亚细胞器

亚细胞器（通用10篇）

亚细胞器 篇1

韭子为百合科植物韭 (Allium tuberosum Rottler ) 的种子, 含有生物碱、挥发油、皂甙、硫化物、蛋白质、氨基酸、油脂、维生素C等成分[1]。祖国医学认为:韭子味辛、甘、性温。具有补肝肾, 暖腰膝, 壮阳固精之功效。临床上主治阳痿遗精, 腰膝酸软, 遗尿, 尿频, 白带过多, 冷痛, 顽固性呃逆等[2]。现代科学研究表明, 韭子具有抗炎抑菌、祛痰等药理作用[3], 并可有效地恢复和增强免疫功能低下小鼠的非特异性免疫和体液免疫功能[4]。目前还没有其对机体细胞免疫功能影响的报道和研究。本实验设计韭子的水煎剂对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的T细胞亚群的影响, 来研究韭子对机体免疫系统作用的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

昆明系小鼠, 雌雄兼用, 6至8周龄, 体重 (20±2) g, 购于佳木斯大学实验动物中心。

1.2 药物和仪器

韭子、黄芪购于佳木斯药材公司。取50g加水500mL文火煎煮2h, 去渣浓缩为50mL备用, 实验时需将制剂经浓缩灭菌处理。环磷酰胺 (CY) 为上海华联制药公司产品;PRMI-1640为GIBCO公司产品;淋巴细胞分离液为天津血研所产品;抗小鼠CD3、抗小鼠CD4、抗小鼠CD8单克隆抗体购于北京医科大学免疫系;流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.3 实验分组及免疫功能低下模型建立[5]

将小鼠随机分为5组, 第1组为正常对照组;第2组为免疫低下对照组;第3组为正常服药组;第4组为韭子治疗组;第5组为黄芪治疗组。第2组、第4组、第5组造免疫低下模型, 剂量为80mg/kg, 第1、2、3天连续腹腔注射CY;第1组、第2组灌服生理盐水;第3组、第4组灌服韭子液1.24g/kg;第5组灌服黄芪液2.08g/kg;各组灌胃体积相同, 0.5mL/只, 1次/天;共灌服10d, 第11天检测指标。

1.4 T淋巴细胞亚群测定[6]

断颈处死小鼠, 75%酒精中浸泡消毒, 无菌取脾脏, 剪碎, 研磨, 过200目钢网、不完全RPMI-1640培养液冲洗制成脾细胞悬液 (在冰盒内操作) , 将脾细胞悬液缓慢置于配好的淋巴细胞分离液 (比重为1.080的聚蔗糖-泛影葡胺) 上分离淋巴细胞, 以2000转离心20min后取第2层云雾状的低密度细胞, 再经不完全培养液1000r/min离心洗涤两次后, 调整细胞数配成1×106/mL的细胞悬液。将细胞悬液分别加入2个试管内, 1mL/管。第1管加入FITC标记的抗小鼠Thy-1 (CD3+) McAb40μL、第2管同时加入PE标记的抗小鼠L3T4 (CD4+) McAb和FITC标记的抗小鼠Lyt-2 (CD8+) McAb各20μL, 作用30min, 然后加入2mL红细胞裂解液孵育10min, 再加2mLPBS液1000r/min离心5min, 重复PBS液洗两遍后弃去上清。上流式细胞仪检测106个细胞中各细胞亚群的比例。

2 结果

见图1及表1。

均与模型组比较, *P<0.01;与正常对照组比较, #P<0.01;与黄芪组比较, &P<0.05

结果表明:模型组与正常对照组比较, 模型组的CD4+亚群的比例、CD4+/CD8+的比值明显降低, 统计学处理有显著性差异 (P<0.01) ;韭子治疗组与黄芪治疗组均能提高模型组小鼠的CD4+亚群的比例, 提高CD4+/CD8+的比值, 已达到了正常组水平;韭子治疗组与黄芪治疗组之间比较有差异 (P<0.05) , 韭子治疗组的作用低于黄芪治疗组;韭子治疗组与正常对照组、正常服药组之间比较无显著性差异 (P>0.05) ;而模型组CD8+亚群的比例虽有上升趋势, 但各组间比较无统计学意义 (P>0.05) 。

3 讨论

T细胞在机体的免疫防御、免疫调节、免疫监视及免疫修复中有极为重要的作用, 对于机体的自身稳定和免疫平衡至关重要。T细胞活化、增殖、分化是一个十分复杂的过程, 受到多种因素的调控。根据T细胞的功能不同可将其分为辅助性T细胞 (Th) 、细胞毒性T细胞 (CTL) 、抑制性T细胞 (Ts) 。其中Th细胞 (CD4+) 和TS细胞 (CD8+) 的相互协调是调控的重要环节之一。CD4+/ CD8+的比值反映机体免疫内环境是否稳定的一个重要指标, 两者平衡决定了免疫反应的总效应, 若比值偏离正常值, 说明机体免疫功能失调。本次实验中, CY所致免疫功能低下模型小鼠Th (CD4+) 细胞明显降低, CD4+/CD8+比值偏离正常组水平, 提示模型小鼠T细胞亚群的分布发生了变化, 导致小鼠T淋巴细胞免疫功能异常及免疫调节功能紊乱, 造成小鼠细胞免疫功能低下。韭子可改善CY引起的CD4+亚群比例的降低、CD4+/CD8+比值的降低, 说明它们对模型小鼠T细胞功能有增强作用, 并通过主要增强CD4+细胞调整CD4+/CD8+的比例失调, 提示它不仅对细胞免疫功能低下具有免疫增强作用, 还具有较好的免疫调节作用。

上述研究提示, 机体免疫功能低下者可长期口服韭子以增强免疫功能, 预防某些疾病, 为临床应用韭子提供了实验依据。由于中药成分复杂, 其有效成分的提取、作用环节的进一步研究、适应证的范围等均有待于进一步研究。

摘要：目的:研究中药韭子对小鼠的免疫调节作用。方法:环磷酰胺腹腔注射建立小鼠免疫功能低下模型, 应用流式细胞仪对小鼠T细胞亚群进行检测。结果:韭子可改善环磷酰胺引起的CD4+亚群比例的降低、CD4+/CD8+比值的降低, 说明它对模型小鼠T细胞功能有增强作用, 并通过增强CD4+细胞调整CD4+/CD8+的比例失调。结论:韭子不仅对细胞免疫功能低下具有免疫增强作用, 还具有较好的免疫调节作用。

关键词：韭子,免疫功能低下,T细胞亚群,流式细胞仪

参考文献

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亚细胞器 篇2

OsWRKY10是一个新的.WRKY类转录因子.该项研究构建了OsWRKY10基因与绿色荧光蛋白基因融合的增强表达载体pCamU-OsWRKY10-GFP.将载体转入根瘤农杆菌EHA105中,叶盘转化法转化烟草.转化植株经PCR鉴定呈阳性.通过荧光显微镜可检测到绿色荧光蛋白在根细胞的核中表达,并且OsWRKY10基因定位在细胞核.

作 者：赵佩欧 谢科 郭泽建 ZHAO Pei-ou XIE Ke GUO Ze-jian  作者单位：赵佩欧,ZHAO Pei-ou(浙江大学,生物技术研究所,浙江,杭州,310029)

谢科,XIE Ke(浙江大学,生物技术研究所,浙江,杭州,310029;中国农业大学,植物病理系,北京,100094)

亚细胞器 篇3

[摘要]目的 探讨胃癌患者根治术后化疗对外周血T 细胞亚群及NK细胞的影响， 了解化疗对机体免疫功能的影响。 方法 选择我院2007年6月～2010年6月32例胃癌根治术后行化疗的患者作为观察组，另选32例健康体检者作为对照组，分别检测两组外周血T 淋巴细胞亚群CD3+ T、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4+/CD8+及NK细胞的变化情况。 结果 32例胃癌术后化疗患者完全缓解（CR）17例，部分缓解(PR)8例、无变化（SD）5例，进展（PD）2例，总有效率78.1%（25/32）。 胃癌根治术后化疗前32例患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+、NK细胞明显低于健康对照组，术后进行3个周期的化疗后，与化疗前比较，32例胃癌患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+、NK細胞明显升高（P ＜ 0.05）。 结论 胃癌根治术化疗可以提高患者的临床疗效，化疗后可以提高机体CD4+T细胞、CD4+/CD8+及NK细胞的表达水平。

[关键词] 胃癌根治术；FOLFOX化疗方案；T 淋巴细胞亚群；NK细胞

[中图分类号] R735.2[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）09-0159-02

亚细胞器 篇4

1 资料和方法

1.1 仪器和主要试剂

EPICS-XL型流式细胞仪由美国贝克曼库尔特公司制造。白介素2 (IL-2) 、白介素4 (IL-4) 、白介素6 (IL-6) 等细胞因子检测试剂盒购自美国T&B生物公司。

1.2 对象

2005年11月至2007年12月我院住院白血病患儿35例为治疗组, 男21例, 女14例, 年龄4～12岁, 平均 (7.82±3.46) 岁。所有病例的诊断、分型及疗效判定均参考文献[1]标准, 包括急性淋巴细胞白血病22例、急性非淋巴细胞白血病8例和急性早幼粒细胞白血病5例。随机选取我院健康体检合格儿童30名为对照组, 男18名, 女12名, 年龄7～18岁, 平均年龄 (12.55±1.22) 岁。实验组和对照组性别、年龄比较差异无统计学意义具有可比性

1.3 治疗方法

急性淋巴细胞白血病治疗用药为长春新碱加强的松加门冬酰胺酶加柔红霉素 (VPLD方案) 行诱导化疗, 巩固治疗用替尼泊苷 (VM 26) 或依托泊苷 (VP16) 加阿糖胞苷 (Ara-c) 及环磷酰胺加长春新碱加柔红霉素加强的松 (CODP方案) ;环磷酰胺加长春新碱加阿糖胞苷加强的松 (COAP) 以及大剂量甲氨喋呤 (MTX) 等。急性非淋巴细胞白血病采用柔红霉素加阿糖胞苷 (DA方案) , 三尖杉酯碱加阿糖胞苷 (HA方案) , 米托蒽醌加阿糖胞苷 (MA方案) , 大剂量阿糖胞苷等方案交替进行。急性早幼粒细胞白血病先采用维甲酸诱导, 继之以其他化疗方案治疗。

1.4 检测方法

治疗组患儿开始化疗前1d、化疗结束后第2天空腹抽静脉血。取3ml置肝素抗凝管中, 用流式细胞仪检测CD 3+、CD 4+和CD 8+含量, 操作按说明书进行。取静脉血2ml, 不抗凝, 室温下2 500r·min-1离心15min, 分离血清, 置-20℃保存备用, 用ELISA双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清IL-2、IL-4和IL-6水平, 操作按说明书进行。对照组仅采血检查1次。

1.5 统计学处理

用SPSS10.0统计软件包进行处理, 计数资料比较采用χ2检验, 患者治疗前后采用两个样本均数的t检验, 治疗组与对照组比较采用配对资料的t检验。

2 结果

与对照组相比, 治疗组外周血CD 3+、CD 4+和CD 8+含量, CD 4+/CD 8+值和IL-2水平均下降, IL-4和IL-6水平均升高, 差异均具有统计学意义 (P<0.01, P<0.05) 。化疗后, 治疗组CD 3+、CD 4+、CD 8+含量, CD 4+/CD 8+值和IL-2水平升高, IL-4和IL-6水平均下降, 与治疗前比较差异具有统计学意义 (P<0.01, P<0.05) 。见表1、2。

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;与治疗前相比, ▼P<0.05, ▼▼P<0.01

与对照组比较, **P<0.01;与治疗前比较, ▼P<0.05, ▼▼P<0.01

3 讨论

白血病属于造血干细胞异常增生的恶性肿瘤, 细胞免疫在抗肿瘤免疫中起着主要调节作用[2]。机体维持正常的免疫功能有赖于各种免疫细胞, 特别是T细胞亚群之间相互协作和相互制约。CD 3+是成熟T细胞的重要标志, 通常代表总T细胞;CD 4+是辅助性T细胞的代表, CD 8+是抑制性T细胞的代表。CD 4+/CD 8+值是机体免疫调控网络的重要枢纽, 生理状态下CD 4+和CD 8+之间始终保持动态平衡, 调节机体的免疫状态[3]。本研究中治疗组CD 3+、CD 4+、CD 8+含量, 以及CD 4+/CD 8+值明显低于对照组, 反映白血病患儿细胞免疫应答能力低下, 免疫功能紊乱。有报道认为, CD 3+、CD 4+和CD 8+含量以及CD 4+/CD 8+值降低可刺激B细胞分泌抗体形成免疫复合物并激活补体, 致机体生理功能紊乱及组织损伤[4]。因此, 细胞免疫功能受损会进一步加重患儿的病情, 改善机体细胞免疫功能可能有助于恢复机体的生理功能。化疗是临床治疗白血病的常规手段, 本组病例化疗后, CD 3+、CD 4+和CD 8+含量以及CD 4+/CD 8+值明显上升, 提示化疗可增强机体免疫功能, 提高患者抗肿瘤能力。

根据分泌细胞因子的不同, CD 4+T细胞分为Th1和Th2两种亚型, Th1亚型分泌的IL-2、IL-12、干扰素 (IFN) -γ等细胞因子在机体细胞免疫应答中发挥重要作用, Th2亚型分泌的IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子主要调节机体体液免疫应答[5]和在功能上相互拮抗, 只有各种细胞因子处于平衡状态, 机体才能进行正常的免疫应答。IL-2可促进Thl细胞活化, 促进T细胞增殖及提高杀伤作用, 促进B细胞分泌抗体等功能。而IL-4是Th2细胞活化的决定性因素[5]。IL-6主要由单核巨噬细胞、T细胞、内皮细胞产生, 在肿瘤患者中明显升高。本实验结果显示, 治疗前白血病患儿IL-2水平低于健康体检儿童, IL-4、IL-6水平高于健康体检儿童, 而化疗后两组比较差异无统计学意义, 表明化疗前患儿细胞因子网络失衡, 抑制了细胞免疫, 促进了白血病细胞的增生, 化疗后患儿免疫细胞调节功能得到一定程度的恢复, 机体的免疫状态总体上接近正常水平, 可见化疗可以改善机体细胞因子紊乱状态。

综上所述, 白血病患儿细胞免疫功能低下, 细胞因子水平紊乱, 化疗可以增强机体细胞免疫功能, 改善细胞因子水平。因此, 外周血T细胞亚群和细胞因子的测定可作为判断白血病患者病情变化程度和预后的辅助指标对临床诊断及疗效判定具有一定意义。

摘要：目的探讨化疗对白血病患儿细胞免疫功能的调节作用。方法在白血病患儿化疗前、后用流式细胞仪检测外周血CD3+、CD4+和CD8+含量, 用ELISA双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清白介素2 (IL-2) 、白介素4 (IL-4) 和白介素6 (IL-6) 水平, 比较治疗前后各检测值的变化。以健康体检合格儿童30名为对照组。结果白血病组外周血CD3+、CD4+和CD8+含量, CD4+/CD8+值和IL-2水平均低于对照组, 而IL-4和IL-6水平均高于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.01, P<0.05) 。与化疗前相比, 白血病患儿化疗后外周血CD3+、CD4+、CD8+含量, CD4+/CD8+值和IL-2水平升高, 而IL-4和IL-6水平均下降, 差异也均有统计学意义 (P<0.01, P<0.05) 。结论积极稳妥的化疗可调节白血病患儿T细胞亚群和细胞因子水平, 提高机体免疫力。

关键词：白血病,化疗,T细胞亚群,细胞因子

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亚细胞器 篇5

【关键词】 干燥综合征；白芍总苷；饮水量；唾液量；T细胞亚群；小鼠

干燥综合征（sj?gren's syndrome，SS）是一种以外分泌腺高度淋巴细胞浸润为特征的自身免疫性疾病，最常见的症状是口眼干燥。SS在中医文献中无相似的病名记载，目前多数学者将其归属中医学“燥证”范畴，气阴两虚、津血亏虚等是本病的致病因素，虚、疲、毒相互交结是本病的病理关键。目前，尚无根治性药物及方法，多采取替代及对症治疗以减轻口眼干燥等症状。白芍总苷（TGP）是白芍的主要有效成分，具有抗炎、镇痛、多途径双向免疫调节等作用[1]。有研究表明，TGP能改善SS患者口眼干燥症状[2]，但其作用机制尚不清楚。本课题组对TGP进行了一系列实验研究，现总结报告如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 选择鼠龄为8周的BALb/C近交系小鼠60只，SPF级，雌雄不限，体质量20 g左右，购于重庆医科大学实验动物中心，合格证号SCXK（渝）2006104。严格遵循“3R”原则，实验动物饲养室自然光线，温度控制在18～19 ℃，湿度控制在40%～70%，动物自由摄食、饮水。实验结束以引颈法处死。

1.2 主要药物及试剂 TGP，宁波立华制药有限公司生产，生产批号060301；醋酸泼尼松，天津药业生产，生产批号20060512；百白破疫苗，北京天坛生物制品股份有限公司生产，生产批号2006060402；弗氏完全佐剂，Sigma USA生产，生产批号019k8719-81-2； PBS缓冲液，博士德生物工程有限公司生产，生产批号AR0030；CD4、CD8试剂，晶美生物制药有限公司生产，生产批号FG260611。

2 方 法

2.1 分 组 将60只小鼠随机分成空白对照组、模型对照组、TGP高剂量组、TGP中剂量组、TGP低剂量组、醋酸泼尼松组，共6组，每组10只。

2.2 动物模型的建立[3] 对模型对照组，TGP高、中、低剂量组，醋酸泼尼松组小鼠分别进行造模：各取10只同种小鼠，于无菌条件下取颌下腺，匀浆后加PBS稀释到1 000 μg·mL-1，加入弗氏完全佐剂，调整浓度为500 μg·mL-1，以每只1 mL的总量于小鼠的尾根部多点注射免疫，同时于背部注射百白破疫苗0.5 mL。在造模后第5周处死模型对照组小鼠2只，通过病理形态学观察，模型小鼠颌下腺发现特征性淋巴细胞浸润、腺体萎缩等SS典型病理改变，表明造模成功。

2.3 药物剂量换算 TGP成人每日用量为1 200 mg，

参照人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值

表[4]，换算成小鼠用量180 mg·kg-1；醋酸泼尼松成人每日用量20 mg，换算成小鼠用量3.0 mg·kg-1，

一般以成人体质量为60 kg为基础计算。

2.4 给药方法 空白对照组正常饲养，不予任何药物；模型对照组予生理盐水灌胃；TGP高剂量组予TGP136 mg·d-1灌胃；TGP中剂量组予TGP 68 mg·d-1灌胃；TGP低剂量组予TGP 34 mg·d-1

灌胃；醋酸泼尼松组予醋酸泼尼松0.08 mg·d-1灌胃。

2.5 观察指标

2.5.1 小鼠饮水量的测定 每3天加水150 mL，3 d后称量水量，投入的水量分别减去剩余水量即为每3天每笼小鼠饮水量。

2.5.2 唾液量测定 灌胃2周后将无菌的脱脂棉球制成干重为5 mg的棉球，放入小鼠的后颊部，

5 min后取出，电子天平上称重。唾液分泌量（mg）=棉球湿重-棉球干重。

2.5.3 小鼠唾液腺T细胞亚群含量 小鼠眼眶取抗凝血2 mL，取20 μL CD4/CD8 FITC/PE标记抗体加入流式管底部，取100 μL EDTA抗凝的小鼠外周血加入5 mL流式管底部并轻轻振摇，使其与抗体充分混匀，室温避光孵育20～30 min，加入2 mL红细胞裂解液，混匀后避光放置10 min，溶解红细胞至液体透亮。将样品管以1 000 r·min-1离心5 min，充分倒去上清液，加入2 mL PBS洗液重悬细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液；

加入适量标记二抗，室温避光孵育20 min；加入2 mL

PBS洗液重悬细胞以1 000 r·min-1离心5 min，

弃上清液；加入0.5 mL PBS洗液重悬细胞，流式细胞仪检测。

2.6 统计学方法 采用SPSS 15.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验，方差不齐用秩和检验，等级资料间比较采用秩和检验，计数资料用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组小鼠饮水量比较 各组小鼠饮水量在造模初期无差别，抗原注射后12 d小鼠饮水量显著增加，模型对照组小鼠饮水量逐渐上升直到实验结束，而TGP各剂量组和醋酸泼尼松组小鼠饮水量在一定程度上降低，并维持在一定水平。见表1。

3.2 各组小鼠唾液流量变化比较 造模2周后，与空白对照组比较，模型对照组小鼠唾液流量明显减少（P < 0.01）。各给药组与模型对照组比较，均能不同程度增加小鼠唾液流量（P < 0.01或P < 0.05）；以TGP中、高剂量组，醋酸泼尼松组作用较明显，TGP低剂量组作用较弱。见表2。

3.3 小鼠外周血中T淋巴细胞亚群检测 与空白对照组比较，模型对照组小鼠外周血CD4+T细胞、CD4+/CD8+明显升高，差异有统计学意义（P < 0.01）；

而CD8+T细胞平均含量虽降低，但差异无统计学意义（P > 0.05）。各给药组均能降低CD4+T细胞含量（P < 0.01或P < 0.05），以TGP中、高剂量组及醋酸泼尼松组的作用较明显，三组之间比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；TGP低剂量组与TGP高剂量组、醋酸泼尼松组比较，差异均有统计学意义（P< 0.01）。各给药组对CD8+T细胞含量影响不大，差异无统计学意义（P > 0.05）。各给药组均有降低CD4+/CD8+比值的趋势。醋酸泼尼松组、TGP中剂量组、TGP高剂量组能明显降低CD4+/CD8+比值，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），但与TGP低剂量组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3 、图1。

4 讨 论

SS是一种以侵犯外分泌腺体为主的慢性自身免疫性疾病，临床表现以口眼干燥为特征，其病理表现主要为外分泌腺淋巴细胞及浆细胞局灶性浸润，淋巴细胞中又以CD4+T细胞为多，CD4+/CD8+T比例明显高于正常人，并与疾病严重程度有关，且B淋巴细胞的活性与T淋巴细胞缺陷有关[5]。人外周血T淋巴细胞根据细胞膜表面表达的受体分为三大不同亚群，临床通常检查CD3+、CD4+和 CD8+T 淋巴细胞亚群。CD4+T细胞又称辅助性 /诱导性T细胞（ T helper/ inducer，Th /Ti辅助细胞），主要功能是促进免疫细胞增殖、分化，协调细胞相互作用， 激发免疫应答。CD 8+T细胞又称抑制性/细胞毒性T细胞 （Tsuppressor /cy totox ic，Ts/Tc）抑制免疫应答。T淋巴细胞亚群可反映机体细胞免疫的基本状况，CD4+/CD8+被称为免疫调节指数，可在一定程度上反映机体的细胞免疫状态。

本实验研究显示，模型小鼠CD4+和CD4+/CD8+较正常小鼠明显升高，提示T淋巴细胞调节紊乱在SS的发生与发展中有重要作用，与众多研究结果具有一致性。对SS模型小鼠，予TGP灌胃后，均能不同程度地提高其唾液流量、减少其饮水量，尤以中剂量、高剂量效果明显，与醋酸泼尼松组相当。同时实验结果显示，各给药组均能降低SS模型小鼠外周血中CD4+T细胞及CD4+/CD8+T水平，以TGP中、高剂量组及醋酸泼尼松组作用明显，且TGP中、高剂量组对CD4+T细胞及CD4+/CD8+T比值的影响效果与醋酸泼尼松组相当。因此，我们推测TGP治疗SS的机制可能是通过抑制CD4+细胞活化，减少Th1/Th2细胞因子的产生，从而维持Th1/Th2平衡。

现代中医认为SS属中医学“燥证”范畴，其发病以气阴二虚为多，脾气虚和肝肾阴虚引起的津液生成和敷布异常是SS发病的关键。在SS的治疗方面，目前西医无有效的治疗办法，在急性期多采用激素治疗，长期服用副作用较大。中医主要采用滋阴润燥、健脾补血，结合清热解毒、活血化瘀、宣肺布津等方法，疗效颇佳。由于中医多是采用汤剂加减的方法治疗，效果虽好，但用药不便。白芍性凉，味苦酸，微寒，具有补血柔肝、滋阴润燥之功效，TGP是其主要有效成分，近年来对其药理作用的研究以及在风湿免疫病中的应用研究方面都取得了较大的进展[6]，研究者普遍认为TGP具有抗炎、镇痛、多途径双向免疫调节等作用。本研究显示，TGP对SS模型小鼠具有与激素相当的疗效，同时能改善其免疫学异常，可能替代激素在SS中的使用，从而避免其副作用，值得进一步深入研究。

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亚细胞器 篇6

T淋巴细胞亚群计数、NK细胞计数对于对评定运动员细胞免疫机能有一定作用,一般采用流式细胞仪进行检测。用流式细胞仪进行检测时,根据细胞上的特异抗原CD分子(如CD3阳性即总T细胞、CD3/CD4双阳性即辅助性T细胞、CD3/CD8双阳性即抑制性T细胞、CD3阴性且CD16/CD56双阳性即NK细胞)不同,而需采用特异性荧光标记抗体。目前,有一种新推出的Biolegend的CD3-P E Cy5/C D4-P E/CD 8-F ITC鸡尾酒抗体和CD 3-F IT C(CD16+CD56)-PE鸡尾酒抗体,和传统抗体相比虽标记顺序略有差异但使用荧光相同且更经济。但在流式细胞仪上是否适用这种新抗体检测T细胞亚群和NK细胞,并未见有报道。

本研究的目的是在流式细胞仪上用此新抗体检测运动员T细胞亚群和NK细胞并和传统抗体进行比较,确定2种抗体的分析检测结果是否具有差异和可比性,从而明确在流式细胞仪上是否适用这种新抗体检测T细胞亚群和NK细胞。

2 对象与方法

2.1 研究对象

运动员男21人,年龄(17±1.20)岁,身高(176±4.28)cm,体重(71±5.10)kg,专项训练年限(3±1.19)年。女29人,年龄(18±2.40)岁,身高(166.5±2.69)cm,体重(61.4±4.98)kg,专项训练年限(2.4±1.25)年。

2.2 测试方法

2.2.1 仪器

贝克曼EPICS XL型流式细胞仪,白杨BFX5-320低速离心机,VORTEX涡旋混合器。

2.2.2 试剂

(1)荧光抗体:Coulter的抗人的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE Cy5三标抗体,同型对照鼠抗人IgG 1-FITC IgG 1-PE/IgG 1-PE Cy5抗体;Coulter的抗人的CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE双标抗体,同型对照鼠抗人IgG 1-FITC/IgG1-PE抗体;Biolegend的抗人CD3-PE Cy5/CD4-PE/CD8-FITC Cocktail抗体,同型对照IgG 1-PE Cy5/IgG 1-PE/IgG 1-FITC抗体;Biolegend的抗人CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE Cocktail抗体,同型对照IgG 1-FITC/IgG 2a-PE抗体;(2)其他试剂:Flow Check质控品,OptiLyse C溶血剂,15%EDTAK2溶液,1×PBS缓冲液,抗凝剂取5ul置于1.5mL离心管中。

2.2.3 血样采集

分3～4次,采集50例(男21例,女29例)运动员静脉血1mL;混匀。白细胞计数控制在5～10×109/L,全血采集后6小时内制备。

2.2.4 样本编号

(1)流式细胞仪上2种抗体检测T细胞亚群:每份血样制备4份,阴性对照管编号C1～N,用Coulter抗体标记的记做C_C1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_C1～N。阳性测试管编号T1～N,用Coulter抗体标记的记做C_T1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_T1～N。(2)流式细胞仪上2种抗体检测NK细胞每份血样制备4份,阴性对照管编号D1～N,用Coulter抗体标记的记做C_D1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_D1～N。阳性测试管编号N1～N,用Coulter抗体标记的记做C_N1～N,用Biolegend抗体标记的记做B_N1～N。

2.2.5 测试方法

(1)100uL全血加入20uL阴性对照或荧光抗体混匀,25℃避光存放20min;(2)加入500uL溶血剂,25℃混匀避光存放10min;(3)加入500uL1×PBS缓冲液,25℃混匀避存放10min;(4)1500rpm,离心5min;(5)弃上清液,加入1mL1×PBS缓冲液;(6)上机分析。分析方案,FITC-FL1通道/PE-FL2通道/PE Cy5-FL4通道,进行T细胞亚群计数。FITC-FL1通道/PE-FL2通道,进行NK细胞计数。阴性对照要求FL1/FL2/FL4通道计数<2%。(7)分析指标:T细胞亚群(T3、T4、T8百分比、T4/T8比值)、NK细胞(T3、NK百分比)。

2.3 统计方法

用SPSS统计软件进行配对t检验。

3 结果

3.1 流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群的比较结果(表1)

表1显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群,T3、T4、T8百分比、T4/T8比值等指标无显著性差异。

3.2 流式细胞仪上2种荧光抗体检测NK细胞比较结果(表2)

表2显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测NK细胞,T3、NK百分比等指标无显著性差异。

4 讨论

血液中T淋巴细胞亚群和NK细胞的检测是观察机体细胞免疫水平的重要方法。体育科研中也常检测外周血中T细胞亚群(CD3/4/8)和NK细胞(CD3/16/56)检测,并结合其他指标对于分析运动员的细胞免疫状况,进行运动员机能评定可以提供相当佐证。我中心运动病理实验室的贝克曼EPICS XL流式细胞仪进行T细胞亚群和NK细胞检测时,原使用Coulter抗体。如抗人的CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE Cy5三标抗体及其同型对照用于检测T细胞亚群,抗人的CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE双标抗体及其同型对照用于检测NK细胞。但在使用上述抗体时,我们发现并和同行交流后提出如下问题:

(1)原抗体实际使用过程中预处理时间较长,步骤繁琐,平均一个样本的预处理时间需要30min左右,如再加上阴性对照和上机分析的时间就非常耗时耗力,这常是制约大通道、快速检测样本的瓶颈。因此,寻找其他便捷、可替代的抗体标记方法和样本预处理方法,缩短检测时间就是我们必须考虑的任务之一。

(2)原抗体的成本较高。如这2种抗体的包装规格仅都是50Test/每瓶,不计其他耗才的情况下,每一个样本上述2种指标的检测成本都十分惊人。同样在临床上,这种检测也是相对昂贵的收费项目,但通过相对大的测试样本数仍可较好维持此项检测。但对于体育科研而言,检测样本无法与临床相比,因此社会效益就是我们必须考虑的任务之二。

(3)有报道的自制试剂或国产试剂由于多为单标抗体,不仅没有简化标本预处理步骤,反而增加了荧光抗体的互相干扰而检测结果差强人意。

最近一种新推出的Biolegend的CD3-PE Cy5/CD4-PE/CD8-FITC鸡尾酒抗体和CD3-FITC/(CD16+CD56)-PE鸡尾酒抗体和原抗体比较虽抗原标记荧光顺序略有差异但有如下特点,可一定程度上解决上述矛盾。

(1)标记荧光与原抗体完全一致保证了在流式细胞仪上使用的通用性和替换可能,而且是三标或双表抗体这一良好特性保证了预处理的简易性。

(2)新抗体具有更佳的性价比,而且临床实验室也已开始大量使用。

(3)在流式细胞仪上用这2种抗体检测T细胞亚群和NK细胞并进行比较,还未见报道。(1)临床上由于前述测试样本相对较大,基本不存在成本压力问题;(2)基础科研上多用单标抗体进行肿瘤标记物检测,开展正常人(如运动员机能评定)T细胞亚群和NK细胞的三标或双标荧光抗体法检测并不多见。因此,本研究不仅具有非常大的实际测试和工作必要性,而且有一定社会效益。

本研究的实验结果显示,流式细胞仪上2种荧光抗体检测T细胞亚群、NK细胞,T3、T4、T8、NK百分比、T4/T8比值等指标无显著性差异(P>0.05),结果具有高度可比性。Biolegend新抗体高度适用于流式细胞仪上检测运动员T细胞亚群、NK细胞,而且长期使用更经济,建议作为首选标记抗体。

摘要：目的 通过用2种不同免疫荧光抗体标记运动员T细胞亚群和NK细胞,在流式细胞仪上测定并进行结果比较。方法 采集50例运动员静脉血,分别用Coulter原抗体和Biolegend新抗体标记T细胞亚群和NK细胞,在流式细胞仪上检测T细胞(T3)、辅助性T细胞(T4)、抑制性T细胞(T8)、NK细胞(百分比)等指标,比较测试结果的差异。结果 用2种荧光抗体检测运动员上述指标无统计学差异(P>0.05),结果具有高度可比性。结论 Biolegend新抗体高度适用于流式细胞仪上检测运动员T细胞亚群、NK细胞检测,而且长期使用更经济,建议作为首选标记抗体。

关键词：免疫荧光,抗体,T细胞,NK细胞,流式细胞术

参考文献

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[3]徐明辉,陈智平,秦雪,等.自配试剂在COULTER流式细胞仪检测NK细胞和B细胞中的应用[J].标记免疫分析与临床,2009,16(2):103～105.

亚细胞器 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月至2012年12月在本院住院COPD患者30例为急性加重期组, 患者均为疾病急性发作期未使用任何免疫抑制剂、免疫增强剂等, 其中男22例, 女8例, 平均 (73±8) 岁。另选30例COPD患者为缓解期组, 经治疗均达到缓解期标准, 符合中华医学会呼吸学会分会年诊断指南中的标准[2]。随机选取同期30名健康体检者为对照组, 其中男25例, 女5例, 平均 (70±8) 岁, 三组入选对象年龄、性别无明显差异, 资料具有可比性。

1.2 方法

三组患者均在清晨空腹抽取外周静脉血2ml于EDTA抗凝管内, 分别采用CD45+CD3+CD4+CD8+, CD4+CD3+CD19+CD56+四色荧光标记流式细胞分析术法测定CD3+细胞比例, CD3+CD4+细胞比例, CD3+CD8+细胞比例, CD19+细胞比例, CD56+细胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值) , 采用美国Beckman Coulter Epics-XL流式细胞仪, 具体操作按说明书进行。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 17.0软件包处理, 计量资料以±s表示, 两组显著性差异比较采用t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

COPD急性加重期组与对照组比较, COPD急性加重期组, 外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均比对照组低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD缓解期组, CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均比对照组低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD缓解期组外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤细胞及B淋巴细胞水平均高于急性加重期, 但均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

注:与对照组比较※P<0.05;与急性加重期组比较△P<0.05

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病与机体免疫功能的关系已越来越受到临床关注, 淋巴细胞属于一类具有特异性免疫功能的白细胞, 其包括主要参与细胞免疫的T淋巴细胞 (CD3+) , 还包括主要参与体液免疫的B淋巴细胞 (CD19+) , 同时对于T淋巴细胞而言, 其包括辅助性T淋巴细胞 (CD3+CD4+) 及抑制性/细胞毒性T淋巴细胞 (CD3+CD8+) 。机体为了保证正常的免疫功能状态, 还要依靠T淋巴细胞亚群保持合适的比例。研究显示, COPD急性加重期组和缓解期组外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、B细胞水平与对照组比明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;这与王娜等[3]研究结果相似, 经治疗进入病情缓解期后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、B淋巴细胞比值出现显著的上升, 而与对照组对比差异有统计学意义。说明COPD缓解期免疫功能出现恢复, 但不可能全部保持正常水平, 由于自身防御和免疫功能的降低以及外界各种有害因素的影响, 经常反复发作, 加重病情的发展。自然杀伤细胞是重要的天然免疫细胞, 能够非特异地溶解某些肿瘤和病毒感染的靶细胞, 也能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC) 效应杀伤某些靶细胞, 并可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能, 在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用[4]。本研究显示, COPD患者急性加重期组和稳定期组外周血自然杀伤细胞水平与对照组相比均显著降低, 与国外Urbanowicz等[5]研究结果一致, 提示体内自然杀伤细胞介导的细胞免疫功能降低, 使疾病预后不佳。总之, COPD患者出现免疫功能紊乱, 尤其于COPD急性发作期时, 细胞免疫功能明显下降, 出现自然杀伤细胞水平降低, 同时T淋巴细胞亚群失衡, 这可能是COPD的发病机制之一。COPD患者进行综合治疗时, 还要合理调整免疫功能, 如此对缓解疾病进展有益, 还利于改善预后。

摘要：目的 探讨慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 患者T淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞及B淋巴细胞变化的临床意义。方法用流式细胞仪检测30例急性加重期及30例缓解期COPD患者外周血中T淋巴细胞亚群 (CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+) 、自然杀伤细胞 (CD56+) 、B淋巴细胞 (CD19+) 水平的变化, 同时检测30例同期来院体检的正常人作为对照组。结果 COPD急性加重期组外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤和B淋巴细胞水平均比对照组要低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD缓解期组CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均较对照组低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD患者缓解期组外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均比急性加重期较高, 但均无统计学意义 (P>0.05) 。结论 COPD患者出现免疫功能紊乱, 尤其在COPD急性发作期, 细胞免疫功能明显下降, T细胞亚群失衡, 同时自然杀伤细胞水平降低, 这可能是COPD的发病机制之一。

关键词：慢性阻塞性肺疾病,T淋巴细胞亚群,自然杀伤细胞,B淋巴细胞

参考文献

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[3]王娜, 夏婧.慢性阻塞性肺疾病患者免疫功能的变化[J].贵州医药, 2011, 35 (7) :593-595.

[4]傅佩芳, 殷少军, 颜正茂, 等.慢性阻塞性肺疾病患者与免疫功能关系的临床研究[J].中国现代医学杂志, 2008, 18 (3) :338-340.

亚细胞器 篇8

1 资料与方法

1.1 研究对象

2006年1月～2008年2月在我院住院治疗的结直肠癌患者80例,均经病理确诊。根据国际新TNM分期标准将结直肠癌患者进行临床病理分期[3],其中I期2例,Ⅱ期9例,Ⅲ期23例,Ⅳ期46例。其中男性46例,女性34例,年龄28～78岁,平均(55.03±13.11)岁。正常对照组22例,为本院健康体检者,其中男性16例,女性4例,年龄26～58岁,平均(48.38±13.58)岁。所有受检对象均无免疫系统疾病或使用过免疫抑制剂。

1.2 试剂和仪器.

单克隆抗体抗CD3FITC、抗CD4PE、抗CD8PE及CD16+56PE,均由美国Becton Dickinson公司生产,CD3+、CD4+、CD8+、CD16+56+分别代表总T、Th、Ts、NK细胞。红细胞裂解液由BD公司生产。FACSCan流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。

1.3 检测方法

取肝素抗凝的新鲜外周血100μl,加入上述单抗20μl,混匀,室温避光20min染色;加入1.5ml红细胞裂解液,混匀后室温避光放置10min,破坏红细胞;1500r/min离心5min,弃上清;每管加入2ml 0.1%叠氮钠的磷酸盐缓冲液混匀,1000r/min离心5min,弃上清;加PBS 1 ml,混匀,2h内上机检测。采用FACSCan型流式细胞仪CellQuest软件获取与分析数据。以FSC2H/SSC2H设定淋巴细胞门,IgG/FITC/IgG2aPE确定FL1和FL2的非特异性结合水平,同时调节FSC、SSC电压,FSC阈值,FL12FL2%、FL22FL1%荧光补偿。每管获取1万个细胞。

1.4 统计学处理

数据以表示,用统计分析软件SPSS11.5对各指标表达结果进行统计学处理,取α=0.05水准。

2 结果

与正常对照组比较,结直肠癌各期患者CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值及NK细胞数量均显著降低(P<0.05),而CD8+细胞值则显著升高(P<0.05),尤其是Ⅳ期患者差异更为显著(P<0.01)。Ⅰ期～Ⅳ期结直肠癌患者,CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值及NK细胞数量逐渐下降,CD8+细胞水平逐渐升高,其中Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌患者之间以及Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌患者之间比较无显著差异(P>0.05)。但Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌患者CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值及NK细胞数较I、Ⅱ期显著下降(P<0.05),而CD8+细胞水平显著升高(P<0.05)。见表1。

3 讨论

机体抗肿瘤免疫机制十分复杂,它涉及多种免疫成分,包括体液免疫和细胞免疫,以及起免疫调节作用的各种可溶性分子。抗肿瘤免疫一般以细胞免疫为主,体液免疫也起重要作用。许多研究表明[3,4,5],肿瘤病人常伴有免疫抑制,且随病情的进展而加重。有研究发现,结直肠癌患者CD3+、CD4+、NK、CD4+/CD8+比例明显低于正常对照组,而CD8+细胞数显著增高,表明细胞免疫功能明显受抑制[5,5]。肿瘤患者血清中存在抑制淋巴细胞分化增殖的可溶性免疫抑制因子,包括肿瘤细胞产生的PGE2和免疫抑制酸性蛋白等,导致淋巴细胞表面CD3+、CD4+抗原表达明显减少;CD8+细胞增高是以抑制性T细胞(Ts)增多为主。CD4+细胞的减少及CD8+细胞的增多造成结直肠癌患者CD4+/CD8+比例明显失调。肿瘤患者CD4+细胞释放的白介素-2、γ-干扰素减少,血清中可溶性IL-2受体水平异常增高,必然导致NK细胞数量减少,活性降低,免疫监视功能减弱[7]。本研究结果显示,结直肠癌患者外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+细胞比值均明显低于正常人,而CD8+细胞则明显高于正常人,与文献报道一致,说明结直肠癌患者免疫功能较正常人明显低下,其机制可能与肿瘤在发生、发展过程中分泌大量的免疫抑制因子(tumor-derived immunosuppressive factor,TDSF)有关[8,9],TDSF可广泛抑制杀伤细胞的活性,同时在肿瘤抗原的刺激下,脾细胞免疫抑制细胞前体被激活,分泌免疫抑制因子,从而导致结直肠癌患者免疫功能低下。

也有研究发现,大肠癌患者IgA、IgG、IgM、C3、C4低于正常对照组,表明体液免疫功能明显受抑制[10]。恶性肿瘤患者能够针对肿瘤抗原产生特异性抗体,抗体可以通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)介导肿瘤细胞溶解,这对防止肿瘤细胞的血流播散与转移有重要意义。抗体与肿瘤细胞结合,可以激活补体而溶解肿瘤细胞(complement-dependent cytotoxicity,CDC)。抗体与补体的减少,必然导致机体抗肿瘤效应减弱。由于这种免疫抑制是肿瘤源性的,因此表现为患者的免疫状态与病情呈显著的负相关。在本研究中,随着结直肠癌患者病情的发展,由Ⅰ期至Ⅳ期机体外周血细胞免疫功能逐渐下降,Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期患者之间有显著性差异,提示结直肠癌患者免疫状态与TNM分期呈负相关,患者的病期越晚,免疫状态越差,反之,患者的免疫功能越低下,提示病期越晚、预后越差。故患者的免疫状态可间接提示患者预后。

也有文献报道[11,12],NK细胞是在肿瘤早期发挥作用的效应细胞,不需要预先接触抗原,无MHC限制性,不依赖抗体或补体即可直接杀伤MHCI类分子表达低下或缺如的肿瘤细胞,被称为抵抗肿瘤生长的第一道防线,其表面标志是CD16+CD56+。本研究结果显示,结直肠癌患者NK细胞数量明显低于对照组,且与TNM分期有关,TNM分期越晚,NK细胞数量越低,其原因可能是在杀伤肿瘤细胞的过程中消耗了大量的NK细胞,肿瘤细胞分泌的TDSF使NK活性降低,NK细胞在血液循环中再分布等。

本文研究结果进一步证实了结直肠癌患者细胞免疫功能降低,即机体抗肿瘤免疫功能低下,导致肿瘤细胞逃避了免疫监视持续生长,因此,应用流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞和NK细胞等指标可用于结直肠癌患者的免疫状态监测,提示结直肠癌患者的免疫辅助治疗应主要围绕提高CD3+细胞、CD4+细胞及NK细胞的数量和功能,提高患者免疫功能。对于结直肠癌患者T淋巴细胞变化规律、发生机制以及作为判定肿瘤患者预后指标的临床意义,还需要进一步深入研究。

摘要：目的:探讨结直肠癌患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞检测的临床意义及与健康人的差异。方法:采用流式细胞仪测定结直肠癌患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞的活性,以健康人作对照分析。结果:结直肠癌患者外周血CD3+、CD4+、NK细胞数量及CD4+/CD8+比值较正常对照组均明显下降(P<0.05),而CD8+细胞水平显著升高。外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞数量的改变与结直肠癌临床病理分期有关,分期越晚,CD3+、CD4+及NK细胞数量CD4+/CD8+细胞比值越低,CD8+细胞水平越高;Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌患者与Ⅲ、Ⅳ期患者之间有显著差异(P<0.05)。结论:检测淋巴细胞亚群对判断患者的免疫功能、预测肿瘤患者的预后以及指导临床合理应用免疫增强药物均有重要意义。

关键词：结直肠癌,T淋巴细胞亚群,NK细胞

参考文献

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亚细胞器 篇9

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在深圳市盐田区计生中心经过妇检, B超, 尿HCG都正常无不孕, 无死胎或流产史, 要求人流的妇女30例为正常早孕组。同期经我中心排除因遗传, 感染及血型不合, 抗精子抗体阳性等因素, 确诊为RSA的妇女30例为病例组。见表1。

注:以上年龄, 孕周, 孕次比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 设备及试剂

采用Beckman Coulter FC500及其原装试剂, 利用表面分子将其分类CD3+CD4+CD-30T (Th1) , CD3+CD4+CD+30T (Th2) 细胞。ELISA试剂盒购自美国GBD公司。

1.3 标本收集

分析前收集RSA组和对照组孕妇空腹取静脉血5 m L, 注入5.0 m L于EDTA.K2管, 空腹静脉血4 m L, 分离血清, -20℃保存待检测。严格按照操作程序。

1.4 统计方法

采用SPSS13.0统计学处理软件包进行数据分析, 计量资料采用均值±标准差表示, 进行t检验。

2 结果

2.1 病例组与对照组资料比较

对照组与病例组的CD3+, CD4+, CD+30, CD-30经过统计学比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。对照组与病例组的IFN-γ、IL-10经过统计学比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表3。

3 讨论

大多认为早期妊娠母体对胚胎的免疫耐受主要有以下: (1) 妊娠期对母体免疫反应的抑制。 (2) 胎盆的屏障作用可将胚胎抗原封闭, 避免与母体免疫接触, 同时将母体抗体及其免疫因子进入胎儿导致免疫反应隔离。Greco等[1]分别把妊娠与产妇, 男性与未孕的女性的外周血淋巴细胞在体外与胎盘生物制剂进行MLC培养, 发现前者可令淋巴细胞转化而后者不能, 证实了早孕期间的免疫耐受是动态的。相关研究结果显示:“免疫细胞分泌的细胞因子影响胚胎的着床、发育, 生殖的神经内分泌以及胎盘功能, 以维持正常妊娠活动”。

Th1细胞分泌IL-2, TNF-α, IFN-γ等, 引起局部炎症反应和迟发细胞免疫反应, Th2细胞分泌IL-4, IL-5, IL-6, IL-10等, 引起体液免疫促进B细胞增殖和抗体形成。Piccinni等[2]报道, 孕鼠胎盘IL-4比血中高5-10倍。而流产鼠胎盘IL-4等浓度相对低, 但IL-2, TNF-α, IFN-γ等浓度高。Makhseed等[3]对流产倾的妇女进行实验研究, 发现其成功怀孕组以Th2型的细胞因子为主, 而失败的以Th1型的细胞因子为主。Th1型细胞因子通过直接或间接激活NK、细胞毒性T淋巴细胞 (CTLs) 、巨噬细胞等多种毒性细胞妨碍妊娠。Th2型细胞因子主要是通过抑制Th1型细胞因子的产生及其作用来维持妊娠, 大部分反复自然流产均是由于患者机体不能产生足够的Th2型细胞因子来抑制Th1型细胞因子所致。国内刘庆之等[4]对此亦有论述。

大量研究表明Th2淋巴细胞有利于妊娠, 而Th1则相反。但需注意适量的Th1型细胞是有利于促进胎儿生长和母体抗感染能力。Haynes等[5]认为, 对妊娠来说, Th1与Th2的平衡更应该考虑。现已证实, Th2型细胞因子对维持正常妊娠起重要作用, 而Th1型细胞因子则不利于妊娠的正常进行[6];两种细胞因子之间的平衡对维持正常妊娠发挥重要作用。正常妊娠时Th1/Th2的比值下降, 母体免疫反应偏离Th1型而偏向Th2型。在RSA中Th1/Th2比值上升, 母体免疫反应呈相反变化。可见, 细胞因子自身、与妊娠有关的激素、感染等因素均对两型因子间平衡起重要调节作用

该研究主要从淋巴细胞的表面分子和淋巴细胞因子进行实验研究, 发现RSA的患者CD3+, CD4+, CD3+CD4+CD-30和IFN-γ相对正常妊娠妇女表达增强, 而CD3+CD4+CD+30, 和IL-10表达相对较弱。提示正常妊娠为一种特殊的Th2现象, Th1受到抑制。陈巧儿[7]等报道, RSA患者经过免疫治疗后, 促进机体向Th2淋巴细胞转化, 利于妊娠成功。综上所述, 利用流式细胞仪对RSA快速诊断, 结合运用淋巴细胞免疫治疗[8]或者给予细胞因子如Th2类因子制剂或抗Th1类因子制剂, 调节优势应答的类型, 达到早预防, 早治疗, 达到妊娠成功的目标。

摘要：目的 探讨反复自然流产患者外周血中Th1/Th2亚群水平及其细胞因子的变化, 研究在反复自然流产患者中的意义。方法 采用流式细胞仪检测和用酶联免疫吸附法检测30例反复自然流产患者血液中的Th1/Th2亚群水平, 并以30例正常健康早孕组为对照。结果 反复自然流产患者Th1和IFN-γ高于对照组, Th2和IL-10低于对照组数据比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 反复自然流产患者的Th1/Th2和细胞因子失衡可能是反复自然流产的原因, 需加以重视。

关键词：反复自然流产,淋巴细胞亚群Th1/Th2, Th1/Th2细胞因子

参考文献

[1]Greco CR, Koncurat MA.Different responsen of lymphocyte to huaman placenta conditioned medium in vitro[J].J Investig Clin Immumol, 1998, 8 (1) :42-45.

[2]Piccinni MP, Romagnana S.Regulation of fetal allograft survival byhor-mone-controlled[J].Th1-and Th2-type cytokines immonol Res, 1996, 15 (2) :141-150.

[3]Makhseed M, Raughupathy R, Azizieh F, et al.Th1and Th2cytoline profiles in recurren aborters nwith successful pregnancy and with subse-quent abortions[J].Hum Reprod, 2001, 16 (10) :2219-2226

[4]刘庆芝, 黄山鹰姚吉龙, 等.反复自然流产患者外周血中Th1/Th2型细胞因子的表达及其意义[J].东南大学学报, 2011, 30 (4) :565-568.

[5]Haynes MK, Smith JB.Can Th1-like immune responses esplain the im-muno-pathology of recuurent miscarriage[J].Reprod Immunol, 1997, 35 (1) :65-71.

[6]Rezaei A, Dabbagh A.T-helper (1) cytokines increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion[J].Med Sci Monit, 2002, 8 (8) :607-610.

[7]陈巧儿, 秦卫兵, 杨宁, 等.免疫治疗原因不明反复自然流产后Th1/Th2型细胞因子和NK细胞的变化[J].中国妇幼保健, 2005, 20 (20) :2637-2639.

亚细胞器 篇10

1资料与方法

1.1病例选择

选取2013年10月-2014年10月在本院确诊的不孕症患者117例,年龄25~39岁,根据病史分为原发性不孕组(49例)、继发性不孕组(68例)。另选取正常体检的孕妇(无自然流产史)78例作为对照组,年龄23~38岁。各组在年龄、其他系统伴发疾病等方面比较差异无统计学差异(P >0.05)。

1.2标本采集

入组患者晨起采集空腹静脉血,选择肘静脉采集凝固血2 ml,3 000 r/min,5 min离心取上清后放入-20℃冰箱保存。

1.3检测仪器及试剂

流式细胞仪(美国BD公司,型号FACSCal- ibur),酶标仪(美国Bio-tek,型号Multishan Go)。

1.4检测方法

自身抗体:采用酶联免疫吸附法测定入组对象上清液中抗精子抗体(antisperm antibody,ASAb)、抗子宫内膜抗体(antiendometrium antibody,AEm Ab)、 抗卵巢抗体(antiovarian antibodies,AVo Ab)、抗滋养层抗体(antitrophoblast antibody,ATAb)、抗人绒毛膜促性腺激素抗体(human anti-chorionic go- nadotropin-antibody,Ah CGAb)及抗透明带抗体(an- ti-pellucid zone antibody,AZp Ab)含量。T细胞亚群: 取入组对象外周静脉血,EDTA抗凝后加入单克隆抗体CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE,1 200 r/min离心去上清液后,流式细胞仪检测1×104个淋巴细胞。

1.5统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间用t检验、三组间用方差分析,相关性分析用一元线性回归,P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组患者的自身抗体含量

原发性不孕组及继发性不孕组患者的ASAb、 AEm Ab、AVo Ab、ATAb、Ah CGAb及AZp Ab含量显著高于正常对照组(P <0.05),见附图。

2.2各组患者的T细胞亚群水平

原发性不孕组及继发性不孕组的血清CD3+、 CD4+、CD4+/CD8+水平显著低于正常对照组(P < 0.05),各组间CD8+水平比较差异无统计学意义(P > 0.05),见表1。

2.3自身抗体含量与T细胞亚群水平的相关性

不孕症患者的ASAb、AEm Ab、AVo Ab、ATAb、 Ah CGAb及AZp Ab自身抗体含量与CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平呈负相关。见表2。

覮, P <0.05

3讨论

不孕症的定义为有正常性生活且不采取避孕措施2年内无法生育者。国际卫生组织(WHO)的研究显示,目前全球已婚夫妇中不孕不育者>10%,其中女性因素占25%~35%。导致女性不孕的原因众多, 包括内分泌紊乱、子宫结构及功能异常、输卵管炎症堵塞及免疫因素等,其中免疫性不孕症的治疗难度较大,在不孕症患者发病过程中占据重要地位,是目前临床研究的重点及难点[2]。

ASAb、AEm Ab、AVo Ab、ATAb、Ah CGAb及AZp Ab是目前与不孕症相关的最主要的6种抗体类型[3]。 ASAb是精子抗原产生自身免疫反应的产物,可以活化巨噬细胞并影响精子运行,已经证实其具有抗生育及不孕作用[4]。AVo Ab与抗原结合形成抗原抗体免疫复合物可以引起卵巢免疫损伤、卵子退化,产生抗生育效应。AEm Ab可以激活补体反应,破坏子宫内膜组织,降低子宫内膜对孕卵的接受性及孕卵着床成功率。Ah CGAb可以降低受孕率,增加胎孕死亡率[5]。

上述多种不孕相关自身抗体的联合检测,有望解开不孕症之谜,同时为远期的不孕症临床治疗提供新思路。上述研究对比各组患者的体内相关抗体的阳性表达。结果显示,原发性不孕组及继发性不孕组患者的ASAb、AEm Ab、AVo Ab、ATAb、Ah CGAb及AZp Ab含量显著高于正常对照组(P <0.05),继发性不孕组患者的以上抗体阳性率高于原发性不孕组,但是差异无统计学意义(P >0.05),提示以上自身抗体在不孕症的发生过程中发挥重要作用,对其自身抗体进行干预有望成为治疗不孕症的有效手段之一。

有研究证实,正常的妊娠过程中,以Th2型细胞因子分泌为主,Th1处于相对抑制状态,而当Th1型细胞因子过度表达时将对妊娠组织产生毒性效应,继而发生不孕。机体维持正常的免疫状态有赖于各种免疫细胞尤其是T细胞亚群的协作与制约,最终产生适度的免疫应答,在发挥清除异物抗原效果的同时又可避免产生组织损伤[6]。CD4+与CD8+之间的恒定比例构成细胞免疫调节的重要环节,其平衡紊乱有可能导致机体免疫紊乱,产生针对自身抗原的自身抗体,无法有效清除免疫复合物,干扰相应器官的正常生理功能,促进炎性介质对输卵管组织的损伤,最终产生不孕[7,8]。上述研究对各组患者的细胞免疫水平进行检测。结果显示,不孕症患者与正常妊娠人群相比,CD4+水平与CD4+/CD8+比例大幅下降,其中继发性不孕组患者上述指标值下降幅度更大,提示其发生T细胞亚群比例失调,出现异常免疫调节。

在不孕症患者中,相关自身抗体与T细胞亚群水平发生异常,在对不孕症患者的自身抗体与T细胞亚群水平进行相关性分析后发现,不孕症患者的ASAb、AEm Ab、AVo Ab、ATAb、Ah CGAb及AZp Ab自身抗体含量与CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平呈负相关,提示T细胞亚群水平异常的育龄期女性很可能存在自身抗体水平异常,应早期进行自身抗体水平检测并加以干预。不孕症患者的自身抗体水平大幅上升,伴有T细胞亚群的紊乱,可能是造成女性不孕的直接原因,对以上相关因素进行及时干预有望改变不孕症结局。

摘要：目的 分析不孕症患者自身抗体含量及T细胞亚群的变化。方法 选择在该院接受治疗的不孕症患者117作为观察组,其中原发性不孕49例、继发性不孕68例,另取正常妊娠78例作为正常对照组,检测各组患者的抗精子抗体(ASAb)、抗子宫内膜抗体(AEm Ab)、抗卵巢抗体(AVo Ab)、抗滋养层抗体(ATAb)、抗人绒毛膜促性腺激素抗体(Ah CGAb)及抗透明带抗体(AZp Ab)等自身抗体含量,T细胞亚群包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平,进一步分析自身抗体含量与T细胞亚群水平的相关性。结果 原发性不孕组及继发性不孕组患者的ASAb、AEm Ab、AVo Ab、ATAb、Ah CGAb及AZp Ab含量显著高于正常对照组(P<0.05);血清CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平显著低于正常对照组(P<0.05),各组间CD8+水平比较差异无统计学意义(P>0.05);不孕症患者的ASAb、AEm Ab、AVo Ab、ATAb、Ah CGAb及AZp Ab等自身抗体含量与CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈负相关。结论 不孕症患者的血清相关抗体含量大幅上升,T细胞亚群水平紊乱,可能直接参与不孕症的发生、发展,有望成为治疗不孕症的新靶点。