黑素瘤细胞

黑素瘤细胞（共3篇）

黑素瘤细胞 篇1

黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤, 其发病率比较低, 占全部恶性肿瘤的1.0%~3.0%, 但黑色素瘤恶性度高, 转移早且广泛, 而且对常规放疗有较强的抗性, 是一种临床治疗上颇为棘手的恶性肿瘤[1]。褪黑素 (melatonin, MT) 是由松果腺和其它来源的细胞合成分泌的一种生物活性物质, MT能有效抑制乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤, MT还能够增强传统化疗药物的疗效, 降低其不良反应, 延长患者的生命[2]。目前认为褪黑素是通过细胞膜表面的受体 (褪黑素受体) 发挥作用, 褪黑素受体为细胞膜G蛋白耦联受体超家族, 有3种亚型, 分别称为MT1、MT2、MT3, 研究发现这3种受体在A375细胞中都有表达[3]。VEGF是是促进肿瘤血管形成的主要因子, SHAO等发现VEGF在黑色素瘤组织中广泛表达并与其临床分期、预后有关[4]。然而褪黑素是否能抑制A375细胞VEGF的表达以及与褪黑素受体及其下游信号转导通路的关系还没有明确。

本研究应用褪黑素、褪黑素受体抑制剂、腺苷酸环化酶激动剂Forskolin及PKA激动剂8-brom-camp处理人黑色素瘤细胞A375, 观察其VEGF表达的变化及与c AMP-PKA信号转导通路的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞及其他材料来源及细胞培养

人黑色素瘤细胞株A375购自中南大学细胞生物实验中心, 置于含10%肽牛血清的DMEM培养基中, 于37℃、5%二氧化碳孵箱中常规培孔接种2×105个细胞, 96孔板每孔接种5×103个细胞, 贴壁24 h后用于实验。

TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司, SYBR GREEN PCR Master Mix购自美国应用生物系统公司。VEGF ELISA试剂盒购自美国R&D公司。Luzindole, Forskolin, 8-brom-camp购自美国Sigma公司。VEGF抗体购自美国Santa Cruz公司。其他化学试剂购均为分析纯, 购自国药集团。

1.2 实时定量PCR (Real-time PCR)

6孔板每孔接种2×105个细胞, 以DMSO为对照, 10μmol/L褪黑素处理细胞24 h后, 用TRIzol Reagent方法提取RNA, 测浓度后取2μg进行反转录 (25μL体系) , 取2μL c DNA、10μL SYBR GREEN PCR Master Mix、6μL dd H2O、上下游引物各1μL进行反应, 引物序列如下:VEGF[5]sense:5'-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3', anti-sense:5'-AGCCCCCGCATCGCATCAG-3', 目的片段长度为178 bp;GADPH sense:5'-CACCCATGACGAACATG GG-3', anti-sense:5'-TTCCAGGAGCGAGATCCCT-3', 目的片段长度为175 bp。

1.3 ELISA实验

96孔板每孔接种5×103个细胞, 贴壁24 h, 以DMSO为对照, 分别用10μmol/L褪黑素、10μmol/L Luzindole (褪黑素抑制剂) 处理24 h, 或者用500μmol/L Forskolin、30μmol/L 8-brom-camp分别预处理1 h后加10μmol/L褪黑素处理23 h, 收集培养上清, 5 000 r/min离心10 min, 按ELISA试剂盒说明检测VEGF蛋白。培养板中加入100μL DMEM+10μL Cell Counting Kit-8工作液, 450 nm检测细胞活力。每孔VEGF的相对含量=ELISA OD值/WST OD值, 以DMSO组作为对照。

1.4 细胞胞浆中VEGF的检测

6孔板每孔接种2×105个细胞, 贴壁24 h, 以DMSO为对照, 分别用10μmol/L褪黑素处理细胞0、6、12和24 h, 或10μmol/L Luzindole 24 h, 或500μmol/L Forskolin、30μmol/L 8-brom-camp分别预处理1 h后加10μmol/L MT处理23 h, PBS终止反应, 细胞刮收集细胞, 加入适量细胞裂解液冰上作用30 min, 冰浴下超声粉碎, 15 000 r/min, 离心30min, 取上清, 用Bradford方法定量蛋白浓度。取60μg上述蛋白在12%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离, 电转至硝酸纤维素膜, 封闭1 h, 一抗4℃孵育过夜, PBS洗涤后二抗孵育2 h, ECL显色系统检测VEGF的表达, 以β-actin为内参照。X线片上的信号用Image-J软件进行统计分析。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件, 两组间比较采用t检验, 以P<0.05为显著性检验。

2 结果

2.1 褪黑素抑制A375细胞VEGF m RNA的表达

以DMSO为对照, 实验组10μmol/L褪黑素处理24 h后, Real-time PCR观察到实验组VEGF m RNA含量减少48.7%, 差异有显著性。见图1。

2.2 褪黑素抑制A375细胞VEGF蛋白表达

用10μmol/L褪黑素分别处理A375细胞0、6、12和24 h, 细胞浆中VEGF的表达水平分别下降了14.2%、27.3%和41.8%, 差异均有显著性 (图2) 。ELISA实验观察到实验组细胞培养上清中VEGF的含量是对照组的65.7%, 差异有显著性 (图3) 。

1) 与对照组相比, P<0.05;2) 与对照组相比, P<0.01

2.3 褪黑素受体拮抗剂对A375细胞VEGF表达的影响

以DMSO为对照, 实验组用10μmol/L褪黑素受体拮抗剂Luzindole处理24 h后, 实验组细胞浆VEGF的表达水平与对照组相比下降了32.3%, 差异具有显著性 (图4) 。ELISA结果显示, Luzindole处理组细胞培养上清VEGF表达水平与对照组相比下降20.1%, 差异具有显著性 (图5) 。

2.4 8-brom-camp和Forskolin对A375细胞VEGF的影响

以DMSO为对照, 实验组用30μmol/L PKA激动剂 (8-brom-camp) 或500μmol/L腺苷酸环化酶激动剂 (Forskolin预处理1 h后, 加入10μmol/L MT作用23 h, PBS终止反应, Western blot观察实验结果, 发现8-brom-camp+MT组、Forskolin+MT组细胞浆中VEGF的表达水平分别为MT组的1.58和2.24倍, 与MT组比较均差异有显著性 (图6) 。ELISA检测结果显示, 8-brom-camp+MT组、Forskolin+MT组细胞培养上清中VEGF的表达水平分别为MT组的1.65和2.39倍, 与MT组均差异有显著性 (图7) 。

3 讨论

MT的抗肿瘤作用是一个广阔的研究领域, 而且新的作用机制仍在不断发现之中。MT不但本身具有抗肿瘤作用, 还可以增强机体免疫功能, 或与其他化疗药物合用发挥增效、降毒作用。加之MT口服具有很好的生物利用度, 极少见不良反应 (剂量2mg/d~1.2 g/d) 。因此, 对MT抗肿瘤作用及机制进行深入的研究具有重要的临床应用意义。研究表明, MT可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭转移和肿瘤血管的形成[6]。MT抑制肿瘤血管形成的方式主要有两种[7]: (1) 抑制血管内皮细胞的增殖、侵袭、管型的形成; (2) 抑制肿瘤细胞分泌促血管生成因子如VEGF, 但是MT抑制黑色素瘤细胞VEGF表达的信号转导通路还不明确。

VEGF是主要的促血管形成因子, 与肿瘤血管形成密切相关, 其中VEGF 165、VEGF 189和VEGF 206与游离的肝素和分布于细胞表面、细胞外基质中的类肝素蛋白多糖结合保留在细胞中, 细胞合成的纤溶酶、基质金属蛋白酶等可以通过蛋白水解作用使VEGF游离分泌到细胞外以二聚体形式发挥作用[8]。VEGF在促进黑色素癌的发生发展中具有重要作用, 李静等[9]报道70例黑色素癌组织中VFGF-C的阳性表达率为87.3% (61/70) , VEGF-C的表达与转移情况、无病生存期及总生存率均有显著相关性。

多种信号分子作用于膜受体后, 可通过G蛋白激活腺苷酸环化酶, 产生第二信使c AMP。c AMP作为第二信使, 进一步激活PKA、Epac及下游的调控元件, 从而调节细胞内活动。研究表明, 第二信使c AMP激活与VEGF的表达相关。AMANO等[10]发现在小鼠皮下海绵移植模型中, 激活c AMP的合成能促进血管内皮细胞VEGF的分泌从而促进肿瘤血管的形成。NAMKOONG等[11]发现腺苷酸环化酶激动剂Forskolin能促进人血管内皮细胞分泌VEGF从而促进血管形成。KIEFER等[12]研究表明褪黑素可以抑制黑色素瘤细胞c AMP、VEGF的合成。目前认为, MT主要通过细胞膜表面3种MT受体 (MT1、MT2和MT3) 发挥作用。SEUNG等[13]研究发现MT受体与G蛋白的Gs亚单位偶联, 并激活腺苷酸环化酶, 促使c AMP合成, 激活下游一系列调控元件, 包括PKA等。因此, 推测MT抑制黑色素瘤细胞VEGF的合成可能是通过阻断MT受体激活c AMP-PKA信号转导通路所致。

本研究结果表明, 10μmol/L MT对A375细胞VEGF m RNA、蛋白的表达具有抑制作用;进一步应用MT受体拮抗剂处理A375细胞, 结果显示, MT受体拮抗剂能明显抑制A375细胞VEGF蛋白的表达, 提示MT对A375细胞VEGF表达的抑制可能主要是通过MT受体发挥作用的。为了证实MT通过MT受体及c AMP-PKA信号转导通道下调A375细胞VEGF表达的推测, 应用500μmol/L Forskolin和30μmol/L 8-brom-camp处理细胞, Forskolin是腺苷酸环化酶的激动剂, 可以激活腺苷酸环化酶, 上调c AMP的合成;8-brom-camp是PKA激动剂, 可以直接激活PKA而上调下游蛋白磷酸化水平。结果表明8-brom-camp和Forskolin可以激活MT抑制A375细胞VEGF表达的作用, 8-brom-camp+MT组、Forskolin+MT组A375细胞浆VEGF的表达水平是MT组1.58和2.24倍, A375细胞培养上清中VEGF的表达水平是MT组的1.65和2.39倍, 与MT组均差异有显著性, 证实了MT对VEGF的调节作用与MT受体拮抗、c AMP-PKA信号转导通路阻断有关, 为MT抑制肿瘤血管生成的机制研究提供了进一步的理论依据。

摘要：目的 探讨褪黑素对人黑色素瘤细胞A375 VEGF表达的影响及其可能涉及的信号转导通路。方法用褪黑素、褪黑素受体拮抗剂、forskolin+褪黑素、8-brom-camp+褪黑素处理A375细胞, Real-time PCR、Western blot、ELISA等检测VEGF mRNA、蛋白表达的变化。结果 10μmol/L褪黑素处理A375细胞24 h后, VEGF mRNA的表达水平下降了48.7% (P<0.01) 、细胞培养上清中VEGF蛋白表达水平下降了24.3% (P<0.01) ;10μmol/L褪黑素处理A375细胞6、12和24 h后, 胞浆中VEGF蛋白的表达水平分别下降了14.2%、27.3%和41.8% (P<0.01) ;10μmol/L褪黑素受体拮抗剂处理A375细胞24 h后, 胞浆、细胞培养上清中VEGF蛋白表达水平与对照组相比分别下降了32.3%和20.1% (P<0.01) ;30μmol/L PKA激动剂 (8-brom-camp) 、500μmol/L腺苷酸环化酶激动剂 (forskolin) 处理A375细胞24 h后, 胞浆VEGF的表达水平分别是对照组的1.58和2.24倍, 细胞培养上清中VEGF的表达水平分别为对照组的1.65和2.39, 与褪黑素组相比均差异有显著性 (P<0.01) 。结论 褪黑素可下调A375细胞VEGF的表达, 其作用机制可能是通过褪黑素受体阻断cAMP-PKA信号转导通路所致。

关键词：黑色素瘤,褪黑素,褪黑素受体,VEGF,cAMP-PKA

黑素瘤细胞 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

黑色素瘤细胞株B16由日本理研提供,雄性C57BL/6J小鼠,6～8周龄,体重20～25 g,购自日本SLC公司。TransIT-TKO R转染试剂、oligo(dT)20-M4adaptor引物、细胞增殖试剂WST-1购自日本Ta KaRa公司,QuickPrepTM总RNA提取试剂盒购自Amersham Bioscience,M-MLV逆转录酶,RNA酶抑制剂购自Promega公司。与HPA(NM-152803)第546～566核苷酸序列对应的干扰引物21聚双链RNA 5'-GAACAGCACCUACUCAAGAtt-3'(正义)和3'-ttCUUGUCGUGGAUGAGUUCU-5'(反义)及对照用无义乱序RNA购自日本i GENE公司。定量实时PCR(Real Time PCR)引物:与第947～963核苷酸序列对应的正义引物,5'-GCTCCGAAGCGTGAGT C-3';与第1097～1081核苷酸序列对应的反义引物,5'-CTTTGTGCCGCCAAATC-3'购自日本Life S cience公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA干扰

使用TransIT-TKOR转染试剂将si RNA(终浓度10 nM)经逆转染法[1]导入B16细胞。

1.2.2 总RNA的提取和逆转录

总RNA的提取按照QuickPrepTM总RNA提取试剂盒提供的方法操作。经分光光度法定量后,取1μg RNA使用200uM-MLV逆转录酶合成c DNA。总反应体积20μL,内含0.5μg/μL oligo(dT)20-M4 adaptor引物,10 m M dNTP混合物,5×逆转录缓冲液,25 m M氯化钙,0.1M DTT,RNA酶抑制剂。反应条件为37℃下60 min和95℃下5 min。

1.2.3 定量实时PCR

定量实时PCR(RT-PCR),使用Fast Start DNA Master plus SYBR GreenⅠ(Roche Diagnostics)试剂盒在Light Cycler ST300(Roche Diagnostics)仪上进行。每一反应内含0.5μM正义和反义引物,5μL 10倍稀释的c DNA,和4μL SYBR GreenⅠMaster混合物,总反应体积为20μL。HPA m RNA的表达经G3PDH表达水平修正[1]。

1.2.4 细胞增殖实验

细胞数用细胞增殖试剂WST-1按照说明进行测定,具体如下:干扰后的细胞及对照组细胞以1×104细胞/孔100μL培养基接种于96孔培养板,37℃24 h培养后,吸除培养基换成100μL 0.5 mg/m L的MTT继续在37℃培养箱中放置4 h。培养板离心除去上清后,加入200μL Is opropanol,于室温反应4 h,最后测定562 nm波长下的吸光度。

1.2.5 黑色素定量分析

细胞经PBS洗涤后,在1N氢氧化钠中于60℃反应1 h,取等量样品转至96孔培养板,每组4孔,测定470 nm波长的吸光度。与合成的黑色素标准比较,得出黑色素的含量。

1.2.6 实验性肝转移

C57BL/6J小鼠经麻醉后,左侧腹部作1 cm切口,拖出脾脏,自脾脏下极沿其长轴注入100μL无血清培养基,内含2×105个B16黑色素瘤细胞。实验组注入经HPA si RNA干扰的细胞(n=10),对照组注入经对照用无义si RNA转染过的细胞(n=10)。脾脏穿刺点加压1 min后关腹。术后2周采用离颈法处死动物,在手术显微镜下计数肝脏转移瘤。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件包进行数据分析,计量资料比较采用t检验,计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPA mRNA表达水平

从经过RNA干扰48 h后的黑色素瘤细胞及对照RNA处理过的细胞中提取总RNA,逆转录成c DNA后行实时PCR。HPA m RNA的表达水平经内源性G3PDH表达水平的修正,经对照用无义RNA处理的细胞HPA m RNA的表达水平视为100%。如图1所示,实验组HPA m RNA的表达水平为对照组的20%左右(n=3,P<0.01)。

2.2 B16黑色素瘤细胞增殖及黑色素定量分析

为了解RNA干扰对B16黑色素瘤细胞的影响,实验还测定了其特异性的指标,如黑色素生成及细胞增殖速度。经RNA干扰后,B16黑色素瘤细胞生成黑色素的能力与对照组细胞无明显差异(n=4,P>0.05),如图2所示。细胞的增殖能力(图3)亦未受到影响(n=6,P>0.05)。

2.3 小鼠实验性肝转移

如实验方法所述,B16黑色素瘤细胞注入小鼠脾脏后14 d计数肝脏转移性结节数。结果见图4,A和B为选自实验组和对照组的有代表性的肝脏照片,对照组可见大量黑色结节(A),实验组肝脏结节数明显较少(B,C:n=10,P<0.01)。

3 讨论

自1975年魻GREN和LINDAHL[2]发现乙酰肝素酶以来,经过几十年的研究,人们对于乙酰肝素酶的结构及功能有了较为全面的了解。乙酰肝素酶基因编码区全长1.7 kb,编码543个氨基酸的65 kD前体蛋白,加工后形成50 kD和8 kD亚基组成的活性形式,是哺乳动物细胞内惟一具有降解HS功能的酶。乙酰肝素酶是一种内源性β-葡萄糖酸酯酶,以水解的方式切割糖苷键。乙酰肝素酶识别独特稀有的HS结构,降解产物仍是较大的片段(5～10 kD,10～20个糖基)。

正常情况下,乙酰肝素酶只在部分胎盘细胞、血源性细胞如白细胞及皮肤素细胞中表达[3]。正常组织及细胞中的乙酰肝素酶与组织形成和细胞功能关系密切,如小鼠胎盘中乙酰肝素酶的较高表达显示其在组织发生及形成中的作用,白细胞特别是炎症白细胞表面乙酰肝素酶被证实其在炎症反应中参与了白细胞从血管游出的过程[4]。

然而,有意义的是侵染性细胞尤其是转移性肿瘤细胞中乙酰肝素酶也有表达。近年来研究表明,乙酰肝素酶与癌症组织的转移有极为密切的相关性,研究者在各种来源的肿瘤组织及肿瘤细胞系中发现其表达。乙酰肝素酶基因转染的实验也证明乙酰肝素酶在肿瘤转移中的作用,当淋巴细胞和癌细胞被乙酰肝素酶基因稳定转染后,会激发其转移能力。反之,使用乙酰肝素酶抑制剂等降低乙酰肝素酶表达的方法可以有效地减少转移的发生,提示乙酰肝素酶可成为癌症转移治疗的靶点[5]。

笔者研究采用RNA干扰的方法,有效地抑制了黑色素瘤细胞HPA m RNA的表达,其表达水平只有对照组细胞的20%,而细胞的肿瘤学特性如细胞增殖及生成黑色素的能力与对照组无差异,说明该方法制备的肿瘤细胞非常适合于研究HPA在肿瘤转移中的作用。经脾脏注射肿瘤细胞进行实验性肝转移的方法为许多研究者所采用,因为其特异性的肝窦结构为肿瘤细胞提供了合适的温床。笔者研究采用经脾脏注射的方法,将RNA干扰的黑色素瘤细胞及对照黑色素瘤细胞所致肝脏转移结节数进行对比,结果显示,RNA干扰组肝脏转移结节数显著少于对照组。提示HPA的表达水平与肿瘤转移成正相关,与文献报道使用HPA抑制剂能降低肿瘤细胞的转移能力相一致[6],也与文献报道使用反义核苷酸或RNA干扰的结果相符[7,8]。

摘要：目的 研究用RNA干扰的方法抑制乙酰肝素酶的表达及其对B16黑色素瘤细胞实验性肝脏转移的影响。方法 将HPA siRNA转入B16黑色素瘤细胞,抑制HPA的表达,并测定该细胞的增殖能力及黑色素生成能力;还将RNA干扰的B16黑色素瘤细胞注入小鼠脾脏测定其实验性肝转移的能力,并与对照组比较。结果 将HPA siRNA转入B16黑色素瘤细胞,行RNA干扰后获得HPA较低表达的细胞(表达水平为对照组的20%,P<0.01),而黑色素生成及细胞增殖能力不受影响(P>0.05)。将该细胞注入小鼠脾脏后,计数实验性肝转移结节的数目,实验组较对照组肝脏转移结节明显减少(P<0.01)。结论 B16黑色素瘤细胞经RNA干扰后,随着HPA表达的降低,细胞转移能力下降。RNA干扰抑制HPA的表达,是一种理想的抗肿瘤治疗方法。

关键词：B16黑色素瘤细胞,RNA干扰,实验性肝转移

参考文献

[1]OVCHAREN KO D,JARVIS R,HUNICKE-SMITH S,et al.High-throughput RNAi screening in vitro:from cell lines to pri-mary cells[J].RNA,2005,11(6):985-993.

[2]OGREN S,LINDAHL U.Cleavage of macromolecular heparin byan enzyme from mouse mastocytoma[J].J Biol Chem,1975,250:2690-2697.

[3]HULETT MD,FREEMAN C,HAMDORF BJ,et al.Cloning ofmammalian heparanase,an important enzyme in tumor invasionand metastasis[J].Nat Med,1999,5:803-809.

[4]ZCHARIA E,METZGER S,CHAJEK-SHAUL T,et al.Trans-genic expression of mammalian heparanase uncovers physiologicalfunctions of heparan sulfate in tissue morphogenesis,vasculariza-tion,and feeding behavior[J].FASEB J,2004,18:252-263.

[5]VREYS V,DAVID G.Mammalian heparanase:what is the mes-sage[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine,2007,11(3):427-452.

[6]ZHAO H,LIU H,CHEN Y,et al.Oligomannurarate sulfate,anovel heparanase inhibitor simultaneously targeting basic fibroblastgrowth factor,combats tumor angiogenesis and metastasis[J].Can-cer Res,2006,66:8779-8787.

[7]GAO J,SU L,QIN R,et al.Transfection of antisense oligo-de-oxynucleotide inhibits heparanase gene expression and invasive a-bility of human pancreatic cancer cell in vitro[J].J Huazhong U-niv Sci Technolog Med Sci,2006,26:72-74.

人正常黑素细胞体外培养方法 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

标本取自包皮环切术的包皮组织 (患者年龄8~25岁) 。DMEM/F12 (1:1) 、EDTA、胰酶均购自Gibco公司;霍乱毒素、异丁基甲基黄嘌呤、二甲基亚砜、G418、左旋多巴 (L-DO-PA) 均购自Sigma公司;十四烷酰佛波醇乙酯购自WAKO公司;L-谷氨酰胺购自Amresco (分装) ;新生胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司。

1.2 人正常黑素细胞的分离、细胞悬液的制备及黑素细胞的原代培养

取包皮环切术后包皮标本, 参照辛燕等[4]的方法将标本放入PBS液中冲洗, 取出后去除皮下组织, 剪成5 mm×5 mm小块, 移入含0.02%EDTA和0.25%胰酶溶液的无菌瓶中, 于4℃冰箱中消化18~24 h;分离真皮和表皮, 留表皮, 弃真皮;振荡表皮, 将液体收集于离心管, 按1 000 r/min离心5 min, 弃上清, 将细胞沉淀物用黑素细胞培养基重新悬浮, 按2.5×105个/瓶的细胞密度接种于培养瓶内, 37℃、5%CO2条件下培养48 h后换液, 去除未贴壁细胞, 以后适时更新培养液。

1.3 黑素细胞的传代与纯化

MC生长至70%~80%融合时, 用0.25%胰酶溶液消化, 细胞从瓶底漂浮, 立即加入等量的MC培养基终止消化, 并制成细胞悬液, 移入离心管, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清后再加入MC培养基, 再次吹打悬浮, 将此细胞悬液按1×105个/瓶接种于25 m L的培养瓶内, 37℃、5%CO2培养, 每2 d换液1次。为防止FC污染, 在培养液中加入100μg/m L的 (Gene-ticin, G418) 选择性除去成纤维细胞。

1.4 左旋多巴 (L-DOPA) 染色

取第3代处于对数生长期的MC, 调整细胞浓度为5×105个/m L, 接种于培养皿中, 37℃、5%CO2条件培养, 生长达到70%时, 终止生长, 冰PBS液洗2次, 5%甲醛固定细胞30 min, 冰PBS液洗3次, 加入0.1%L-DOPA, 37℃染色3 h, 中间更换染液1次, 冰PBS液洗3次, 再用10%甲醛固定20 min, PBS液洗3次, Giemsa染液复染10 min, 去离子水冲洗。

2 结果

2.1 MC的生长情况

原代培养将细胞接种于培养瓶观察, 可见细胞呈单个、圆形、多数飘浮, 见图1。24 h后换液, 可见贴壁的多为两极树突状细胞, 见图2。随着培养时间的延长, 此类细胞数量增多, 并出现三极的树突状细胞, 同时贴壁的圆形或多角形类KC逐渐减少, 见图3。4~5 d后MC即可铺满瓶底, 此时贴壁的类KC基本消失, 见图4。传代时加入100μg/m L基因素 (Geneticin, G418) 以防止FC的生长。传代后约4 h MC即可贴壁, 多见两极/三极细胞, 见图5。第5 d细胞树突相互连接成网状, 见图6。

2.2 L-DOPA染色

取培养的MC进行L-DOPA染色 (步骤同1.4) , 均呈阳性反应, 证实所培养的细胞为纯化的MC。见图7。

3 讨论

黑素细胞约占表皮细胞总数的2%~3%, 分布于表皮、毛囊、眼及血管周围等部位, 其数目随部位不同而不同, 以面部及生殖器部位密度为高[5]。MC最重要的功能和分化特征是合成黑素, 大多数色素障碍性皮肤病都与MC的功能、其酪氨酸酶的活性以及与其相关的信号转导途径的变化等密切相关[6]。

为了学习MC的原代培养、传代培养及纯化技术, 并为进一步研究提供实验模型, 本实验结合国际培养MC的现状和具体情况, 结果发现, MC细胞在接种20 h以上就贴壁生长, 并且随着培养时间延长, MC树突变长、增多, 多数为2~3级。在MC融合到80%时, 进行传代, 最终获得了大量纯化的MC。

在MC细胞培养过程中的几点体会: (1) FC对胰蛋白酶的敏感性与MC无明显差别, FC的优势生长可以掩盖MC的生长, 因此防止FC污染至关重要, 应该在培养的各个环节都加以重视, 如在处理包皮组织时应尽量剪去皮下组织, 不仅可减少混杂的FC, 还可有利于真表皮的分离;掌握胰酶消化时间, 使真表皮分离达最佳效果;原代或传代培养时把握好加入G418的时机等。 (2) 在培养的细胞中KC也易混杂生长, KC贴壁较牢, 较MC难于消化, 可利用胰蛋白酶差异消化法将之去除。 (3) 在培养的过程中要进行无菌操作, 包括对操作器械的取用, 酒精灯烧灼的时间、部位等;培养过程中的换液、吹打强度和次数等都会关系到实验的成败。

本实验成功培养、纯化和传代了MC, 并通过L-DOPA染色证实, 为下一步的研究奠定基础。

摘要：目的:学习人正常黑素细胞的原代培养技术, 为进一步研究提供实验模型。方法:分离培养人正常黑素细胞, 细胞取材于包皮环切术后的包皮组织;采用左旋多巴染色法进行细胞鉴定。结果:成功培养、传代、纯化了人正常黑素细胞, 并经左旋多巴染色证实。结论:动态观察了人正常黑素细胞培养的全过程, 验证了细胞的特性, 获得了大量纯化的黑素细胞, 为进一步的细胞内干预实验提供了物质基础。

关键词：黑素细胞,体外培养,原代培养

参考文献

[1]Zhao Z, Jin C, Ding K, et al.Dedifferentiation of human epidermal melanocytes into melanoblasts in vitro[J].Exp Dermatol, 2012, 21 (7) :504-508.

[2]Shin DH, Cha YJ, Joe GJ, et al.Whitening effect of Sophora flavescens extract[J].Pharm Biol, 2013, 51 (11) :1467-1476.

[3]Kim TK, Lin Z, Tidwell WJ, et al.Melatonin and its metabolites accumulate in the human epidermis in vivo and inhibit proliferation and tyrosinase activity in epidermal melanocytes in vitro[J].Mol Cell Endocrinol, 2014, 404C:1-8.

[4]辛燕, 栗济深, 夏隆庆.5-甲氧补骨脂素及山柰素对黑素细胞的酷氨酸酶活性和增殖的影响[J].中国麻风皮肤病杂志, 2007, 23 (3) :189-191.

[5]Genead MA, Fishman GA, Rha J, et al.Photoreceptor structure and function in patients with congenital achromatopsia[J].Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52 (10) :7298-7308.