LC-MS/MS分析

2024-08-17

LC-MS/MS分析（共5篇）

LC-MS/MS分析篇1

利巴韦林(1-β-D-呋喃核糖基-1H-1,2,4-三氮唑-3-羧酰胺),又名三氮唑核苷、病毒唑。该药系广谱抗病毒药,为单磷酸次黄嘌啉核苷脱氢酶抑制剂,抑制IMB转变为乌苷酸,阻碍病毒核酸合成,阻止病毒复制和传播,从而达到抗病毒的作用。但易产生耐药性,使病毒发生变异,其对人体产生的最突出的安全性问题是溶血性贫血及动物实验所显示的遗传毒性、生殖毒性和致癌性等。此外,虽然有文献表明利巴韦林等药物可抑制禽流感等病毒株的复制,可用于预防禽流感,但长期大量使用会使禽流感的病毒产生变异,给防控工作带来巨大困难。目前,国内外尚无任何利巴韦林在可食性动物组织内残留的检测方法,国家和行业标准更是空白,这给对此类药物的监管带来了不便。

本文采用液相色谱-串联质谱法测定鸡肉组织中利巴韦林的残留量,为禽类养殖环节利巴韦林药物的监控提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱-串联质谱仪(Aglient 1260/6460);Bond Elut PBA(500mg 6ml)固相萃取柱;北京时代北利GTR16-2高速冷冻离心机:10000r/min;涡旋振荡器。

1.2 药品和试剂

利巴韦林标准品,纯度100.0%,中国药品生物制品检定所;13C5-利巴韦林,纯度98%,加拿大TRC公司;乙腈:色谱纯;1%三氯乙酸:(1+99,V/V)乙酸铵缓冲液(0.25mol/L,p H8.5):称取19.25乙酸铵到1L水中,用氨水调p H到8.5

1.3 溶液的配制

(1)利巴韦林标准溶液的配制:称取利巴韦林标准品约10mg(精确至0.01mg),置100ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,超声均匀,得到0.1mg/ml的标准储备液,置-18℃以下冰箱中保存,有效期6个月。用移液管吸取标准储备液1ml于100ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得到1.0ug/ml标准工作液,置4~8℃保存,有效期1个月。(2)内标溶液的配制:称取13C5-利巴韦林10mg(精确至0.01mg),置100ml容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,超声均匀,得到0.1mg/ml的内标储备液,置-18℃以下冰箱中保存,有效期6个月。用移液管吸取内标储备液1ml于100ml容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,得到1.0ug/ml内标工作液,置4~8℃保存,有效期1个月。

1.4 样品提取和净化

准确称取鸡肉样品(2g±0.02)g于15ml具塞离心管中,加入适量的内标Ribavirin-13C5,加入5ml乙腈:1%三氯乙酸溶液(7:3),加盖后涡旋1min,10000r/min离心10min,吸取上清液于15ml离心管中;再向残渣中加入5ml的乙腈:1%三氯乙酸溶液(7:3),重复上述操作,合并2次上清液;涡旋混匀,用氨水调节提取液p H值为8.5±0.1,再10000r/min离心10min,取全部上清液过柱净化。净化流程如下:

1.5 色谱条件

(1)色谱柱:ZORBAX SB-Aq RRHT3.0*100mm 1.8um;(2)柱温:30℃;(3)流速:0.4m L/min;(4)进样量:5µl;(5)流动相:A:乙腈,B:0.1%甲酸水,梯度洗脱。

1.6 质谱条件

离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多重反应监测(MRM);GAS Temp:350℃;GAS Flow:12L/min;Nebulizer:50psi;母离子、子离子、驻留时间、锥孔电压和碰撞能量,见表1。

1.7 定性测定

被测组分选择1个母离子,2个子离子,在相同试验条件下,样品中待测物的保留时间与标准溶液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物。

(%)

1.8 定量测定

以利巴韦林定量离子m/z 245.1/113与内标校正离子m/z 250/113峰面积之比进行单点或多点校准定量,标准溶液与待测溶液中利巴韦林的响应值均在仪器检测范围内。

2 结果与讨论

2.1 方法的线性范围和检出限

用基质配制的标准得到的标准工作曲线,在1.0~50.0ng/ml范围内呈良好线性关系(R>0.999)。试验数据确定本方法的检出限为2.0ng/g。

2.2 回收率和精密度

共做了3个浓度的添加试验,样品中利巴韦林添加浓度为2.0ng/g、5.0ng/g和10.0ng/g;每个浓度做了6次平行实验。

2.3 净化条件的优化

由于利巴韦林含有较多的醇羟基,极性极强,不易通过有机相液液萃取方式提取,也不易找到合适的固相萃取小柱来净化。本文尝试了C18、HLB、SCX、SAX、NH2等多种不同类型的SPE小柱,效果均不理想。通过反复试验,采用了Bond Elut PBA固相萃取柱,取得了较好的净化效果。

2.4 色谱条件的优化

由于利巴韦林极性极强,在反相C18色谱柱上保留较弱,所以采用100%水相作为梯度色谱条件的起始比例,另比较了C18柱和SB-Aq在分析利巴韦林时具有选择性差异,在C18上不能完全分离的基质干扰,在SB-Aq柱上可以实现很好的分离。

3 结论

由于用LC-MS/MS测定利巴韦林时有较强的基质效应出现,单独采用外标法定量的结果准确度较低,采取了同位素内标校正和标准品基质校正的方法,有效的去除了基质效应的影响,能够准确的定量。本方法操作简单,测定结果准确可靠,可以实现对鸡肉中利巴韦林残留量的检测确证分析。

摘要：本试验采用高效液相色谱-串联质谱法检测鸡肉组织中利巴韦林残留量。该方法的检出限为2.0ng/g,利巴韦林的测定在1.050.0ng/ml范围内线性关系良好(r>0.999),在2.0、5.0和10.0ng/g 3个添加浓度的平均回收率为91.4%110.2%,相对标准偏差小于10%。

关键词：固相萃取,高效液相色谱-,电喷雾质谱,/质谱,利巴韦林

参考文献

[1]Yeh L T,Nguyen M,Dadgostari S,et al.LC-MS/MS Method forSimultaneous Determination of Viramidine and Ribavirin Levels inMonkey Red Blood Cells[J].J Pharm biomed Anal,2007,43(3):1057-1064.

LC-MS/MS分析篇2

在此背景下, 仪器工作者需要开发一种更有效的前处理手段, 以便检测工作者得到浓缩度和纯净度更高的样品, 从而提高检测信号、降低检测噪音, 提高工作效率和检测的精确度。基于色谱原理的创新样品制备方法——Turbo Flow技术就是一种不错的选择, 它为客户检测盐酸克伦特罗提供了新的前处理思路。这种在线自动过程处理技术结合了扩散、化学和体积排除的原理, 在捕获感兴趣分析物的同时, 能够快速消除基质干扰。本实验旨在建立一个前处理简单、选择性灵敏度高的克伦特罗Turbo Flow实用在线净化方法, 并确定该方法的检出限。

实验仪器与方法

样品制备

取5g动物组织样品与10mL乙腈, 10%乙酸铵 (1:3) 混合溶液混匀, 匀浆10分钟, 5000r/min离心10分钟, 取1mL上清液经过0.22µm注射过膜, 上机。

Turbo Flow条件

系统:Thermo Scientific Aria

TLX-1 controlled by Aria晣software

在线净化柱:Turbo Flow Cyclone MCX 0.5x50mm (方法参数见图1)

进样体积:50µL

上样溶剂:0.1%的甲酸水溶剂

上样流速:2mL/min

洗脱溶剂:1%的氨水甲醇溶液

洗脱体积:50µL

HPLC方法条件

色谱柱:Hypersil GOLD aQ 3µm100×2.1mm;

流路A:0.1%的甲酸水溶液;

流路B:甲醇;

质谱条件

调谐参数:

系统TSQ Ultra AM

离子源极性:正离子模式

喷雾电压:4500V

鞘气压 (N2) :50arb

辅助气压 (N2) :16arb

毛细管柱温度:350℃

碰撞气体 (Ar) :1.5mTorr

Skimmer offset:10V

Q1/Q3峰分辨度:0.7u (单位质量) SRM反应参数:

结果与讨论

食物样品本身基质比较复杂, 在进行检测之前往往需要一个较长的样品预处理过程。比如使用酶解、高氯酸沉淀蛋白, 应用HLB和MCX两次SPE (固相萃取) 的方法对食品中β2-受体激动剂进行残留检测, 取得了很好的效果, 应用该方法的目的也是为了获得更加浓缩和纯净的样品。而当应用Turbo Flow在线净化技术时, 能使这些工作变得更加简洁方便, 减少了中间步骤和偶然误差, 并使得加标回收的重复性更加稳定, 0.05µg/kg浓度下六6个平行RSD为5.36%;同时由于样品更加纯净浓缩、干扰较少, 此方法在添加量为0.02µg/kg浓度下峰型良好 (如图2所示) 。根据欧盟法规计算此方法检出限 (LOD) 为0.002µg/kg, 定量限为0.006µg/kg, 已经能轻松应对需要。同时, 如果有实际需要, 可以采用更长的净化柱 (100mm规格) 或者采用串联净化柱的方法, 进一步增加样品浓缩倍数, 来提高检出限。

由于采用了在线净化系统, 进入分析色谱柱的样品也更为纯净, 一定程度上降低了噪音和杂峰的产生。如图3所示, 采用TurboFlow技术一定程度上起到了稳定基线的作用。

运用Transcend在线净化系统的操作软件Aria OS的变量设置功能, 可以方便设置批处理程序尝试不同的洗脱溶液。在对不同浓度的氨水甲醇溶液进行比较后, 结果表明1%的氨水甲醇溶液作为洗脱溶液的效果最优。使用外标法计算其与不经过净化柱的结果得到其绝对回收率为79%～84%。而且此浓度的氨水甲醇溶液以0.2mL/min的速度与0.4mL/min的分析柱溶液混合, 不会对高效液相色谱产生不良影响, 在使用此方法千针后, 10个平行的保留时间RSD仍然只有0.1%。

分别配置5pg/m L、10 pg/m L、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1ng/mL, 和2ng/mL的克伦特罗标准溶液, 其中都混有100pg/mL内标, 内标法定量得到标准曲线有很好的线性 (曲线见图4) , 相关系数R2为0.9995。

向5g动物组织中分别添加100pg、250pg、500pg克伦特罗标准, 内标法定量、计算其回收率。结果表明, 经过在线净化和内标法校正后样品回收率非常稳定, 简单的前处理步骤带来最少的偶然误差。 (见表1)

结论

LC-MS/MS分析篇3

1 仪器和试剂

液质系统:Agilent 1100TrapVL液质联用系统数据处理系统:AgilentChemstation和Bruker质谱软件。醋酸甲羟孕酮对照品(中国药品生物制品检定所);甲醇(色谱纯,TEDIA公司);正己烷(分析纯);空白人血浆(山东省血液中心)。

2 LC-MS/MS条件

色谱条件:

ZorbaxSB C 18色谱柱(150×4.6mm I.D,5m);流动相:甲醇:水(90:10,v/v);流速:1.0ml/min,柱后分流0.3ml/min进入质谱;进样量:20l。

质谱条件:

电喷雾离子源(ESI源);喷雾气(N 2)压力30psi;干燥气(N 2)流量10L/min。毛细管温度为350℃;正离子方式检测;扫描模式为多反应离子监测(MRM),用于定量分析的离子反应为m/z387 327,碎裂电压0.9V。

3 血浆样品处理

取血浆1.0ml,加入4.0ml正己烷,涡旋混合1min,静置10min,分取上层有机相3.0ml于另一试管中,于80℃水浴氮气吹干,残留物加入100L流动相溶解,取20L进行分析。

4 方法学考察

4.1 方法的专属性

取10g/ml醋酸甲羟孕酮甲醇对照溶液,离子源为电喷雾离子源(ESI源),加热毛细管温度为325℃,喷雾气(N 2)压力12psi,干燥气(N 2)流量4L/min,使用灌注进样,流速5L/min,在正离子模式下,醋酸甲羟孕酮主要生成[M+H]+,[M+Na]+和[M+K]+离子峰,m/z分别为387,409和425,见图1。选择性对[M+H]+分子离子峰进行产物离子扫描,将醋酸甲羟孕酮生成的主要碎片离子(为m/z=327)作为定量分析的产物离子,见图2。

取空白血浆1.0ml,按“血浆样品处理”项下操作,得空白血浆色谱图(a);取一定浓度的醋酸甲羟孕酮溶液,进样分析,得对照品色谱图(b),醋酸甲羟孕酮的保留时间为2.6min;将一定浓度的醋酸甲羟孕酮对照溶液加入空白血浆中,依同法操作,得血浆添加对照色谱图(c);取受试者口服给药后的血浆样品,依同法操作,得样品色谱图(d)。结果表明,空白血浆中的内源性物质不干扰醋酸甲羟孕酮的测定。以上色谱图见图3。

(a),对照品(b),血浆添加对照(c)和样品(d)色谱图(自左到右)

4.2 标准曲线和检测限

取空白血浆1.0ml,分别加入醋酸甲羟孕酮溶液适量,配制成相当于醋酸甲羟孕酮血浆浓度为0.2,0.5,1.0,5.0,10.0和30.0ng/ml的对照样品,每一浓度5份,按“血浆样品处理”项下依法操作,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归(n=5),典型回归方程为Y=44927X-22820,r=0.9986。结果表明,血浆中醋酸甲羟孕酮浓度为0.2 30.0ng/ml时,浓度与峰面积有良好的线性关系,定量下限为0.2ng/ml。

4.3 方法精密度

取空白血浆,按“标准曲线”项下的方法配制低、中、高三个浓度(1.0,5.0和10.0ng/ml)的醋酸甲羟孕酮血浆样品,按“血浆样品处理”项下操作,每一浓度连续测定5次,以醋酸甲羟孕酮的峰面积来计算日内精密度,其RSD(n=5)分别为9.7%,12.3%和6.2%。每一浓度在5d各分别配制分析一次,以醋酸甲羟孕酮峰面积来计算日间精密度,其RSD(n=5)分别为10.5%,4.5%和9.3%。

4.4 提取回收率试验

取空白血浆,按“标准曲线”项下的方法配制低、中、高三个浓度(1.0,5.0和10.0ng/ml)的醋酸甲羟孕酮血浆样品,按“血浆样品处理”项下依法操作,每一浓度进行5样本分析,提取回收率分别为95.8%,101.2%和99.4%。

4.5 稳定性试验

取空白血浆,按“标准曲线”项下的方法配制低、中、高三个浓度(1.0,5.0和10.0ng/ml)的醋酸甲羟孕酮血浆样品,分别在室温放置24h,3次-20℃冷冻、解冻循环后和-20℃存放5d后,按“血浆样品处理”项下依法操作,测定醋酸甲羟孕酮浓度,计算相对标准偏差,结果见表1。

4.6 方法应用和质控样品测定

应用本方法成功的对20名受试者口服醋酸甲羟孕酮制剂后血浆中的醋酸甲羟孕酮进行了含量测定。在受试者血浆样品测定期间,随行测定含醋酸甲羟孕酮浓度为0.5,1.0和10.0ng/ml的对照血浆样品,测得其RSD(n=8)分别为8.6%,5.2%和9.3%。

采用LC-MS/MS法测定人血浆中醋酸甲羟孕酮浓度,血浆样品经液-液萃取,在上述色谱条件下进样分析,血浆中内源性物质不干扰待测物测定,色谱条件稳定。该方法高效、准确,特异性强,样品处理方法简单,可用于醋酸甲羟孕酮的药代动力学研究。

参考文献

[1]张建伟,王淑云.RP-HPLC法测定人血浆中醋酸甲羟孕酮及片剂生物等效性研究.中国新药杂志,2003,12(3):200-202.

[2]周晓飞,邵庆翔,韩学军等.中国妇女单次及多次注射cy-clofem后血中醋酸甲羟孕酮的药代动力学.中国临床药理学与治疗学杂志,1998,3(1):9-13.

[3]Seong-Mo Kim,Dong-Hyun Kim.Quantitative determination ofmedroxyprogesterone acetate in plasma by liquid chromatography/electrospray ion trap mass spectrometry.Rapid Commun MassSpectrom,2001,15(21):2041-2045.

[4]张志刚,施冰,王根芳,等.液相色谱-串联质谱法测定水产品中的醋酸甲羟孕酮.质谱学报,2006,27(1):36-39.

LC-MS/MS分析篇4

1 仪器与试药

1.1 仪器

API 4000串联四极杆质谱仪 (美国Applied Bio-systems公司) , LC-30A高效液相色谱仪 (日本Shimadzu公司) , Eppendorf AG5804R低温高速离心机 (德国Eppendorf公司) , XW-80A涡旋混合器 (姜堰市康健医疗器具有限公司) , 梅特勒AE240电子天平 (Mettler托利多仪器上海有限公司) , Milli-Q ADVANTAGEA10纯水仪 (Merck Millipore公司) , DW-86L628医用低温箱 (青岛海尔特种电器有限公司) 。

1.2 试药

盐酸阿霉素 (纯度>98.89%, 上海宝曼生物科技有限公司, 批号20120715) , 盐酸吡格列酮 (含量质量分数>99.55%, 济南中科一通化工有限公司, 批号20110904) , 阿霉素载药纳米粒 (含量0.6 g/L, 宁夏医科大学总医院临床药理研究室制备) 。色谱甲醇、乙腈 (美国Fisher公司) 。

1.3 动物

6只SD大鼠, 雄性, 平均体重约为230 g, 由宁夏医科大学实验动物中心提供, 实验动物使用许可证号SCXK (宁) 2011-0001。

2 方法与结果

2.1 溶液配制及样品处理

2.1.1 溶液配制

精密称取盐酸阿霉素10.7 mg, 置于10 m L容量瓶中, 用甲醇溶解后并定容, 配制相当于阿霉素浓度为1.00 g/L的溶液。用甲醇水 (1∶1) 稀释浓度为2、4、10、20、100、400、1000、2000μg/L系列标准溶液, 以及浓度分别为5、80、1600μg/L的质量控制 (QC) 溶液, 置于-4℃冰箱备用。

精密称取盐酸吡格列酮11.0 mg, 置于10 m L容量瓶中, 用甲醇溶解后并定容, 配制相当于吡格列酮浓度为1.00 g/L的溶液。取上述储备液用甲醇水 (1∶1) 稀释至浓度为15μg/L的内标溶液, 置于-4℃冰箱备用。

2.1.2 血浆样品处理

取大鼠血浆50μL, 置于1.5 m L EP管中, 加入50μL 15μg/L吡格列酮溶液, 50μL甲醇水 (1∶1) , 涡旋30 s, 加入250μL甲醇, 涡旋2 min, 4℃离心10 min (14 000 r/min) , 取上清液10μL进样。

2.2 测定条件

2.2.1 色谱条件

色谱柱: (Shim-pack XR-ODS (2.0 mm×100 mm, 2.2μm) ;保护柱:Shim-pack GVP-ODS (2.0 mm×5 mm, 2.2μm) ;流动相:A相 (0.1%冰醋酸) , B相 (甲醇) , 采用梯度洗脱, 0~0.2 min, 40%B相;0.2~0.8 min, 80%B相;0.8~3.0 min, 80%B相;3.0~3.5 min, 40%B相, 4.0 min结束, 流速为0.2 m L/min;柱温40℃;进样量10μL。

2.2.2 质谱条件

离子源:Turbo Spray;碰撞气6 psi;气帘气10 psi;雾化气60 psi;辅助加热气30 psi;离子喷雾电压4000 V;离子源温度350°C;去簇电压56 V;Q0电压10 V;碰撞能量15 V;碰撞池出口电位12 V。正离子模式检测;MRM监测。定量离子对为m/z 544.2→m/z 396.9 (阿霉素) 和m/z 357.3→m/z 133.8 (吡格列酮, 内标) , 二级扫描质谱图见图1。

A:阿霉素;B:吡格列酮

2.3 分析方法确证

2.3.1 专属性

分别取6种不同来源的大鼠空白血浆各50μL, 置于1.5 m L EP管中, 其中以50μL甲醇水 (1∶1) 代替内标溶液, 50μL甲醇水 (1∶1) 代替阿霉素标准溶液体积, 其余按照“2.1.2”项下方法操作, 测定后为空白血浆样品色谱图 (图2A) 。

取空白大鼠血浆50μL, 置于1.5 m L EP管中, 将质量浓度为2.0μg/L的阿霉素标准溶液和内标溶液 (15μg/L) 加入空白血浆中, 其余按照“2.1.2”项下方法操作, 测定后为含药血浆样品色谱图 (图2B) 。其中, 阿霉素和吡格列酮的保留时间分别约为2.58 min和3.19 min。

取大鼠给药后4 h采集的血浆样品, 按照“2.1.2”项下方法操作, 测定后为实际血浆样品色谱图 (图2C) 。如图所示, 大鼠血浆中的内源性物质对阿霉素及吡格列酮测定无干扰, 说明本方法专属性良好。

2.3.2 标准曲线与定量范围

取6份空白大鼠血浆各50μL, 分别加入内标溶液50μL, 再加入阿霉素系列标准溶液, 制成阿霉素浓度为2、4、10、20、100、400、1000、2000μg/L的含药血浆样品, 按“2.1.2”项下处理后测定;以阿霉素浓度为横坐标, 阿霉素与内标物的峰面积比值为纵坐标, 得到典型回归方程为:A=0.00528C-0.00593, r=0.9976。结果表明, 阿霉素在2.0~2000μg/L浓度范围内线性关系良好, 定量下限为2.0μg/L, 可以满足大鼠血浆中阿霉素浓度的测定。

2.3.3 精密度与准确度

取大鼠空白血浆50μL, 按照“2.3.2”项下方法制备浓度为2.0μg/L的阿霉素定量下限样品6份, 按血浆样品处理方法处理后测定, 日内精密度RSD为13.4%, 准确度为-2.3%。

取大鼠空白血浆50μL, 按照“2.3.2”项下方法制备阿霉素浓度分别为5、80、1600μg/L的QC样品, 每浓度平行制备6样本, 连续测定3 d, 计算日内、日间精密度与准确度, 结果见表1。由表1可知本方法精密度与准确度良好。

A:空白血浆样品;B:空白血浆加入阿霉素 (2.0μg/L) 和吡格列酮 (15μg/L) 后的提取样品;C:SD大鼠尾静脉注射阿霉素纳米粒 (5 mg/kg) 4 h后的血浆样品;Ⅰ:阿霉素;Ⅱ:吡格列酮

注:RSD为相对标准偏差;RE为相对误差

2.3.4 提取回收率

提取样品的制备 (EX QC) :取6种不同来源的空白大鼠血浆50μL, 按“2.3.2”项下方法配制阿霉素浓度为5、80、1600μg/L的QC样品, 每浓度平行制备6样本, 进样分析, 记录相应的色谱峰面积。

未经提取样品的制备 (NEX QC) :同时另取6种不同来源的大鼠空白血浆各50μL, 加入甲醇溶液250μL, 涡旋2 min, 离心10 min (14 000 r/min) , 吸取上清液, 加入5、80、1600μg/L的QC溶液50μL, 内标溶液50μL, 混匀, 进样分析, 每浓度平行制备6样本, 记录相应的色谱峰面积。

提取回收率计算:以每一浓度EX样本测定所得的分析物峰面积除以NEX样本测定所得的分析物峰面积, 同一来源血浆一对一求比值, 计算对3个QC浓度的分析物于6个不同来源的血浆基质中的提取回收率, RSD应不大于15%;以EX样本测定所得的内标峰面积除以NEX样本测定所得的内标峰面积, 同一QC浓度的同一来源血浆一对一求比值, 计算对工作浓度的内标的提取回收率, RSD应不大于15%。

阿霉素低、中、高3个QC浓度的提取回收率分别为 (92.1±5.9) %、 (82.8±2.9) %和 (80.1±9.7) %, 内标提取回收率为 (91.6±12.0) %, RSD均≤12.0%, 结果可知提取回收率良好。

2.3.5 基质效应

含有基质样品的制备:同“2.3.4”项下未经提取样品的制备方法操作。

无基质样品的制备 (溶液W样本) :取纯水50μL代替空白血浆, 分别加入50μL IS溶液、50μL阿霉素浓度为5、80、1600μg/L的QC标准溶液, 再加入250μL甲醇, 每浓度各6样本, 涡流后测定, 记录相应的色谱峰面积。

基质效应计算:以每一浓度NEX样本测定所得的分析物峰面积除以W样本测定所得的分析物平均峰面积, 计算6个不同来源的血浆基质中内源性物质对3个QC浓度的分析物的基质效应, RSD应不大于15%;以NEX样本测定所得的内标峰面积除以W样本测定所得的内标平均峰面积, 计算内源性物质对工作浓度的内标的基质效应, RSD应不大于15%。

阿霉素低、中、高3个QC浓度的基质效应分别为 (91.1±2.4) %、 (82.1±1.7) %和 (81.2±2.5) %, 内标基质效应为 (109.0±10.0) %, 结果符合规定[16]。

2.3.6 稳定性

按“2.3.2”项下方法分别配制阿霉素浓度为5、80和1600μg/L的含药血浆样品, 考察阿霉素血浆样品在室温放置12 h稳定性、样品处理后放置24 h稳定性、-70℃3次冻融稳定性以及-70℃长期放置30 d稳定性。结果如表2所示, 阿霉素在以上条件下稳定性良好。

注:RSD为相对标准偏差;RE为相对误差

2.4 生物样品测定

2.4.1 给药方案及血浆样品采集

6只健康SD大鼠, 雄性, 平均体重约为230 g, 分别尾静脉注射阿霉素载药纳米粒, 给药剂量为5 mg/kg。给药后分别在0.087、0.167、0.25、0.33、0.5、1、2、4、6、10、24、48、72 h眼眶取血0.5 m L, 取血后立即移入经肝素处理的试管中, 4℃离心10 min (14 000 r/min) , 分离血浆, 于-70℃冰箱中冷冻, 待分析。

2.4.2 血浆样品测定

血浆样品的处理按照“2.1.2”项下方法进行, 根据当日标准曲线, 计算各时间点血浆中阿霉素的浓度, 同时测定浓度为5、80、1600μg/L的QC样品。血药浓度-时间曲线如图3所示。

2.4.3 药物动力学参数计算

采用DAS 3.0药动学软件处理, 非隔室模型法计算阿霉素载药纳米粒注射后的主要药动学参数。其中AUC0-t为 (2585±273) μg·h/L, AUC0-∞为 (2854±240) μg·h/L, ke为 (0.03±0.01) /h, t1/2为 (28.40±7.27) h, tmax为 (0.08±0.00) h, V为 (71.87±18.07) L/kg, 血浆清除率为 (1.76±0.15) L/ (h·kg) , Cmax为 (3253±968) μg/L。

3 讨论

3.1 液相条件的考察

有机相为甲醇时, 阿霉素的响应比用乙腈时高约1.5倍;水相为0.1%冰醋酸时, 阿霉素的响应比0.1%甲酸高约1.2倍;采用梯度洗脱时, 阿霉素和内标的峰形良好, 无拖尾。最终确定以甲醇-0.1%冰醋酸作为水相, 甲醇作为有机相, 梯度洗脱。

3.2 测定方法的比较

文献中虽然已有LS-MS/MS法测定阿霉素体内浓度的报道[13,14,15], 但多采用氯仿-甲醇 (4∶1) 和乙酸乙酯进行液液萃取, 样品处理较复杂, 且血浆用量大, 本研究只需要大鼠血浆50μL, 文献中分别使用200μL和400μL, 是本研究的4倍和8倍。虽然定量下限最低可以达到1.0μg/L, 但血浆样品处理方法比较复杂, 采用乙腈沉淀蛋白后, 将上清液取出用氮气吹干, 再用流动相复溶, 灵敏度虽高, 但制样过程时间较长;同时, 阿霉素的出峰时间为4.9 min, 约为本研究的2倍。本研究采用甲醇直接沉淀蛋白, 处理方法简单, 阿霉素在给药后2.58 min左右出峰, 大大缩短了分析时间。

本研究建立的大鼠血浆中阿霉素浓度测定的LC-MS/MS法, 样品处理方法简单、专属性强、分析时间快, 能够满足阿霉素纳米粒在大鼠体内的药动学研究。

摘要：目的建立液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 法测定大鼠血浆中阿霉素的血药浓度, 并用于阿霉素载药纳米粒的体内药动学研究。方法色谱柱采用Shim-pack XR-ODS柱 (2.0 mm×100 mm, 2.2μm) , 仪器采用API 4000三重四极杆串联质谱仪, 采用多反应监测 (multiple reaction monitoring, MRM) 定量离子对为m/z544.2→m/z396.9 (阿霉素) 和m/z357.3→m/z133.8 (吡格列酮, 内标) ;甲醇沉淀蛋白法处理样品。结果阿霉素在2.02000μg/L范围内线性关系良好, 定量下限为2.0μg/L, 血浆中的内源性物质不干扰阿霉素的测定;日内和日间精密度RSD均小于±15.0%;阿霉素低、中、高3个QC浓度的提取回收率分别为 (92.1±5.9) %、 (82.8±2.9) %和 (80.1±9.7) %, 基质效应分别为 (91.1±2.4) %、 (82.1±1.7) %和 (81.2±2.5) %。结论该方法适用于阿霉素纳米粒在大鼠体内的药物动力学研究。

LC-MS/MS分析篇5

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB 3200QTRAP液质联用仪 (美国应用生物系统公司) , 配有电喷雾离子化源、三重四级杆质量分析器及Analyst 1.5.1工作站;Sartorius BP211D。

1.2 试药

对照品均由中国食品药品检定研究院提供。阿替洛尔 (批号:100117-199903) 、盐酸可乐定 (批号:0071-9504) 、氢氯噻嗪 (批号:100309-200702) 、卡托普利 (批号:100318-200602) 、盐酸哌唑嗪 (批号:100164-200402) 、利血平 (批号:041-9409) 及硝苯地平 (批号:100338-0001) 。样品:6个样品由本所在市场购得。乙腈、甲酸均为色谱纯, 水为超纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱:Phenomenex Luna C18 (2.0mm×100mm, 3μm) ;流动相:以0.5%甲酸水溶液为流动相A, 乙腈为流动相B, 梯度洗脱, 见表1。流速:0.2mL/min;进样量:5μL;柱温:35℃。

2.2 质谱条件

ESI电离源;正负离子扫描模式, 区间扫描模式见表2;多反应监测 (MRM) 扫描方式;喷雾电压:5500V;气帘气压力:25psi;雾化气压力:40psi;辅助加热器温度:400℃;辅助气压力:40psi;碰撞气压力:Medium;碰撞室出口电压:3V, 解簇电压 (DP) 及碰撞能量 (CE) 。见表3。

2.3 对照品溶液的制备

对照品储备溶液:取上述7种对照品约10mg, 精密称定, 分别置于100mL量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀。

混合对照品溶液:分别精密吸取上述对照品储备液1mL, 置同一100mL量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。

2.4 供试品溶液的制备

取一次服用量的供试品, 研细, 精密称取0.5g置于50mL量瓶中, 加入甲醇40mL, 超声处理15min, 放冷至室温, 加入甲醇至刻度, 混匀, 滤过, 精密吸取续滤液1mL, 置100mL量瓶中, 加甲醇稀释至刻度, 过0.2μm滤膜, 取续滤液, 即得。

2.5 样品测定

取混合对照品溶液及供试品溶液各10μL注入液质联用仪, 按照LC-MS/MS测定条件分别进行分析。

3 结果

3.1 质谱条件的优化

分别将7种对照品储备液用甲醇稀释至1μg·mL-1的对照溶液, 采用ESI离子化方式, 通过直接进样, 进行质谱条件优化。首先, 采用母离子扫描 (Q1) 方式得到准分子离子峰, 在确定准分子离子峰的基础上, 进行DP值的优化, 得到各成分的最佳DP值, 再采用子离子扫描 (MS2) 方式确定其子离子及最佳CE值, 最后选择母离子及丰度较大的子离子组成检测离子对, 使MRM具较高的灵敏度。此外, 在样品测定中可适当增加离子对数量, 使MRM具有更强专属性。结果见表3。

3.2 检测限

取对照品溶液适量, 加甲醇逐步稀释, 按上述液质联用条件进行测定, 以S/N=3, 计算各成分的最低检测限 (LOD) 。结果见表4。

3.3 样品测定结果

在质量色谱图中, 如供试品出现与混合对照品保留时间一致的质量色谱峰, 则需比较其与相应的对照品MS/MS图, 若其离子对相同, 且其相对丰度一致, 见表5, 则判断该样品中含有该化学成分。在抽取检验的6批次供试品中, 检出1批样品添加了氢氯噻嗪, 相应图谱见图1、图2。

4 讨论

硝苯地平光稳定性较差, 操作中应尽量避光, 配置过程须采用棕色容量瓶。阿替洛尔因结构中含有一个手性碳原子, 存在着对映异构现象, 为外消旋体[8], 故在质量色谱中出现两个不同保留时间的吸收峰。

为使7种化学成分达到满意的分离度, 分别对0.5%甲酸-乙腈、0.5%乙酸-乙腈、0.5%甲酸-甲醇、0.5%乙酸-甲醇及20mmol/L乙酸铵-乙腈等洗脱条件进行了考察, 结果表明在0.5%甲酸-乙腈梯度洗脱时, 7种化合成分的离子化效率高, 并均能得到较好的分离。

本实验共建立了7种降压类保健品中非法添加成分的定性检测方法, 该方法采用多反应监测的方式检测, 专属性强, 灵敏度高, 检测结果更准确。

参考文献

[1]王艳, 赵龙凤, 王勤英.药物性肝损伤66例[J].中华肝脏病杂志, 2010, 18 (9) :715-716.

[2]沈素.引起药源性肾损害的药物与常见类型[J].中国医刊, 2007, 42 (11) :13-15.

[3]孙晓翠, 高尚, 刘艳丽, 等.检查清脑降压片中非法添加氢氯噻嗪的方法研究[J].中国药事, 2007, 21 (7) :504-506.