小胶质细胞（精选8篇）
小胶质细胞 篇1
帕金森病 (PD) 这一中枢黑质变性疾病, 小胶质细胞对其发病和病情进展中的重要地位已逐渐得到认识, 虽然左旋多巴及其复方制剂的发现, 但也只能补充已经减少的多巴胺 (DA) 水平, 却不能抑制多巴胺能神经的继续坏死, 甚至还认为具有神经毒性, 为此调控小胶质细胞活性来实现对多巴胺能神经的保护, 以求减缓病程进展对帕金森病人的威胁。
1 小胶质细胞的性能
小胶质细胞是哺乳动物大脑在胚胎和新生发育时期, 由于一些趋化因子的作用, 血源性单核细胞透过发育不完全的血脑屏障而浸润到大脑内, 也有人认为小胶质细胞来源于中胚层的骨髓前体细胞 (即单核巨噬细胞系统) 。在成年期, 成为脑内固有的免疫细胞, 参与脑内的炎症及免疫反应。小胶质细胞是中枢神经系统 (CNS) 独特的细胞类型, 属胶质细胞的一种, 占脑细胞的10%左右, 正常状态下的小胶质细胞胞体较小, 具有向各个方向伸出的细胞突起, 且突起细而长, 同神经元和星形胶质细胞有着紧密联系。静息状态下小胶质细胞只是通过简单的吞饮起到清除代谢产物, 维护组织稳定的净化作用以及可能通过释放低水平的生长因子促进神经元和胶质细胞的生存。
2 小胶质细胞被激活的作用
小胶质细胞对神经元损伤的作用是转化为激活状态, 几乎所有导致脑细胞损伤的因素如感染、炎症外伤、缺血或毒性物质等刺激时都能使小胶质细胞迅速活化, 体积增大, 突起伸长、增多, 细胞表面表达的456 补体受体和784 分子水平上调, 合成和分泌多种细胞因子如肿瘤坏死因子2α (TNF2α) 、白细胞介素21α、21β ( IL21α、IL21β) 、和表皮生长因子、免疫反应性纤维结合素 (IFN2γ) 、类花生酸物质和兴奋性氨基酸, 以及通过释放还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) 氧化酶衍生超氧化物自由基, 而上述细胞因子还可诱导星形细胞表达CD23 , 进而激活诱导型一氧化碳合成酶 (iNOS) 产生NO, NO与超氧阴离子 (O2-) 结合形成强氧化物质亚硝酸根离子 (ONOO-) , 直接损伤或分解为其他自由基, NO又可以刺激促炎因子的产生, 如TNF2α, 细胞因子也可以通过与细胞表面的细胞因子受体特异性结合, 如TNF2α通过活化其两种受体p55 (TNF2RI) 和p75 (TNF2RII) 而引起其生物学效应, 直接作用于神经元, 从而激活凋亡途径, 激活的小胶质细胞也可使前列环素限速酶COX-1、COX-2上调, 前列环素合成增加, 前列环素又是细胞N-甲基-D-天门冬氨酸 (NMDA) 谷氨酸受体突触后信号传递级联放大反应的一种中介物, 前列环素还通过抑制星形胶质细胞再摄取谷氨酸, 增强谷氨酸能神经元的传递, 小胶质细胞还可启动中枢神经系统的免疫应答对中枢神经系统产生损害作用, 细胞因子不仅对神经元产生毒性作用, 同时还刺激未活化的小胶质细胞活化, 扩大并增殖胶质细胞反应, 使炎症反应持续进行, 死亡的和即将死亡的神经元周围亦可见活化的小胶质正在吞噬多巴胺神经元和突触, 多途径的结果作用于周围的神经元, 最终导致神经元死亡[1]。但是小胶质细胞在活化的过程中同时也释放少量神经保护因子, 如胶质源性神经营养因子 (GDNF) 和白细胞介素210 (IL210) 等, GDNF对DA能神经元很强的营养和保护作用, 属转化生长因子-β (TGF-β) 家族, 它能特异性促进中脑DA能神经元存活、分化, 增加突触末梢对DA的摄取[2], 保护DA能神经元对抗6-羟多 (6-OHDA) 和1-甲基-4苯基-1, 2, 3, 6-四氢基吡啶 (MPTP) 等神经毒素的损伤[3], 明显阻止中脑黑质DA 能神经元数目的减少及使TH 阳性神经元数量显著增加等作用。IL210是具抗炎作用的细胞因子, 它能抑制小胶质细胞的活化和促炎因子的产生, 从而保护DA能神经元。
小胶质细胞在脑内的分布具有不均匀型性, 中脑黑质致密部的小胶质细胞分布密度明显高于其他脑区。实验发现中脑黑质内的神经元比其他脑区的神经元更易受到神经毒素的影响, 从而说明神经元对神经毒性的敏感程度可能取决于小胶质细胞的分布密度与数量[4]。Herrera 等[5]将脂多糖 (LPS) 注入脑内不同的区域, 通过免疫组化和原位杂交证实中脑黑质DA损伤的同时伴有明显的小胶质细胞激活。Liu等[6]用2.5 μg LPS注入中脑黑质使用小胶质细胞特异性标记物OX242 免疫组化分析, 6 h后一部分静止的小胶质细胞开始出现形态学的改变, 24 h后所有的小胶质细胞均被激活。周国庆等[7]发现, PD大鼠模型损伤侧黑质多巴胺区TNF2α和IL21 水平较对照组明显升高, Mogi等[8]发现, PD 病人尾状核、壳核处IL21β、IL22、IL26、TNF2α、转化生长因子2α (TGF2α) 和表皮生长因子 (EGF) 的浓度明显高于大脑皮质区及无神经疾病对照组的相应部位, 证实PD 病人DA能神经元的变性过程中确有细胞因子的改变。董丽华等[9]采用立体定向术将神经毒素6-OHDA注入大鼠右侧纹状体内, 制成帕金森病动物模型后, 发现模型组右侧黑质DA 能神经元的数量减少, 同时伴有星形胶质细胞和小胶质细胞的数量明显增高, TNF2A在模型组右侧黑质和纹状体内有阳性表达, 且主要分布在激活的小胶质细上。Agnieszka 等[10] 于2003 年用MPTP 制作PD小鼠模型, 也发现TNF2α在纹状体内很快增加, 在24 h达到峰值。在缺乏TNF2α受体的小鼠身上可以完全地对抗MPTP 所致的神经毒性, 在脂多糖处理的大鼠中脑原代培养体系中, 也发现有小胶质细胞的激活和细胞因子 ( TNF2α、IL21β) 表达的升高, 且伴随有多巴胺能神经元的死亡, TNF2α是一个具有潜在毒性的强有力的炎症介质, 在PD病人中可以发动及维持炎症反应过程, 这些结果说明TNF2α是多巴胺能神经元损害过程中一个必须因素。研究发现PD大鼠模型损伤侧黑质多巴胺区诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS) 基因表达增加[7], PD病人黑质中CD23 阳性星形胶质细胞增多, 星形细胞在维持邻近神经元代谢中起重要作用, 小胶质细胞可干扰星形细胞代谢如 (iNOS) 最终造成神经元损伤变性。PD病人体内也存在自身抗体, 侯晓妹等[11]用免疫亲和层析法获得PD血清中抗大鼠黑质部膜蛋白的IgG抗体成分, 其对黑质多巴胺能神经元具有免疫损伤作用, 自身免疫反应可导致神经元大量死亡, 神经元碎片成分又可释放更多的抗原成分, 继而触发下一个恶性循环。在PD死亡者的黑质胶质细胞中还发现有前列环素及其合成酶, 环氧合酶22的表达[12], 前列腺素E2的含量也上升, 升高的细胞因子很可能诱导炎性反应, 并通过增加脑内一氧化氮 (NO) 水平、诱导细胞程序性死亡等多种途径损害黑质多巴胺神经元。
3 一些抗炎和抑制小胶质活性的药物
近年来不断有证据表明, 在PD 的发生发展过程中, 小胶质细胞不仅是简单的反应性增生, 而且参与很多神经退行性疾病的发生、发展过程乃至最后结局。因此调控小胶质细胞以及抗炎处理便成为近年治疗PD的新方向之一。在动物实验中, Castano等[13]发现地塞米松能干扰LPS注射引起的胶质细胞反应, 保护多巴胺神经元。免疫抑制剂环孢素A和FK506能通过其受体亲免素对MPTP 引起的小鼠多巴胺神经元死亡发挥神经保护作用, 其作用机制还不清楚, 但可能为免疫干预治疗提供新的思路。水飞蓟宾也可抑制LPS 诱导的小胶质细胞激活和神经毒性因子如TNF2α, 超氧化物和iNOS 衍生NO 的产生, 从而减少大鼠多巴胺神经元损害。研究表明, 植物雌激素金雀异黄酮可抑制LPS诱导的小胶质细胞激活, 减轻多巴胺能神经元的损伤。程晓馨等[14]实验证明免疫抑制剂雷公藤氯内酯醇 (T4 ) 对PD大鼠具有肯定的神经保护作用, 其作用的发挥与T4抵抗细胞因子在脑内过度升高而产生的毒性作用有关, 推测T4通过抑制激活的胶质细胞、下调细胞因子在脑内的异常升高而保护DA神经元, 减缓DA神经元的进行性死亡进程。纳洛酮是一种类吗啡样多肽受体拮抗剂, 部分资料显示纳洛酮也可能抑制LPS 诱导的小胶质细胞活化和超氧化物的产生, 保护多巴胺神经元抗LPS诱导的炎症损害, 但与吗啡样受体的拮抗作用无关。最近研究表明, 血管活性肠道多肽是一种明显的抗炎神经多肽, 能通过阻断小胶质细胞活化和抑制神经毒性介质iNOS、TNF2α、IL21表达, 减少MPTP诱导的黑质多巴胺通路中神经变性。茶叶中没食子儿茶素 (EGC) 也被证实可抑制小胶质细胞活化, 保护多巴胺能神经元。米诺环素亦可有效抑制小胶质细胞活化, 减少小胶质细胞衍生的神经毒性介质IL21, 抑制iNOS和NADPH氧化酶, 减轻MPTP和6-OHDA导致的黑质中DA能神经元变性和纹状体DA含量的下降。过氧化物酶体增殖物活化受体γ (PPARγ) 是一种核转录因子, 属由配体激活的Ⅱ型核受体超家族的成员, 参与炎症反应及免疫调节, PPARγ激动剂如吲哚美辛、双氯芬酸及氟芬那酸能通过PPARγ依赖或非依赖机制抑制活化的小胶质细胞、促进活化的小胶质细胞凋亡、抑制环氧合酶 (COX) 合成前列环素从而发挥神经保护作用。
4 展 望
一些研究发现, 神经元和通过表达CD200作用于小胶质细胞的CD200R , 从而激活小胶质细胞, 因此以CD200R为靶点调控小胶质细胞亦将成为PD研究的新途径[15]。寻找能特异性抑制小胶质细胞活化而同时又能促进其释放神经保护因子的药物将是PD研究的新方向。
小胶质细胞 篇2
少突胶质细胞体外培养、纯化、鉴定及缺氧模型建立
目的 观察体外培养少突胶质细胞的增殖、分化及其生物学特性;探讨获得细胞纯度较高的实验方法及如何建立少突胶质细胞的`缺氧培养模型.方法 1.取新生SD大鼠脑皮质进行体外培养,采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养,倒置显微镜结合免疫荧光染色法鉴定细胞种类并分析纯度.2.缺氧联合低糖培养建立细胞体外缺氧培养模型,相差显微镜观察细胞的形态学变化.结果 1.获取高纯度的大鼠少突胶质细胞.少突胶质前体细胞祖细胞A2B5荧光标记阳性,成熟少突胶质细胞半乳糖脑苷脂阳性.2.缺氧培养 2小时细胞变化不明显,但缺氧培养6小时,细胞存活率明显下降,并且随着缺氧时间延长存活细胞更少,凋亡细胞更多,至缺氧培养10小时,大多数细胞破碎.结论 1.两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞.2.低糖联合缺氧培养模型可以建立可行的少突胶质细胞体外缺氧模型.
作 者：杨晖 王玮 YANG Hui WAN Wei 作者单位：杨晖,YANG Hui(福建医科大学附属厦门市第一医院眼科,福建厦门,361004)王玮,WAN Wei(福建医科大学基础医学院,福建福州,350001)
刊 名：四川解剖学杂志 英文刊名：SICHUAN JOURNAL OF ANATOMY 年，卷(期)： 17(4) 分类号：Q28 关键词：少突胶质细胞 细胞培养 细胞分离 缺氧小胶质细胞 篇3
1 小胶质细胞的活化机制
1.1 分子机制
小胶质细胞的特征之一就是受刺激后迅即激活。引发其活化的因素十分广泛, 例如:脂多糖 (LPS) 、三磷酸腺苷 (ATP) 、β-淀粉样前体蛋白 (β-APP) 、炎性细胞因子、诱导型一氧化氮合酶 (iNOS) 等。但什么分子启动小胶质细胞的活化至今还是个谜。小胶质细胞的激活可能与下列结构有关:小胶质细胞有中枢神经系统 (CNS) 信号分子 (ATP, CGRP, Ach) 等的膜受体 (β-APP 直接激活小胶质细胞, 诱发其产生IL-1, 从而激活补体系统, 补体系统随着IL-1的表达, 进一步活化小胶质细胞) [2];小胶质细胞上的膜通道 (如钾离子通道, 这种类型的通道使小胶质细胞对去极化非常敏感) [3];细胞内信号传导途径 (PTK、PLA2级联反应途径参与了小胶质细胞的激活) [4,5];细胞内转录因子的激活:小胶质细胞的激活可能与细胞内核转录因子κB (NF-κB) 、环磷酸腺苷 (cAMP) 反应元件结合蛋白等的活化有关[6,7]。此外, 扩展性抑制神经递质、氧自由基、多种可溶性炎性细胞因子, 如TNF-α、内皮素 (ET) 等, 均可诱导广泛的小胶质细胞激活, 引起吞噬活动增加, 趋化作用、细胞因子分泌和一氧化氮合酶表达[8]。
1.2 炎性因子激活小胶质细胞机制
①小胶质细胞表面存在TNF-α受体, 在中枢神经系统免疫炎症反应中发挥重要作用。敲除小鼠TNF受体 (TNFR) 后, 动物对兴奋性毒素和脑缺血损害反应加剧, 而给予TNF-α也不能对神经元发挥保护作用。此外, 这种小鼠脑内小胶质细胞对红藻氨酸 (KA) 刺激的反应性也大大减弱, 提示TNF-α在小胶质细胞的激活中起着重要作用[9]。②集落刺激因子 (CSF) 作为小胶质细胞的有丝分裂原, 可刺激小胶质细胞增生、活化[10] 。巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF) 可增加小胶质细胞IL-1、IL-6和NO 的释放, 放大小胶质细胞的毒性作用, 进一步活化小胶质细胞。脑缺血时, 反应性星形细胞分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 增加、刺激小胶质细胞活化增殖。③在白细胞介素-3 (IL-3) 诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎的实验中发现, IL-3可活化CNS 中的小胶质细胞。而活化的小胶质细胞和巨噬细胞也可产生IL-3。④IFN主要由淋巴细胞产生, 是较强的小胶质细胞激动剂, 可促进补体C1q、C3 和C4 的产生, 增加TNF-α的释放, 促进活性氧 (ROI) 和NO 的产生, 诱导神经胶质细胞增生[11]。在IFN-γ转基因鼠中, 可观察到皮质小胶质细胞MHC Ⅱ类分子mRNA 增加, 小胶质细胞活化和神经胶质细胞增生。
并非单一因素激活小胶质细胞, 不同的信息分子调控小胶质细胞活化的不同方面, 这决定了小胶质细胞的活化特征, 包括在细胞大小、数量、分子水平、免疫显型、细胞因子和生长因子的活化表现。此外, 与小胶质细胞活化有关的其他因素包括氧自由基、超氧化物、非甾体抗炎药、抗白细胞药、人工合成的多肽和抗生素以及温度等[12] 。心力衰竭时循环中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6长时期增高, 环氧化酶2 (COX-2) 、前列环素E2 (PGE2) 也增加。而许多炎性细胞因子参与小胶质细胞激活。表明心力衰竭可能引起小胶质细胞激活, 而小胶质细胞激活进一步加重心力衰竭。提示小胶质细胞在下丘脑室旁核神经系统的激活与心力衰竭之间建立了相互联系, 这种关联的分子机制有待于进一步阐明。小胶质细胞激活的现象已被充分认识, 可激活机制的研究才刚刚起步, 正常脑组织中静息小胶质细胞的功能状态有待于深入探索。
2 小胶质细胞的作用
最近研究表明, 缺血性心力衰竭时下丘脑室旁核小胶质细胞激活分泌炎性细胞因子 (如TNF-α, IL-1β和IL-6等) 、类花生酸类物质、活性氧簇 (ROS) 、氧化亚氮 (NO) 及过氧化物等物质[13]。脑室内给药阻断小胶质细胞激活可减少交感神经兴奋, 减少循环血中炎性细胞因子, 阻止左室重构[1]。提示小胶质细胞激活在缺血性心力衰竭中起重要作用。同时有研究证实细胞因子反过来能激活小胶质细胞。这样在体内就形成一个正反馈环路, 使细胞因子不断增加[14]。
3 小胶质细胞和心力衰竭
心力衰竭病人外周血循环中炎性细胞因子显著增加[15,16]。尽管炎性细胞因子不能穿过血脑屏障, 但炎性细胞因子将激活NF-κB导致室旁核 (PVN) 微血管表达COX-2[17,18,19,20]。在血脑屏障上皮细胞COX-2催化下产生PGE2[21,22,23,24]。PGE2的作用:①研究表明PGE2在下丘脑的作用是通过对γ-氨基丁酸能神经元超极化作用, 抑制PVN自律性和神经内分泌, 从而提高下丘脑-垂体-肾上腺轴活性[25], 导致交感神经性血压升高、心率加快和循环中去甲肾上腺素 (NE) 增加。②心力衰竭时PGE2进入脑组织引起致炎细胞因子合成并激活下丘脑室旁核小胶质细胞[26,27], 小胶质细胞也可产生炎性因子, 如TNF-α, IL-1β和IL-6[28], 并激活下丘脑神经元, 特别是下丘脑室旁核神经元, 激活下丘脑-垂体-肾上腺髓质 (HPA) 轴[26,29,30]。
此外, 传统的观点认为中枢神经系统是免疫豁免器官, 随着发现激活的T 淋巴细胞可附着在脑毛细血管内皮细胞表面, 通过分泌内皮糖苷酶降解基膜, 以变形的方式穿过内皮细胞层进入脑内也可引发脑内的炎症反应[31]。如 T 淋巴细胞可分泌较强的小胶质细胞激动剂IFN-γ、TNF-α。
综上所述, 各种因素引起的心力衰竭导致炎性细胞因子合成增加, 炎性细胞因子通过一些转变穿过血脑屏障进入下丘脑室旁核激活小胶质细胞, 反应性小胶质细胞反过来分泌炎性细胞因子激活HPA轴加重心力衰竭。可见小胶质细胞和心力衰竭相互作用、相互影响形成正反馈环路, 但是它们之间某些特定的调控作用以及确切的作用机制还不十分清楚, 仍有待于更深入的研究。
4 结语
小胶质细胞 篇4
细胞疗法的目标是要在体内形成新的细胞以治疗疾病。两年前, 隆德大学的研究人员就对人类皮肤细胞 (成纤维细胞) 进行重编程, 使其直接变身为可产生多巴胺的神经细胞, 从而绕过了干细胞这一中间阶段, 当时这在世界上尚属首次。现在, 该小组又证实, 皮肤细胞和支持细胞都有可能直接在大脑中重编程为神经细胞。
研究人员使用一种被设计过的基因, 可通过药物激活或使其失活。这种基因被插入两种类型的人类细胞中:成纤维细胞和神经胶质细胞, 后者是自然存在于大脑中的支持细胞。随后, 研究人员将细胞移植进大鼠的大脑, 并在大鼠的饮用水中加入药物将基因激活。结果发现, 这些细胞开始向神经细胞转化。
在另一项实验中, 研究人员向小鼠大脑内注入同样的基因后, 也成功将小鼠自身的神经胶质细胞重新编程成为神经细胞。“这一发现是首个表明其他细胞有可能在大脑内经过重编程而转化为神经细胞的重要证据。”研究小组负责人马林·帕尔马说。
他表示:“研究结果有望开辟一条途径, 为将来的细胞疗法植入物找到替代品, 从而扫除以前遭遇的研究障碍, 比如难以让大脑接受外来细胞, 以及易形成肿瘤的风险等。”在大脑中直接对细胞重编程的新技术开启了新的可能性, 为更有效地替换帕金森氏症等患者已经死亡的脑细胞创造了条件。
“我们正在对这项技术进行开发, 以便用它来创建新的神经细胞, 取代受损细胞的功能。能够在体内进行重新编程也就意味着可以设想, 未来我们可以直接在人类大脑中形成新的细胞, 而无需绕行细胞培养和移植这条弯路。”帕尔马说。
这项研究让人们展开想象:其他细胞可以重新编程直接转化为神经细胞, 那么是否也可以转化为肌肉细胞、肝细胞等其他细胞?既然细胞可以实现转化, 那么转化细胞能否形成组织, 继而组成器官?尽管想象难以在短时间内成为现实, 但积跬步以至千里, 我们相信对细胞这一生命基本单位的这类研究必将成为揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。
节细胞胶质瘤1例 篇5
讨论:节细胞胶质瘤 (Ganglioglioma, GG) 是一种既有神经元又含有胶质的肿瘤, 临床上极其罕见, 好发于儿童和青少年, 常见于30岁前。其发生率占整个神经系统肿瘤的0.4%～6.25%[1,2]。但它是混合性神经元-神经胶质肿瘤中最常见的类型[3]。是中枢神经系统少见的低级别肿瘤, 生长缓慢, 临床过程偏于良性肿瘤, 通常手术切除预后良好。Luyken 等[4]对86 例神经节细胞胶质瘤患者在肿瘤切除后7年随访, 仅有1例复发, 86%幕上神经节细胞胶质瘤患者术后无癫痫发作。CT、MRI是临床诊断节细胞胶质瘤的最重要方法之一。但是在对肿瘤的定性和定位诊断上, MRI 检查效果明显优于CT, 故MRI检查为肿瘤的术前准备提供了有利的依据 , 早期治疗对其预后改善有重要意义。肿瘤主要见于幕上大脑半球, 以颞叶最常见, 其次是额叶和顶叶, 偶见与脑室、桥小脑角区、脑干、丘脑等, 发病部位比较广泛。肿瘤通常单发, 多发极其少见。神经节细胞胶质瘤没有特征性的CT 表现, 肿块通常呈低密度或等密度, 有20% ～ 50%的病例可以出现钙化[5]。节细胞胶质瘤MRT1加权图像常表现为不均匀低信号或等信号, T2加权图像一般表现为高信号。CT平扫常表现为低密度或等密度, 少数为高密度可以有囊变及钙化, CT和MR增强扫描半数以上囊壁有轻中度强化, 囊性为主型常表现是囊变伴强化壁结节。完全囊性者可无强化。按病理特点将其分为囊性、囊实性和实性。肿瘤囊变较常见, 完全囊变可仅由单个或多个囊组成。附壁结节和钙化为节细胞胶质瘤的重要的影像学征象。典型的节细胞胶质瘤影像学表现很有特点, 即单个大囊加壁结节钙化。本病还应与胶质瘤相鉴别, 后者MRI信号多不均匀, 瘤内出血和坏死比较常见, 而钙化少见, 灌注MRI和MRS利于两者鉴别.囊实性神经节细胞胶质瘤需与胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、血管母细胞瘤以及毛细胞型星形细胞瘤相鉴别. 实性为主、周边可见小囊变区者需与分化较好的星形细胞瘤相鉴别. 实性神经节细胞胶质瘤: 需要与脑炎相鉴别, 灌注MRI和MRS利于两者鉴别。
参考文献
[1]Matsumoto K, Tamiya T, Ono Y, et al.Cerebral gangliogliomas;clinical characteristics, CT and MRI[J].Acta Neurochir (Wien) , 1999, 141:135
[2]沈天真, 陈星荣, 主编.神经影像学[M].上海:上海科技教育出版社, 2004, 698
[3]张冬, 邹利光, 冯晓源, 等.颅内节细胞胶质瘤的MRI特征分析[J].临床放射学杂志, 2008, 27:865
[4]Luyken C, Blumcke I, Fimmers R, et al.Supratentorial gangli-ogliomas:histopathologic grading and tumor recur-rence in 184patients with a median follow-up of 8 years[J].Cancer, 2004, 101 (1) :146-155
小胶质细胞 篇6
神经胶质细胞是哺乳动物神经组织中除神经元以外的另一大类细胞, 其数量为神经元的10倍。直到最近, 科学家都认为神经胶质细胞只是为神经元提供结构和营养支持, 而星形胶质细胞作为神经胶质细胞中最大的一种, 则只是在神经元间起到联结纽带的作用。
英国布里斯托大学和伦敦大学学院的研究人员通过先进的基因转移技术, 对小鼠大脑中星形胶质细胞的活动进行观察后发现, 该种细胞的化学敏感度极高, 能够感知血液中二氧化碳水平的变化, 当二氧化碳含量过高时, 它们会释放化学信号三磷酸腺苷 (ATP) , 刺激大脑神经中枢调整呼吸强度, 以移除血液中过多的二氧化碳。
研究人员表示, 该发现表明, 星形胶质细胞可根据不断变化的新陈代谢和活动需要来调节呼吸强度, 它在呼吸调节方面居于中心地位。而神经胶质细胞功能障碍很可能与婴儿猝死综合征或先天中枢性换气不足症有关。如果这个假设正确, 星形胶质细胞则可作为防止呼吸衰竭的潜在治疗标靶。
小胶质细胞 篇7
1 材料与方法
1.1 试剂
青霉素、链霉素、Hoechst 33342、MTT为美国Sigma公司产品,胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司,干细胞培养基购自美国Millopore公司,PRMI 1640培养基购自英韦创津公司,FITC-CD133抗体为美国R&D公司产品。
1.2 细胞系及培养
神经胶质瘤C6细胞在37℃5%二氧化碳条件下培养于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素及100IU/mL链霉素的PRMI 1640培养液中。
肿瘤的球囊培养(sphere):使用干细胞无血清培养基,按照说明书操作,每3天加1次EGF(20ng/mL)、b FGF(20 ng/mL)和1×B27(无维生素A)。
1.3 实验动物以及裸鼠成瘤实验
BALB/c-nu裸鼠购自省医学实验动物中心,鼠龄5~6周,体重20~25 g,无特殊病原体(SPF)条件下饲养。分选的SP和NSP细胞分为103、104、105和1064组,每组5只裸鼠,每只裸鼠皮下接种两个部位,1个月后处死裸鼠计算成瘤率。
1.4 侧群(SP)细胞的流式细胞仪分选
参照林琳等[4]的方法,简述如下:取对数生长期的神经胶质瘤C6细胞,制成单细胞悬液调整细胞浓度为106/m L,加入Hoechst 33342至终浓度5mg/L,另取1 m L细胞加入维拉帕米至终浓度50mg/L作用30 min后再加入Hoechst 33342作为对照,37℃水浴避光染色90 min,其间不断摇匀细胞避免细胞沉淀。FACS AriaⅡ流式细胞仪(美国BD公司产品)IL6和IL7双通道做门,结合维拉帕米的对照样品分选SP细胞。
1.5 生长曲线绘制
将分选的SP和NSP细胞接种到96孔板每孔1 000个细胞,常规含血清培养基培养,于2、4、6、8和10 d后加入MTT,酶标仪570 nm波长测定OD值,每个时间点设置3个复孔,每个孔计数3次,参照郝新保等[5]的方法制作OD值与细胞数标准曲线,然后在标准曲线上计算出所测OD值对应的细胞数,取平均值绘制细胞时间—生长曲线。
1.6 克隆形成能力检测
将分选的SP和NSP细胞接种到46孔板每孔400个细胞,常规含血清培养基培养,2周后计数细胞多于50个的克隆,计算克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。
1.7 CD133表达的流式细胞仪检测
按照抗体试剂盒的说明书操作,分选的SP和NSP细胞调整细胞浓度至106/m L,取400μL,BAS封闭细胞1 h,加入FITC-CD133抗体10μL,避光染色30 min,同型对照调零,流式细胞仪IL-1通道处检测细胞CD133的表达量。
1.8 统计分析
实验数据连续性资料以表示,应用SPSS12.0统计软件处理数据,两样本均数比较采用t检验,多组间均数比较采用方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 神经胶质瘤C6细胞侧群(SP)细胞的流式细胞仪检测和分选
神经胶质瘤C6细胞中SP细胞的比例为(4.24±1.36)%,加入维拉帕米抑制后SP细胞的比例变为(0.04±0.02)%(下图1),说明所选定的区域可以用于分选,使用建立的方法我们得到了纯度>95%的SP细胞。
2.2 SP和NSP细胞增殖速度的比较
从图2可以看出SP和NSP细胞在第2、4天生长差异无显著性(P>0.05),到第6、8、10天SP细胞的生长速度显著快于NSP细胞(P<0.05)。
2.3 SP和NSP细胞球囊性生长和克隆形成能力的比较
图3A显示在无血清条件下培养SP细胞有形成球囊的特性,而NSP细胞无球囊性生长的特性。在常规培养条件下SP细胞的克隆形成率为(31.24±6.48)%,NSP细胞的克隆形成率为(9.63±1.16)%,二者之间差异有显著性(P<0.01)。
2.4 SP和NSP细胞裸鼠成瘤能力的比较
103、104、105和106个SP细胞接种裸鼠皮下,成瘤率分别为40.00%、60.00%、80.00%和100.00%,而NSP细胞的成瘤率分别为0.00%、0.00%、60.00%和70.00%,两组之间差异有显著性(P<0.05)。
2.5 SP和NSP细胞CD133表达的比较
流式细胞仪检测显示SP细胞CD133表达的量为(61.74±7.32)%,NSP细胞CD133表达的量为(1.06±0.81)%,二者之间差异有显著性(P<0.01)。
3 讨论
最近的研究显示肿瘤细胞内存在有一小群具有高增生潜能和自我更新潜能的起始细胞被称为肿瘤干细胞,随后的研究证实了正是这一小群起始细胞是肿瘤复发的根源,并且对传统的化疗药物不敏感成为化疗失败原因之一[6]。
1996年Goodell等研究小鼠造血干细胞时发现有一小群对Hoechst 33342拒染的细胞,分离这群细胞后检测发现其造血能力是普通骨髓的1千多倍,因这群细胞在流式细胞仪检测中位于细胞主群的一侧,故称为侧群(SP)细胞[7]。随后的研究发现肿瘤细胞中也存在这样一群干细胞样细胞,目前肿瘤干细胞的分选主要有免疫标记、球囊培养富集、SP分选3种,因为肿瘤干细胞的特异性标记蛋白在一些肿瘤肿瘤中并不明确,无血清悬浮培养耗时太多而且培养条件比较苛刻,所以SP细胞分选已成为大多数肿瘤干细胞分选的常用方法[8,9]。本组使用Hoechst 33342染色神经胶质瘤C6细胞流式细胞仪检测显示约有4.24%的SP细胞,加用维拉帕米后这群细胞消失,证明了神经胶质瘤细胞中存在少量的SP细胞。随后笔者分选了这群细胞,生物活性检测显示SP细胞较NSP细胞具有较强的增殖、克隆形成、球囊性生长、致裸鼠成瘤能力,上述结果说明本组分离得到的SP细胞具有干细胞的特性,可以用于神经胶质瘤干细胞的研究。
CD133是已被大多数实验证实的神经胶质瘤干细胞的免疫标志物,并且CD133已被研究者作为神经胶质瘤复发和预后监控的一个评估指标[10,11,12]。本组分选的神经胶质瘤SP细胞检测显示CD133表达量高达60.00%以上,而NSP细胞基本测不出CD133的表达,进一步证实了神经胶质瘤SP细胞具有干细胞样特性。
综上所述,本研究在神经胶质瘤细胞中发现了SP细胞的存在,SP细胞具有干细胞的特性且高表达CD133,这种肿瘤干细胞的富集方法为以后神经胶质瘤干细胞的研究提供了有力的保障。
摘要：目的 分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群(SP)细胞,探讨其相关生物学特性。方法 Hoechst33342染色流式细胞仪分选SP细胞,另取非侧群(NSP)细胞作为对照。MTT法绘制细胞生长曲线,平板克隆法检测细胞克隆形成能力,无血清悬浮培养观察细胞的球囊形成能力,裸鼠移植瘤实验检测细胞的成瘤能力,流式细胞仪检测细胞CD133的表达。结果 神经胶质瘤C6细胞中SP细胞的比例为(4.24±1.36)%。SP细胞的生长速度显著快于NSP细胞(P<0.05)。SP细胞在无血清条件下培养有形成球囊的特性,而NSP细胞无球囊性生长的特性。SP细胞的克隆形成率为(31.24±6.48)%显著高于NSP细胞的(9.63±1.16%)(P<0.01)。103、104、105、106个SP细胞接种裸鼠皮下,成瘤率分别为40.00%、60.00%、80.00%和100.00%,而NSP细胞的成瘤率分别为0、0、60.00%和70.00%,两组之间差异有显著性(P<0.05)。SP细胞CD133表达的量为(61.74±7.32)%显著高于NSP的(1.06±0.81)%(P<0.01)。结论 神经胶质瘤中存在SP细胞,SP细胞高表达干细胞标志蛋白CD133,SP细胞分选可以富集神经胶质瘤肿瘤干细胞样细胞。
关键词：神经胶质瘤,肿瘤干细胞,侧群细胞,CD133
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小胶质细胞 篇8
肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor, HGF) 是一种具有多种生物学效应的细胞因子, 不仅能促进多种细胞的增殖、存活、迁移, 还具有促血管形成的作用[2,3]。笔者前期通过在体实验的研究显示, 外源性HGF的使用对大鼠脑缺血/再灌注损伤具有保护效应, 能明显改善其神经功能障碍, 减小脑梗死灶体积, 降低脑含水量[4,5]。本实验采用体外氧糖剥夺/再灌注 (oxygen-glucose deprivation/reperfusion, OGD/R) 模型来模拟体内缺血/再灌注损伤, 探讨HGF对星形胶质细胞耐受性的影响及其可能的机制。
1 材料与方法
1.1 试剂
人重组HGF (美国R&D systems公司) , DMEM培养基 (美国Gibco公司) , 小牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司) , 多聚-D-赖氨酸 (美国Sigma公司) , 胰蛋白酶、MTT、DMSO (美国Amresco公司) , Hoechst 33258 (美国Invitrogen公司) , 兔抗bcl-2多克隆抗体、兔抗bax多克隆抗体 (美国Santa Cruz公司) , 鼠抗β-actin单克隆抗体 (武汉博士德生物工程有限公司) , HRP标记羊抗兔Ig G二抗、HRP标记羊抗小鼠Ig G二抗 (美国Santa Cruz公司) , ECL Western blot试剂盒 (美国Pierce公司) 。
1.2 仪器
二氧化碳培养箱 (3131, 美国Thermo Scientific公司) , 倒置显微镜 (IX70, 日本Olympus公司) , 低温高速离心机 (5415C, 美国Eppendorf公司) , 自动生化分析仪 (7100, 日本Hitachi公司) , 酶标仪 (ELx800UV, 美国Bio Tek公司) , 流式细胞仪 (Epics XL, 美国Beckman Coulter公司) 。
1.3 实验方法
1.3.1 大脑皮层星形胶质细胞的分离培养
取出生24 h内的新生SD大鼠, 断头取脑, 无菌条件下分离出双侧大脑皮层, 0.125%胰酶37℃消化10 min。分离所得细胞重悬于含10%小牛血清的DMEM培养基中, 种植在预先用多聚-D-赖氨酸 (100μg/m L) 包被过的培养瓶中, 置37℃、5%二氧化碳、饱和湿度细胞培养箱内培养, 选择生长状态良好的第4次传代后细胞用于实验。
1.3.2 OGD/R损伤模型
OGD:细胞培养液换为预先通以无氧混合气体 (95%N2+5%二氧化碳) 30min的无糖DMEM培养液, 然后将细胞立即置于通有无氧混合气体 (95%N2+5%二氧化碳) 的密闭室内, 37℃、饱和湿度条件下培养。此时开始计OGD处理时间, 如OGD 12 h, 记为OGD12。R:OGD 12 h后, 换含25 mmol/L葡萄糖的培养液, 37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱内培养。OGD 12 h后, 再灌注0、6、12及24h, 分别记为OGD12/R0、OGD12/R6、OGD12/R12、OGD12/R24。
1.3.3 给药方法
细胞于OGD处理前2 h, 加入不同终浓度 (5、10、20、40、60及80 ng/m L) 的HGF。
1.3.4 MTT比色法检测细胞活力
每孔加入终浓度为0.5 mg/m L的MTT, 于37℃孵育4 h, 弃上清, 加入DMSO, 振荡20 min, 置酶标仪570 nm处测定OD值。以对照组细胞活力为100%, 实验组细胞活力 (%) =实验组OD值/对照组OD值×100%。
1.3.5 乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase, LDH) 漏出率的测定
分别收集细胞孵育液和细胞裂解液, 自动生化分析仪测定LDH活性。LDH漏出率 (%) =细胞孵育液LDH活性/ (细胞孵育液LDH活性+细胞裂解液LDH活性) ×100%。
1.3.6 流式细胞术
收集细胞, 加入冰预冷的70%乙醇于4℃固定24 h。调整细胞密度为1.0×106个/m L, 取1 m L细胞悬液, 用PBS洗3次, 细胞重悬于含RNase A的PI染液中, 37℃孵育30 min, 以流式细胞仪分析细胞凋亡率。
1.3.7 Hoechst 33258染色
细胞用3%多聚甲醛固定后, 加入1μg/m L Hoechst 33258, 室温孵育10min, 荧光显微镜下观察并计数。凋亡细胞显示核浓染、碎裂等典型的形态学改变, 同一处理随机选择至少10个观察视野, 计算细胞凋亡率 (%) 。
1.3.8 Western
blot检测bcl-2、bax蛋白的表达提取蛋白, 取制备的蛋白样品, 进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 电转移至PVDF膜上。用含3%牛血清白蛋白的TBST (含0.05%Tween-20的TBS) 室温封闭1 h, 分别加入兔抗bcl-2多克隆抗体、兔抗bax多克隆抗体及鼠抗β-actin单克隆抗体, 4℃孵育过夜。TBST漂洗3次, 分别加入HRP标记羊抗兔Ig G二抗及HRP标记羊抗小鼠Ig G二抗, 室温孵育1 h。TBST漂洗3次, 用ECL Western blot试剂盒检测。
1.4 统计学分析
用SPSS 20.0统计学软件进行分析, 结果以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用方差分析, 以P<0.05为具有显著性差异。
2 结果
2.1 OGD12/R对星形胶质细胞的影响
2.1.1 OGD12/R对细胞活力的影响
以常氧、葡萄糖浓度为25 mmol/L条件下培养的星形胶质细胞为对照, 细胞活力在一段时间内未出现明显变化 (P>0.05) 。缺氧、无糖处理12 h的星形胶质细胞 (OGD12/R0) , 细胞活力为73.22%。随再灌注时间的延长, 细胞活力逐渐降低, 再灌注6、12及24 h的细胞活力分别为67.06%、57.61%及50.50% (图1) 。
2.1.2 OGD12/R对LDH漏出率的影响
以常氧、25 mmol/L葡萄糖条件下培养的星形胶质细胞为对照, 其LDH漏出率较低, 在一段时间内无明显变化 (P>0.05) 。OGD处理12 h的星形胶质细胞 (OGD12/R0) LDH漏出率为6.27%。随再灌注时间的延长, LDH漏出率逐渐升高, 再灌注6、12及24 h的LDH漏出率分别为9.69%、15.75%及20.34% (图2) 。
2.2 HGF对OGD12/R12处理星形胶质细胞的影响
2.2.1 HGF对细胞活力的影响
MTT比色法测定不同终浓度HGF对OGD12/R12处理星形胶质细胞活力的影响 (图3) 。终浓度为5和10 ng/m L的HGF对细胞活力无明显影响 (与OGD12/R12组比较, P>0.05) 。HGF终浓度达20 ng/m L时, 对星形胶质细胞开始有保护效应 (与OGD12/R12组比较, P<0.05) 。在一定范围内, 随HGF终浓度增加, 细胞活力呈上升趋势, 最大效应剂量为60 ng/m L, 细胞活力升至85.34%。而60 ng/m L HGF组与80 ng/m L HGF组比较, 细胞活力的差异无显著性 (P>0.05) 。
1) 与OGD12/R12组比较, P>0.05;2) 与OGD12/R12组比较, P<0.05;3) 与OGD12/R12组比较, P<0.01;1:对照组;2:OGD12/R12组;3:5 ng/m LHGF组;4:10 ng/m L HGF组;5:20 ng/m L HGF组;6:40 ng/m L HGF组;7:60 ng/m L HGF组;8:80 ng/m L HGF组
2.2.2 HGF对LDH漏出率的影响
5和10 ng/m L HGF对OGD12/R12处理星形胶质细胞的LDH漏出率无明显影响 (与OGD12/R12组比较, P>0.05) 。HGF终浓度达20 ng/m L时, 星形胶质细胞的LDH漏出率开始降低 (与OGD12/R12组比较, P<0.01) 。随HGF终浓度的增加, LDH漏出率呈降低趋势, 最大效应剂量为60 ng/m L, 星形胶质细胞LDH漏出率降为6.58%。60 ng/m L HGF组与80 ng/m L HGF组比较, LDH漏出率的差异无显著性 (P>0.05) (图4) 。
2.2.3 HGF对细胞凋亡率的影响
流式细胞仪分析终浓度为60 ng/m L HGF对OGD12/R12处理星形胶质细胞凋亡率的影响 (图5) 。以常氧、25 mmol/L葡萄糖条件下培养的星形胶质细胞为对照, 其细胞凋亡率为2.35%;OGD12/R12组细胞凋亡率升至28.19% (与对照组比较, P<0.01) ;60 ng/m L HGF预处理后, 细胞凋亡率降为8.68% (与OGD12/R12组比较, P<0.01) 。
1) 与OGD12/R12组比较, P>0.05;2) 与OGD12/R12组比较, P<0.01;1:对照组;2:OGD12/R12组;3:5 ng/m L HGF组;4:10 ng/m L HGF组;5:20 ng/m L HGF组;6:40 ng/m L HGF组;7:60 ng/m L HGF组;8:80ng/m L HGF组
Hoechst 33258染色的结果也显示, 60 ng/m L HGF能明显抑制OGD12/R12处理星形胶质细胞的凋亡 (与OGD12/R12组比较, P<0.01) (图6) 。
1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与OGD12/R12组比较, P<0.01
2.2.4 HGF对bcl-2、bax蛋白表达的影响
Western blot的结果显示, OGD12/R12损伤后, 星形胶质细胞bcl-2蛋白的表达下调, 而bax蛋白表达水平明显上调 (与对照组比较, P<0.01) 。用HGF (60ng/m L) 预处理明显上调了星形胶质细胞bcl-2蛋白的表达 (与OGD12/R12组比较, P<0.05) , 下调了bax蛋白的表达 (与OGD12/R12组比较, P<0.01) (图7) 。
A:对照组 (×400) ;B:OGD12/R12组 (×400) ;C:60 ng/m L HGF组 (×400) ;D:各处理组细胞凋亡率;1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与OGD12/R12组比较, P<0.01
A:bcl-2、bax印迹图;B:bcl-2与β-actin灰度的比值;C:bax与β-actin灰度的比值, 1:对照组;2:OGD12/R12组;3:60 ng/m L HGF组;1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05;3) 与OGD12/R12组比较, P<0.05;4) 与OGD12/R12组比较, P<0.01
3 讨论
缺血性脑卒中是临床最为常见的急重症, 具有极高的致残率及致死率。尽管近年来国内外的研究取得了很多进展, 但迄今为止, 临床治疗脑缺血损伤的效果仍不理想, 因此迫切需要寻找新的治疗方向。HGF作为一个多效性的细胞因子, 在多种组织的修复和重建过程中发挥着重要作用, 近年来日益受到关注[6,7,8]。阐明HGF对脑缺血损伤的保护机制对预防及治疗脑缺血性疾病, 提高患者生存质量有着重要意义。既往对于神经元的缺血性损伤关注较多, 而近年来的研究热点逐渐集中于星形胶质细胞。星形胶质细胞对缺血耐受力较强, 且在中枢神经系统中数量众多, 对脑缺血状态下的神经元可能发挥持续的影响。研究表明, 在脑缺血时, 星形胶质细胞对脑组织的影响存在双重性:一方面通过产生兴奋性递质、炎症介质等损伤神经元, 另一方面通过释放神经营养因子、产生抗氧化物质等多种途径发挥神经保护效应[9]。因此, 在脑缺血过程中, 如何对星形胶质细胞进行有效干预, 对神经元的生存及转归具有重要意义。
脑缺血在血流供应恢复后, 脑组织功能障碍和结构损伤加重, 可能与缺血再灌注过程中产生大量氧自由基、兴奋性氨基酸及细胞内钙离子浓度异常增高等因素有关[10,11]。缺氧、缺糖是脑缺血导致损伤的两种基本因素, 脑细胞的损害在本质上主要是脑组织氧、糖缺乏而引发的一系列事件的结果[12,13]。本实验采用体外培养的星形胶质细胞进行OGD/R处理, 模拟体内缺血/再灌注损伤, 探讨HGF对星形胶质细胞缺血耐受性的影响及其可能的机制。
本实验结果表明, 缺氧、无糖处理12 h的鼠脑皮层星形胶质细胞随再灌注时间的延长 (0~24 h) , 细胞活力逐渐降低, LDH漏出率逐渐升高。提示再灌注能加重缺氧、无糖处理星形胶质细胞的损伤。接下来, 本实验观察了不同终浓度的HGF (5~80ng/m L) 预处理对星形胶质细胞OGD12/R12损伤耐受性的影响。结果显示, HGF增强细胞活力以及降低LDH漏出率的效应均从20 ng/m L开始出现, 在60ng/m L达高峰。提示HGF能提高星形胶质细胞对OGD/R损伤的耐受性, 并呈一定的剂量依赖关系。
有研究证实, 缺氧、缺糖能诱导细胞凋亡, 可能与钙超载、一氧化氮、自由基及转录信号的激活等多种因素有关[14,15,16]。在本实验中, 流式细胞术和Hoechst33258染色的结果均显示, OGD12/R12处理后星形胶质细胞凋亡率增加, HGF能有效减少细胞凋亡的发生。提示HGF提高星形胶质细胞对OGD/R损伤的耐受性可能部分与抑制细胞凋亡有关。
Bcl-2家族在细胞的存活和凋亡过程中起重要的调节作用。抗凋亡因子bcl-2可与促凋亡因子bax形成异二聚体, 抑制bax的活性。有研究显示bcl-2与bax的比例决定细胞对凋亡的易感性[17,18]。SHI等[19]证实大鼠脑缺血损伤与bcl-2的表达受抑制有关, 而上调bcl-2的表达能减少细胞凋亡的发生。LU等[20]报道甘氨酸能抑制脑缺血再灌注损伤导致的小鼠神经细胞凋亡, bcl-2蛋白表达增多、bcl-2/bax比值上调可能参与了这一效应。本实验Western blot的结果显示, OGD12/R12处理后, 星形胶质细胞bcl-2蛋白的表达下调, 而bax蛋白的表达上调。用HGF (60 ng/m L) 预处理明显上调了星形胶质细胞bcl-2蛋白的表达, 下调了bax蛋白的表达。提示HGF减少OGD/R星形胶质细胞凋亡可能与促进bcl-2蛋白的表达, 抑制bax蛋白的表达有关。而HGF究竟是通过何种途径来影响bcl-2和bax的表达, 笔者将在后续研究中进一步探讨。