α、β细胞功能

α、β细胞功能（共7篇）

α、β细胞功能 篇1

摘要：目的:探讨罗格列酮对人子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法:罗格列酮处理原代培养的人子宫肌瘤细胞,甲基噻唑基四唑(MTT)实验测定细胞生长曲线,流式细胞术测定细胞凋亡率,实时定量PCR和Western Blot分别检测雌激素受体α(ERα)和β(ERβ)的表达。结果:罗格列酮以浓度和时间依赖的方式抑制人子宫肌瘤细胞的增殖,以浓度依赖的方式促进人子宫肌瘤细胞的凋亡,降低人子宫肌瘤细胞ERα和ERβ的mRNA及蛋白的表达。结论:罗格列酮抑制人子宫肌瘤细胞增殖,促进其凋亡,其机制与罗格列酮降低人子宫肌瘤细胞中ERα和ERβ的表达有关。

关键词：罗格列酮,子宫肌瘤,雌激素受体

子宫肌瘤是一种雌激素依赖性肿瘤,在生育期发生、发展,在绝经后逐渐萎缩, 提示雌激素是子宫肌瘤生长的促进剂[1]。雌激素要发挥其生物学效应首先与其受体结合,因此雌激素受体(estrogen receptor, ER)是其信号转导的起始环节,雌激素受体分为两种亚型,即 ERα和ERβ[2]。过氧化酶体激活物增殖受体(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)属于配体激活的核转录因子,其分为3个亚型:PPARα、PPARβ 和PPARγ。PPAR除具有调节代谢及抗炎作用外,还有抑制肿瘤细胞增殖的作用[3,4]。罗格列酮是PPARγ的激动剂。本文旨在探讨PPARγ激动剂罗格列酮对人子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响,并进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基(Invitrogen 公司),胎牛血清(杭州四季青公司),Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、聚乙二醇辛基苯基醚(Trizol X-100)试剂、罗格列酮均为美国Sigma 公司产品。一抗以及辣根过氧化物酶标记二抗(Santa Cruz公司),BCA蛋白定量试剂(Pierce公司)。总RNA提取试剂盒,MMLV第一链cDNA合成试剂盒和Hot Star Taq Master Mix试剂盒购自Invitrogen公司产品。所用引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 标本采集和细胞培养

选择年龄35～45 岁的单纯子宫肌瘤患者6例,术后均经组织病理学证实。切除子宫后,无菌条件下取离体的子宫肌瘤组织约1 cm×1 cm×1 cm,将肌瘤组织剪碎至<1 mm3 ,加入含800 U/mlⅠ型胶原酶的培养液,37℃消化肌瘤组织,6小时后离心收集细胞,以5×105个细胞/ml的密度接种于24孔细胞培养板。培养液中加入10%胎牛血清,将细胞培养板置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。细胞经免疫组化两步法二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)显色,鉴定为子宫肌瘤细胞。取生长状态稳定,呈对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 实验分组

将原代培养的细胞分组为:①子宫肌瘤组(未加罗格列酮干预,加入相同量的溶媒DMSO);②10-8 mol/L罗格列酮组;③10-7 mol/L罗格列酮组;④10-6 mol/L罗格列酮组。罗格列酮用DMSO溶解,DMSO在培养液中的浓度控制在1%以内。

1.2.3 MTT实验测定细胞增殖

实验终止前4 小时加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,37℃继续孵育4 小时,吸去上清液,每孔加入DMSO 200 μl,振荡10 分钟,用酶标仪在490 nm 处测定各孔的吸光度A值,绘制生长曲线。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

将细胞悬液移入离心管中,1500 r/min离心5 分钟,弃上清后用PBS液洗涤2次,70%乙醇4℃固定过夜。离心后PBS液洗涤2次,加入碘化丙啶(propidium iodide, PI)50 μg/ml,核糖核酸酶(ribonuclease, Rnase)10 μg/ml,Triton X-100(10%)的染液300 μl,于室温下避光染色20分钟后,流式细胞仪检测细胞凋亡率[5]。

1.2.5 实时定量PCR分析

按Trizol试剂盒说明书提取细胞的总RNA。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应,合成cDNA第一链。选取cDNA样品进行Real-time PCR反应,反应体系25 μl,含Hot Star Taq Master Mix(2×)12.5 μl, PCR上下游引物及探针(10 μmol/L)各0.3 μl, cDNA 4 μl, 去离子水补足25 μl。PCR扩增程序为:95℃ 10 分钟激活Hot Star Taq DNA合成酶,扩增循环94℃ 40秒, 60℃ 70秒,共52个循环。Real-time PCR反应在ABI 7500实时定量PCR系统上进行。引物和探针序列上海生物工程有限公司合成,引物序列:β-actin:上游:5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′,下游:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′;ERα:上游:5′-TGCCAAGGAGACTCGCTA-3′,下游:5′-CCTCTTCGGTCTTTTCGTATCC-3′;ERβ: 上游:5′-ATCAGGCTGTCATTATGGTGT-3′, 下游:5′-AAATTTTCGACCTCCAAGGAC-3′。

1.2.6 Western Blot分析

用裂解液裂解细胞,离心去除沉淀,BCA试剂测定蛋白含量,用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST(20 mmol/l Tris base pH 7.6, 50 mmol/l NaCl, 0.1% Tween)封闭1 小时,按1∶150加入兔抗人ERα、ERβ一抗,室温孵育1 小时,1∶150加入辣根过氧化物酶标记二抗,室温1 小时,洗3次,用Western Blot荧光检测试剂盒显示结果于X光片。以β-actin作为加样的内参。扫描图像,用Labworks图像分析系统进行吸光度扫描,以对照组的面积灰度值为100%与实验组进行比较和分析。

1.2.7 统计学处理

数据用均数±标准差undefined表示,组间差异采用单因素方差分析;两两比较采用SNK-q检验;用SPSS 13.0 统计软件系统进行数据分析。

2 结 果

2.1 罗格列酮对人子宫肌瘤细胞增殖活性的影响

相同药物浓度作用48 小时与作用0和24 小时比较,其对肌瘤细胞增殖的抑制作用显著增加(P<0.05);相同药物浓度作用72 小时与作用0、24和48 小时比较,其对肌瘤细胞增殖的抑制作用显著增加(P<0.05),呈时间依赖性。不同浓度罗格列酮作用24 小时对人子宫肌瘤细胞增殖无明显抑制作用,各组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);而在作用48小时和72 小时均能抑制人子宫肌瘤细胞的增殖,随着药物浓度的增加,增殖抑制作用越高,各组间比较,差异有统计学意义(P<0.05),呈浓度依赖性。见图1。

2.2 罗格列酮对人子宫肌瘤细胞凋亡率的影响

对照的子宫肌瘤组经培养后细胞未见明显凋亡现象,罗格列酮处理72小时后,细胞出现有不同程度的凋亡,而且细胞凋亡呈现浓度依赖性(P<0.05),随浓度的增高,凋亡率逐步上升。见图2。

(①与子宫肌瘤组比较,P<0.05;②与10-8mol/L罗格列酮组比较,P<0.05;③与10-7mol/L罗格列酮组比较,P<0.05)

2.3 罗格列酮对人子宫肌瘤细胞中雌激素受体表达的影响

罗格列酮作用于人子宫肌瘤细胞72小时后,实时定量PCR和Western Blot检测ERα和ERβ表达。罗格列酮以浓度依赖的方式降低人子宫肌瘤细胞ERα、ERβ mRNA和蛋白的表达。见图3、图4。

((1)与子宫肌瘤组比较,P<0.05;(2)与10-8mol/L罗格列酮组比较,P<0.05;(3)与10-7mol/L罗格列酮组比较,P<0.05)

(①与子宫肌瘤组比较,P<0.05;②与10-8mol/L罗格列酮组比较,P<0.05;③与10-7mol/L罗格列酮组比较,P<0.05)(4A为Western Blot技术显示子宫肌瘤细胞ER蛋白表达水平的代表图,图中1为子宫肌瘤组;2为10-8mol/L罗格列酮组;3为10-7mol/L罗格列酮组;4为10-6mol/L罗格列酮组。4B、4C为量化图)

3 讨 论

PPARγ属于核受体超家族的成员,PPARγ在多种肿瘤细胞,如脂肪瘤、子宫肌瘤、乳腺癌、结肠癌等中高表达。当PPARγ激活后可抑制这些肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞凋亡以及诱导细胞分化[6]。PPARγ在人子宫肌瘤组织中的表达明显高于其同源的子宫正常平滑肌组织。PPARγ激动剂可以抑制雌激素对鼠子宫肌瘤细胞的生长刺激作用[7]。我们的结果显示,用PPARγ的特异激动剂罗格列酮处理体外培养的人子宫肌瘤细胞后,罗格列酮以浓度和剂量依赖的方式显著性抑制了人子宫肌瘤细胞增殖,同时以浓度依赖的方式显著性促进了人子宫肌瘤细胞的凋亡。PPARγ与配体结合后被激活,与维甲酸受体形成异源二聚体,再与所调节基因启动子上游的一段特定DNA 序列即PPARγ反应元件结合,调控下游靶基因的转化活化,从而发挥一系列的生物活性[8]。

子宫肌瘤是雌激素依赖性的肿瘤,雌激素有诱发并促进子宫肌瘤生长的作用, 减低雌激素浓度或阻断雌激素的作用, 其诱导增殖的作用也将终止[9,10]。雌激素发挥其作用先必须与靶细胞上的受体结合,而ER有ERα和ERβ两种亚型。经典的ER信号转导途径为通过与靶基因启动子上的雌激素反应元件(estrogen response element, ERE)结合激活基因转录,即雌激素在细胞核中与受体蛋白结合,激活的ERα和ERβ形成同种或异种二聚体,一些共同调节因子与二聚体形成复合物,然后复合物与ERE结合启动转录, 从而发挥生物学效应。研究发现,子宫肌瘤中ER mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常子宫肌层组织。子宫肌瘤细胞中ER的水平与肌瘤的生长速度呈正相关[11]。本研究发现,罗格列酮以浓度依赖的方式降低了人子宫肌瘤细胞中ERα和ERβ mRNA和蛋白的表达,因此罗格列酮抑制了人子宫肌瘤细胞增殖,促进其凋亡也可能与其降低人子宫肌瘤细胞中ER的α、β的表达有关。

ER 属于核受体家族,是一类能与DNA应答元件结合的配体依赖的转录调控因子。ER表达调控的分子机制十分复杂,大致可以分为染色质水平、 转录水平、 microRNA水平以及翻译后水平的调节,也涉及到多条信号通路,如:MAPK信号通路、JNK信号通路、ERK1/2信号通路等。罗格列酮是通过何种途径影响ER的表达还有待进一步研究。

总之,本研究显示罗格列酮抑制人子宫肌瘤细胞的增殖,促进了人子宫肌瘤细胞的凋亡,其机制与罗格列酮降低人子宫肌瘤细胞中ERα和ERβ的表达有关。因而本实验的结果为罗格列酮可能成为人子宫肌瘤治疗药或辅助用药提供了实验依据。

参考文献

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α、β细胞功能 篇2

1 材料与方法

1.1实验动物

100 只8 周龄SPF级雄性Wistar大鼠,体质量200 ~ 220 g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号: SYXK( 京) 2012-0001。于北京中医药大学动物中心严格按照北京中医药大学动物伦理委员会有关实验动物伦理审查和管理规定进行。按照随机的原则将100 只动物分成4 组,其中模型组( AMI group) 40 只,术后成活19 只,死亡21只,成活率为47. 50% ,其中死亡大鼠死亡原因为术中或术后心律失常。给药组( PTX group) 35 只,术后成活15 只。假手术组( Sham group) 15 只。正常组( normal group,N group) 10 只。

1. 2 主要实验设备和仪器

心电图解析系统SP-2006_LAN( 北京软隆生物技术有限公司) ; 自发行为动物检测系统( JLBehv-LAR-1,上海吉量软件科技有限公司) ; 强迫游泳分析系统( Etho Vision XT,Noldus公司,荷兰) 。

1. 3 实验试剂

己酮可可碱( Enzo Life Sciences公司,批号:L 02465) 。

1. 4 心肌梗死动物模型建立

心肌梗死动物模型的建立,对比后参考True-blood的方法［7］并在其基础上予以改进,将Wistar大鼠用10% 的水合氯醛( 0. 4 m L/100g) 麻醉后,仰位固定于手术台上,采用生物信号定量分析系统SP-2006 _LAN( 北京软隆生物技术有限公司) 记录大鼠术前及术后标准体表心电图。正中剃毛,碘酒常规消毒,手术刀正中切开,用止血钳钝性分离肋间肌肉,自左侧4 ~ 5 肋间开胸,暴露心脏,在肺动脉圆锥及左心耳之间,距左冠状动脉起点2 ~ 3mm处,用3 ~ 0 无创缝合线结扎左冠状动脉前降支,立刻将心脏送回胸腔,挤出胸腔内气体,待心率及呼吸平稳后用5 ~ 0 缝合线缝合,假手术组在心脏左冠状动脉左前降支处穿线不接扎,余过程与模型建立相同。正常组不予以任何手术处理。术后模型组及假手术组大鼠肌注青霉素钠注射液80 000 U / 天,共3 天,以防止感染。动物清醒后按常规饲养。模型成功标准为心电图显示Ⅱ导联出现ST段弓背抬高0. 2 m V以上( 见图1、图2) 。假手术组术后ST段的抬高不明显( 见图3、图4) 。术后1 ~7天给药组连续7 天每日上午10 点进行腹腔注射PTX( 0. 2 m L/100g) ,模型组给等体积的生理盐水。

1. 5 行为学观察

1. 5. 1 蔗糖水消耗实验［8］蔗糖水消耗实验于大鼠手术前,手术后2 周进行。本实验是以大鼠蔗糖水摄取量降低作为指标,用于评估大鼠快感缺乏［9-10］。实验前48 小时,训练大鼠适应饮用蔗糖水。同时给予每只大鼠两瓶水: 一瓶为1% 蔗糖水,一瓶为纯净水。大鼠禁食禁水24 小时,而后在安静避光的环境下进行蔗糖水消耗实验。然后每笼分别给予已定量的蔗糖水( 1% 蔗糖水) 和纯净水两瓶液体,60 分钟后取走液体并分别称重。蔗糖水消耗百分比= 蔗糖水消耗量/总液体消耗量 ×100%

1. 5. 2 自发行为实验自发行为实验所用装置为不透明的材料所制成,箱体为正方体,通过箱体所带摄像头来观察大鼠在箱体的运动状态。根据参考文献［11］,本实验于大鼠手术后第2 周进行。实验时将大鼠轻慢置于中心方格内,关闭箱门,观察大鼠在5分钟内的活动总路程,活动总时间和站立次数。

1. 5. 3 强迫游泳实验本实验为行为绝望实验法,其基本原理为当大鼠放置在一个有限的空间使之游泳,观察大鼠在水中的行为,大鼠不动时间越长,表示抑郁程度越高。本实验于手术后30 天进行,参考文献［12-13］将每只大鼠于下午13: 00 在安静状态下分别置于水温24 ~ 25℃,水深30 cm,21 cm × 21 cm× 50 cm的有机玻璃缸中,进行预游泳,每只大鼠游泳时间为15 分钟。24 小时后进行正式游泳实验。同时间,同条件下让每只大鼠强迫游泳5 分钟,并同时使用强迫游泳分析系统( Etho Vision XT,Noldus公司,荷兰) 记录大鼠游泳时间、挣扎时间及不动时间并对指标进行分析。

1. 6 组织学检测

TNF-α,IL-1β 在大鼠血浆内和脑组织内浓度。术后33 天取材。用10% 的水合氯醛( 0. 4 m L/100g)麻醉大鼠,腹主动脉取血4 m L,注入肝素钠离心管并离心,取上清液,- 80℃ 保存; 断颈法处死大鼠,取脑组织,将脑组织于-80℃保存。大鼠腹主动脉取血于用肝素钠采血管内,离心机3000 rpm离心10 分钟,取上清液,大鼠脑组织匀浆。用Rat TNF-α El ISA KIT试剂盒检测( Multi Science) 和Rat IL-1β El ISA KIT试剂盒检测( Multi Science) 。

1. 7 统计学处理

所有数据应用SPSS 20. 0 统计软件包进行分析。数据以均数 ± 标准差( ± s) 表示。数据均服从正态分布,并采用单因素方差分析( one-way ANO-VA) ,两两比较时采用LSD法,P < 0. 05 为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2. 1 各组大鼠蔗糖水消耗实验比较

各组大鼠蔗糖水消耗百分比经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术与正常组相比,大鼠蔗糖水消耗百分比没有明显差异( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠蔗糖水消耗百分比明显减少,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组与模型组相比,PTX组大鼠蔗糖水消耗百分比明显高于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表1。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 2 各组大鼠自发行为实验比较

各组大鼠三项自发行为指标经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术与正常组相比,大鼠的活动总路程,总时间和站立次数差异无统计学意义( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠的活动总路程,总时间和站立次数明显减少,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组和模型组相比,PTX组大鼠的活动总路程,总时间和站立次数明显高于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0.05) 。见表2。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 3 各组大鼠强迫游泳实验比较

各组大鼠强迫游泳三项指标经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术组与正常组相比,大鼠的游泳时间,不动时间和挣扎时间差异无统计学意义( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠游泳时间和挣扎时间明显减少,但不动时间增加,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组与模型组相比,PTX组大鼠的游泳时间和挣扎时间明显高于模型组大鼠,但不动时间明显低于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表3。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 4 各组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度

各组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05 组间两两比较采用LSD法。假手术组与正常组相比,大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度无统计学意义( P > 0. 05) 。模型组与假手术组相比,模型组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度均增加,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组和模型组相比,PTX组大鼠血浆内IL-1β 和TNF-α 浓度均低于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表4。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

2. 5 各组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度

各组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度经正态检验,均符合正态分布,方差齐性检验P > 0. 05,组间两两比较采用LSD法。假手术组与正常组相比,大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度无统计学差异( P > 0. 05) 。模型组和假手术组相比,模型组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度均增加,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。PTX组和模型组相比,PTX组大鼠脑内IL-1β 和TNF-α 浓度均低于模型组大鼠,差异有统计学意义( P < 0. 05) 。见表5。

注: 与假手术组相比,aP < 0. 05; 与模型组相比,bP < 0. 05

3 讨论

传统中医认为识神是指人的精神意识思维活动,是以人的意志为转移的,大脑的后天活动,本源于大脑却隶属于心,这是由于心主血脉为大脑的识神活动提供了物质基础。目前临床统计表明心血管疾病并发情绪障碍的概率为8% ~ 44%［14］。抗抑郁药对心肌梗死的治疗疗效甚微,因此探求心肌梗死后抑郁相关病理机制尤为重要。目前在急性心梗模型的基础研究中,慢性轻度不可预见性应激抑郁模型是目前较为理想的抑郁动物模型之一［15-16］。根据参考文献,抑郁症动物模型至少应符合3 个标准［17］: ( 1) 表观信度: 例如动物的行为特点看上去是否象人类的抑郁症; ( 2) 内在信度: 引起行为改变的原因和因果关系是否和抑郁症一样; ( 3)预测信度: 对人类有效的抗抑郁药是否能可靠地改变动物的这种行为。本实验结果表明大鼠冠状动脉前降支结扎2 周后,模型组大鼠与正常组和假手术组大鼠相比,蔗糖水偏好显著减少,表明大鼠快感缺乏; 自发行为实验中大鼠的活动总路程、总时间、直立次数均明显减少,表明大鼠的活动度和对外界新鲜环境的好奇度明显下降; 游泳时间和挣扎时间明显减少,不动时间增加,表明大鼠具有绝望行为。以上大鼠产生快感缺乏,活动能力下降,产生绝望行为与抑郁症的核心症状( 心情低落、兴趣缺乏等) 有一定程度的相似性,类似抑郁症患者的症状,因此可以判定大鼠在急性心肌梗死后产生了抑郁行为。

目前心肌梗死后抑郁的发生机制尚未明确,有研究表明,心肌梗死与炎症反应密切相关。心肌局部及全身的炎症反应,影响心肌梗死的病理及预后,并最终导致心肌重塑和疤痕形成。心肌梗死后,由免疫导致的炎症反应,包括补体激活、细胞因子释放、炎症和免疫细胞趋化和浸润,可加重心肌损伤和扩大心肌梗死的范围。前炎症细胞因子的释放与心梗后抑郁的发病病理有关［18-19］。与心肌组织细胞因子浓度升高相平行的是,心梗后脑组织当中细胞因子的浓度也急剧增加［20］。因此本研究可以提出假设在急性心梗使得前炎症细胞因子( 如IL-1β、TNF-α) 被激活并释放入血,随血液循环透过血脑屏障进入脑组织,刺激脑内神经元,小胶质细胞和血管内皮细胞进一步释放前炎症细胞因子如TNF-α 和IL-1β 等,引起脑内炎症从而诱发抑郁的产生。根据上述实验结果,模型组大鼠与假手术组大鼠和正常组大鼠相比,其血浆内和脑内IL-1β 浓度和TNF-α 浓度均明显升高,从而可印证本研究提出的假设。

PTX是甲基黄嘌呤衍生物,是一种非特异性磷酸二酯酶抑制剂,具有抗炎抗纤维化特性,可通过c AMP依赖机制降低促炎细胞因子循环水平,如TNF-α、IL-1β 等［21］。有研究证明PTX可能通过改变促炎细胞因子水平从而衰减抑郁行为。据报道促炎细胞因子可诱发抑郁样行为和细胞凋亡。例如: IL-1β 可提高HPA活性［22］,并且诱发抑郁行为［23-25］,而IL1-β 在抑郁症患者循环浓度升高,且IL-1β 拮抗剂可抑制IL-1β 活性,由此可以认为PTX可减少炎性细胞因子。本实验研究数据表明,PTX可通过抑制炎症因子循环水平而缓解心梗后抑郁的症状,从而印证炎症反应可能是心梗后抑郁发生的可能机制这一猜想。

本研究采用冠状动脉前降支结扎方法建立大鼠急性心肌梗死模型,并通过行为学实验和组织学检测研究表明大鼠在心肌梗死后出现快感缺乏,活动度低下,绝望行为等抑郁行为,且模型组大鼠血浆内和脑内炎症因子IL-1β 和TNF-α 浓度明显升高。并采用PTX予以治疗。结果表明PTX组大鼠与模型组大鼠相比,不但血浆内和脑内炎症因子IL-1β和TNF-α 循环水平浓度降低,且包括蔗糖水偏好显著升高; 活动总路程、总时间、直立次数和直立时间均明显升高,游泳时间和挣扎时间明显升高,不动时间显著减少在内的抑郁行为显著减轻,提示炎症反应可能是心梗后抑郁发生的可能机制。

本实验研究急性心肌梗死后产生的炎症因子通过血液循环进入脑组织从而引起脑内炎症而产生抑郁,但目前研关于炎症因子如何改变血脑屏障通透性的机制仍尚未明确,希望通过建立更详细的实验来研究心梗后抑郁的炎症机制。

摘要：目的 观察心肌梗死后抑郁大鼠行为学及前炎症因子的表达规律,揭示心肌梗死后抑郁发生的机制,为心肌梗死后抑郁的治疗提供药物作用的靶点。方法 采用手术法结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支制作大鼠心肌梗死模型,术后用前炎症细胞抑制剂己酮可可碱腹腔注射进行治疗,采用蔗糖水消耗实验,自发行为实验,强迫游泳实验观察大鼠行为学变化,并检测大鼠血清和脑中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的含量变化。结果 大鼠急性心肌梗死后2周,与假手术组相比,模型组大鼠的蔗糖水消耗量,及活动总路程、站立时间、活动总时间、游泳时间和挣扎时间减少,不动时间增多,炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β均明显增多(P<0.05,或P<0.01)。结论 心肌梗死后大鼠出现活动度下降,快感缺乏,产生绝望行为以及血浆内和脑内炎症因子升高,在使用己酮可可碱后其行为活动度升高及绝望行为减缓,血浆内和脑内炎症因子下降,提示阻断炎症反应过程,可以改善大鼠心肌梗死后的抑郁状态,提示炎症反应可能是心梗后抑郁发生的可能机制。

α、β细胞功能 篇3

1 对象与方法

1.1 对象

本次研究对象来自2014年开滦职业病防治院查体的在职和退休矿工以及住院矽肺患者,选择壹期矽肺患者55例(矽肺组),均经开滦职业病防治院按照GBZ 70-2009《尘肺病诊断标准》确诊,主要从事掘进、开拓、采支等;年龄52~70岁,平均(62.37±4.21)岁;接尘年限10~38 a,平均(25.39±6.2)a。选取具有与矽肺组相同接尘条件的健康井下矿工35例(接尘组),年龄55~66岁,平均(63.21±3.96)岁;接尘年限13~35 a,平均(24.56±5.84)a。另选33例非接尘井上健康查体人员(对照组),年龄55~65岁,平均(63.32±5.14)岁。所选对象均为男性,且无肝、肾疾病、心脑血管疾病、免疫系统疾病、内分泌系统疾病及近期肺部感染史。经统计学分析,各组年龄和接尘年限间比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 标本采集

所有检测对象均于治疗前采集空腹静脉血,室温状态下静置1 h,3 000 r/min(离心半径17.5 cm)离心10 min后提取血清放入冻存管中,置-20℃冰箱中保存待测。

1.3 实验仪器和方法

采用Luminex流式荧光技术检测MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α,试剂盒购自美国Millipore公司,仪器为美国Luminex公司生产的Luminex200多功能流式点阵仪。肺功能测定使用德国耶格公司生产的PTF肺功能机。所有试剂使用前均平衡至室温,严格依照说明书操作。

1.4 统计学分析

应用SPSS 13.0软件进行统计学分析,正态分布的计量资料以±s表示,偏态分布的计量资料以中位数(M)和四分位数间距(P75~P25)表示,数据转换为对数处于正态分布后,两组间差异比较采用t检验,多组计量资料比较采用单因素方差分析F检验,组间两两比较采用q检验;相关性采用Pearson相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 壹期矽肺患者血清中MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平

与对照组比较,接尘和矽肺组血清中MIP-1α水平均明显降低,接尘组MIP-1β水平也降低显著,差异均有统计学意义(均P<0.01);与接尘组比较,矽肺组血清MIP-1α和MIP-1β水平均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);血清MIP-3α水平在3组之间比较均无显著性差异(均P>0.05)。见表1。

注:MIP-1α—巨噬细胞炎症蛋白-1α;MIP-1β—巨噬细胞炎症蛋白-1β;MIP-3α—巨噬细胞炎症蛋白-3α。与对照组比较,aP<0.01;与接尘组比较,bP<0.01。

2.2 壹期矽肺患者血清中MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平与相关指标关系

与非吸烟矽肺患者比较,吸烟矽肺患者血清中MIP-1β水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);MIP-1α水平略降低,MIP-3α水平略增高,差异均无统计学意义(均P>0.05)。与非饮酒矽肺患者比较,饮酒矽肺患者血清MIP-1β和MIP-3α水平略增高,MIP-1α水平无明显变化,差异均无统计学意义(均P>0.05)。3组不同接尘年限的壹期矽肺患者血清中MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),见表2。

注:MIP-1α—巨噬细胞炎症蛋白-1α;MIP-1β—巨噬细胞炎症蛋白-1β;MIP-3α—巨噬细胞炎症蛋白-3α。与非吸烟组比较,aP<0.05。

2.3 壹期矽肺患者肺功能4项指标水平

与接尘组比较,壹期矽肺组用力肺活量(FVC%)、1秒钟用力呼气量(FEV1.0%)、用力呼气1秒率(FEV1.0/FVC%)和最大呼气中期流速(MMEF 75/25%)均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.01),见表3。

注:FVC%—用力肺活量;FEV1.0%—一秒钟用力呼气量;FEV1.0/FVC%—用力呼气1秒率;MMEF—最大呼气中期流速。与接尘组比较,aP<0.01。

2.4 壹期矽肺患者各项指标相关性分析

结果显示,MIP-1α与FVC%、MIP-1α与FEV1.0%呈正相关,相关系数r分别为0.330、0.324,P值分别为0.01、0.012,其他各指标间无相关性(P>0.05)。

3 讨论

研究证实,趋化因子与促纤维化因子协同作用,通过趋化肌纤维细胞、巨噬细胞和其他重要的效应细胞聚集在组织损伤部位,促进纤维化发展。MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α受细胞因子调节可趋化那些暴露后聚集的活化巨噬细胞,导致肺纤维化患者肺泡灌洗液中巨噬细胞数增加,同时CC趋化因子MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平也增加,并且与增高的肺泡巨噬细胞数有关,CC趋化因子在肺中巨噬细胞的聚集和炎症消除中起重要作用[6]。

MIP-1α和MIP-1β相对分子质量不同,但氨基酸序列同源性高,生物学活性相似,主要表达在单核/巨噬细胞和中性粒细胞,并促进其趋化活性,也可增加其他炎性细胞的分泌活性,对纤维化的发病机制具有重要的调节作用。曾有矽尘刺激小鼠实验发现,MIP-1α在不同浓度矽尘刺激组及各个不同时间点实验组均有显著不同,MIP-1α在矽肺炎症的发生及进展中发挥作用[3]。郭菲菲等[7]应用受试者工作特征(ROC)曲线评价认为,MIP-1α作为筛检指标具有较高的真实性和可靠性,在煤工尘肺早期诊断中具有较高的参考价值。我们研究显示,接尘和矽肺组血清中MIP-1α水平均明显低于对照组,接尘组MIP-1β水平也比对照组显著降低,而矽肺组血清中MIP-1α和MIP-1β水平均比接尘组显著升高。提示趋化因子MIP-1α和MIP-1β在接尘初期可能由于参与炎症的发生发展,趋化效应细胞而大量消耗导致降低,随着病情进展,大量效应细胞被激活,可能产生MIP-1α和MIP-1β增多,进一步参与了矽肺纤维化的发生发展。尤其是被认为主要纤维化介质的MIP-1α,可通过对M1和M2型巨噬细胞趋化作用的不同,在肺部炎症转化为纤维化过程中的作用更为突出[8]。

MIP-3α是气道上皮细胞的诱导产物,具有固有免疫和适应免疫双重特性功能的肽,可通过炎症介质调节气道上皮细胞表达,增加其在纤维化患者气道分泌物中的含量[9]。夏玉静等[10]曾用抗体芯片技术检测尘肺患者血清中多种趋化因子,发现MIP-3α等多数趋化因子表达降低。本研究结果显示,血清中MIP-3α水平在对照、接尘和矽肺3组间比较无明显改变,其表达可能受到其它生物介质作用,也不能排除方法学上的误差或其他影响因素干扰。MIP-3α在壹期矽肺发生发展中的作用有待进一步研究。

我们在对吸烟、饮酒是否对壹期矽肺患者血清中MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平影响的比较结果中发现,吸烟组血清中MIP-1β水平显著低于非吸烟组,MIP-1α和MIP-3α水平无明显改变,3指标在非饮酒组和饮酒组之间比较均无明显变化。有研究显示,MIP-3α及其受体相互作用,有助于慢性阻塞性肺疾病中吸烟引起的肺炎症及肺气肿形成,其受体缺陷可减缓疾病进程[11]。吸烟依赖γ-干扰素和CCR5途径可诱导趋化因子MIP-1α、MIP-1β的表达[12]。本研究结果与文献报道间存在差异,可能是由于矽肺发生发展过程中,机体内多种效应细胞和生物介质相互影响、相互作用,MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α表达受其它介质干扰所致,今后我们将加大样本例数或通过其它方法进行验证。本研究还显示,血清中MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平在壹期矽肺不同接尘年限间均无明显差异,提示接触矽尘时间长短可能对血清中MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α的表达影响不明显。

另外,本次肺功能研究结果显示,壹期矽肺组FVC%、FEV1.0%、FEV1.0/FVC%和MMEF 75/25%均明显低于接尘对照组,表明随着矽肺病情的进展,肺功能损伤较为严重,小气道功能受损,出现限制性和阻塞性通气功能障碍[13]。MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α间及其与4项肺功能指标相关分析结果显示,MIP-1α与FVC%、FEV1.0%呈正相关,其他各指标间无相关性,认为MIP-1α水平可间接反映限制性和阻塞性通气功能障碍。

作者声明

本文无实际或潜在的利益冲突

摘要：目的 探讨壹期矽肺患者血清中巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)和巨噬细胞炎症蛋白-3α(MIP-3α)水平变化及其与肺功能关系。方法 用Luminex流式荧光技术检测55例壹期矽肺(矽肺组)、35例具有与矽肺组相同接尘条件的健康井下接尘矿工(接尘组)和33例非接尘井上健康人员(对照组)血清中MIP-1α、MIP-1β和MIP-3α水平;用肺功能机检测用力肺活量(FVC%)、1秒钟用力呼气量(FEV1.0%)、用力呼气1秒率(FEV1.0/FVC%)、最大呼气中期流速(MMEF 75/25%)4项肺功能指标。结果 与对照组比较,接尘和矽肺组血清中MIP-1α水平均明显降低,接尘组MIP-1β水平也明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.01);与接尘组比较,矽肺组血清中MIP-1α和MIP-1β水平均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);吸烟矽肺患者血清中MIP-1β水平低于非吸烟矽肺患者,差异有统计学意义(P<0.05);矽肺组4项肺功能指标明显低于接尘组,差异均有统计学意义(均P<0.01);矽肺组MIP-1α与FVC%、MIP-1α与FEV1.0%均呈正相关(r=0.330、0.324,P<0.05)。结论 壹期矽肺患者血清中MIP-1α和MIP-1β水平异常,二者参与壹期矽肺发生发展;吸烟影响MIP-1β水平;MIP-1α水平可间接反映肺功能。

α、β细胞功能 篇4

1材料与方法

1. 1实验动物及分组

健康成年白兔40只,体重1. 8 ~ 2. 5 kg,雌雄不限,重量分布均一。采用随机数字表法分为4组,即拔伸松动手法组、注射透明质酸钠组、模型组,正常组。4组经治疗和观察6周后,拔伸松动手法组与注射透明质酸钠组各有2只实验兔死亡,与随机选取的模型组与正常组各8只实验兔进行相关指标检测。

1. 2治疗方法

拔伸松动手法组,以拔伸松动手法治疗兔右膝,专人操作,手法、操作步骤及时间固定。手法为按揉法、拔伸松动法; 取穴膝眼、血海、鹤顶、阳陵泉、阴陵泉、足三里、委中,家兔的取穴方法按《实验针灸学》［2］严格取穴。先按揉以上所取诸穴,20秒/ 穴,再施以拔伸松动手法: ( 1) 拔伸法施以患膝10秒后放松; ( 2) 徐徐拔伸患膝,在拔伸下分别以小鱼际固定于膝关节下缘之内侧和外侧,向对侧推按5次( 外侧向内侧,内侧向外侧) ; ( 3) 五指提拿髌骨10次,顺时针和逆时针活动髌骨5次,再上下左右推动髌骨; ( 4) 屈伸患膝关节30次; ( 5) 拔伸患膝10秒,在拔伸过程中作膝关节小幅度内旋和外旋运动。手法治疗每天一次,治疗十天后休息一天,共治疗6周。

注射透明质酸钠组,关节腔内注射透明质酸钠( 山东正大福瑞达公司生产,国药准字H10960136, 产品批号: 2012-01-09 ) 。规格2 ml ∶ 20 mg,按0. 15 ml / kg,每周注射1次,共治疗6周。

模型组,正常组仅给饲料,喂养6周。

1. 3观测指标

测定膝关节液中IL-1β、TNF-α 含量。采用IL- 1β 及TNF-α 试剂盒。 检测按照IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒酶标仪说明书操作。膝关节液采集施行膝关节穿刺,证实刺入关节腔后,注入0. 9% 的生理盐水0. 5 ml,反复回抽、注入3次后,再尽量抽出腔内液体。回收量0. 4 ~ 0. 6 ml,平均0. 5 ml。采集的膝关节冲洗液按说明采用双抗体夹心( ELISA) 法测定。

1. 4统计学处理

数据采用SPSS 17. 0软件进行分析,关节液中IL-1β、TNF-α 浓度水平采用均数 ± 标准差( ± s) 表示,每个指标数据用单因素方差分析做整体分析, 用LSD-t做两两比较。

2结果

4组白兔试验后膝关节液中IL-1β、TNF-α 浓度数据详见表1。

其中各组IL-1β 浓度平均数值为模型组> 正常组> 注射透明质酸钠组> 拔伸松动手法组,统计学上通过方差分析,F = 8. 833,P = 0. 000,P < 0. 05,表明四组兔膝关节液中IL-1β 浓度不全相等。用LSD-t进行两两比较分析,得出正常组与模型组比较P = 0. 001,拔伸松动手法组与模型组比较P = 0. 000,注射透明质酸组与模型组比较P = 0. 001,表明拔伸松动手法组、正常组、注射透明质酸组与模型组差异皆有统计学意义。拔伸松动手法组与正常组比较P = 0. 289,拔伸松动手法组与注射透明质酸组比较P = 0. 575,正常组与注射透明质酸组比较P = 0. 668,表明这三组之间两两比较差异无统计学意义。

各组TNF-α 浓度平均数值为模型组> 拔伸松动手法组> 注射透明质酸钠组> 正常组,统计学上通过方差分析,F = 11. 488,P = 0. 000,P < 0. 05,表明四组兔膝关节液中TNF-α 浓度不全相等。用LSD-t进行两两比较分析,得出正常组与模型组比较P = 0. 000,拔伸松动手法组与模型组比较P = 0. 001,注射透明质酸组与模型组比较P = 0. 000,表明拔伸松动手法组、正常组、注射透明质酸组与模型组差异皆有统计学意义。拔伸松动手法组与正常组比较P = 0. 151,拔伸松动手法组与注射透明质酸组比较P = 0. 230,正常组与注射透明质酸组比较P = 0. 891,表明这三组之间两两比较差异无统计学意义。

说明通过拔伸松动手法治疗和注射透明质酸钠治疗,都能降低膝关节关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度,且两组差异没有统计学意义。表明拔伸松动手法也是一种治疗膝关节骨性关节炎的有效治疗手段。

3讨论

膝关节骨性关节炎是由于关节滑膜退变,软骨破坏引起的以膝关节疼痛、僵硬和活动受限为特征的慢性骨关节病,其中关节软骨退变是OA发病的最直接原因,研究表明膝关节骨性关节炎的发病主要与生物力学因素、生物化学因素、遗传因素、炎症性因素等有关。近年来发现细胞因子IL-1β、TNF-α 是参与骨关节炎进程的重要介质,是炎症反应的重要调节剂,是调节炎症的始动因素,是骨关节炎病理过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的两种最重要的细胞因子［3-4］。Hung等［5］将重组人IL- 1β 注入兔膝关节,发现滑膜内有大量白细胞浸润, 滑膜细胞增生,滑膜肥厚,并有关节软骨蛋白多糖合成下降。TNF-α 在关节炎( 包括OA) 的发生过程中对关节软骨起着重要的破坏作用。TNF-α 和IL-1的生物学作用相似,但其生物学活性比IL-1约低100倍,在OA的发病中与IL-lβ 起着协同作用,动物模型研究也表明关节软骨的破坏主要是由IL-1β 激发的,并且在早期和TNF-α 是密切相关的［6-7］。

中医药治疗膝关节骨性关节炎有独特的优势, 其中推拿手法治疗本病的研究已取得可喜的进展。 近年来的研究证实: 手法的作用和关节被动运动可促进滑液向关节软骨的浸透和扩散,改善组织的营养代谢,有助于改善关节周围的血液循环,降低骨内压,促进关节周围组织的自身修复,改善关节软骨的营养和关节的润滑,并能减轻软骨的退变,还可增加股四头肌之肌力,改善关节的活动度［8-9］。 拔伸松动法为云南中医学院第一附属医院推拿科治疗膝关节骨性关节炎的经验手法,该手法将理筋手法与关节松动手法有机结合,包括拔伸下侧向推按法、髌骨松动法、拔伸下微旋法和屈伸法四步,临床研究中发现: 该手法能明显改善膝骨性关节炎患者关节活动度,缓解疼痛［10］。课题组在前期的实验研究中亦发现,拔伸松动法能明显改善兔膝骨性关节模型的关节活动度,修复退变的软骨组织［11］。

本课题将关节腔内注射透明质酸钠设为对照组,研究结果表明: 治疗后拔伸松动手法组关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度与正常兔膝关节液中的浓度无显著差异,较模型组中兔膝关节液中的浓度低; 拔伸松动手法组和注射透明质酸钠组,均能降低膝关节关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度,两组差异没有统计学意义。说明拔伸松动手法可能通过降低兔膝骨性关节炎关节液中的IL-1β、TNF-α 浓度, 达到抑制膝骨性关节炎软骨基质降解和关节软骨破坏的目的,对软骨损伤的修复有利。

摘要：目的 研究拔伸松动手法对膝骨性关节炎兔膝关节液中白细胞介素1β(interleukin 1beta,IL-1β)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的影响。方法 采用随机数字表法分为4组,即为拔伸松动手法组、注射透明质酸钠组、模型组,正常组。拔伸松动手法组手法治疗,每天一次,治疗十天后休息一天,共治疗6周;注射透明质酸钠组注射治疗,每周一次,共治疗6周;模型组正常喂养、正常组给正常喂养。结果 治疗后各组关节液中IL-1β浓度平均数值为模型组>正常组>注射透明质酸钠组>拔伸松动手法组;TNF-α浓度平均数值为模型组>拔伸松动手法组>注射透明质酸钠组>正常组。用方差分析及LSD-t进行两两比较分析显示,拔伸松动手法组、正常组、注射透明质酸钠组两个指标与模型组比较均为P<0.05,差异有统计学意义;拔伸松动手法组、注射透明质酸钠组、正常组之间两两比较比较,两个指标均为P>0.05,差异无统计学意义。结论 拔伸松动手法和注射透明质酸钠,均能降低膝骨性关节炎兔关节液中IL-1β、TNF-α的浓度,但两种方法之间不能认为有差异。拔伸松动手法可能通过降低膝骨性关节炎兔关节液中的IL-1β、TNF-α浓度,从而抑制膝骨性关节炎软骨基质降解和关节软骨破坏,对软骨损伤的修复有利。

α、β细胞功能 篇5

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

实验动物:40只成熟的健康成年新西兰白兔,雌雄均半,体重2.5～3.5 kg,由我院实验动物学部提供。实验主要药品:羊抗兔IL-1β、TNF-α单克隆抗体免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),单克隆抗体IL-1β、TNF-α抗体(R&D Systems)。

1.2 动物模型的制备

将新西兰白兔后膝关节局部脱毛,氯丙嗪1 mg/kg肌内注射,氯胺酮5 mg/kg肌内注射全身麻醉。麻醉成功后,仰卧固定于操作台,常规消毒、铺巾。取膝前内侧切口,依次切开皮肤、皮下筋膜组织,暴露膝关节。按改良Hulth模型法切断膝前交叉韧带、内侧副韧带,切除内侧半月板。冲洗关节腔,缝合皮下筋膜和皮肤。术后饲养于实验动物中心,单笼单只饲养,环境温度20～25℃,湿度50%～60%。青霉素20万U/kg肌内注射,每日1次,连续5 d,每日检查石膏固定情况,并及时进行修复。

1.3 动物分组与治疗方法

造模后2周,把右膝关节设为磁场治疗组(n=20),每日给予低频脉冲磁场治疗,磁场强度30 mW/cm2,频率1.0 MHz,频宽200μs,重复频率1.0 KHz,每次15 min。左膝关节为对照组(n=20),给予假磁场治疗(治疗过程同低频脉冲磁场组,磁场治疗仪不开机,探头无能量输出,为假治疗)。

1.4 膝关节活动度评价

处死动物后用量角器测量每只兔子的实验侧膝关节的被动活动度。

1.5 IL-1β和TNF-α表达检测

分别于动物模型制备治疗后1、4周深麻醉处死兔。制软骨细胞匀浆,留取上清后用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α含量。

1.6 Outerbridge评分

处死实验动物后大体观察关节液的变化,根据手术显微镜观察所见,采用Outerbridge软骨损伤评分方法进行评分。

1.7 统计学方法

应用SPSS 19.0统计学软件进行数据统计学处理,计量资料以均数±标准差表示,重复测量的计量资料采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-1β和TNF-α表达变化比较

在同一观察时间点,两组的IL-1β和TNF-α表达量均有差异,治疗组均明显少于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 两组Outerbridge积分比较

在同一观察时间点,治疗组软骨损伤程度较对照组轻微,Outerbridge积分也少于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

2.3 两组关节活动度比较

在同一观察时间点,治疗组的关节活动度均明显大于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

3 讨论

骨关节炎是一种多发于中老年人的慢性进行性骨关节病,属增龄性疾病,其主要病变是关节软骨的破坏及关节边缘的骨赘形成,其致病因素多种多样,除年龄外,肥胖、超负荷运动、遗传、环境、饮食、性别等都可能是发病因素[5]。现代生物医学研究则表明细胞因子、生长因子、免疫因素等都与膝骨关节炎的发生有关[6]。骨性关节炎动物模型较多,分为自发性模型和实验性或诱发性模型,笔者采用改良Hulth骨性关节炎模型,手术切断膝关节前交叉韧带、内侧副韧带并切除内侧半月板,通过改变关节正常的力学轴线促发关节软骨变性,能很好模拟软骨损伤的终末环节,更适用于晚期骨性关节炎的研究[7]。

目前,对于骨关节炎的治疗方法较多,大体可分为手术治疗和非手术治疗。非手术治疗包括合理的休息与功能锻炼、药物治疗、物理治疗、运动疗法、注射疗法以及中医治疗等。物理治疗是指应用各种物理因子来预防和治疗疾病[8]。已有研究证实,低频脉冲在一定频率和电流下,可促进组织重排,细胞软化,激发细胞分化,促进组织新生。脉冲微波同时还有杀菌作用,对局部细菌和真菌性炎症由于吸收的浓度不同,产生不同的杀伤作用,协助抗生素的抗感染作用。同时磁场的振动产生涡电流进入组织,这些电流会产生神经轴突的去极化,并向近端和远端方向输送传递性的神经冲动。而当磁场作用于生物体时,可影响体内电子运动方向和带电离子的分布及浓度、细胞膜电位、神经的兴奋和抑制,并可使细胞膜通透性增强,加速细胞内外物质交换。磁场作用于人体,可以扩张局部血管,促进血液循环和营养物质供应,同时降低了血液黏度,改善血液流变学特性,减弱致痛物质活性和瘀滞,从而缓解疼痛。

本研究通过对各组动物关节活动度与Outerbridge积分检测结果的分析,发现随着时间的延长,治疗组的关节活动度都在不同程度的增大,主效应都是比较明显的,直接提高了受损膝关节的关节活动范围,使得关节腔内炎性积液得以较快吸收消散,使其在关节局部的含量减低。同时Outerbridge积分也逐渐降低,从而加快关节软骨的新陈代谢,间接地提高了关节局部的抗氧化能力[9]。

IL-1β、TNF-α是一种重要的促炎症因子,具有广泛的生物学效应。研究表明,膝关节损伤缺血后IL-1β、TNF-α的释放可促进骨关节实质内白细胞的浸润,进而加重炎症反应;同时,IL-1β、TNF-α能促进IL-2、IL-6、IL-8等细胞因子的合成;此外,IL-1β还可以激活释放细胞因子、自由基等参与炎症反应[10]。本文结果显示,在同一观察时间点,两组的IL-1β和TNF-α表达量都有所差异,治疗组均明显少于对照组(均P<0.05),表明低频脉冲磁场对能有效缓解IL-1β、TNF-α的刺激释放。不过动物模型不能完全模拟人体骨性关节炎的自然病理过程,低频脉冲磁场对人体骨性关节炎的治疗效果仍需进一步的临床试验验证。

总之,低频脉冲磁场治疗骨性关节炎具有简便易行,安全无创等优点,可有效遏制IL-1β、TNF-α的释放,调节分泌作用,从而对骨性关节炎软骨损伤修复具有促进作用。

参考文献

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α、β细胞功能 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院住院或门诊就诊的无症状性HUA患者60例,均符合HUA的相关诊断标准[1]:男性SUA>420μmol/L,女性SUA>357μmol/L。其中男38例,女22例,年龄20～66(48.0±11.7)岁。所有患者均无痛风表现,排除药物、血液病、肾功能不全等因素继发者,常规肝、肾功能检查均正常。所有患者随机分为治疗组和对照组各30例。治疗组男18例,女12例,年龄20～66(46.8±11.1)岁;对照组男20例,女10例,年龄22～64(49.3±12.4)岁。2组性别、年龄、病情比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 研究方法

空腹血糖(FBG)、SUA、血脂指标[三酰甘油(TG)、总胆固醇(CH)、低密度脂蛋白(LDL)]采用罗氏生化仪测定,空腹胰岛素(FINS)采用放射免疫法测定。2组在治疗前均平衡饮食3d,于第4天清晨测量身高、体质量、血压[收缩压(SBP)、舒张压(DBP)],计算体质量指数(BMI),抽空腹静脉血,检测SUA、FBG、FINS、TG、CH、LDL水平。治疗组第5天始均予以低嘌呤饮食,别嘌醇片0.1g口服,2次/d,治疗后每间隔1个月复查SUA值,连续3次SUA值在正常范围后,测量BMI、SBP、DBP,抽清晨空腹静脉血,复查SUA、FBG、FINS、TG、CH、LDL水平。自开始治疗至SUA降至正常范围的时间为3～8个月,平均4.3个月。对照组未接受治疗,间隔4～5个月后复测BMI、SBP、DBP,并抽取空腹静脉血,复查SUA、FBG、FINS、TG、CH、LDL水平。IR的临床观察指标采用HOMA公式,即胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=[FINS(mU/L)×FBG(mmol/L)]/22.5;胰岛β细胞功能的观察指标,采用胰岛素敏感性指数(ISI)=[20×FINS(mU/L)]/[FBG(mmol/L)-3.5]。对2组治疗前、后各观察指标进行比较。

1.3 统计学方法

采用Stata 7.0软件对数据进行统计分析。计量资料以$\overline{x}\pm s$表示,组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2组治疗前所有观察指标水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗组治疗后SUA水平显著低于治疗前,且低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);但对照组治疗前、后SUA水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。2组间治疗后及组内治疗前、后其他观察指标水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

注:与治疗前比较,*P<0.01;与对照组比较,#P<0.01

3 讨 论

Bickel[2]和Feig[3]的前瞻性临床研究显示,HUA(>398μmol/L)患者6～7年后糖代谢异常发病率较HUA水平正常者(<280μmol/L)增高78%。也有研究表明[4,5],HUA可损伤血管内皮细胞合成一氧化氮(NO)功能,血管内皮细胞出现炎症反应,从而影响局部血供微环境,间接破坏胰腺β细胞功能而诱发糖尿病。据文献[1],80%的HUA患者合并高血压,50%～70%合并超重或肥胖,≥67%合并高脂血症。临床试验已证明抑制HUA水平可有效预防高血压发生与发展[1]。

本研究以目前国际上在临床实践中比较通用的HOMA公式评估HUA患者IR和胰岛β细胞分泌功能,同时结合BMI、SBP、DBP等指标,证明了HUA患者多存在超重或肥胖、高血脂、高血压,与其他研究结果相一致[6,7]。HUA常伴随代谢综合征、IR,FBG虽在正常范围,但胰岛β细胞处于高分泌功能状态,这可能是胰岛β细胞对机体内IR的一种代偿反应。但是在通过低嘌呤饮食、口服别嘌醇降低SUA治疗后,IR及胰岛β细胞功能却并无明显改善,提示HUA并发IR,单纯控制SUA可能已经不能逆转IR,但这一现象仍有待于进一步临床证实。

摘要：目的 探讨降低血清尿酸(SUA)水平对高尿酸血症(HUA)患者胰岛素抵抗(IR)、胰岛β细胞功能改善的影响。方法 将60例无症状性HUA患者随机分为治疗组和对照组各30例。治疗组采用低嘌呤饮食并口服别嘌醇治疗,对照组未接受治疗。观察2组治疗前、后体质量指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(CH)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(ISI)等指标的变化。结果 治疗组治疗后SUA水平显著低于治疗前,且低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);但对照组治疗前、后SUA水平无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。2组间治疗后及组内治疗前、后其他观察指标水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 HUA降低SUA治疗并不能改善IR、胰岛β细胞功能。

关键词：高尿酸血症,血清尿酸,胰岛素抵抗,胰岛β细胞功能

参考文献

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α、β细胞功能 篇7

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组

选择SPF级Wistar雌性成年大鼠60只, 体重 (200±20) g (山东大学实验动物中心提供, SCXK【鲁】20030004) , 常规饲养一周, 适应环境后, 按体重随机分为慢性盆腔炎造模组 (模型组) , 桂枝茯苓胶囊治疗高、中、低剂量组 (高、中、低剂量实验组) , 少腹逐瘀胶囊治疗组 (对照组) , 各组均为12只, 另选假手术慢性盆腔炎造模大鼠 (假手术组) 、正常饲养未干预大鼠 (正常组) 各12只。

1.2 实验试剂

1.2.1 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8的ELISA检测试剂盒 (美国ADL公司生产) 。

1.2.2 菌液配制

将大肠杆菌 (山东中医药大学附属医院菌种室提供) 、乙型溶血性链球菌 (山东省卫生防疫站提供) 和金黄色葡萄球菌 (山东中医药大学附属医院菌种室提供) 按2:1:1分别接种于血平板35℃, 24 h后, 稀释菌液, 无菌生理盐水2 ml, 分别取经24 h培养的菌株数个, 用标准麦氏管 (相当30亿个菌) 比浊, 制成浓度30亿/ml的混合细菌悬液。

1.2.3 实验药物

桂枝茯苓胶囊 (江苏康缘药业股份有限公司生产, 国药准字Z10950005) , 用蒸馏水制成31 mg/ml悬浊液;少腹逐瘀胶囊 (东阿澳东药业有限公司生产, 国药准字Z20000085) , 用蒸馏水制成45 mg/ml悬浊液。

1.3 实验方法及指标检测

采用混合细菌加机械损伤造模法[4], 大鼠腹腔麻醉取仰卧位, 取下腹正中切口1 cm, 暴露并固定子宫, 每侧宫腔内注入0.1 ml菌液, 注入前注射器机械损伤子宫内膜组织;假手术组动物开腹后, 双侧宫腔内分别注入0.1 ml无菌蒸馏水关腹, 术后均不使用抗生素。高、中、低剂量实验组分别按临床2倍、1倍、1/2倍剂量, 每天给予桂枝茯苓胶囊配制液502、251、125 mg/kg灌胃;对照组按临床等效剂量, 每天给予少腹逐瘀胶囊配制液364 mg/kg灌胃。模型组、假手术组、正常组予蒸馏水灌胃, 每100克灌胃1 ml/d。各组均为造模后第22天开始灌胃, 连续14 d。

给药后第15天清晨禁食, 1%戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔麻醉后, 心脏取血8 ml, 抗凝离心每分钟3000 r取上清液, -30℃以下保存, 酶联免疫吸附法 (ELISA法) 检测血清指标 (按ELISAkit操作说明进行) 。

1.4 统计学处理

应用SPSS 12.0软件统计, 计量资料以表示, 采用F检验和t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠用药结束后血清TNF-α检测比较

模型组血清TNF-α水平较正常组、假手术组明显升高 (P<0.01) ;中剂量实验组较模型组明显降低 (P<0.01) , 且接近正常组水平 (P>0.05) , 对照组较正常组明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;中剂量实验组较对照组降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 高剂量实验组较对照组升高, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 低剂量实验组较对照组明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;中剂量实验组血清TNF-α水平, 较高、低剂量实验组明显降低 (P<0.01) , 高剂量实验组较低剂量实验组亦明显降低 (P<0.01) 。见表1。

2.2 各组大鼠用药结束后血清IL-1β检测比较

血清IL-1β水平, 模型组较正常组、假手术组明显升高 (P<0.01) ;高、中剂量实验组、对照组较模型组明显降低 (P<0.01) , 且接近正常组水平 (P>0.05) ;高、中剂量实验组较对照组降低, 但差异无统计学意义 (P>0.05) , 低剂量实验组较对照组升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;高、中剂量实验组血清IL-1β水平, 较低剂量实验组明显降低 (P<0.01) , 中剂量实验组较高剂量实验组降低, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

2.3 各组大鼠用药结束后血清IL-8检测比较

模型组血清IL-8水平较正常组、假手术组明显升高 (P<0.01) ;中剂量实验组较模型组明显降低 (P<0.01) , 且接近正常组水平 (P>0.05) ;对照组较正常组明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;中剂量实验组较对照组降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 高剂量实验组较对照组升高, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 低剂量实验组较对照组明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;中剂量实验组血清IL-8水平, 较高、低剂量实验组明显降低 (P<0.01) , 高剂量实验组较低剂量实验组亦降低 (P<0.05) 。见表3。

3 讨论

3.1 前炎症细胞因子对炎症发展和结局的影响

前炎症细胞因子广泛参与机体免疫、炎症、感染等反应, 影响疾病的预后, 其中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等是重要的前炎症细胞因子, 可触发炎症细胞因子网络级联反应, 进一步与血小板激活因子、白三烯、氧自由基、一氧化氮等炎症介质共同作用, 推动疾病发生发展[5,6]。

TNF-α作为活化单核-巨噬细胞产生的一种重要细胞因子, 在感染性疾病和炎症方面, 能刺激血管内皮细胞表达黏附分子、刺激单核-巨噬细胞和其他细胞分泌趋化性细胞因子, 引起白细胞在炎症部位聚集, 促进炎症反应, 适量TNF-α增进机体免疫功能, 调节多种免疫细胞共同杀灭和消除入侵的致病原, 过度反应的过量TNF-α, 则产生剧烈免疫反应, 呈现毒性作用, 对机体造成损害[7]。IL-1β是旁分泌型细胞因子, 能调节炎症反应中纤维蛋白沉积和溶解, 增加成纤维细胞胶原酶的产生, 刺激成纤维细胞增殖, 促进胶原沉积。Wiczyk等[8]发现腹部大手术后患者的早期血清IL-1、TNF-α水平与术后肠粘连、腹腔内粘连有显著联系, 认为IL-1和TNF-α术后早期升高, 可作为人类术后腹膜粘连形成的可靠生物学标志。Hershlag等[9]实验证明, IL-1是术后腹膜粘连形成的重要短期介质。IL-8在炎症刺激后由巨噬细胞、内皮细胞和其他细胞产生, 主要特点是帮助募集中性粒细胞、单核细胞进入炎症部位, 调节白细胞黏附分子的表达[10], 导致粒细胞浸润、聚集、黏附、脱颗粒, 释放溶酶体, 呼吸爆发等, 参与水肿、渗出等各种炎症过程, 与免疫性炎症、感染性疾病、休克等密切相关[11]。

本研究结果显示, 血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平增高, 与大鼠慢性盆腔炎造模密切相关, 造模后37 d的模型组, 三项指标仍处于异常增高水平, 可能反映了局部过度的炎症反应。药物干预后, 血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平均能降低, 且降低幅度大, 接近正常组指标的组别, 其子宫大体形态学、组织病理学改变越接近正常组和假手术组, 这与笔者实验观察结果较一致[12]。因此, 推断TNF-α、IL-1β、IL-8可能在慢性盆腔炎发展和结局中发挥重要作用, 早期纠正其异常增高的水平, 可能是防治慢性盆腔炎的重要环节之一。

3.2 活血化瘀法对前炎症细胞因子的作用

具有活血化瘀功效的中药方剂, 能通过多环节调整炎症发展过程, 对前炎症细胞因子的作用是其调节炎症网络因子的主要方面之一。刘淑清等[13]证实, 益气补肾活血方可通过抑制与骨破坏密切相关的细胞因子TNF-α和IL-1水平, 可能是治疗类风湿关节炎的作用机制之一。胡波等[14]研究提示, 活血补肾方通过对IL-8、SIg A分泌量的调节起到调节免疫作用, 从而对ⅢA型前列腺炎大鼠起治疗作用。慢性盆腔炎 (CPID) 是指女性盆腔生殖器官及其周围结缔组织、盆腔腹膜发生的慢性炎症性病变, 西医妇产科学七年制教材统称为盆腔炎症性疾病后遗症, 现代中医妇科学认为, 血瘀是本病病机的关键所在。本研究干预药物选用临床确有疗效的妇科经典活血化瘀方剂桂枝茯苓胶囊、少腹逐瘀胶囊, 实验结果表明, 其作用机理与降低血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平, 使其接近正常, 纠正过度炎症反应密切相关, 并与药物剂量存在一定相关性。桂枝茯苓胶囊中剂量组 (相当于临床用量) 效果明显, 可见活血化瘀法通过下调前炎症细胞因子, 减轻和消除炎症损伤, 抑制炎症发展可能是其防治慢性盆腔炎的主要机理之一。

下一步研究思路:一是桂枝茯苓胶囊的剂量大小与其对慢性盆腔炎大鼠血清前炎症细胞因子降调节的程度, 呈现非正比关系, 这可能与炎症调控平衡点及实验偏倚有关, 需开展更为精确的不同剂量对比实验及可靠性高的重复性试验。二是活血化瘀法防治本病血清前炎症细胞因子之间的变化关系, 也有待进一步探讨。

摘要：目的:探讨活血化瘀法对慢性盆腔炎雌性大鼠血清前炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、白介素-1β (IL-1β) 、白介素-8 (IL-8) 水平的影响。方法:采用混合细菌加机械损伤方法, 建立慢性盆腔炎大鼠模型, 将60只造模后大鼠随机分为慢性盆腔炎造模组 (模型组) 、桂枝茯苓胶囊治疗高、中、低剂量组 (高、中、低剂量实验组) 、少腹逐瘀胶囊治疗组 (对照组) , 各组均为12只, 另选假手术慢性盆腔炎造模大鼠 (假手术组) 、正常饲养未干预大鼠 (正常组) 各12只。运用酶联免疫吸附测定法, 分别检测各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8的水平。结果: (1) 血清TNF-α、IL-8水平, 模型组较正常组、假手术组明显升高 (P<0.01) ;中剂量实验组较模型组明显降低 (P<0.01) , 且接近正常组水平 (P>0.05) ;中剂量实验组较对照组降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 高、低剂量实验组均较对照组升高 (P>0.05或P<0.01) ;中剂量实验组较高、低剂量实验组明显降低 (P<0.01) 。 (2) 血清IL-1β水平, 模型组较正常组、假手术组明显升高 (P<0.01) ;高、中剂量实验组、对照组较模型组明显降低 (P<0.01) , 且接近正常组水平 (P>0.05) ;高、中剂量实验组较对照组降低, 但差异无统计学意义 (P>0.05) ;高、中剂量实验组较低剂量实验组明显降低 (P<0.01) 。结论:活血化瘀法通过影响慢性盆腔炎大鼠血清前炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8水平, 以抑制炎症反应, 这可能是活血化瘀法治疗慢性盆腔炎和预防、缓解盆腔粘连的作用机制之一。