大学学报,2000,12(4):20-22.
[3]王继远,包俊山.鸡黄曲霉毒素中毒[J].吉林畜牧兽医,1985(4):34-36.
[4]林曦.家畜病理学[M].3版.北京:中国农业出版社,2000.
肿瘤形态 篇2
1 材料和方法
1.1 标本来源
本文检测的胸腔积液标本均来源于我院2007年1月-2007年5月间住院患者,共计60例。其中通过病理学及影像学确诊为恶性肿瘤标本30例,其它为良性胸水标本30例, 年龄在21～73岁,平均年龄为47岁。
1.2 检测方法
1.2.1 细胞形态学检查:
采用离心推片法[1]。(1)制片:将积液分装于2支试管内,每管约5～6ml,经粗天平称量平衡后,1 500r/min离心沉淀5min。用滴管小心吸弃上清液,再用血红蛋白吸管吸取沉淀物10～15μl于洁净玻片一端,用推片压于沉淀物上,形成25°～30°夹角制成厚薄均匀的涂片。对于白细胞计数低于200×106/L的标本采用二次离心后再制作涂片,对于含有大量血液的标本,离心后用一毛细吸管取有核细胞层制作涂片,对于凝固标本用一竹签插入标本中,顺时针方向旋转、挤出细胞、剔除凝块再离心,取沉淀物制片。经上述方法制作的涂片,细胞分布均匀,便于染色观察。(2)染色:涂片制作好后,自然干燥,以95%酒精固定5min,滴加Wright-Giemsa染色液数滴以覆盖薄膜,滴加pH 6.4～6.8磷酸盐缓冲液2～3倍与染液混匀,染色5～8 min,蒸馏水冲洗待干。(3)观察:在奥林巴斯多媒体荧光显微镜上镜检。本试验采用二步扫描观察涂片,先用低倍镜扫描全片,发现可疑细胞后再用油镜鉴定细胞性质,每例标本均制作2～3份涂片,观察结果60例胸水标本有24例查见癌细胞,见图1。
A 恶性胸水腺癌细胞(10×40) B 恶性胸水腺癌细胞成管状排列(10×40) C 间皮细胞(10×40)
1.2.2 生物化学指标检测:
总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、氯(Cl)、胆固醇(TC)、乳酸脱氢酶(LDH)、C反应蛋白(Crp)、纤维蛋白原降解产物(FDP)。方法:将胸水离心后留上清液检查,采用北京中生北控生物科技股份有限公司提供的TP、ALB试剂盒,北京九强公司的LDH、Crp试剂盒,浙江东欧生物有限公司的TC、Cl试剂盒,在奥林巴斯2700全自动分析仪上按试剂盒说明书进行测定;FDP则按上海太阳生物有限公司提供的试剂盒说明书选择半定量法检测。以上项目参考值(参照相应试剂盒标准):FDP<5μg/ml,LDH 105～235U/L;TP 60～80g/L;ALB 35～55g/L;Cl 96～110mmol/L;TC 2.33～5.17mmol/L;Crp 0～5mg/L。
1.2.3 肿瘤标志物检测:
癌胚抗原(CEA) 、细胞角质蛋白(CYFRA21-1) 、神经元特异性烯醇化酶(NSE)。方法:胸水离心后留上清液做检查,按Elecsys 2010原装试剂盒操作说明,在Elecsys 2010上测定。CEA参考值标准为0～3.4ng/ml;CYFRA21-1为0～3.3ng/ml;NSE为0～15.2μg/L。
1.3 统计学处理
各组数据经检验符合正态分布,计算各组均数及标准差
2 结果
2.1 根据本研究设计的胸水系列检测指标对本组资料进行临床检测,其结果见表1。从表1分析结果可以看到:Cl、TP、ALB、Crp、TC、NSE检测指标在恶性肿瘤鉴别方面显著性差异不大(P>0.05),所以单独使用时对恶性肿瘤的诊断无明显的临床意义。而癌细胞检查、LDH、FDP、CEA、CYFRA21-1在恶性肿瘤诊断方面存在显著性差异(P<0.01),对临床诊断恶性肿瘤有重要的意义。
注:结果以均值和标准差表示
2.2 根据表1统计结果,以
3 讨论
恶性肿瘤严重危害人类健康,引起胸腔积液常见的恶性肿瘤主要有肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤等,目前尚无有效的根治性治疗手段。提高治愈率依赖于早期诊断、早期治疗。本文通过胸腔积液细胞形态学、生物化学、 肿瘤标志物三方面检测,探讨联合检测对恶性肿瘤的早期诊断。
从统计结果可以看到:Cl、TP、ALB、Crp、TC、NSE在鉴别恶性肿瘤方面无多大意义(P>0.05),而胸水细胞形态学检查、FDP、LDH、CEA、CYFRA21-1在鉴别恶性肿瘤方面意义很大(P<0.01),为临床诊断恶性肿瘤提供了可靠的指标。
本组资料检查发现胸水中恶性细胞检出率达80%,通过与临床影像学、病理学对恶性肿瘤诊断结果比较,查到癌细胞对恶性浆膜腔积液的诊断符合率达95%,但是未查到癌细胞并不一定能排除恶性肿瘤。本文胸水细胞瑞氏-姬姆萨染色形态学检查的阳性率为80%(24/30),比周道银[1]报告的阳性检出率78%偏高。胸水细胞涂片瑞氏-姬姆萨染色是一般基层医院检验科易开展的染色方法,具有简洁、快速、染色均匀、细胞结构显示清晰、容易辨认、鉴定细胞性质等优点,值得推广应用。
乳酸脱氢酶(LDH)分子量135KD,是无氧酵解中调节丙酮酸转化为乳酸的极其重要的酶,广泛存在于肝脏、心脏、肺等器官。从上表看出恶性肿瘤性胸水中LDH阳性率与良性胸水相比差异性显著(P<0.01)。参考试剂盒说明书确定良性胸水的临界值分别是LDH为643.9U/L。当指标高于临界值时,对恶性肿瘤的诊断准确率为90%;当低于临界值时,对良性胸水的诊断准确率为71%。但其在肺结核、肺炎所产生的胸水亦可显著升高,产生假阳性。故可作为临床联合诊断恶性肿瘤的重要参考指标,尤其是在综合分析胸水检测结果时意义显著。
纤维蛋白(原)的降解产物(FDP)是一种来自于纤溶酶降解纤维蛋白原或纤维蛋白的片段,间接反映体内纤溶酶的活性,在恶性肿瘤、结核性胸腹水、肝硬化、肝炎时可升高。根据本文统计,当积液中FDP>1 365.6mg/L时,提示恶性肿瘤的可能性较大。表1显示恶性肿瘤与良性胸水的FDP差异性显著(P<0.01),也可作为联合诊断恶性肿瘤的重要参考指标。
CEA是分子量为 180KD的糖蛋白,最初发现于胚胎性结肠和结肠癌中,后来发现其在多种腺癌尤其是原发于胃肠道和胰腺的腺癌均有表达[2],在正常人体内含量较少,在多种癌症时均有明显升高。胸水CEA对肺癌检测的阳性率文献[10]报道从25%到77%不等,本资料阳性率为50%。造成如此大差异的原因可能是占肺癌最大比重的两种类型鳞癌和腺癌比例不一所致[8]。本资料恶性肿瘤组肿瘤标志物检出率明显高于良性对照组,经统计学分析存在显著性差异(P<0.01),并且本资料显示肺癌组胸水CEA明显高于非肺癌组,因此CEA检测可适用于肿瘤高危人群的筛查和肿瘤病人的动态观察。CYFRA21-1是细胞角蛋白19片段(Cy-Toker-Atin19,CK19)。角蛋白(Keratin)是一个酸性多肽,相对分子量为4 000D,是构成细胞骨架的一种中间丝状物,它主要分布于单层和复层上皮肿瘤细胞的胞浆内[4]。当细胞死亡时,它以溶解片段的形式释放于血液中。CK19分子量为30 000 D,正常时以寡聚物形式存在,含量极低,当上皮细胞转化为肿瘤细胞时,其含量有不同程度的提高[5,6]。本文测定的30例肺癌患者胸水中的CYFRA21-1的水平非常显著地高于正常人组水平(P<0.01)。这是由于非小细胞肺癌肿瘤细胞主要表达CK19片段[7], 且胸水CYFRA21-1含量随分期的进展而增高,所以胸水CYFRA21-l检测对非小细胞肺癌的诊断有重要的临床价值。
据上表统计资料显示,单项肿瘤标志物(TM)检测仅对某一类型肺癌有较高的阳性率[10],但对肺癌总体普遍较低,尤其是在组织病理不明确的肺癌早期诊断中,单项检测有较大的局限性。本文中的“CYFRA21-1+CEA+LDH+FDP”联合检测确实比单项检测提高了肺癌的灵敏度,因此联合测定病人胸水中的CYFRA21-1、CEA、 LDH 、FDP对于肺癌的诊断有很大的临床价值。4项指标联合检测可以互补各自的不足,提高肺癌诊断的灵敏度和准确性,并对肺癌的分型有一定的参考价值[9]。很多报道认为,CYFRA21-l、CEA等的含量还和肺癌患者的预后有密切联系,值得进一步研究[3]。
通过上述讨论,在临床鉴别良恶性浆膜腔积液上最有诊断价值的指标是:细胞学形态检查、LDH、FDP、CEA和CYFRA21-1。现在对胸水系列检测还处在发展阶段,还需要建立一些新的检测指标,使恶性疾病的确诊率更进一步得到提高,为此研究人员已着手进行新的指标的研究,力争把胸水系列检测在临床上的应用提高到一个新的水平。
摘要：目的:对胸腔积液进行细胞形态学、生物化学、肿瘤标志物的检测,探讨其结果在诊断恶性肿瘤方面的临床意义。方法:胸腔积液细胞形态学检测采用离心推片法及瑞氏-姬姆萨复合染色鉴定细胞性质;LDH、TP、Cl、ALB、TC、Crp生物化学指标在奥林巴斯2700全自动生化分析仪上检测;CEA、CYFRA21-1、NSE肿瘤标志物在Elecsys 2010上检测,FDP检测采用酶联免疫胶乳凝集法。结果:在选择的60例胸腔积液标本中,有30例胸腔积液为恶性肿瘤,查到癌细胞24例,检出率80%,与病理学、影像学恶性肿瘤诊断符合率为95%,但是未查到癌细胞并不一定能排除恶性肿瘤,本组资料的癌细胞阳性率为80%(24/30)。LDH阳性率为67%(20/30),FDP阳性率为47%(14/30),CEA阳性率为50%(15/30),CYFRA21-1阳性率为77%(23/30)。TP、Cl、ALB、TC、Crp、NSE的检测在鉴别肿瘤方面无显著性差异(P>0.05)。结论:查到癌细胞和CEA、CYFRA21-1、LDH、FDP的联合检测在鉴别恶性肿瘤方面有显著性差异(P<0.01),为恶性肿瘤的鉴别诊断提供了可靠依据。因此在临床诊断中综合分析这些指标可作为恶性肿瘤诊断的依据,值得大力推广。
关键词：胸腔积液,恶性肿瘤细胞检测,生物化学检测,肿瘤标志物检测
参考文献
[1]周道银,惠小阳,杜家美,等.胸腔心包腔细胞学检查方法改进(J).临床检验杂志,1999,17(5):296.
[2] Ordonez NG.Role of immunohistochemistry in differentiatingepithelial mesothelioma from ademocarcinoma(J).Am J ClinPathol,1999,112:75-89.
[3]杨宜娥,孙涛,等.胸水和血清CYFRA21-1、CEA、NSE测定对肺癌的诊断价值(J).齐鲁医学检验,2004,15(6):126.
[4] Debus E,Moll R.Frahke WW,et al.Immunohistochemical dis-tinction of human carcinomas by cytoderatin typing with mono-clonal antibodies(J).Am J Pathol,1984,14:121.
[5]杜同信,王自正,田韧.等.市癌患者NSE、CYFRA21-1、CEA水平变化分析(J).放射免疫学杂志,1999,12(3):138.
[6]刘明,单越芬,赵惠扬.一种新的肿瘤标志物:CYFRA21-1(J).国外医学.放射医学核医学分册,1995,19(20):69.
[7] Broers JL,Rot MK,Oostendorp T,et al.Immunohistochemicaldetection of human lung cancer hetemgeneith using antibodiestocpithelial neuronal and neumendoerine antigens(J).CancerRes,1987,47:3225.
[8]王火强,黄蓓绮,顾益群.血清B-MG及CEA在不同肺癌组织中的水平(J).放射免疫学杂志,1998,11(4):27.
[9]杨辰,吾为一,等.多项血清肿瘤标志物联合检测在肺癌诊断中的价值(J).标记免疫分析与临床,2000,11(2):71.
肿瘤形态 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
白细胞介素-4 (IL-4) 和粒细胞-巨细胞集落刺激因子 (GM-CSF) , 购自美国PEPRO TECH公司;RPMI 1640培养液、青霉素、链霉素, 购自美国HYCLONE公司;胎牛血清, 购自杭州四季青生物工程材料有限公司;B16黑色素瘤细胞, 购自哈尔滨医科大学肿瘤研究所;C57BL/6N小鼠 (合格证号为SCXK京2004-0001, 8周龄, 雌性, 体重16～22 g, 40只) , 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 DC的分离和培养
于无菌条件下提取小鼠股骨骨髓细胞 (方法参照参考文献[3]) , 放入RPMI 1640培养液 (含胎牛血清、青霉素和链霉素) 中吹打混匀;3 h后取贴壁细胞加入IL-4和GM-CSF, 于37 ℃、5%CO2培养箱中培养;每3 d半量更换1次培养液, 同时加入GM-CSF和IL-4。
1.2.2 肿瘤全细胞DC和ADC的制备
消化、收集对数生长期的B16黑色素瘤细胞, 离心、洗涤、封装入冻存管内;将冻存管缓慢放入液氮内10 min, 取出后立即放入37 ℃水浴箱中水浴10 min, 重复3次;再放入离心机中3 000 r/min离心10 min;取上清液, -20 ℃保存, 备用;在DC培养的第6天加入上述的肿瘤抗原, 共培养3 d后即为ADC, 用倒置相差显微镜观察。
1.2.3 动物模型的建立及免疫细胞的注射
将黑色素瘤细胞复苏后培养、传代, 取对数生长期细胞消化, 离心并调整细胞浓度为1×106个/ mL;取0.2 mL注射到小鼠左侧肩背部皮下, 注射8～10 d后小鼠皮肤会长出肿瘤;在小鼠肿瘤周围皮下注入0.1 mL的DC和ADC, 对照组注射 0.1 mL生理盐水。每天肉眼观察并记录肿瘤的变化, 每3 d测量肿瘤体积1次, 9 d后计算抑瘤率。
1.2.4 光镜观察
取肿瘤与正常组织交界处的皮肤制备光镜样品, 光镜观察。
1.2.5 透射电镜观察
取肿瘤与正常组织交界处的皮肤及局部淋巴结制备常规透射电镜样品, 半薄和超薄切片, 醋酸铀-柠檬酸铅双重染色, 透射电镜观察。
1.2.6 统计学方法
分别测量每只小鼠肿瘤的长 (a) 、宽 (b) 、高 (c) , 肿瘤体积和抑瘤率分别按以下公式[4]计算:肿瘤体积 (cm3) = 4/3π (a+b+c/3×2) 3 , 抑瘤率=[ (对照组肿瘤平均体积-试验组肿瘤平均体积) /对照组肿瘤平均体积]×100%, 分别计算样本均数, 用q检验进行统计学处理。
2 结果
2.1 显微镜观察及肉眼观察结果
在倒置相差显微镜下, 肿瘤细胞形态不规则, 常呈梭形或三角形, 胞核较大, 形状不规则。视野中肿瘤细胞生长旺盛, 呈密集排列 (见图1) 。
在小鼠左侧肩背部皮下注射生长旺盛的B16黑色素瘤细胞 (1×106个/mL) , 0.2 mL/只, 8 d后肉眼可见对照组小鼠脊柱与左前肢之间皮下出现黑色素瘤, 皮肤凸起, 瘤体质地稍硬, 呈黑色, 大小约为1.5 cm×1.5 cm (见图2) , 且肿瘤一直增大, 15 d后生长速度明显加快, 部分结节出现溃疡、大片结痂现象, 小鼠精神萎靡、食欲差甚至死亡。
DC组和ADC组肿瘤体积均缩小 (见图3、图4) , 且ADC组缩小更明显, 肿瘤表面皮肤出现明显皱缩, 黑色变浅, 肿瘤生长变得局限, 部分萎靡小鼠精神状态好转。
每组小鼠肿瘤平均体积和抑瘤率的比较结果见表1。
由表1可知, DC和ADC诱导机体的抗肿瘤效应显著, 与对照组相比均差异显著 (P<0.05) , 且ADC组与DC组抑瘤率比较亦有显著差异 (P<0.05) 。
2.2 光镜观察结果
在光镜下, 对照组肿瘤呈巢状或弥散分布, 可见较多大小不等的黑色颗粒;细胞体积较大, 细胞核不规则, 核仁明显, 胞浆丰富, 可见核分裂相。
注:数据肩标*表示与DC组相比差异显著 (P<0.05) , △表示与对照组相比差异显著 (P<0.05) 。
DC组小鼠可见皮肤中有大量的肿瘤细胞, 呈浸润性生长, 胞核大而不规则, 分裂相较多, 核深染, 淋巴细胞浸润较少 (见图5) 。
ADC组可见皮下组织内有许多黑色素瘤细胞分布, 胞质较大, 周围有大量淋巴细胞浸润, 可见明显的癌团 (见图6) 。
2.3 透射电镜观察结果
2.3.1 DC组电镜观察
肿瘤细胞周围的DC核有切迹, 不规则, 核仁明显, 胞浆丰富, 细胞器较多, 细胞表面突起粗大, 与癌细胞之间有膜接触 (见图7) 。腋窝淋巴结的副皮质区内可见DC, 其表面伸出突起与周围淋巴细胞有紧密的膜接触, 有一个对一个、一个对多个或形成环形接触方式 (有紧密膜接触、点状膜接触、指状膜接触和球状膜接触形式) , DC周围环绕许多淋巴细胞, 形成树突状细胞-淋巴细胞环 (或簇) (见图8) 。
T.肿瘤细胞;D.DC。
L.淋巴细胞;D.DC。
2.3.2 ADC组电镜观察
在肿瘤的周边和边缘区可见ADC、淋巴细胞和癌细胞互相接触或者是几个淋巴细胞同时包绕癌细胞。与ADC接触的淋巴细胞形态不规则, 细胞质增多, 呈活化状态。培养2 d后大量淋巴细胞浸润, 淋巴细胞以多个包绕或单个攻击的形式与癌细胞密切接触 (见图9) 。癌细胞周围可见一群淋巴细胞, 癌细胞核已固缩, 细胞质缩小, 与淋巴细胞接触处有多处较大面积的融合。培养5 d后可见多个淋巴细胞围绕癌细胞或进入癌细胞内, 两者的细胞膜消失, 细胞质融合, 裸露的淋巴细胞核固缩凋亡, 癌细胞细胞质溶解坏死, 两者在互相作用中双双死亡 (见图10) 。
L.淋巴细胞;T.肿瘤细胞。
L.淋巴细胞;T.肿瘤细胞。
3 讨论
3.1 DC诱导特异性CTL的抗肿瘤效应
谢遵江等[5]通过对人胃癌肿瘤浸润DC的研究发现, DC与淋巴细胞、肿瘤细胞之间有着紧密的接触, 接触方式和形式呈多样性, 为DC接受抗原刺激后向淋巴细胞递呈提供了形态学基础。有研究表明[2], 在抗原摄入后到有效抗原递呈的时间是24～48 h。本研究通过透射电镜观察发现局部回输后12小时癌组织周围皮肤内即可见到淋巴细胞散在分布, 12～48 h癌巢周边和边缘区DC、淋巴细胞和癌细胞常常互相接触。透射电镜观察发现, 癌巢周边及附近有很多类高内皮微静脉的存在, 管腔内外有很多淋巴细胞积聚和穿越管壁的淋巴细胞。试验中还发现, DC分枝状小突起与邻近的淋巴细胞以点或面接触, 接触部位有高电子密度颗粒, 与DC接触的淋巴细胞呈活化状态。作者推断淋巴细胞在肿瘤局部与刚刚摄取、处理完肿瘤抗原的DC直接接触并被活化, 杀伤肿瘤细胞, 发挥细胞毒作用, 这与Bodey B等[6]的研究结果相符。
试验发现肿瘤局部皮下注射回输DC 48 h后, 有大量淋巴细胞浸润, 淋巴细胞以多个包绕或单个攻击的形式与癌细胞密切接触, 有时可见淋巴细胞进入癌细胞内与癌细胞融合, 淋巴细胞的细胞核挤压癌细胞核使其凹陷, 这可能是淋巴细胞攻击癌细胞的又一种方式。回输后5～7 d癌细胞出现凋亡和溶解。由于在抗原摄入后到有效抗原递呈的时间是24～48 h[7], 因此认为此时的淋巴细胞是淋巴组织内接受DC递呈的肿瘤抗原后活化进而迁移至肿瘤局部的抗原特异性淋巴细胞, 其杀伤活力大且特异性强。
3.2 ADC诱导特异性CTL的抗肿瘤效应
由肉眼观察可知, DC组和ADC组肿瘤体积均缩小, 且ADC组缩小更明显。DC组和ADC组注射后诱导机体抗肿瘤效应显著, 与对照组相比均差异显著 (P<0.05) , 并且ADC组诱导抗肿瘤作用明显高于DC组, 二者比较差异也显著 (P<0.05) , 此结果表明ADC诱导CTL抗肿瘤效应明显强于DC。
有关DC和ADC的抗肿瘤机理已有很多报道[8,9], 主要是CTL效应和TIL效应。本研究结果的形态学表现提示, ADC不用再摄取抗原就可以直接通过淋巴和血液循环两条经路进入局部淋巴结、递呈抗原、激活副皮质区的淋巴细胞、启动肿瘤免疫应答的初始反应。在肿瘤局部有大量淋巴细胞积聚, 甚至一群淋巴细胞包围癌细胞或进入癌细胞内, 癌细胞核固缩, 细胞质缩小, 与淋巴细胞接触处有多处较大面积的融合, 癌细胞的细胞质溶解坏死, 提示ADC能激发有效的CTL 效应。
试验发现, 在肿瘤局部ADC直接与淋巴细胞接触, 或者ADC、肿瘤细胞和淋巴细胞三者互相接触, 同时发生细胞形态的变化和癌细胞的凋亡、坏死, 说明ADC可以激活TIL特异性细胞毒作用。
透射电镜观察发现, ADC分化成熟度高和处于变形的游走状态, 提示ADC较DC更为成熟, 同时可见多个淋巴细胞围绕癌细胞或进入癌细胞内。因此, ADC比DC诱导CTL抗肿瘤效应更强。
参考文献
[1]RESCIGNO M, GRANUCCI F, RICCIARDI C P.Dendritic cells at the end of the millennium[J].Immunol Cell Biol, 1999, 77 (5) :404-410.
[2]CONRAD C, NESTLE F O.Dendritic cell-based cancer therapy[J].Curr Opin Mol Ther, 2003, 5 (4) :405-413.
[3]谢遵江, 贾立敏, 贺业春, 等.体外培养小鼠骨髓树突状细胞的扩增、鉴定及形态学观察[J].解剖科学进展, 2005, 11 (3) :240-243.
[4]LIEBRICH W, SCHLAG P, MANASTERSKI M, et al.In vitro and clinical characterization of a newcastle disease virus-modified au-tologous tumor cell vaccine for treatment of colorectal cancer patients[J].Eur J Cancer, 1991, 27 (6) :708-710.
[5]谢遵江, 张云芳, 刘颖, 等.人胃癌肿瘤浸润树突状细胞的形态学观察[J].解剖科学进展, 2003, 9 (4) :297-299.
[6]BODEY B, BODEY J B, KAISER H E.Dendritic type, accessory cells within the mammalian thymic microenvironment, antigen pres-entation in the dendritic neuro-endocrine-immune cellular net-work[J].In-Vivo, 1997, 11 (4) :351-361.
[7]BUELENS C, WILLEMS F, DELVAUX A, et al.Interleukin-10differentially regulates B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) expres-sion on human peripheral blood dendritic cells[J].Eur J Immunol, 1995, 25 (9) :2668-2672.
[8]谢遵江, 张云芳, 刘丽, 等.人直肠癌肿瘤浸润树突状细胞的形态学观察[J].解剖学报, 2005, 36 (1) :107-109.