Treg细胞

Treg细胞（共5篇）

Treg细胞 篇1

机体免疫系统进行性减退是人体衰老的生理变化之一, 它涉及免疫系统的各个成分, 例如T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞和红细胞等。而这种变化很可能增加老年人群的感染性疾病、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病的发病率。关于免疫系统老化与老年疾病关系的研究虽鲜有报道, 但关于T淋巴细胞, 特别是CD4+T细胞的变化与这些疾病关系的研究得到了相对一致的结果[1,2,3]。调节性T细胞 (regulatory T cells, Treg) 是机体维持自身耐受的重要成分。CD4+CD25+ Foxp3+ Treg细胞来源于胸腺, 其主要功能是抑制自身反应性T细胞, 其作用是通过Treg-T效应细胞 (Teff) 之间的直接接触方式实现的。已有研究证明, 人和小鼠的Treg细胞可抑制Teff细胞的增殖, 减弱其活化并降低其细胞因子的分泌[4]。由于许多疾病都与Treg细胞的质或量的改变有密切关系, 人们推测机体发生衰老时, Treg细胞的生成和功能会发生变化, 而这种变化可能与老年人疾病的发生发展密切相关。

在对老龄Balb/c小鼠体内CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞进行研究时发现, 老龄小鼠外周血CD4+T细胞比例下降, CD4+CD25+T细胞的比例增高。与幼龄小鼠相比, 老龄小鼠脾、淋巴结中总CD4+T细胞无显著性差异, 但CD4+CD25+T细胞的比例增高。进一步研究发现, 老龄小鼠初始性T细胞 (CD45RBhighCD62LhighCD44low) 减少, 记忆性T细胞 (CD45RB low CD62L low CD44 high) 增加。通过测定Vβ家族和细胞表面分子, 表明老龄小鼠外周血CD4+CD25+ Treg细胞的TCR组成成分发生改变。此外, CD4+CD25+ Treg细胞具有抑制Teff细胞增殖的作用, 但老龄小鼠Treg细胞体外抑制Teff细胞分泌IL-2的作用以及体内抑制致敏T淋巴细胞迟发型超敏反应的作用显著下降[5,6]。小鼠胸腺T细胞分化能力降低早于其胸腺萎缩。业已表明, 与幼鼠相比, 老龄小鼠胸腺中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量显著下降, 但其占胸腺CD4单阳性细胞的比例增加。此研究结果说明相对于胸腺中其他细胞, Treg细胞更耐受衰老[6,7]。

最近, 有关人Treg细胞与衰老的研究显示, 老年人与青年人外周血具有相似的调节性T细胞的数量, 且其CD25和Foxp3的表达量相似。根据CD45RA标记将Treg分为初始性CD45RA+和记忆性CD45RA-两型, 发现在老年人体内, 记忆性CD4+Foxp3+T细胞 (CD45RA-) 的数量增高。众所周知, 胸腺在人性成熟时即开始萎缩, 那么老年人是如何维持与青年人相似的CD4+Foxp3+T细胞数量呢?研究显示, CD4+Foxp3+T细胞与CD4+Foxp3-T细胞相比, 具有高水平的IL-2/15Rβ链, 此链在CD4+Foxp3+Treg细胞的IL-2和IL-15信号通路中发挥重要作用, 能够辅助T细胞的活化。有人测定了老年人和青年人Treg细胞IL-2/15Rβ链的表达情况, 结果老年人与青年人Treg细胞上的IL-2/15Rβ链表达无差异, 说明有可能老年人CD4+Foxp3+T细胞IL-2, IL-15信号通路的正常维持, 使得这群细胞数量并未受衰老而影响[8]。然而, 也有研究表明老年人外周循环中CD4+Foxp3+Treg细胞的比例升高, 且未检测到其表达特殊的归巢受体, 排除归巢过程改变导致Treg细胞比例升高的可能。该项研究认为, Treg细胞也可能来源于外周CD4+CD25- T细胞, 因为在小鼠或人, TGF-β都可诱导CD4+CD25-Foxp3-T细胞转变为Foxp3+的Treg细胞。这种转变是否稳定, 除TGF-β之外, 是否还需要其他细胞因子的参与, 有待进一步研究追溯[9]。

Treg细胞功能的研究显示, 年轻人与老年人CD4+CD25+T细胞对Teff细胞分泌IL-10的抑制作用不同, 当老年人CD4+CD25+Foxp3+T细胞与CD4+CD25-T细胞以1∶1共培养时, 后者分泌IL-10的能力抑制最为明显。然而也有在CD4+CD25+T细胞存在的条件下, Teff细胞分泌IL-10 量增加的研究报道。小鼠的研究表明, CD4+Foxp3+Treg细胞在淋巴结和脾等次级淋巴组织的数量增加, 占总CD4+T细胞的30%, 与衰老有关。CD4+Foxp3+Treg能够浸润到肿瘤组织和炎症组织, 这说明大量CD4+Foxp3+Treg细胞可被招募到炎症部位作为调节因子。由此可见, 衰老时CD4+Foxp3+Treg细胞大量存在, 抑制CD4+CD25-T细胞分泌IL-10的作用增强, 这对炎症的控制是不利的。人们推测老年人体内存在较多Treg细胞, 抑制Teff细胞分泌IL-10的作用增强, 可能是老年人败血症发病率和死亡率增加的部分原因[10]。

关于Treg细胞功能相关标志物如GITR、CTLA-4或PD-1等的研究表明, 与幼鼠相比, 这些标志物在老龄小鼠Treg细胞的表达无变化或稍有增加。且比较健康老年人和青年人外周循环中的Treg细胞发现, 与Treg细胞功能相关的分子如CD27、PD-1、TGF-β或颗粒蛋白酶A和B表达并无明显不同。也有研究表明, 在老龄小鼠的其他组织中, CD4+Foxp3+Treg细胞较幼鼠体内Treg细胞表达更多的活化标志物CD69, 而血液中CD69+Treg细胞却减少, 说明活化的Treg细胞在老龄小鼠组织中积聚。研究还发现, 老龄宿主Treg细胞CD27和CCR7表达水平下降, 表明Treg细胞的分化增强。这些结果都表明, Treg细胞在老龄宿主组织中活性更强。老龄宿主Treg细胞调节作用发生的变化是否与其功能标志物有关还有待进一步研究[10]。

老龄机体T细胞应答能力下降, 既有固有缺陷的原因, 也涉及激活和调节机制之间平衡失调。老年人体内功能性Treg细胞发生的变化可能导致了老龄宿主免疫应答能力的减弱。由于感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等不同疾病的内环境不同, 其确切的机制也各异。对于Treg细胞与老龄化相关疾病的关系有待进一步研究探讨。先前的研究结果存在一些不一致性, 可能是由于用于筛选Treg细胞的特征性标志物不同 (如 CD25+或Foxp3+) ;也可能是由于表型测定的技术不同或者选择研究人群的标准 (如平均年龄, 或者健康受试者标准) 不同所造成。一些慢性炎症性疾病如风湿性疾病、巨细胞动脉炎更易发生于老年人, 而且随年龄的增加, 代谢性疾病如动脉粥样硬化、2型糖尿病发病率增加, 且老年人感染的自发性复发率高, 部分是由于抗炎和促炎因子平衡失调造成的。因此, 针对Treg细胞数量或活性的治疗, 可能是提高老年人免疫状态、增强抵抗力的关键所在。

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Treg细胞 篇2

关键词：调节性T细胞,牙周炎,骨吸收

牙周炎不仅导致牙周支持组织的损伤,而且也是其他系统性疾病如糖尿病、心血管病等的 诱发因素[1]。近年研究表明宿主对抗牙周致病菌的免疫应答参与牙周炎的发病过程[2],其中调节性T ( regulato-ry T,Treg) 细胞可通过分泌抑炎性细胞因子如转化生长因子( transforming growth factor,TGF) -β1和白细胞介素( interleukin,IL) -10参与维持牙周组织稳态[3,4]。然而目前在牙周炎中有关Treg细胞介导免疫应答的研究仅限于牙周局部,缺乏从机体整体的角度进行研究。本实验以牙周炎小鼠为研究对象,研究Treg细胞及相关细胞因子TGF-β1和IL-10在牙龈、颈部淋巴结和外周血的表达,为牙周炎的免疫学研究提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1实验动物及分组7周龄SPF级C57BL /6雌性小鼠8只,体重18 ~ 20 g,由中国医科大学实验动物中心提供。

1. 1. 2 主要试剂及仪器羧甲基纤维素 ( CMC) 、红

细胞裂解液( Sigma,美国) ; Ficoll分离液( 灏洋生物制品科技有限责任公司,天津) ; RPMI1640培养液、胎牛血清 ( FBS) ( Invitrogen,美国) ; FITC标记的CD4、Al-exa 647标记的Foxp3抗体及其相应的同型对照抗体、流式细胞仪 ( BD,美国) ; IL-10和TGF-β1 ELISA试剂盒 ( 优尔生科技股份有限公司,武汉) ; 体视显微镜( OLYMPUS,日本) ; 酶标仪( BIORAD,美国) 。

1. 2 方法

1. 2. 1牙周炎动物模型的建立牙龈卟啉单胞菌( Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis) W83 ( 中国医科大学附属口腔医院牙周科潘亚萍教授馈赠) 以菌密度1×1010/ ml重悬于含2% CMC的磷酸盐缓冲液( PBS) 中。牙周炎组( n = 4) : 将100μl菌悬液涂抹于小鼠龈缘乃至整个口腔,连续涂抹7 d。感染对照组( n = 4) : 以相同体积含2% CMC的PBS液涂抹于小鼠口腔。于菌悬液口腔涂抹结束后的第4周处死。

1. 2. 2牙槽骨吸收评价取半侧上颌骨,去除软组织。在体视显微镜下测量上颌第一磨牙至第三磨牙从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离,每牙测量4个位点:颊、腭侧的近、远中。取12个位点的均值。

1. 2. 3组织学观察取半侧上颌骨的磨牙段,经固定、脱钙、脱水、包埋,制成近远中向5μm切片,常规HE染色。

1. 2. 4 流式细胞仪分析

1. 2. 4. 1组织样本制备1牙龈: 参照Kobayashi等[5]的方法制备牙龈单细胞悬液。牙龈称重后,于1ml PBS液中切成1 mm3小块,取上清。Ficoll分离液分离经胶原酶消化的牙龈细胞中的单个核细胞; 2颈部淋巴结及脾脏: 组织称重后,在200目筛网上研磨,分别用1 ml PBS液反复冲洗,收集上清。红细胞裂解液去除红细胞,PBS液清洗后RPMI 1640培养液重悬细胞; 3外周血: 眼球摘除的方法取外周血,一部分100μl 1% 肝素处理后,Ficoll分离液分离单个核细胞; 另一部分室温静置2 h,离心后 ( 3 000 r/min、10min) 收集血清。

1. 2. 4. 2细胞染色及检测将上述细胞悬液以5×105细胞数分别加入流式管。常规进行胞外、胞内因子染色,PBS液( 含1% FBS) 洗涤并重悬细胞,流式细胞仪检测。应用Flow Jo 7. 6. 1软件分析CD4+Foxp3+( Treg) 细胞。

1. 2. 5ELISA检测按照ELISA试剂盒说明采用双抗体夹心ELISA法测定组织上清中TGF-β1和IL-10的含量。

1. 3 统计学分析

采用SPSS 11. 0统计软件分析数据。2组间的比较采用独立样本t检验,P < 0. 05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2. 1 牙槽骨吸收分析

图1显示了2组小鼠牙槽骨吸收情况。与感染对照小鼠相比,牙周炎小鼠从釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离增大,差异显著( P < 0. 001) 。

图 1 牙槽骨吸收分析( **: P < 0. 01)( 体视显微镜,× 32)Fig 1The analysis of alveolar bone resorption ( **: P <

2. 2 组织学观察

感染对照小鼠结合上皮完整并附着于釉牙骨质界,牙周膜胶原纤维排列整齐,结合上皮及下方的结缔组织内有少量的炎细胞浸润,牙槽骨表面完整,未见破骨细胞和骨吸收陷窝形成。牙周炎小鼠结合上皮上方与牙面分离,附着位于釉牙骨质界的根方,牙周膜胶原纤维溶解、变性,排列紊乱,结合上皮周围有大量的炎细胞浸润,牙槽骨嵴顶吸收变平,可见破骨细胞和骨吸收陷窝形成( 图2) 。

图 2 牙周组织学观察Fig 2 The histological examination of periodontal tissues

2. 3 流式细胞仪分析结果

在牙龈中,与感染对照小鼠相比,牙周炎小鼠CD4+Foxp3+( Treg) 细胞在CD4+T细胞中的比例显著降低( P < 0. 01) ( 图3A) 。并且,牙周炎小鼠在颈部淋巴结和外周血中CD4+Foxp3+( Treg) 细胞比例低于感染对照小鼠 ( 图3C,D,F,G) ,差异显著 ( P <0. 01) 。虽然牙周炎小鼠在牙龈、颈部淋巴结和外周血中Treg细胞数量高于感染对照组小鼠( 图3B,C,E,F,H) ,但差异无统计学意义( P > 0. 05 ) 。2组小鼠脾脏中Treg细胞比例的降低和细胞数量的增高无统计学意义( P > 0. 05) ( 图3I ~ K) 。

2. 4 ELISA 检测结果

2. 4. 1TGF-β1表达在牙龈中,牙周炎小鼠TGF-β1表达较感染对照组小鼠增高了9. 32倍( 图4A) ,差异具有显著性( P < 0. 01) 。虽然与感染对照小鼠相比,牙周炎小鼠TGF-β1的蛋白表达在颈部淋巴结中增高了0. 14倍( 图4B) ,在血清中增高了0. 22倍( 图4C) ,在脾脏中增高了0. 18倍( 图4D) ,但差异无统计学意义( P > 0. 05) 。

2. 4. 2 IL-10表达在牙龈中 ( 图4E) ,牙周炎小鼠IL-10表达显著高于感染对照小鼠( 增高了0. 886倍)( P < 0. 01) ,并且与感染对照小鼠相比,牙周炎小鼠IL-10表达在颈部淋巴结中增高了0. 25倍 ( 图4F) ,在血清中增高了0. 97倍 ( 图4G) ,差异明显 ( P <0. 05) 。然而在脾脏中( 图4H) ,IL-10的表达在2组小鼠之间无统计学差异( P > 0. 05) 。

3 讨 论

牙周炎是由牙周菌斑微生物引发的炎症性疾病。虽然菌斑微生物对牙周炎的发生必不可少,近年来越来越多的研究表明宿主对抗入侵牙周组织菌斑微生物产生的免疫应答是导致牙周组织损伤和病程进展的主要原因[2],其中CD4+T细胞介导的免疫应答在牙周炎的发病过程中发挥重要的作用[6,7]。

研究发现牙周微生物侵入到牙周组织后,区域淋巴结中抗原特异性的CD4+T细胞活化、增殖并分化为不同的细胞亚群。在牙周局部趋化因子的作用下,这些细胞亚群迁移到牙周组织中,通过细胞表面分子和分泌的细胞因子发挥促炎性或抑炎性作用,进而参与牙周炎的发病过程[6,7]。根据产生细胞因子的效应不同,CD4+T细胞分为辅助性T ( T helper,Th ) 1、Th2、Th17和Treg细胞。早期研究认为Th2细胞是牙周炎中参与炎症过程中维持组织稳态和组织修复的主要细胞[8,9]。随着对Treg细胞的日益关注,学者们对牙周炎的免疫学病因进行重新认识。Treg细胞是一类具有广泛免疫抑制作用的CD4+T细胞亚群,特异性表达转录因子Foxp3和表面分子CD25、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原( cytotoxic T lymphocyte-associated anti-gen,CTLA) -4和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体( glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor,GITR) ,通过表面分子( 如CTLA-4,GITR) 与其他细胞直接接触或通过分泌抑炎性细胞因子( 如IL-10、TGF-β1) 的方式,抑制体内多种免疫细胞的活化和增殖,削弱炎症反应,维持免疫系统的稳定[10]。Treg细胞包括天然性Treg( natural Treg,n Treg) 细胞和诱导性Treg( induced Treg,i Treg) 细胞[11,12]。n Treg在胸腺发育成熟,随机体的生长发育定植到各组织,分泌的细胞因子以TGF-β1为主[11]。i Treg是外周组 织中活化 的CD4+T细胞在TGF-β1存在的条件下诱导分化而成,分泌的细胞因子以IL-10为主。研究发现在牙周炎患者的病损牙龈中Treg细胞比例减少,并与牙周组织破坏呈负相关[4]。动物实验研究发现在牙周组织修复期,病变牙龈组织中Treg细胞数量增多,相关的细胞因子( IL-10、TGF-β1) 表达增高,然而抑制Treg细胞的功能,导致Treg细胞数量减少,抑炎性细胞因子IL-10和TGF-β1表达降低,牙周致病菌诱导的牙周组织损伤加重[3]。这些研究结果提示Treg细胞在牙周炎中参与维持牙周组织稳态和修复组织损伤。在本实验中,研究发现在细胞比例上,牙周炎小鼠病变牙龈、颈部淋巴结和外周血中Treg细胞在CD4+T细胞中的比例显著降低( P < 0. 01) 。在细胞数量上,虽然牙周炎小鼠上述组织中Treg细胞数高于感染对照小鼠,但差异无统计学意义( P > 0. 05) 。在细胞因子的表达上,

图3流式细胞仪分析Treg细胞( **: P < 0. 01)

Fig 3 The analysis of Treg cells by flow cytometry( **: P < 0. 01)

牙周炎小鼠牙龈中Treg细胞相关因子TGF-β1和IL-10的表达明显高于感染对照小鼠( P < 0. 05 ) ,实验结果从细胞比例、细胞数量和相关细胞因子表达的角度进一步证明Treg细胞( 包括n Treg和i Treg) 参与牙周炎中维持组织稳态和保护牙周组织,但Treg细胞比例的降低、细胞数量的不足以及相关细胞因子效应的不足使其不能发挥有效的保护作用,导致牙周炎发生。

此外,我们发现在细胞比例方面,牙周炎小鼠牙龈、颈部淋巴结和外周血中Treg细胞比例的变化较脾脏更为明显。在细胞因子表达方面,牙周炎小鼠牙龈、颈部淋巴结和血清中Treg细胞相关细胞因子IL-10的变化较脾脏显著,虽然牙周炎小鼠TGF-β1的表达在牙龈中显著增高,但在颈部淋巴结、血清和脾脏中变化不明显。提示牙龈、颈部淋巴结和外周血可能是牙周炎中Treg细胞的主要来源,其中n Treg可能主要来源于牙龈,i Treg可能主要来源于牙龈、颈部淋巴结和外

图4 ELISA检测TGF-β1和IL-10的蛋白表达( * : P < 0. 05; **: P < 0. 01)

Fig 4 The protein expression of TGF-β1 and IL-10 examined by ELISA( * : P < 0. 05; **: P < 0. 01)

周血。但具体的内在机制还有待于进一步的研究。

综上所述,P. gingivalis诱导的牙周炎小鼠的牙龈、颈部淋巴结和外周血中Treg细胞比例明显降低,细胞数量无明显变化,相关的抑炎性细胞因子IL-10表达上调,TGF-β1的表达在牙龈中明显增高。牙龈、颈部淋巴结和外周血中Treg细胞比例及相关因子IL-10的变化较脾脏显著。提示在牙周炎的发病过程中Treg细胞介导的免疫应答减弱,进而造成牙周组织的损伤。此外,牙龈、颈部淋巴结和外周血可能是牙周炎中Treg细胞的主要细胞来源 ( n Treg可能主要来源于牙龈,i Treg可能主要来源于牙龈、颈部淋巴结和外周血) 。

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Treg细胞 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年7月-2011年8月郑州大学附属郑州市中心医院与郑州大学第一附属医院门诊和住院治疗诊断明确的ITP患者35例 (按照《血液病诊断及疗效标准》确诊[2]) 。其中男11例, 女24例, 年龄18~63岁, 平均36.5岁;对照组为健康体检者22例, 各项指标正常, 无感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等疾患, 男10例, 女12例, 年龄17~62岁, 平均35.2岁。

1.2 试剂与抗体

FIT C标记鼠抗人CD4抗体、PE标记鼠抗人CD25抗体和PE-cy 5标记鼠抗人的CD127抗体 (购自BD公司) 。仪器为流式细胞仪器购自美国BD公司, 为临床应用型号CABILUR, 荧光激发光的波长为488 nm, 系统分析软件为CELLQUEST。血清IL-2、IL-10、TNF-α及IFN-γ测定均采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) , 试剂盒由上海晶美生物有限公司提供。测量仪器为佰腾ELX808全自动酶标仪。

1.3 方法

(1) 各取50μl抗凝血于流式专用管中, 分别加入5μl CD4-FIT C、PE-CD25、PE-cy 5-CD127荧光标记抗体, 室温避光反应15 min, 加入500μl红细胞裂解液, 溶解红细胞15 min。完全溶血用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤, 200 g离心5 min后, 500μl PBS悬浮细胞, 立即上流式细胞仪检测并记录。 (2) ITP患者组治疗前、治疗后及正常对照组于清晨空腹抽静脉血3 ml, 取血清置-20℃保存。采用酶联免疫吸附法进行细胞因子IL-2、IL-10、TNF-α及IFN-γ检测。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0软件, 检验两组数据符合正态分布且方差齐后采用t检验, 不符合则采用非参数检验, 多组间均值比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

检测35例ITP初诊患者和22例健康体检者的CD4+CD25highT细胞和CD4+CD25+CD127dimT细胞表达水平, 初诊ITP患者CD4+CD25highT细胞和CD4+CD25+CD127dim T细胞占CD4+T细胞比例均低于正常对照组 (P<0.01) , 差异有统计学意义, 见表1。

35例ITP初诊患者治疗前血清IL-2、TNF-α及IFN-γ水平均明显高于治疗后及正常对照组 (P<0.05、P<0.01) ;血清IL-10水平均明显低于治疗后及正常对照组 (P<0.01) 。见表2。

3 讨伦

ITP是一种自身免疫性疾病, 因血小板免疫性破坏而引起外周血中血小板水平下降的出血性疾病。过去对ITP的发病机制的研究主要认为是与感染, 免疫因素, 遗传及肝脾的作用等因素相关, 尤以免疫因素关系最为密切[3,4]。

*P<0.05, **P<0.01, 与正常对照组比较;#与治疗后比较, P<0.05

目前研究表明, 调节性T淋巴细胞 (Treg细胞) 与ITP密切相关, 其数量减少、免疫抑制功能的减弱可能是导致ITP患者免疫调节机制紊乱的一个重要机制。Treg细胞是一个成熟的CD4+T细胞亚群, CD4+CD25+Treg细胞对细胞免疫和体液免疫反应均能抑制, 主要是对致敏过程产生的效应性T细胞有较强的免疫抑制作用, 这种抑制作用随着CD4+CD25+Treg细胞数量增加而增强, 为维持体内效应性T细胞和外周免疫耐受发挥重要作用。本实验检测结果显示, 初诊ITP患者CD4+CD25highT细胞和CD4+CD25+CD127dim T细胞占CD4+T细胞比例明显低于正常对照人群, 说明Treg细胞在维持外周免疫耐受中发挥重要作用, 其数量减少可能是ITP发病的一个重要机制, 差异具有统计学意义。近年研究认为, 炎性介质和细胞因子参与了ITP的发病过程。本研究结果表明, ITP患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ水平明显增高 (P<0.01) , 而血清IL-10水平明显降低 (P<0.01) 引起Th1型细胞反应, 进一步诱导巨噬细胞激活, 补体形成和细胞毒细胞活性增加, 最终导致巨核细胞及血小板的破坏。ITP患者血清TNF-α明显升高 (P<0.01) , 加剧了对机体的损伤, TNF-α的升高可能与发病前的病毒或细菌感染有关。

由此可见, ITP作为一种自身免疫性疾病, 存在多种细胞相关细胞因子的异常[5], 临床上对ITP患者定期观察其血液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α及IFN-γ等细胞因子水平的变化, 对于判断其病情的变化, 治疗效果及其预后具有重要意义。

摘要：目的:检测特发性血小板减少性紫癜 (ITP) 患者外周血中CD4+、CD25+调节性T (Treg) 细胞的比例及相关细胞因子水平的变化, 探讨其在ITP发病中的作用。方法:依据临床诊断标准, 检测22例健康人、35例初诊ITP患者的外周血标本, 流式细胞学方法检测各组CD4+CD25highTreg细胞和CD4+CD25+CD127dimTreg细胞的表达水平, 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测Treg细胞分泌的细胞因子IL-10、IL-2、TNF-a、IFN-γ的表达水平。结果:初诊ITP患者CD4+CD25highTreg细胞、CD4+CD25+CD127dimTreg细胞比例明显低于正常对照组 (P<0.01) , ITP患者血清IL-2、TNF-α及IFN-γ水平明显高于正常对照组 (P<0.01) ;血清IL-10水平明显低于正常对照组 (P<0.01) 。结论:调节性T (Treg) 细胞表达异常是特发性血小板减少性紫癜发病机制的重要环节, 对ITP患者应定期观察其血液中IL、TNF-α和IFN-γ水平变化, 以判断其病情变化、疗效观察。

关键词：特发性血小板减少性紫癜,调节性T细胞,白细胞介素,肿瘤坏死因子-α

参考文献

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[4]陈灏珠.实用内科学[M].第12版.北京:人民卫生出版社, 2005:2436-2444.

Treg细胞 篇4

1 Th1、Th2细胞与RSV感染

RSV主要感染原始气道上皮细胞,通过识别宿主细胞表面受体,如Toll样受体,来激活特异性免疫反应。众所周知,支气管哮喘是由Th2细胞所介导,表现出白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)等细胞因子的增加,RSV感染后可出现类似支气管哮喘的免疫紊乱现象。RSV感染后最理想的细胞免疫是Th1型,因为它产生的干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)等细胞因子可以激活细胞毒性T细胞和NK细胞,从而高效清除病毒[7]。然而,Th2免疫记忆功能可以在RSV感染后或疫苗接种后出现,甚至有害的炎性反应会在再次接触RSV后出现。

Th1与Th2细胞之间是互相促进又互相抑制的关系,二者在严重的RSV感染时,其失衡的理论是有争议的。一方面,IL-4浓度在RSV感染儿童的血液和鼻咽分泌物中增加,IFN-γ水平降低,IL-4/肿瘤坏死因子(IFN-γ)增加率与感染严重程度的增加率相关[8]。另一方面,一些研究发现Th2优势或Th1反应下调在RSV感染中并不存在[9]。因此,Th1/Th2平衡作为RSV感染发病机制的主要解释模式并未得到完全证实,这意味着严重RSV感染中存在不同的免疫机制。

2 Treg细胞与RSV感染

Treg细胞是不同于Th1和Th2细胞的一种免疫调节细胞,特异性表达Foxp3转录因子,主要通过调节外周免疫耐受控制免疫性疾病,避免免疫反应中过度的效应性T细胞活化和组织损伤[10]。Treg细胞通过抑制性细胞因子IL-10和TGF-β发挥作用[11]。研究发现,RSV感染早期婴幼儿外周血中Treg细胞出现明显降低[12],导致RSV特异性CD8+细胞毒性T细胞向肺的招募延迟,从而导致病毒的清除效率降低。然而,RSV感染后尽管清除速度与恢复速度减慢,但病毒可最终清除。

Treg细胞可显著增加CD4+和CD8+T细胞的数目。在Treg细胞缺乏的小鼠气道中嗜酸粒细胞表现出大量聚集,并引发全身炎性反应和过度的RSV特异性T细胞反应。在这种环境下,CD8+T细胞的大量存在可以超越它们在有效病毒清除方面的贡献,相反可导致组织病变加重和疾病严重程度的增加[13]。

Treg细胞可通过中性粒细胞和NK细胞抑制过度的炎性反应,限制低效的Th2型免疫反应和控制非特异性免疫反应。在Treg细胞缺乏小鼠中,可自发形成Th2型反应。Treg不仅可以避免过度炎性T细胞反应,也可限制低效的Th2型免疫反应。

在对RSV初始和二次感染进行比较时发现,Treg细胞在初次感染时Treg反应扩大来维持免疫环境稳定以有利于病毒清除,而在二次感染时,观察到Treg反应减少。这种现象可能与疾病的严重程度增加有关,而与再次感染无关[14]。Wang等[15]研究发现,初次感染RSV时,Treg/Th17失衡被逆转,而二次感染RSV时,通过Treg/Th17失衡存在诱发疾病的急性加重。

3 Th17与RSV感染

Th17细胞是一种新型CD4+T细胞,其细胞表面可表达细胞趋化因子受体6(CCR6)、白细胞介素-23R、CD161等分子,并可特异性表达转录因子RORγt[16]。Th17细胞是一种重要的促炎细胞,主要通过分泌IL-17等炎性细胞因子发挥其作用,其主要作用是刺激炎性反应和增强对胞外细菌、真菌和病毒的获得性免疫应答。许多研究表明,在RSV感染小鼠模型中,RSV能够通过激活补体C3a和速激肽诱导Th17反应[17]。Yasui等[18]研究发现,RSV毛支的肺泡灌洗液中,中性粒细胞百分比占50%~76%,说明其在炎性细胞中占主导地位。研究发现,过表达IL-17能使哮喘小鼠气道出现高反应性、黏液分泌增多及中性粒细胞聚集,而在IL-17基因敲除的小鼠中,RSV感染后气管内黏液的分泌明显减少[19]。

可见IL-17在RSV感染中发挥重要作用,可能通过以下四个方面导致严重感染。首先,IL-17可导致黏液分泌增加。其次,IL-17被认为能够促进Th2型细胞因子产生,从而释放一系列细胞因子,如白细胞介素13(IL-13)等,而不是直接影响气道高反应。IL-13是主要由Th2细胞分泌的一种促炎细胞因子,是调节人气道高反应性、增加气道上皮黏液产生、影响嗜酸粒细胞迁移、致平滑肌痉挛的主要关键因子。第三,IL-17与肺部中性粒细胞浸润有关,推测是由基质细胞促进趋化因子产生带来的,如白细胞介素-8(IL-8)[20]。第四,IL-17似乎能通过T-bet和Eomes负调控转录因子调节减少效应CD8+T细胞反应,从而减少病毒清除。

由此推断,Th17细胞在毛细支气道炎症、气道高反应以及病原清除中起着重要作用,但其具体机制仍需进一步探索。

4 RSV对T细胞分化的影响

RSV刺激多种细胞因子的分泌[21]:树突细胞产生IL-10和白细胞介素-6(IL-6),巨噬细胞产生白细胞介素-1β(IL-1β),上皮细胞产生IL-6、白细胞介素-23(IL-23)和TGF-β,中性粒细胞产生TNF-α。这些特定的细胞因子分泌有利于Th17细胞分化。RSV感染人支气管上皮细胞增强炎症转录因子NF-κB,并释放多种趋化因子,如细胞间黏附因子1(ICAM-1)、IL-6、IL-8和T细胞表达和分泌因子(RANTES),导致中性粒细胞、嗜酸性粒细胞招募,促进Th细胞分化为Th17细胞方向,抑制Treg细胞方向分化[22]。此外,RSV可通过诱导转录因子GATA-3诱导Th2样Treg细胞效应,从而导致Treg细胞的正常抑制功能缺失,引发一系列过敏性气道疾病[23]。目前,RSV对T细胞分化的影响的确切机制尚不明确,需进一步研究证实。

5 Treg/Th17与RSV感染

Treg和Th17细胞的发育途径有密切的关联,Treg细胞可诱导分化生成Th17的可塑性已被证实[24]。二者在功能上互相拮抗共同维持机体免疫状态的相对稳定,同时又存在相关性:Th17细胞促进炎性反应,甚至可以诱发自身免疫性疾病;Treg控制炎性反应和维持自身免疫耐受。目前,Treg/Th17平衡在多发性硬化症、类风湿性关节炎和炎症性肠病等发病机制中发挥重要作用。

研究表明,二者平衡在RSV感染发病机制中仍然存在重要意义。Treg细胞诱导的免疫反应确保有效的病毒清除效率和抑制Th2型细胞免疫反应,减轻临床症状;而Th17细胞诱导的免疫反应被认为是妨碍有效的病毒清除,并进一步增强Th2型细胞免疫反应,形成严重的临床表现[25]。

Qin等[22]研究发现,人支气管上皮细胞感染RSV时,可刺激分化为Th17细胞,而抑制分化为Treg细胞。李宾等[26]研究发现,RSV感染毛细支气管炎儿童外周血中Treg细胞比率及IL-10、TGF-β水平较非RSV感染组、健康对照组明显降低,而Th17细胞比率及IL-17水平较非RSV感染组、健康对照组明显增高。这些研究显示,Treg/Th17可能是决定RSV临床严重程度的重要因素。

6 展望

在20世纪60年代,福尔马林灭活RSV疫苗(FI-RSV)实验失败,现只有减毒活疫苗或RSV病毒蛋白表达在活病毒载体被认为安全,然而到目前为止,无有效的疫苗被许可。明确RSV感染免疫学发病机制,是下一步疫苗研究必不可少的,并是否可通过修饰Treg/Th17平衡来预测、诊断或治疗RSV感染,尚需进一步研究。

摘要：呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿期最常见的引起呼吸道感染性疾病的一种病原体,急性期也可在任何年龄段引起哮喘的恶化,增加小儿的住院率和病死率。RSV引起的免疫反应是导致该病发病的主要因素之一,调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17细胞),特别是两个细胞亚群之间的平衡可能会在RSV感染发病机制中发挥重要的作用。RSV感染期间Treg与Th17的功能既相互关联又相互对立,本文对二者在RSV感染发病机制的作用进行进一步探讨。

Treg细胞 篇5

1 资料和方法

1.1 一般资料

妊娠组分为早早孕组、正常早孕组、正常中孕组和正常晚孕组,各35例,孕周依次为7周以内、8～12周、13～23周和24周以上,孕妇年龄25～34岁,平均28岁,全部孕妇均选取来自笔者所在医院定期产检的孕妇,既往无死胎、自然流产、放射性职业、自身免疫性疾病史。同时排除内分泌、解剖结构、染色体异常病例。对照组即正常非妊娠组35例,年龄26～33岁,平均29岁,均随机选取来笔者所在医院正常体检女性,均有妊娠史,既往无死胎、自然流产、放射性职业、自身免疫性疾病史,同时排除内分泌、解剖结构、染色体异常病例。

1.2 主要仪器和试剂

采用德国ROCH公司2010型电化学发光仪和美国COULTER公司生产的EPICSXL型流式细胞仪,雌二醇试剂采用ROCH公司电化学发光配套试剂,eBioscience公司提供的小鼠抗人CD4、CD25和FOXP3荧光抗体和同型对照检测试剂。

1.3 试验方法

1.3.1 外周血雌二醇水平检测

取上述各研究对象静脉血2 ml置于无菌干燥管内,静置30 min后离心4000r/min,离心5 min分离出血清,严格按照ROCH公司2010型电化学发光仪操作规程检测雌二醇水平。

1.3.2 外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞百分率检测

采用标准全血裂解法,取上述各研究对象静脉血2 ml置于肝素抗凝管,充分混匀后各取100μl细胞悬液,分别加入CD4-FITC和CD25-PE各15μl,混匀后避光孵育30 min,离心去上清,加入固定破膜剂,混匀后避光放置20 min,离心去上清,取100μl Hank's液重悬、15μl PE-Cy5-FOXP3单克隆体抗,混匀后避光放置30 min,严格按照COULTER EPICSXL型流式细胞仪操作规程检测CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞比例。同时分别用PE-IgG1、FITC-IgG1、PE-Cy5-IgG1抗体作同型对照实验。

1.4 统计学分析

采用SPSS 15.0软件包进行实验数据的统计分析。各妊娠组与对照组比较和早、中、晚孕组与早早孕组的比较均采用成组设计t检验,各妊娠组间比较采用方差分析和SNK-q检验,各组数据以均数±标准差()表示,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

从结果比较发现,外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞百分率,对照组(8.54%±2.90%)和早早孕组(9.32%±1.96%)明显低于早孕组(13.38%±3.35%)、中孕组(19.33%±4.49%)、晚孕组(18.51%±3.98%),差异有统计学意义(P<0.05),并且随孕周增大而升高(P<0.05)(图1);外周血雌二醇水平,对照组(135.25±171.31) pmol/L和早早孕组(453.62±352.31)pmol/L明显低于早孕组(17107.28±16623.81) pmol/L、中孕组(80019.95±49210.01) pmol/L、晚孕组(121010.37±65799.32) pmol/L,差异有统计学意义(P<0.05),并且孕周越大雌二醇水平越高(P<0.05)(图2)。

3 讨论

近来研究表明,妊娠具有半同种移植的性状,介导母胎免疫耐受,对胎儿产生保护性免疫应答,对于维持整个妊娠,避免孕妇与胎儿半同种异体抗原产生排斥反应有重要的意义。在整个妊娠过程中,随着胎儿的发育,暴露于母体的抗原逐渐增多,而不被母体排斥产生免疫耐受是母体免疫系统包括某些激素水平(如E2、HCG、PRL等)有效调节的结果。目前研究认为,排除由胸腺输出增高而在外周发生扩增的CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞,是在维持机体外周免疫耐受的一个重要调控者,正常的CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞数量和功能可使母体对胎儿半同种异体抗原发挥免疫抑制保护作用,可能是通过细胞产生特异性封闭抗体和抑制性免疫细胞主动抑制自身免疫性T细胞活化的机制诱导母胎免疫耐受,使胚胎免遭攻击的原因,促使妊娠成功。

CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞具有的免疫调节作用,在维持内环境稳定、诱导移植免疫耐受也发挥着重要的作用[4,5]。Somerset等[6]研究发现,妊娠妇女在早期CD4+CD25+显著升高,中孕达到最高峰,FOXP3+Treg细胞是调控CD4+CD25+的重要因子。本研究发现,正常妊娠妇女外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞百分率在孕8周左右开始明显升高,这与肇静娴等[7]报道相符,可能与胎盘绒毛植入和大量胎儿自身抗原产生有关。同时中孕组CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞百分率明显高于早孕组,晚孕组略有下降趋势,CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞百分率略低于中孕组,但无统计学意义。Sindram-Trujillo等[8]报道表示,CD4+CD25+下降与诱导分娩有相关性。本研究结果提示,正常妇女外周血中存在一定数量免疫抑制功能的CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞,并且在妊娠过程中可诱导和维持母体对具有半同种异体抗原胎儿的免疫耐受,从而保护正常的妊娠过程。

雌二醇是雌激素中生命活性最强的一种,主要作用于垂体,也是妊娠期重要的性激素之一。妊娠6周前E2主要来源于卵巢分泌,6周后则主要来源于胎盘。有研究发现,而E2则可能是让在耐受环境下激活的CD4+CD25+细胞转向FOXP3+Treg的重要信号,并通过促进CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞的增殖来增强其免疫抑制功能。本研究结果认为,正常妊娠妇女外周血E2水平明显高于正常非妊娠妇女,并且随孕周增加而升高;同时又发现妊娠妇女外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞数量与其E2水平有相似的变化规律。结果提示,外周血E2规律性变化是有效妊娠的重要因素之一,可能通过促进CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞的增殖在诱导妊娠免疫耐受中发挥重要作用,从而保证正常的妊娠过程。

综上所述,外周血CD4+CD25+FOXP3+Treg细胞百分率与雌二醇水平的规律性变化对诱导母胎免疫耐受,维持正常妊娠有重要意义。

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