免疫毒理学

免疫毒理学（共4篇）

免疫毒理学 篇1

免疫毒理学是指对免疫系统的结构或功能的任何不良作用, 或由于免疫系统功能异常对其他系统的不良作用。这里的不良作用是指机体防御感染或肿瘤 (免疫抑制) 所需要的体液或细胞免疫损伤或免疫毒性, 或引起不必要的组织损伤 (自身免疫、超敏、或慢性炎症) [1]。

免疫毒理学主要研究免疫抑制、免疫刺激、超敏反应、慢性炎症、自身免疫及其他与免疫有关的毒理反应。本文拟从以上几个领域的体外替代试验进行逐一介绍。

1. 免疫抑制体外替代试验

免疫抑制可导致机体适应性免疫应答的抑制, 宿主抵抗力下降和经常性的严重感染。与免疫抑制相关的免疫毒理实验还是仅限于一般的毒性测试阶段[2]。

2. 免疫刺激体外替代试验

免疫刺激包括眼刺激、皮肤刺激、黏膜刺激等。

眼刺激离体替代方法主要用离体器官模型、基于鸡胚绒毛膜尿囊膜的试验、基于细胞功能试验及组织工程等替代方法模拟在体兔眼刺激试验 (Draize试验) 。

其中离体器官模型使用宰杀动物 (猪、牛、鸡、兔) 的眼球/角膜等作为试验材料, 利用检测角膜水肿、混浊及荧光素滞留, 和组织学观察等结果来评估受试物的眼刺激性[3]。离体兔眼试验 (isolated rabbit eye, IRE) 区分不同刺激物较为敏感, 加上角膜组织学观察和水肿两个指标后, 对刺激物的分类与在体试验一致性高;而牛角膜混浊和渗透性试验 (bovine corneal opacity and permeability assay, BCOP) 只能筛选严重眼刺激性受试物, 加上组织学观察后才能区分不同刺激性的受试物[4]。

基于鸡胚绒毛膜尿囊膜的试验 (Chorioallantoic membrane vascular assay, CAMVA) , 利用尿囊绒膜与眼黏膜组织结构有类似的特点, 筛选发育良好的鸡胚绒毛膜尿囊膜, 给予试验样品, 利用肉眼可见的出血、凝血、充血等指标并计算RC50作为刺激判断依据。

Draize试验大部分原理可以通过蛋白变性和细胞膜破坏来解释, 由此发展而来的血红细胞溶血试验, 可以通过测定漏出红细胞的血红蛋白量来评价膜损伤。采用化合物与哺乳动物红细胞直接接触, 通过定量检测红细胞溶血, 以及释放出细胞外的血红蛋白变性程度, 模拟角膜的损伤作用, 适用于区分极轻度和非轻度刺激物, 特别是潜在急性眼刺激性物质的快速筛查。检测物质类型包括表面活性剂及相关产品。

其他基于细胞功能试验及组织工程等替代方法还有荧光素漏出试验 (sodium fluorescein leakage test, FLT) 可用于评价受试物对细胞屏障功能的影响, 以导致培养单、多层细胞荧光素漏出20%或50%的受试物浓度 (FL20、FL50) 为检测指标, 以及中性红释放试验 (the neutralred release assay, NRR) 等。

皮肤刺激、腐蚀的体外替代试验建立的模型有皮肤角质形成细胞培养、皮肤成纤维细胞培养等单层细胞培养。单层细胞培养存在着不少的缺陷, 最重要的是模型缺乏完整皮肤的一些重要的特征, 如表皮细胞排列紧密、表皮选择性渗透屏障以及皮肤不同细胞类型之间的相互作用, 不能模拟正常人的皮肤。而且, 因为缺乏角质层的屏障作用, 化学物对细胞产生直接的细胞毒性, 使细胞模型呈现高敏感性。所以, 单层细胞实验所获得的结果一般难以用来解释体内情况或与体内情况相联系[5]。

为突破单层细胞培养的这些局限性, 更好的模拟在体的真实状态, 科学家从正常人或动物身上获取完整的皮肤组织块培养来进行试验研究。欧洲替代方法验证中心 (ECVAM) 采纳并进行验证前研究的皮肤组织培养模型包括有人皮肤组织块体外培养模型 (Prediskin™模型) 、非灌注猪耳朵实验还有体外小鼠皮肤完整功能实验 (SIFT) 。三种方法经改良后, 其中SIFT法其预测能力得到改善幅度较大, 特异度、灵敏度和总准确度均超过了60%, 符合现有既定标准, 该方法最终进入正式的验证过程[6]。

皮肤组织块来源有限, 体外存活时间短的制约限制了它作为科研对象的应用前景。而近年来组织工程学研究发展迅速, 用复合细胞层构建人重组皮肤层的方法已实现商业化。

常用的皮肤刺激重建模型有Episkin™、EpiDerm™、SkinEthic™[7], 因其呈现良好的重现性和预测能力而被ECVAM所采纳, 现已进入正式验证研究[8]阶段。

3. 超敏反应体外替代试验

迟发型超敏反应是个体接触变应原产生的特异性T细胞介导的免疫学记忆感应, 由个体再次或多次接触该变应原引起。传统上检测迟发型超敏反应的方法是豚鼠法。豚鼠法分为豚鼠最大剂量法 (GPMT test) 和局部封闭涂敷法 (Buehler test) , 不仅动物用量大, 耗时长, 而且终点判断主观因素强。继豚鼠法后, 有小鼠局部淋巴结 (LLNA) 法, 是目前技术验证最为完备的能在一定程度上能使检验结果定量的试验方法。使用动物少, 耗时减短, 但依旧需要使用动物, 并且因为试验中使用放射核素做标记, 有造成环境污染和危害操作者健康的风险。

随着近年来公众和社会机构对动物福利的要求的提高, 对动物实验体外替代方法的研究日渐热门起来。

欧洲在2013年颁布了禁止化妆品及其原料禁止使用动物做实验的禁令。为适应这一要求, 各组织开发了一些评估过敏体内生物信号通路中一个或多个步骤的试验方法。在欧洲进入预验证最终阶段的试验包括了:直接肽反应性分析 (DPRA) 、人细胞系活化试验 (h-Clat) 、粒细胞皮肤致敏性试验和KeratinoSens™试验[9]。

由于基础科研的发展, 我们对迟发型超敏引起的皮肤致敏现象有了更深入的理解。皮肤致敏是复杂的过程, 涉及多个细胞相互作用过程。主要的皮肤致敏分为induction、elicitation两阶段。在induction阶段, 致敏原穿透皮肤, 与体内蛋白质或半抗原前体 (经皮肤代谢活化) 相互作用。紧接着, 角质细胞分泌像IL-1α和IL-18这样的细胞因子。DC (dendritic cells) 识别共价结合的蛋白质-致敏结合物, 并在一些细胞因子的作用下成熟并向淋巴结迁移。在淋巴结内DC将抗原呈递给幼稚T细胞, 并使得幼稚T细胞分化、成熟并释放到外周血液循环中。在elicitation阶段, 游离在外周血中的成熟T细胞如果遇到相同的致敏原, 则发生大规模的免疫炎症反应[10]。

3.1 直接肽反应性分析 (DPRA)

针对以上介绍的迟发型超敏反应原理, 最直观的检测方法就是测定致敏物与体内蛋白 (半抗原/半抗原前体/完全抗原) 共价结合的发生情况。DPRA是假设多肽的损失都是由于与待测物产生共价修饰造成的。将合成的含半胱氨酸或赖氨酸的多肽与过量的待测物共孵育, 然后用HPLC检测未经共价修饰的多肽的吸收量。有研究使用谷胱甘肽和含赖氨酸, 组氨酸或半胱氨酸的具有反应性残基的合成7肽进行测试。spearman分析结果表明 (1) , 除了组氨酸以外, 致敏物致敏能力 (判定依据来自LLNA实验) 与待测物的吸收程度明显相关 (谷胱甘肽p=0.001;赖氨酸p=0.025;半胱氨酸p=0.020) 。其中, 具有最高灵敏度的是含半胱氨酸残基的多肽 (80.8%) , 最低的是含组氨酸多肽 (11.5%) [11]。

3.2 人细胞系活化试验 (h-CLAT) /粒细胞皮肤致敏性试验 (MUSST)

基于迟发型超敏发生的原理, 当曝露于致敏物时, 不成熟的DC细胞, 比如说LC (抗原呈递细胞) 会迁移至淋巴结以敏化幼稚T细胞。在此过程中, 不成熟的DC细胞逐渐成熟, 伴随着实质的细胞表型的变化, 包括细胞间粘附分子 (CD54) 、细胞共刺激因子 (CD86) 和MHCⅡ抗原 (HLA-DR抗原) 等多种细胞表面因子的上调[12]。

人细胞系活化试验 (h-CLAT) 与粒细胞皮肤致敏性试验 (MUSST) 基于相同的作用机制。针对具体测试来说, 人细胞系活化试验是 (h-CLAT) 使用人类单核巨噬细胞系的一种, THP-1细胞。该实验评估THP-1细胞与待测物共孵育24小时后, 细胞表面CD54或者CD86的表达变化。在实验结果的数据处理上, 通常我们使用相对荧光强度RFI (relative fluorescence intensity) 来判定待测物的致敏能力。有研究报道称, 当用CD54的RFI≥200, 或者CD86的RFI≥150为判定待测物是否致敏的标准时, 该实验的准确度是93%[13]。

与此类似的, 粒细胞皮肤致敏性试验 (MUSST) 也是使用人类单核巨噬细胞系的一种, U-937细胞。不同的是U-937与待测物共孵育后, 只需测试细胞表面CD86的扩增情况。

3.3 KeratinoSens™试验

有证据表明, 在致敏的induction阶段, 角质细胞中Nrf2-Keap1-ARE通路被触发, 从而引发免疫作用[14]。

Nrf2-Keap1-ARE通路中, 转录因子Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2) 和含有活性半胱氨酸残基的阻遏蛋白Keap1结合在一起。在未被诱导的状态下, Keap1通过自身BTB区结合Cul3、Kelch区结合Nrf2, 将Nrf2连接到E3复合体, 使泛素从E3转移到Nrf2的赖氨酸残基 (位于ETGE基序、DLG基序之间) , 泛素化的Nrf2被迅速降解。发生氧化应激时, Keap1特定的半胱氨酸残基被修饰, 导致构象的改变, DLG基序与Keap1的亲和力减弱而分离, 从而免于泛素化降解。

免于降解的Nrf2转录因子在细胞核中积聚, 与核内抗氧化反应元件ARE (antioxidant response element) 相互作用, 调节抗氧化蛋白和II相解毒酶的表达。

少数致敏物, 尤其是专一与赖氨酸残基反应的致敏物, 在试验观察中看似没有参与Nrf2-Keap1-ARE通路, 而是触发了其他目前未知的毒理学通路[15]。

根据迟发型超敏反应触发的细胞通路, 研究人员设计将含ARE元件控制的荧光素酶报告基因的人类AKRIC2基因稳定嵌入HaCaT角质细胞, 从而获得KeratinoSens™细胞系。该细胞系与待测物共孵育一定时间后, 再与荧光素底物相互作用, 所测荧光强度可在一定范围内指示致敏物致敏能力。

KeratinoSens™试验的结果是统计EC1.5值 (诱导出比背景显著高出50%的浓度) 。在Roger Emter等人对67种化合物进行的KeratinoSens™试验中, 对其中36个做统计发现质控品的变动在11.3%, 故此1.5倍的诱导在几乎所有试验都有显著的统计学意义。当使用EC1.5作为判定标准时, 在43个致敏物 (使用LLNA判定) 中, KeratinoSens™试验结果出现5个假阴性;24个非致敏物 (使用LLNA判定) 中, 5个假阳性;总体准确率是85.1%。如果与DPRA法联用, 则可以使总体准确度提高至89.6%

3.4 四种主流检验方法的比较及发展

Caroline Bauch等人筛选了人类斑贴试验有文献记录的或临床数据的23种化合物, 通过这致敏能力确切的23种化合物验证了四种体外替代方法的准确度、敏感度、专一性。当然, 如果样本量增加, 得出的结果可能有变化, 但在小范围内仅就准确度来说, 总体上四种方法与人类斑贴试验比准确度在83%～91%之间, 与LLNA试验比准确度在78%～91%间。值得一提的是, 在两组对比中DPRA的准确度都是最高的91%, MUSST法与人类数据相比准确度为87%, 而与LLNA相比则为78%。

异丁子香酚和肉桂醛是半抗原前体, 是不直接与体内蛋白质反应的致敏物。使用U-937细胞系的MUSST试验不能准确识别这两种化合物为致敏物, 而其他三个试验可以识别出。如果一个试验没有足够的代谢机能, 那么这个细胞系对于判断半抗原前体是否致敏是不够的, 需要一些补偿的机制。Schreiner与合作者建立了角质细胞与树状细胞共培养的方法来检测像异丁子香酚这样的半抗原前体[16]。还有研究者使用皮肤模型模拟试验, 皮肤模型能模拟不同种类皮肤细胞的代谢机制和真皮组织不同层间的穿透机制[17～19]。

角质层的屏障是皮肤发挥防御作用的关键, 是迟发型超敏作用不得不考虑的一个环节, 但是目前的四种体外的方法都没有能够准确的模拟这个环节, 所以我们要进一步发展检测策略。在评估穿透皮肤能力时使用像QSAR这样的工具, 可以将化合物的化学结构与皮肤穿透力定量相关[20]。目前, 有报道保洁公司发展的贝叶斯网络整合测试策略, 综合了计算机模拟、化学结构预测、有关化学反应活性、DC活化等数据, 来评估化学物致敏性。

致敏物引起的表皮炎症反应使得树突状细胞和T细胞释放细胞因子, 如IL-18。Corsini和同事提出了使用角质细胞系NCTC2544, 通过IL-18的释放, 以确认致敏物, 并把刺激物和呼吸道过敏原区别开来[21]。Coquette和同事提出在重建皮肤模型通过考虑IL-1α和IL-8的比值来区分刺激物和致敏物的可能性[22]。

3.5基因标志物及其他

新的免疫学技术如流式细胞术、蛋白质组学及基因芯片技术与免疫毒理学相结合给在免疫毒物的筛选、毒性机制研究、危险评估的研究带来革命性的影响。

在基因水平上, TARAMA等[23]用微阵列分析致敏化学物 (能导致IV型免疫反应) 导致的树突状细胞基因表达的改变, 通过聚合酶链反应筛选出了两个能引起IV型免疫反应的基因标志物:Sdc1和SMO。JOHANSSON等[24]用20种致敏化合物、20种非致敏化合物和对照组分别对细胞株MUTZ-3进行染毒, 24小时后通过IPA (IngenuityPathway Analysis software) 软件分析与细胞转导、转录相关的200种基因标记物的表达水平, 正确区分出了致敏物和非致敏物, 结果与LLNA有很好的吻合性。但成本高, 不能广泛使用。

TAIHARDAT[25]采用敏感、快速、定量的低密度基因芯片, 选择经筛选的165个基因探针, 对未成熟树突状细胞进行基因芯片分析, 结果显示有21个基因表达有显著变化。该法快速, 成本较低, 有望成为LLNA的体外替代方法。

SLODOWNIK等[26]将人的皮肤嫁接到鸡胚绒毛尿囊膜上建立了Skin-CAM模型, 该模型价格相对低廉, 也是致敏体外筛选替代试验的一个有意义的尝试。

4. 慢性炎症体外替代试验

炎症是局部损伤后的修复反应, 是机体的保护机制。慢性炎症特征为巨噬细胞和淋巴细胞浸润, 并形成免疫性肉芽肿和更为严重的免疫毒性反应。现有评估慢性炎症使用动物模型植入后观察局部反应。炎症过程因涉及器官、组织、细胞种类多, 机制复杂, 故体外替代试验报道不多。Granchi等[27]有研究表明, 对外周血单个核细胞中的IL-1、IL-6、GM-CSF、TNF等细胞因子的变化可预测骨水泥产品炎症反应[28]。

5. 自身免疫体外替代试验

自身免疫是免疫原与组织或血清蛋白结合, 改变蛋白的构象, 使得机体可对这些修饰后的自身抗原进行识别, 产生针对自体细胞的抗体或T淋巴细胞与宿主的自身抗原发生反应, 导致免疫细胞对自体组织进行攻击, 进而细胞损伤或组织破坏, 并可能导致慢性、消耗性自身免疫性疾病。自身免疫一般表现为较高的个体差异性, 影响因素复杂, 很难使用动物模型进行模拟试验。

6. 体外替代方法管理现状及展望

很多国家和地区已先后建立了专门的机构开展替代方法的建立、验证和管理等工作, 如欧洲替代法验证中心 (ECVAM) 、美国替代方法验证协调委员会 (ICCVAM) 、德国动物实验替代方法评价研究中心 (ZEBET) 、日本动物实验替代方法学会 (JSAAE) 和荷兰国家替代法研究中心 (NCA) 等。截至2011年7月, 已有69种动物实验替代方法获得了经济合作与发展组织 (OECD) 等组织的管理认可。我国替代法研究起步较晚, 目前尚未建立专门的替代法验证与管理认可机构, 但越来越多的学者和机构已经开始关注体外替代试验的发展, 相关研究报道逐年增多, 也开始有了教育培训与学术交流。在不久的将来随着医药产业发展与管理水平的提高, 体外替代试验需求不断增多, 我们也必定能建立起自己完善的体外替代试验管理制度和管理体系[29]。

免疫毒理学 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

取辽宁省肿瘤医院1995～2004年间手术切除的结节性筋膜炎62例。全部标本均经过10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,连续切片,片厚3～5μm,分别进行HE和免疫组织化学染色,对其中的51例病例进行随访。

1.2 免疫组织化学染色

所有试剂均购自福州迈新生物技术公司,运用SP法,DAB显色,设阴性对照。Vimentin,aclin,SMA,CD34以细胞胞质中有棕黄色颗粒状物质沉着为(+);S-100,PCNA以细胞胞核中有棕黄色颗粒状物质沉着为(+),CD3,CD20以细胞胞膜有棕黄色颗粒状物质沉着为(+)[4]。采用计数标记指数(labeling index,LI),即每例切片连续观察10个高倍视野(10×40倍),计数1000个细胞中的阳性细胞数,求出每100个细胞中的阳性细胞数。

1.3 统计学处理

计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 临床资料

本组62例结节性筋膜炎患者,其中男28例,女34例,年龄12～64岁,平均38岁。从发病到治疗时间,20例为2周内,31例为4周内,5例为3个月,6例为6个月以上。所有病例均在1～2周内出现局部结节,有轻微疼痛及局部麻木感,患处皮肤微隆起,颜色正常,结节边界不清。发生部位:上肢前臂17例,胸壁15例,肩背部10例,下肢8例,腹壁4例,足3例,颈部3例,手2例。结节直径:>2cm 17例,<2cm 45例。单结节病变57例,2个以上结节病变5例。62例均行局部肿块切除,切缘距离肿块1 cm。51例获得随访结果,随访时间6个月至10年,其中3例复发,复发时间距离手术时间最短的6个月,最长的2年,再次手术后未见复发,未发现转移病例。

2.2 病理学检查

圆形或者卵圆形结节,无包膜,与周围组织分界不清,质地坚实,切面灰白色。镜下所见:增生活跃的梭形细胞,细胞核肥胖淡染,核仁明显,可以见到核分裂;偶见多核巨细胞;不同程度的增生的胶原纤维和网状纤维,伴有水肿和黏液变;有新生的毛细血管和炎性细胞浸润。依据病变结构和成分的不同分为三个组织学类型[5],见表1。

2.3 免疫组织化学检查

2.3.1 Vimentin,actin,SMA,S-100,CD3,CD20,CD34阳性细胞胞质中可见棕黄色颗粒状物质沉着,但在各类型中的表达有所不同,见表2。

2.3.2 PCNA阳性细胞胞核中有棕黄色颗粒状物质沉着,其计数标记数为7%～68.4%,平均37.7%,阳性细胞弥漫分布,也可以散在灶状或片状分布。PCNA的表达与复发有关系,将PCNA按其表达程度分为高表达组(LI>38%) 1 1例和低表达组(LI<38%)51例,高表达组的复发率明显高于低表达组(P<0.01),见表3。

3 讨论

1955年Konwaler首先报道8例,并命名为“假肉瘤性纤维瘤病”;1961年Stout指出本病为特殊性原因不明的反应性增生或肉芽肿;同年Price对65例结节性筋膜炎进行了临床病理分析,进一步将其分为三个类型:(1)黏液瘤样型;(2)纤维瘤样型;(3)肉芽肿型,也称中间型。随着对结节性筋膜炎的认识逐渐深入,特别是免疫组织化学和超微结构等先进技术的应用,又让大家增加了新的认识。

参考文献

[1]Allen PV.Nodular fasciitis.Pathology,1972,4:9.

[2]Wirman JA.Nodular fasciitis,a lesion of myofirobiast:An ultrastuclural study.Cancer,1977,38:2378.

[3]Meister P.Nodular fasciitis(analysis of 100 cases and review of the literature ).Pathol Res Pract,1978,162:133.

[4]Montgomery EA.Nodular fasciitis:Its morphologic spectrum and immunohistochemical profile.Am J Surg Pathol,1991,15:942.

免疫毒理学 篇3

近年来, 机体的生物反应变异剂 (M B P) ——制剂的异源类引起人们兴趣。制剂的主要效果是直接作用于机体体内平衡结构, 提高机体抗肿瘤免疫力。生物反应变异剂可在合成的化合物和天然药物中, 主要是从植物源的药物中寻找。应当提出, 提高对作为生物反应变异剂潜在源的植物, 在很大程度上力图寻找现有综合效果和在保证最大生物有效性的剂型中有生物活性物的低毒性药剂。

植物源制剂, 很久以来在民间医学中就用来治疗恶性增生物。大多数用于肿瘤的植物药的疗效, 与抑制原发性肿瘤结的生长、抑制转移、提高治疗恶性增生物方法的效果和控制机体体内的平衡系统 (它的功能在无法补偿的生长过程中受到破坏) 有关。植物制剂实现治疗作用的主要机理之一, 是其对天然免疫系统机能施加影响。

天然免疫系统在实现抗肿瘤保护机体中的意义, 现在无可争辫。天然杀伤细胞 (EKK) 和巨噬细胞是排除异种和变换成分的天然免疫的中枢操纵环节。与细胞毒性功能一样, 天然免疫系统具有协调血液系统和免疫系统环节各功能的明显调节活性。在细胞、组织和系统水平上实施调节的主要作用属于胞质。现在研究生物反应变异剂, 其中包括细胞生长抑制剂的性能中, 必须评价制剂不仅对天然免疫力效应细胞毒性活性的影响, 而且要评价它对巨噬细胞产生胞质的影响, 以确定药理动因的阳性效果和阴性效果。

在O·H·科诺瓦洛娃等人 (1992) 的研究中, 在移植肿瘤动物体上已查明沙棘制剂——沙棘油、沙棘树皮和树枝乙醇提取物 (ЭΚПО) , 可以抑制原发性肿瘤结的生长, 极大地抑制肿瘤的扩散过程和提高细胞抑制生长剂的疗效性能, 为该植物制剂列入生物反应变异剂提供了依据。为了阐明作为ЭΚПО和沙棘油治疗作用的分子细胞的机理, 研究沙棘制剂在正常条件下和在肿瘤病理学条件下对天然免疫力效应器的功能活性有很高价值。

本研究的目的在于研究正常条件下和在化疗背景及肿瘤病理条件下, 使用沙棘树皮和树枝乙醇提取液、沙棘油, 对小鼠天然免疫系统的功能状况的影响。

主要的研究任务:一是研究健康小鼠在服用不同沙棘树皮和树枝乙醇提取液的方案下, 其天然免疫功能状况。二是研究小鼠Lewis肺癌在服用沙棘树皮和树技乙醇提取液和沙棘油时, 其天然免疫系统的功能状况。三是研究小鼠Lewis肺癌在沙棘制剂 (沙棘树皮和树枝乙醇提取液和沙棘油) 与环磷酰胺合用时, 其天然免疫系统的功能状况。

科学新颖处:首次研究了沙棘树皮和树枝制剂和沙棘油对健康小鼠天然免疫系统功能状况的影响, 提出该植物制剂对天然杀伤细胞和腹膜巨噬细胞的免疫效果。使用ЭΚПО对脾杀伤细胞的细胞毒性活性有刺激作用。查明了服用ЭΚПО对刺激天然杀伤细胞疗程的适宜持续时间 (5昼夜) 。

在接种Lewis肺癌动物的研究中, 发现ЭΚПО和沙棘油对天然免疫力效应器的功能状况有修复作用, 表现在天然杀伤细胞的细胞毒性功能的消耗症状减少, 肿瘤剌激腹膜巨噬细胞的活性下降, 巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子正常化。

本研究结果已经被俄罗斯卫生部采用, 作为对恶性肿瘤患者采用化疗方案时提高化疗疗效的药剂, 以扩大沙棘树皮和树枝制剂和沙棘油的临床试验。在无损动物试验中取得的资料, 是在天然杀伤细胞受到抑制情况下将ЭΚПО作为刺激其细胞毒性活性药剂可能应用的依据。

1 材料和方法

供试材料是品系F1 (CBA×C57B1/6) 380只两性小鼠和品系F1 (DBA×C57B1/6) 90只雄小鼠。将106Lewis肺癌细胞肌肉注射于小鼠作转移肿瘤模型。

实验中使用阿尔泰国立医学院药型工艺教研室制备的特殊制剂——沙棘油与沙棘树皮和树枝乙醇提取液。用探针给动物胃灌沙棘制剂1ml/kg。

在无损动物的实验中使用下述方式:1次给ЭΚПО, 在1, 2, 3, 5, 7昼夜内;每天给ЭΚПО, 在5昼夜内, 间隔24h。对照动物投蒸馏水, 剂量和投料方式相同。

在Lewis肺癌动物的研究中, 沙棘制剂从肿瘤移植后的第2昼夜开始到第22昼夜止, 每日服用, 间隔24h;用蒸馏水植入Lewis肺癌动物用作对照。

实验中使用了细胞生长抑制剂环磷酰胺。在Lewis肺癌小鼠的实验中, 肿瘤转移后的第8昼夜, 一次肌注125mg/kg的环磷酰胺。

在使用植物制剂第1, 2, 3, 5昼夜, 对无损小鼠一次投用ЭΚПО疗程不同时间内, 对天然免疫系统指数的影响在1, 2, 3, 5, 7昼夜服用植物药剂条件下进行研究。用沙棘制剂治疗疗程结束后的1, 3, 5, 7昼夜。测定在第5次服用ЭΚПО停止后天然免疫力功能活性水平。在肿瘤抑制后的1, 3, 5, 7, 11, 15, 22昼夜, 对Lewis肺癌小鼠在疗程投用ЭΚПО和沙棘油时评价天然免疫力系统的状况。在使用细胞生长抑制剂后的3, 7, 14昼夜, 对沙棘制剂和环磷酰胺合用的影响进行评价。按《实验动物操作规程》将动物断头处死。

利用M·H·雷科娃等 (1981) 使用3H——二氧嘧啶核苷和核糖核酸梅的膜毒性方法, 检验脾和淋巴结中天然杀伤细胞的细胞毒性作用。对象是保存在离体条件下的K——562有核红细胞、得到的结果用溶解单位表示。为了评价脾的溶解点位将活性换算成全器官的细胞含量和10×1016的脾细胞。淋巴结和天然杀伤细胞的细胞毒性换算成10×1016的细胞效应表示。

覆膜巨噬细胞的细胞溶解活性按B.И·谢列特佐夫等人 (1987) 的方法测定。用预先以3H-胸腺嘧啶核苷标记小鼠P-815肥大细胞瘤细胞作为靶细胞。

从实验和对照小鼠的粘连腹膜细胞中获得的上清液白血球介素-1的活性, 按Mizel.S. (1980) 添加磷酸甘油醛亚有丝分裂剂, 以刺激胸腺细胞增生的方法予以评价。白血球介素-1的产生水平以活性的标定单位表示, 标定单位计算为“效果剂量”的曲线面积, 根据所获资料建立曲线。

腹膜巨噬细胞所产生的肿瘤坏死因子 (ΦΗΟ↓) 水平用离体保存的对肿瘤坏死因子敏感的L-929品系测定。肿瘤坏死因子产生水平用活性标定单位表示。用非参数曲线ν-Vilkoksona-Manna-Uitni统计处理所得结果。P≤0.05时结果误差可信。

2 研究结果和讨论

在无损动物体上的实验证明, 沙棘油和沙棘树皮树枝制剂对天然免疫力效应器的功能状况有调节作用。

在给无损小鼠一次服量为1ml/kg的ЭΚПО时, 脾天然杀伤细胞毒性活性在观察的第1和第2昼夜, 与背景值无区别。在第3昼夜, 器官的杀伤细胞毒性增高并超过对照水平的5.3倍, 溶解单位为352.81±108.90 (P<0.01) , 而10×106脾细胞的活性与背景指数相对增加了6.9倍 (P<0.01) , 溶解单位达到24.53±4.88。脾的溶解电位和10×106脾细胞的活性, 在研究的第5昼夜, 分别超过对照值的6.6倍和9.4倍。因为在此期间 (3, 5昼夜) 脾细胞量仍处在对照水平, 那么应得出结论, 迁移和增殖过程在提高脾细胞上没有特殊意义。器官溶解电位的增高可能是由于成熟的天然杀伤细胞活性的提高和其循环速度的增加。看来, 这是由于天然杀伤细胞前体的新一代杀伤细胞的成熟在加快。

疗程中投用ЭΚПО引起了评价指标的另一种动态。10×106脾细胞的天然杀伤活性在服制剂所有应用的疗程中, 与背景水平没有差别, 可是折算成全器官的脾的细胞毒性活性随着细胞量增加而同步增高 (表1) 。在疗程中服沙棘制剂所见到的脾溶解电位的增强, 是由另一种机理决定的。在疗程中服沙棘制剂。脾细胞毒性增加时由于导致脾细胞, 其中包括具有杀伤活性的细胞总量增加而发生的过程。脾下细胞量的增加是沙棘制剂作用引起的细胞重新分布和迁移的结果;另一方面, 大概是疗程使用植物制剂, 沙棘在脾细胞天然杀伤细胞前体细胞方面所增生的活性得以实现。在第2和第7次服ЭΚПО时, 器官细胞量变化曲线有两个最大值, 看来, 这不能排除某种机理的参与 (表1) 。

注:制剂每日服用, 间隔24h, 剂量1ml/kg;* P<0.05可靠值与对照不同;** P<0.01可靠值与对照不同。

在5和7昼夜期间服ЭΚПО, 发现脾的溶解电位出现了饱和效果——而增加制剂服用次数并未引起器官功能活性的加强。就外表看, 由研究细胞引起的所有潜在活化效应, 都参与了反应, 因此再增加总剂量是不适宜的。

第5次服用ЭΚПО停止后, 脾天然杀伤细胞功能活性研究表明, 观察的第1和第3昼夜, 10×106脾细胞的天然杀伤活性与背景指数。

无统计意义上的差别。在第5, 7昼夜可靠性增高 (分别占对照水平的130%和250%) , 尽管在服ЭΚПО的小鼠组中器官的细胞量与未治疗的动物值没有差别, 但是脾的溶解电位在整个观察期间 (第3昼夜除外) , 仍高于背景指数。第7昼夜它的值最大, 占对照的280%。脾杀伤细胞的细胞毒性活性变化的波状性质引人注意。由效应制剂作用活化的脾细胞毒性的降低, 是杀伤细胞潜力所引起的, 在停服ЭΚПО的第5, 7昼夜, 由天然杀伤细胞的功能活性的下一个峰所代替。根据文献资料, 第7昼夜是标记前的天然杀伤细胞的成熟期, 因此, 脾细胞的细胞毒性的第二最大值与天然杀伤细胞新一代的活性相关。

在我们对脾细胞的细胞毒性活性的补充研究中, 也对淋巴结天然杀伤活性作了评价。在研究第5次停服ЭΚПО后, 10×106脾和淋巴结细胞的天然杀伤活性动态时, 获得相反性质的曲线。如果脾细胞的细胞毒性活性在研究的第7昼夜增高, 那么淋巴结天然杀伤细胞最高的活性集中在行服ЭΚПО后的第一昼夜 (占对照指数的188%) , 以后淋巴结天然杀伤细胞的细胞毒性下降, 在观察的第7昼夜为背景水平的60%。因为淋巴结的群体主要由圆形细胞组成, 所以圆形细胞的细胞毒性是由免疫系统的中枢器官, 包括脾的功能活性杀伤细胞的迁移决定的。在服ЭΚПО的条件下, 脾已被查明的变化在淋巴结中发生效应活性相对滞后。

一次给无损动物ЭΚПО导致腹膜巨噬细胞的功能活性发生变化, 类似于脾的天然杀伤细胞的毒性动态——巨噬细胞的毒性指数在观察的第3, 5昼夜增高, 分别超过背景值1.7倍和2.0倍。疗程使用沙棘制剂引起了单核吞噬细胞另一种反应性质。

在小鼠对照组中, 细胞毒性指数, 在效应与对象之比为5∶1, 确实低于10∶1的毒性指数 (分别为19.51±5.22%和30.82±4.03%) 。显然, 第一种情况与第二种情况相比, 是分摊到每个靶细胞的细胞毒性巨噬细胞的因子量最小决定的。疗程服用ЭΚПО的动物组中并没有发现10∶1和5∶1之间的类似差异。显然, 被研究制剂所起作用促成的效应处于最大功能活性状态, 且溶解了对细胞毒性作用有敏感的对象。细胞毒性指数值在该情况下不是由巨噬细胞功能活性决定, 而是同肿瘤靶细胞对其作用的抗性决定的, 但是在增加植物制剂服用次数时, 按单核吞噬细胞的细胞毒性指数判断, 靶细胞对经过巨噬细胞加工的蛋白水解因素的敏感度, 也依疗程时间长短而发生变化。众所周知, 单核吞噬细胞具有大量的能够完成细胞溶解或抑制肿瘤细胞的因素, 有可能是疗程使用ЭΚПО对巨噬细胞所完成的细胞毒性机理的频谱起作用, 而扩大或缩小都决定于药理作用的长短。抗一定因素的靶细胞对别的是敏感的, 这可以在增加服用ЭΚПО 1到3次后观察到细胞毒性指数在增高。在第5昼, 尤其是第7昼夜服用植物制剂时, 研究指数大大降低, 后一种情况细胞毒性指数为背景水平的40%。

腹膜巨噬细胞的细胞毒性在第5次给ЭΚПО结束后的研究表明, 尽管停服制剂, 但细胞毒性指数继续下降, 至第7昼占对照指数的14%。

虽然第5次服用ЭΚПО和停服导致腹膜巨噬细胞的毒性明显降低, 但这些效应与对照相比, 表现出了白血球介素-1和肿瘤坏死因子产量水平增高。查明了在第5次服用沙棘制剂结束后第7和第3昼夜, 白血球介素-1的最大值为背景指数的224%和272%。以后由巨噬细胞盛产的白血球介素-1下降, 但仍大大高于对照水平。肿瘤坏死因子的活性水平在观察的第1和第3昼夜, 为背景值的359%和535%。到第5昼夜, 肿瘤坏死因子下降, 到第7昼夜重新增加, 并超过对照水平的6.2倍。

在第5次停服ЭΚПО时揭示的白血球介素-1和肿瘤坏死因子活性高水平和脾天然杀伤细胞的细胞毒性活性高之间的一致性。天然杀伤细胞功能活性的增强, 虽然是同白血球介素-1和肿瘤坏死因子的作用有关。因为在许多靶细胞其中包括天然杀伤细胞方面的调节性能, 是两种因素所固有的、Lewis肺癌的发展引起天然免疫系统效益功能活性的明显改变, 影响着细胞的细胞毒性功能和分泌功能。

腹膜巨噬细胞在改日动物接种Lewis肺癌后的第3和第5昼夜, 被肥大细胞瘤P-815生长的刺激作用所代替。在Lewis肺癌医治后的第7昼夜, 发现肿瘤细胞刺激增生最大;增生指数在患肿瘤的动物组中, 占健康小鼠水平的210% (P<0.05) 。

在此期间 (Lewis肺癌医治后的第7昼夜) , 发现腹膜巨噬细胞产生的白血球介素-1增加 (占背景水平的220%) , 白血球介素-1的产量在研究初期 (第3, 第5昼夜) 与健康小鼠值无差别, 到第22昼夜白血球介素-1的活性水平仍很高, 占无损动物的180%。

肿瘤坏死因子最高水平在接种Lewis肺癌后的第3昼夜, 为健康小鼠的250%。以后 (第5昼夜) 从肿瘤小鼠的腹膜吞噬细胞所得到的上清液中的肿瘤坏死因子的活性, 提高到无损动物的水平。观察第22昼夜, 发现带Lewis肺癌的小鼠效应所产生的肿瘤坏死因子下降, 研究指标为背景水平的69%。

在肿瘤生长初期, 受到抑制的脾天然杀伤细胞到第15昼夜变为活化状态, 占健康小鼠的540%。天然杀伤细胞的细胞毒性功能的类似活化, 占健康小鼠值的540%。天然杀伤细胞的细胞毒性功能的类似活化, 在肿瘤病发展期经常完全可以观察到。由于不能保证排除恶性对象, 在生物学上无根据会使效应器的功能储量耗尽。在肿瘤生长的第22昼夜, 脾天然杀伤细胞的细胞毒性降到零 (占66%) , 是被检验的细胞群代偿失调状态的明显证明。

淋巴结天然杀伤细胞在Lewis肺癌接种后的第3, 第5昼夜处于抑制状态, 然后 (7-11昼夜) 细胞毒性的活性恢复到健康动物的水平, 而在15, 22昼夜, 研究指数增高, 超过无损小鼠值的2.8和2.7倍。

在Lewis肺癌转移后的第2昼夜至第22昼夜服用沙棘制剂 (ЭΚПО和沙棘油) , 对处在相当于肿瘤生长初期的功能状态的没有显示出很大的作用。但此后投用植物制剂均使天然免疫力效应活性的某些指数得到校正, 因此天然免疫力有可能被研究制剂中所发现的抗肿瘤和抗转移特性所决定。

服用ЭΚПО的小鼠脾的天然杀伤细胞的细胞毒性活性, 因为在观察初期与对照值 (带肿瘤动物) 无区别, 所以一只Lewis肺癌的第15昼夜, 与未治疗小鼠的指数一样提高了, 但其水平低于比较组的指数。在第22昼夜, 服ЭΚПО的小鼠组的效应, 同未治疗的动物组比较, 显出消耗更少的特征。实验组小鼠脾细胞的天然杀伤细胞活性, 超过对照组水平的2.2倍。

疗程使用沙棘油, 也防止了在肿瘤生长的第22昼夜天然杀伤细胞的功能活性损耗。

根据已获得的结果可以得出结论:沙棘制剂在肿瘤增生期可预防脾天然杀伤细胞效应活化在该条件下生物学上的无效活化。研究的植物制剂类似的保护作用, 防止了探究系统功能储量的消耗, 在肿瘤发展后期, 亦有助于脾细胞毒性活性保持较高水平。

与对照组的情况不同, 当肿瘤细胞回避杀伤细胞的细胞毒性作用时, 服用植物制剂, 为有效的杀伤对象创造条件, 使抑制肿瘤生长和转移得以实现, 并减弱天然杀伤细胞系统的应力反应。

带Lewis肺癌动物的淋巴结天然杀伤细胞, 在整个观察期间, 对ЭΚПО和沙棘油的作用, 仍然是无亲合力的。

给肿瘤小鼠疗程服用ЭΚПО, 在开始期 (3, 5昼夜) 没有引起腹膜巨噬细胞的细胞毒性活性在统计意义上的变化。第7昼夜, 当未受到治疗作用的动物的腹膜巨噬细胞具有刺激肿瘤特性时, 使用植物药剂可靠地降低了效应器这一活性。以后 (第11, 12昼夜) , 在效应和对象为5:1时发现植物制剂具有类似作用。这一点具有特别的现实性, 因为在很大程度上符合肿瘤发展时机体中出现的实际情况。

在疗程中使用沙棘油, 查明Lewis肺癌转移后的第7, 22昼夜, 肿瘤刺激腹膜巨噬细胞的活性降低;服用沙棘油动物的增生指数, 比对照的增生水平分别低48%和62%。

给Lewis肺癌动物疗程服ЭΚПО在刺激聚多糖, 腹膜巨噬细胞产生白血球介素一1的动态中引起确切变化, 虽然服用植物药剂的小鼠肿瘤坏死因子水平, 在整个研究期间与未治疗的动物确有区别, 但接近于健康小鼠的指数。

环磷酰胺同沙棘制剂 (ЭΚПО和沙棘油) 合用, 对天然杀伤细胞的细胞毒性活性的作用, 是在品系F1 (DBA×C57B1/6) 和F1 (CBA×C5781/6) 的小鼠体上进行研究的。

品系F1 (CBA×C57B1/6) 的小鼠, 在服用环磷酰胺后的第2昼夜, 脾细胞量比未治疗动物的指数下降了28%, 但是器官的溶解电位整个超过对照水平, 为其值的300%。如此高的溶解电位是由10×106脾细胞的天然杀伤细胞活性的增加决定的。天然杀伤细胞杀伤活性比未受治疗小鼠的指数多8.2倍, 与健康动物的值相符。这一现象是由于在该条件下, 环磷酰胺对抑制因子群体起抑制作用占优势, 所以使天然杀伤细胞的功能活性增高。在服用细胞生长抑制剂的第7昼夜, 10×106脾细胞的活性仍处于原先的水平, 但器官的溶解电位因脾细胞量的再生增加而提高。环磷酰胺的使用, 阻碍了天然杀伤细胞转变为高活化状态, 这种状态是在这一期间 (使用细胞抑制剂后第7昼夜, 肿瘤生长第15昼夜) 在对照组中观察到。烷化剂对肿瘤对象的作用在于促使杀伤恶性细胞因子的有效性。但是在服用环磷酰胺后的第14昼夜, 脾天然杀伤细胞的细胞毒性与观察前期相比较低。在此期间, 受细胞抑制剂影响的抑制因子的功能活性得到恢复。

环磷酰胺和ЭΚПО合用, 有助于提高脾天然杀伤细胞的细胞毒性活性。在服用细胞生长抑制剂后的第3昼夜, 10×106脾细胞的细胞毒性超过只服环磷酰胺的动物值的1.6倍。获得综合制剂治疗的小鼠的研究指数, 在细胞毒性作用后的第7昼夜, 与单独服用环磷酰胺的动物研究指数无实质性差别。但是在研究的第14昼夜, 在用环磷酰胺注以ЭΚПО中发现, 脾天然杀伤细胞的细胞毒性水平在所有观察组中 (对照组, 环磷酰胺组, ЭΚПО组) 为最高。脾的溶解电位占单服细胞抑制剂动物值的350%, 超过来治疗带肿瘤小鼠值的7.1倍。若ЭΚПО和环磷酰胺合用, 最大程度地阻止了脾天然杀伤细胞功能储量的消耗.并促使其保持杀伤潜力 (占健康小鼠水平的70%) , 这符合这些制剂综合使用时显示出抗肿瘤的疗效。

在疗程服沙棘油和服环磷酰胺的动物10×106的脾细胞的天然杀伤细胞活性动态有同样效果。但是服沙棘油观察组脾的溶解电位在细胞生长抑制剂起作用后的第7昼夜, 超过单用环磷酰胺的小鼠相应指数的1.2倍。

肺癌发展引起脾天然杀伤细胞的细胞毒性活性另一种动态的品系F1 (DBA×C57B1/6) 小鼠, 以另一种方式表达了服环磷酰胺同ЭΚПО组合使用效果。在使用细胞生长抑制剂后的第3昼夜, 服环磷酰胺使脾的溶解电位下降 (占对照指数的5%) 。这是由器官的细胞量 (占对照水平的19%) 和脾细胞的天然杀伤细胞活性 (占末受化疗的带瘤动物值的29%) 减少决定的。显然, 品系F1 (DBA×C57B1/6) 小鼠的天然杀伤细胞对环磷酰胺的细胞毒性作用比较敏感。但在使用烷化剂后的第7昼夜, 服细胞生长抑制剂的动物脾的溶解电位大大增高, 并超过对照组相应指数的2.2倍。这与器官的细胞量再生复原和新的天然杀伤细胞再生的成熟有关。在以后 (使用细胞生长抑制剂后的第14昼夜) 治疗过的小鼠的脾天然杀伤细胞, 比在该期间处于功能活化状态的对照动物的效应, 具有较小的细胞毒性特点。

环磷酰胺起作用后的第3昼夜, 疗程中服ЭΚПО, 脾天然杀伤细胞的活性水平, 确实比单服细胞生长抑制剂的动物和同未治疗的小鼠指数低。显然在该条件下, 植物制剂增强了环磷酰胺在天然杀伤细胞方面的细胞毒性作用。但是10×106脾细胞的细胞毒性活性和脾的溶解电位, 在观察的第7昼夜增高, 并超过用细胞生长抑制剂治疗组的相应指数的0.8和0.9倍。以后 (服环磷酰胺后的第14昼夜) 合用制剂的小鼠的脾天然杀伤细胞, 比单独服细胞生长抑制剂的小鼠的效应保持了较高的细胞毒性活性水平, 为比较组值的189%。

两品系小鼠淋巴结的天然杀伤细胞, 对服环磷酰胺似乎无亲合力。在研究的整个期间, 受化疗动物的淋巴结10×106细胞的细胞毒性活性, 与对照值无实质性差别。

给品系F1 (CBA×C57B1/6) 小鼠合用环磷酰胺和ЭΚПО, 也没有使在淋巴结天然杀伤细胞的细胞毒性的动态上有显著的统计变化, 虽然品系F1 (DBA×C57B1/6) 动物效应器的功能活性在疗程中服ЭΚПО背景上 (在细胞生长抑制剂起作用后的第3昼夜) 受到抑制。以后接受环磷酰胺和ЭΚПО合用治疗的小鼠的效应的细胞毒性恢复到比较组的值 (对照组和环磷酰胺组) 。

在品系F1 (CBA×C57B1/6) 动物中, 环磷酰胺和沙棘油合用 (在服细胞生长抑制剂后的第7, 14昼夜) , 淋巴结的天然杀伤细胞的细胞毒性活性与环磷酰胺组的相应值降低了44%和84%。

给品系F1 (CBA×C57B1/6) 小鼠服剂量125mL/kg的环磷酰胺, 移植Lewis肺癌后的第8昼夜, 没有使在肿瘤生长过程带来效应的腹膜巨噬细胞刺激肿瘤的活性提高。在疗程服ЭΚПО和环磷酰胺的组合, 同未治疗小鼠和单独服细胞生长抑制剂的值比较, 也未导致与效应器共同酿成的靶细胞P-815增生水平起实质性变化。

环磷酰胺和沙棘油在整个研究期间合用的比较组中的相应指数, 使肿瘤刺激腹膜巨噬细胞的效果, 在统计上显著下降。在受环磷酰胺和沙棘油综合作用的动物组中, 靶细胞的增生指数分别比单用化疗治疗小鼠的增生指数低16%, 23%和28%。

因此, 在带有Lewis肺癌动物体上进行实验的结果, 查明了沙棘制剂 (ЭΚПО和沙棘油) 的性质——调节天然免疫力效应的功能活性 (天然杀伤细胞和巨噬细胞) 在其中存在抗肿瘤和抗转移作用的情况下, 可以把该植物制剂列为机体生物反应变异剂。

此外, 在无损小鼠研究中获得的资料, 更使我们从前景上来看到临床应用ЭΚПО的可能性。无论一次服用或疗程服用植物制剂或其停用后, 天然杀伤细胞的细胞毒性活性都稳定提高。这不仅在肿瘤学上, 而且在导致天然免疫力这一环节的功能活性受到抑制的其它病理阶段, 都有应用的可能性。

3 结论

1.沙棘制剂 (沙棘树皮和树技混合乙醇提取液、沙棘油) , 在正常和肿瘤病理条件下, 对天然免疫力机能具有免疫性能。

2.健康小鼠脾天然杀伤细胞的细胞毒性活性, 在一次或疗程中服用沙棘树皮和树枝乙醇提取液, 可使其活性大大增强。在停服制剂后的第7昼夜仍保持在这一水平上。服用沙棘树皮和树枝乙醇提取液, 刺激天然杀伤细胞的细胞毒性活性的最适宜的持续时间为5昼夜。

3. 5次服沙棘树皮和树枝乙醇提取液, 可促使由腹膜巨噬细胞产生的白血球介素-1和肿瘤坏死因子增加。

4.在肿瘤过程一般化时期, 给移植Lewis肺癌小鼠服沙棘树和树枝乙醇制剂与沙棘油, 引起天然免疫力系统功能活性修正, 表现在天然杀伤细胞功能消耗症状减少, 肿瘤刺激腹膜巨噬细胞的活性下降, 肿瘤坏死因子的产量正常化。

5.环磷酰胺和沙棘制剂 (沙棘树皮和树枝乙醇提取液、沙棘油) 合用, 增强了细胞生长抑制剂对脾天然杀伤细胞的细胞毒性活性的刺激影响。在化疗背景上, 使用沙棘树皮和树枝乙醇提取液, 有助于在肿瘤发展晚期天然杀伤细胞的细胞毒性保持较高水平。

免疫毒理学 篇4

1 结合本校护理学专业的特点调整教学内容, 突出护理特色

我校护理学专业系文理科兼招, 文科生占了60%~70%的比例, 一般来说, 文科生的理科基础知识比较薄弱和欠缺, 而“医学免疫学与病原微生物学”课程往往需要较多的理科基础知识作为铺垫, 如果按照对理科生的要求来设置和选定“医学免疫学与病原微生物学”课程教学内容, 往往会增加学生的学习难度, 教学效果也不尽如人意。而且, 由于中医院校的护理学专业学生还要学习大量的中医药相关的课程, 因而在本课程上安排的学时数往往偏少, (1) 而我校护理学专业仅安排48个教学学时, 明显偏少。有鉴于此, 我们针对本校护理学专业学生的特点, 对培养方案做了适当的调整, 特别在教材和教学内容选取方面做了较大的调整。我们选定了一本内容简明扼要、实用性强的教材, 即范虹和卢芳国教授主编的、科学出版社出版的专供中医药类专业使用的教材《医学免疫学与病原生物学》。在教学内容方面, 我们系统研究了护士执业资格证考试中有关医学免疫学与病原生物学部分的大纲内容, 在课程讲授过程中, 将这部分知识点作为重点讲授内容, 以适应和满足将来护士执业考试的要求。具体来说, 医学免疫学部分我们重点讲述与护理学临床有关的抗原、抗体、补体系统、超敏反应以及免疫学在防治方面的应用等章节, 特别是超敏反应的防治措施;在医学微生物学部分, 我们重点介绍与临床护理关系密切的消毒灭菌概念, 无菌操作技术, 细菌的致病作用。另外, 对化脓性细菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、结核杆菌、呼吸道病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等临床常见的病原体做重点讲授;而在医学寄生虫学部分, 我们则重点讲授医学寄生虫学总论, 介绍寄生虫感染的一般规律、诊断方法及防治原则, 强调学生学习过程中要重点掌握寄生虫的生活史和防治原则。同时给学生讲授临床常见的线虫一章, 而其他临床常见的寄生虫则给学生布置一些课外作业和问题, 要求学生自学书面回答, 上交作业批改后作为平时成绩, 以此督促学生的自学。在教学学时安排方面我们也做了一些调整, 学校教务处安排本课程总学时为48学时, 理论42学时, 实验6学时。我们调整后, 适当减少理论课的讲授学时, 增加了实验课学时, 增加学生动手操作的机会。调整后免疫学部分安排16个理论学时, 医学微生物学部分安排16个理论学时, 人体寄生虫部分安排4个理论学时。实验安排了12个学时, 其中, 医学免疫学部分2个学时, 细菌学部分4学时, 真菌和病毒学部分2学时, 医学寄生虫学部分4学时。

2 采用多种教学方法提高教学质量

为了在有限的教学学时内保证教学质量和效果, 我们在传统讲授的基础上采用了多种教学方法, 通过将这些方法的综合利用, 极大地改善了教学效果, 提高了教学质量。“医学免疫学和病原生物学”课程具有概念多、抽象不易理解和知识点繁杂等特点, 学生们往往学习兴趣不大。现代物理学的开创者和奠基人爱因斯坦曾经说过, “兴趣是最好的老师”, 学习兴趣的培养往往是学习取得成功的基石。为了提高学生们学习“医学免疫学与病原生物学”课程的兴趣, 我们在实际的教学过程中采用了多种教学方法, 在传统的讲授基础上, 结合直观式、讨论式、案例式等方法开展教学, 取得了较好的教学效果。如我们在讲授医学免疫学Ⅰ型超敏反应一章时, 提前准备了马血清致敏的豚鼠, 上课时在讲台上给各组豚鼠分别心脏注射马血清和鸡蛋清, 然后分别观察注射不同抗原后豚鼠发病死亡情况, 给学生视觉上带来了极大的震动和冲击, 加深了学生对超敏反应知识的印象和体会, 在后续的讲授过程中学生们表现出极大的兴趣, 在课堂上提出了许多的问题, 课堂气氛也异常热烈。为了克服“医学免疫学与病原生物学”课程理论抽象、不好理解的困难, 我们收集整理了大量的免疫学、病原生物学的图片、视频和动画等素材, 通过多媒体课件展示给学生, 使得原本枯燥无味的理论和微观世界变得生动, 极大地提高了学生的学习兴趣, 学习效果也显著得到提升。同时, 我们还紧密结合临床实际, 采用案例式方法进行教学。 (2) 如在讲授化脓性球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、幽门螺杆菌、结核杆菌等病原菌章节时, 我们给学生布置了大量的了临床案例, 将全班同学分成多个学习小组, 每组5~6人, 要求各学习小组成员分工合作, 在课外查询资料, 然后制作成PPT课件, 在课堂上进行汇报和讨论, 教师对学生进行点评, 给出成绩, 并指出回答不足和有待提高的地方, 充分调动了学生学习本课程的兴趣, 学生的反响热烈。通过这些教学方法的综合运用, 在学时安排偏少的情况下, 提高了教学质量。

3 加强教师队伍建设, 全面提高教师整体素质

教师队伍的整体素质和质量是搞好教学的基础, 而本课程大部分老师由于常年从事基础课教学工作, 临床经验和相关护理学知识欠缺和不足, 部分教师甚至没有医学背景知识, 不能很好地将本课程的基本理论、基础知识和操作技能与临床护理相结合。这就要求从事本课程护理学专业教学的老师要多接触和了解临床护理工作, 熟悉临床护理工作的特点和要求。例如, 我们采取跟班听讲的形式, 跟随护理学专业班级的临床护理学课程的教学过程, 或者参加护理学院的学术报告和知识讲座, 或者以参观学习的形式在临床护理实践中进行观摩, 熟悉本课程在护理学专业方面是如何与临床护理工作有机结合的, 找准结合要点。通过这些措施全面提高教师的综合能力和素质, 为确保教学质量和教学效果打下良好的基础。

4 加强实验教学过程, 培养学生综合实践能力

“医学免疫学与病原生物学”课程一门是实践性性很强的学科, 常见的免疫学检测方法、消毒和灭菌方法、无菌操作技术、常见病原生物的实验室检查方法、常见病原生物的培养及检查方法、粪便中寄生虫病原检查技术是本课程实验课中要重点学习和掌握的内容。加强实验课的教学, 有利于培养学生的动手能力和操作能力, 同时有助于加深对理论知识的理解。每一次实验课的项目和具体的要求都提前通知给学生, 让学生在课外提前准备。实验课过程中对学生严格要求, 仔细观察和记录实验结果, 课后完成试验报告。通过严格的实验课教学, 有助于培养学生严谨求实的作风, 对于学生今后从事临床护理工作意义重大。为了加强对学生综合能力的培养, 我们在实验课中除了开设常规的验证性实验之外, 还开设部分综合型实验和部分设计性实验。如肠道感染常见病原生物的实验室检查、泌尿生殖道感染常见病原生物的实验室检查、皮肤创伤常见病原生物的实验室检查等实验项目, 指导学生运用学过的知识对实验进行设计和独立完成, 并完整撰写实验报告。这极大地促进了学生对实验课的学习积极性, 取得了比较好的教学效果。

摘要：“医学免疫学与病原微生物学”课程是护理学专业学生必修的一门基础课程, 也是连接基础医学与临床医学的桥梁课程。根据我校护理学专业学生的特点, 通过调整本课程的教学内容、彰显护理学特色、改变传统的教学方法、加强师资培养和强化实验教学等改革, 努力提高学生的学习兴趣, 让学生成为学习的主导, 促进教学质量的提高。

关键词：护理学专业,医学免疫学与病原微生物学,教学改革

注释

11 李岩, 李明地, 邝枣园, 罗海燕.中医药专业医学免疫学与病原生物学教学改革探索.山西医科大学学报:基础医学教育版, 2010.12 (3) :239-241.