细胞缺氧（共7篇）
细胞缺氧 篇1
摘要：目的 探讨不同缺氧程度对食管癌细胞株TE1中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及糖酵解关键酶表达的影响。方法 TE1细胞分别在正常氧分压和缺氧条件下培养,缺氧时间设定为6、12、24及48h,使用Western blot方法检测缺氧培养不同时间后细胞中HIF-1α及糖酵解关键酶己糖激酶II(Hexokinase-II,HK-II)的蛋白水平表达变化。结果 常氧及缺氧条件下TE1细胞中HIF-1α及HK-II均有表达,缺氧后表达均较常氧培养时明显增强,且随缺氧时间不同而呈先增多后减少的动态变化。结论 低氧能够增加食管癌细胞中HIF-1α及HK-II表达而促进糖酵解进程,联合抑制HIF-1α和糖酵解酶可能成为治疗食管癌的潜在的靶点。
关键词：缺氧诱导因子-1α,糖酵解,食管癌
缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)是新近发现的与肿瘤血管生成、转移和浸润密切相关的分子[1],但其在细胞中的调控机制目前认识还不一致。近年研究提示HIF-1α的表达及调控可能涉及糖酵解相关基因。为进一步明确HIF-1α及糖酵解的调控机制,本研究拟观察缺氧对HIF-1α及糖酵解的影响。
1材料与方法
1.1 材料
TE1细胞株(中国科学院上海细胞所),DMEM培养液;鼠抗人HIF-1α单抗;兔抗人HK-II;鼠抗人Tubulin-α单抗;HRP标记的羊抗鼠二抗;HRP标记的羊抗兔二抗;
1.2 方法
1.2.1 食管鳞癌TE1细胞培养
取对数生长期TE1细胞贴壁传代,后随机分为正常氧分压组和缺氧组,正常组置入含5%CO2的37℃培养箱,缺氧组置入缺氧培养箱(37℃、1%O2、5%CO2、94%N2),缺氧时间为6、12、24、48 h,细胞裂解液收集各组细胞。
1.2.2 Western blot方法测定HIF-1α、HK-II表达
取蛋白40μg上样,行 SDS-PAGE电泳,冰浴电转至NC膜,封闭后依次加入一抗(HIF-1α 1:500;HK-II 1:1000;Tubulin 1:4000)、二抗(羊抗鼠1:4000;羊抗兔1:4000),ECL发光法曝光显影。Tanon Gis软件对感光胶片条带进行灰度值分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS13.0软件进行数据整理和分析,组间差异采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
缺氧培养6、12、24、48 h后,HIF-1α及HK-II 表达较常氧培养明显升高(P>0.05),缺氧12 h表达到达高峰,随着缺氧时间延长其表达又逐渐下降(图1)。
3讨论
缺氧诱导因子-1是一种核转录因子,是细胞在缺氧条件下维持氧稳态的关键物质[2]。HIF-1由α和β亚基组成,其活性取决于其α亚基。HIF-1α的调控机制尚不清楚,本研究结果显示,TE1细胞常氧状态下即有HIF-1α表达,缺氧后表达明显增强,提示肿瘤细胞内HIF-1α蛋白水平受环境氧浓度的高度调控。
恶性实体肿瘤生长迅速常造成肿瘤内部微环境的缺氧状态,肿瘤细胞依赖糖酵解获得能量的特点是其缺氧耐受的代谢基础[3]。HK-II是影响糖酵解的关键基因[4],本实验显示低氧能够促进HK-II表达,从而促进糖酵解进程。
有学者提出PI3K/AKT通路是HIF-1α的主要调控机制[5],而HIF-1α可调节糖酵解水平。通过本研究我们推测HIF-1α可能通过调控HK-II进而影响糖酵解,联合抑制HIF-1α和HK-II可能为肿瘤糖酵解途径的一个新的治疗靶点。
参考文献
[1] Jie Hua,Rui-Hua Shi,Hong-Jie Zhang,et al. Effect of RNA interference-based silencing of HIF-1α gene on the expression of vasculogenic mimicry-associated genes in esophageal squamous carcinoma cells. World Chinese Journal of Digestology, 2009 (19 ):1913-1918.
[2] Matsuyama T, Nakanishi K, Hayashi T,et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1α in esophageal squamous cell carcinoma Cancer Science,2005,96:3 (176-182).
[3] Pelicano H, Martin DS, Xu RH,et al. Glycolysis inhibition for anticancer treatment. Oncogene, 2006, 25(34):4633-4646.
[4] Airley RE, Mobasheri A. Hypoxic regulation of glucose transport, anaerobic metabolism and angiogenesis in cancer: novel pathways and targets for anticancer therapeutics. Chemotherapy, 2007, 53 (4): 233-256.
[5] Burrows N, Resch J, Cowen R.L,et al.Expression of hypoxia-inducible factor 1α in thyroid carcinomas Endocrine-Related Cancer,2010,17:1 (61-72).
细胞缺氧 篇2
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton-DickinSon公司)。清洁级SD24h新生乳鼠。RPMI1640液体培养基和胎牛血清,购于Hyclone公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(购于美国BD公司);二甲基亚砜(DMSO购于美国GIBCO公司)溶液10μL/mL储备液;西洋参茎叶总皂苷(解放军总医院病理生理室王琛博士惠赠)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
无菌操作取出大鼠心脏,立即在无菌D-Hanks液中洗去残血,分离出附着组织,剪成约1 mm3大小碎块,经反复D-Hanks液洗涤、0.15%胰蛋白酶消化,差速贴壁法,制备成心肌细胞悬液,最后用15%胎牛血清的DMEM培养液稀释成细胞密度为3×105/mL,接种于25 mL培养瓶中,放入37℃、5%CO2孵育箱内进行原代培养。
1.2.2 心肌细胞缺氧/复氧模型
按Li等[6]将心肌细胞置于缺氧仓内,通入95%N2-5%CO2混合气,缺氧4h小时后放回CO2孵箱37℃,常规培养12h后检测。
1.2.3 心肌细胞分组及诱导凋亡
将培养细胞心肌细胞分为正常组、缺氧/复氧损伤组、缺氧/复氧加西洋参茎叶总皂甘诱导的乳鼠心肌细胞组(西洋参茎叶总皂甘剂量:40 mg/L,80mg/L,160mg/L)用培养液将细胞稀释为106/mL,混匀后放入37℃,5%CO2的孵箱继续培养24h后分别检测。
1.2.4 流式细胞检测
采用FACS Calibur型分析流式细胞仪,用CELL Quest获取和分析数据。488nm激发光源,先将对照管上样,通过调整参数FAS和SSC,在散色光点图(FSC/SSC)中清楚显示出一个清晰、集中的细胞群体。在获取细胞前,根据FAS/SSC的特点,设定阈值,避免碎片和噪声干扰,确定电压及放大器数值后,再以门中细胞进行设门(gate),使门中细胞占95%以上,收集10000个门内细胞。以门中细胞进行后续荧光信号检测,将对照组细胞的荧光强度设定为非特异性本底荧光,并在此基础上确定阳性荧光表达率。调定流式细胞仪,FL1荧光通道检测Annexin V的荧光强度,FL2荧光通道检测PI的荧光强度。分别将设定阴性对照管使荧光散点图中细胞集中在左下(LL)象限,保持FL1、FL2电压不变。上样调整仪器荧光补偿值,进行校正后,即可分析样本,每个样本均获取10000个细胞,数据以List Mode的形式储存,采用CellQest功能软件进行分析。
2 实验结果
2.1 流式细胞仪检测不同剂量西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡
将培养乳鼠细胞上流式细胞仪检测。从Annexine V-FITC/PI荧光双参数点图观察到(见图1)对照组细胞主要分布在左下象限,为非凋亡细胞活细胞,右下象限为少量凋亡细胞。损伤组右下象限出现大量凋亡细胞及死亡细胞。增加随着西洋参茎叶总皂甘剂量增加,死亡细胞显著减少,凋亡细胞相对减少(见图1)。
2.2 西洋参茎叶总皂甘诱导内质网应激心肌细胞凋亡变化
正常对照组细胞生长状态良好,细胞凋亡率3.34±0.78%,损伤组缺氧/复氧损伤组细胞凋亡率38.53±6.15%。根据剂量40mg/L,80mg/L,160mg/L的西洋参茎叶总皂甘诱导细胞凋亡分别是19.65±4.77%,15.32±3.24%,12.64±2.23%(见图2)。结果表明:随着剂量增加大剂量西洋参茎叶总皂甘可明显降低凋亡,与以往文献报道一致[7](p<0.01)。
3 讨论
细胞凋亡又称细胞程序性死亡(PCD)是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束生命的过程,它是一个主动的、高度有序的基因调控过程[8]。随着对细胞凋亡的深入研究,除两条经典死亡受体活化和线粒体损伤介导的传导通路细胞凋亡,近来研究发现过度内质网应激可启动一条新的细胞凋亡信号传导通路[9],内质网功能紊乱将导致细胞Ca2+失衡以及错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集,从而导致内质网应激[10,11,12]。内质网应激可特异性激活Caspase-12.Caspase-3等下游效应蛋白酶,它不同于前两条经典途径,短期的内质网应激有保护细胞作用,但长期的内质网应激将激活一些凋亡信号分子如Chop、JNK、Caspases,可引起细胞凋亡[13]。因此有关细胞凋亡的检测方法也得到广泛发展,流式细胞仪自20世纪70年代后开始应用,细胞凋亡检测从细胞核到细胞膜,从单一色到多色,根据细胞光散射性质结合特异性荧光,细胞发生凋亡时出现特异性变化。在许多细胞凋亡早期会出现胞质内Ca2+浓度迅速持续升高[14]。Annexin V是一种分子量为35-36KD的Ca+依赖性磷脂结合蛋白,在细胞凋亡早期细胞膜磷脂酸丝氨酸外翻细胞膜外表面[15]可与标志的Annexin V-FITC结合[16],利用这一特性可以检测细胞凋亡[17]。但此时细胞膜是完整的而检测核DNA的PI不能进入细胞核。应用流式细胞仪将细胞分为4个亚群区分正常组细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡及死亡细胞比率。本研究采用Raynal P等[18]建立双标记的流式细胞术结合Annexin-FITC/PI荧光染色进行西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤结果与报道一致[19]。高剂量西洋参茎叶总皂甘降低在缺氧/复氧后心肌细胞凋亡率,应用流式细胞仪检测西洋参茎叶总皂甘通过抑制过度内质网应急降低细胞凋亡具有快速、准确、信息量大的特点。为深入发展研究细胞凋亡机制,提供更加直观、敏锐的方法。
摘要：利用流式细胞仪观察西洋参茎叶总皂甘通诱导大鼠心肌细胞后内质网应急引起细胞凋亡。选用原代培养心肌细胞,将心肌细胞分为正常细胞对照组,缺氧/复氧组和缺氧/复氧后加入西洋参茎叶总皂苷组。按照40mg/L,80mg/L,160mg/L浓度培养24h后,应用流式细胞仪采用Annexin-V/PI诱导凋亡。结果显示应用流式细胞仪检测最终浓度为160mg/L西洋参茎叶总皂苷凋亡率明显低于缺氧/复氧组。流式细胞仪检测由内质网应急诱导细胞凋亡对研究细胞凋亡的机理提供一种快速、准确检测方法。
细胞缺氧 篇3
1 材料与方法
1.1 实验试剂
人脐静脉内皮细胞HUVEC和EAhy926(中科院上海细胞生物学研究所);DMEM培养基(Hyclone公司);胎牛血清(FBS)(Gibco公司);BCA试剂盒、核蛋白提取试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒和谷胱甘肽(GSH)试剂盒(南京建成生物工程研究所);抗体(Santa Cruz公司);PVDF膜和ECL化学发光试剂(Millipore公司);TRIzol试剂盒和逆转录试剂盒(Invitrogen公司)。
1.2 分组及处理方法
HUVEC和EAhy926细胞分为对照组、模型组和1%、1.5%、2%异氟烷预处理组。对照组细胞正常培养;IH模型细胞参照Hoffmann等[6]的方法,于5%CO2和95%N2(O2<1%)中37℃培养5 min,再正常培养5 min,每天循环6 h,共4 d;异氟烷预处理组细胞分别用溶解在DMEM中1%、1.5%、2%异氟烷处理3 h后进行IH处理。
1.3 MTT法测定细胞活力
细胞以1×105个/m L接种于96孔板,同“1.2”项方法培养,加5 g/L MTT 20μL培养4 h,弃培养基后加DMSO 150μL溶解结晶。用全自动酶标仪检测490 nm吸光度。重复3次。
1.4 GSH水平、LDH活性及MDA含量测定
细胞培养液离心后取上清,按相应试剂盒说明书测GSH水平、LDH活性和MDA含量,重复3次。
1.5 SOD活性测定
细胞用0.25%胰酶消化,离心,PBS溶解沉淀,超声破碎,按SOD试剂盒说明书测SOD活性,重复3次。
1.6 Real-time PCR检测
TRIzol法提取细胞总RNA,逆转录合成c DNA,定量PCR扩增,扩增体系:SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL,上下游引物各0.5μL,2μL c DNA,dd H2O 7μL。反应条件:94°C,2 min;94°C,30 s;62°C,30 s,30个循环;72°C,5 min。低氧诱导因子(HIF-1α)上下游引物为5'-ATCTGAGGACACGAGCTGCCT-3'和5'-CA-GAAGGACTT-GCTGGCTGATC-3',产物368 bp;核转录因子-B(NF-κB)上下游引物为5'-CTGATGTG-CACCGACAAGTGG-3'和5'-GTT-GATGGTGCTC-AGGGATGAC-3',产物353 bp。各样品复管2次。β-actin为内参。基因表达量由2-ΔΔCt法获得。
1.7 Western blot检测
Trizol抽提细胞总蛋白,用核蛋白提取试剂盒提取核蛋白,BCA法测蛋白浓度。10μg蛋白经10%SDS-PAGE分离并转膜,封闭1 h,分别加入HIF-1α、NF-κB、GAPDH或TBP一抗,4℃孵育过夜,洗膜,加二抗,室温孵育2 h,GAPDH为HIF-1α的内参,TBP为NF-κB的内参,用ECL系统进行化学发光和观察。重复3次。
1.8 统计学方法
采用统计软件SPSS 22.0对数据进行分析,正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 异氟烷增加IH内皮细胞存活力,降低LDH活性
与对照组比较,模型组吸光度值降低,LDH活性均升高,差异有高度统计学意义(P<0.01)。与模型组比较难,随着异氟烷浓度的增加吸光度值增加,LDH活性下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。
注:与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;LDH:乳酸脱氢酶
A:各组细胞存活力;B:各组细胞LDH活力;与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;LDH:乳酸脱氢酶
2.2 异氟烷降低IH内皮细胞MDA含量
与对照组比较,模型组MDA含量增加,差异有高度统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,随着异氟烷浓度的增加MDA含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。
2.3 异氟烷升高IH内皮细胞SOD活性和GSH水平
与对照组比较,模型组培养基中SOD活性和GSH水平显著降低,差异有高度统计学意义(P<0.01),异氟烷预处理显著升高SOD活性和GSH水平,差异有统计学意义(P<0.05),且随着异氟烷浓度的增加SOD活性和GSH水平均升高。见表3、图3。
注:与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;MDA:丙二醛
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;MDA:丙二醛
2.4 异氟烷对IH内皮细胞HIF-1α和NF-κB表达的影响
q RT-PCR和Western blot结果表明:与对照组比较,模型组HIF-1α和核内NF-κB均高表达,差异有高度统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,随着异氟烷浓度的增加内皮细胞HIF-1αm RNA和蛋白表达均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),而NF-κB m RNA和蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、5。
3 讨论
OSAS机体处于IH环境中,产生大量氧自由基,形成氧化应激状态[7]。OSAS可导致诸多心脑血管疾病,病理基础是血管内皮受损,而IH是引起血管内皮受损的核心环节[8]。本实验用HUVEC和EAhy926细胞IH模拟OSAS IH,模型组吸光度降低,LDH活性升高,表明细胞氧化呼吸功能受损,细胞膜通透性增加。
全身麻醉后OSAS患者术后呼吸系统并发症风险很高[9]。麻药的选择对OSAS患者的安全至关重要。异氟烷是临床常用挥发性卤代麻醉药[10],具有抗氧化的特性,保护细胞DNA损伤[11]。异氟烷预处理对多种器官可产生保护作用。据报道,异氟烷对脑[12]、心脏[13]、心肌[14]、肾[15]、肝和肺[16]等器官缺血再灌注损伤均有保护作用。鉴于缺血再灌注与IH有相似之处,本研究探讨异氟烷对IH内皮细胞的作用,发现异氟烷预处理可降低细胞IH损伤。血管内皮细胞功能异常是引发心血管疾病的关键,内皮细胞缺氧可产生大量活性氧,损伤血管。异氟烷可提高IH脐静脉内皮细胞SOD活性和GSH水平,降低氧自由基,保护细胞。
注:与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;SOD:超氧化物歧化酶;GSH:谷胱甘肽
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;A:各组细胞SOD活性;B:各组细胞GSH水平;SOD:超氧化物歧化酶;GSH:谷胱甘肽
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;A:各组HUVEC细胞m RNA表达;B:各组HUVEC细胞蛋白表达;HIF-1α:低氧诱导因子;NF-κB:核转录因子-B
与对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01;A:各组EAhy926细胞m RNA表达;B:各组EAhy926细胞蛋白表达;HIF-1α:低氧诱导因子;NF-κB:核转录因子-B
OSAS合并心脑血管疾病发病机制复杂,NF-κB依赖的炎性通路和HIF-1依赖的适应性通路尤为重要[17,18]。NF-κB在胞浆内与IκB结合,无活性;受到炎症介质和应激反应等刺激后解离,NF-κB活化入核,促进炎症因子转录。据报道IH可升高EAhy926中NF-κB表达[19]。HIF-1广泛存在于人和哺乳动物细胞内,低氧时才稳定表达[20],能激活200多个基因调控缺氧应答[21]。HIF-1由受缺氧调控的HIF-1α和细胞内稳定表达的HIF-1β组成,只有二聚体才能发挥作用。缺氧时HIF-lα表达增多,与HIF-1β结合入核,激活促血管内皮生长因子、促红细胞生成素和一氧化氮合酶等基因转录[22]。HIF-1α可降低缺血再灌注损伤中线粒体氧化应激的产生,其下游效应因子已糖激酶Ⅱ也可阻止缺血再灌注损伤造成的线粒体功能障碍[22]。结果发现:IH HUVEC和EAhy926细胞HIF-1α和核内NF-κB表达升高,而异氟烷预处理能够升高细胞HIF-1α表达,降低NF-κB表达,提示其可抑制氧化应激所致的炎症损伤。
综上所述,异氟烷可降低细胞IH损伤,为其用于OSAS患者的麻醉提供依据。然而异氟烷在降低细胞IH损伤的同时,是否有其他副作用,还有待深入研究。
摘要：目的 探讨异氟烷对间歇缺氧(IH)人脐静脉内皮细胞的作用。方法 HUVEC和EAhy926细胞分为对照组、模型组及1%、1.5%、2%异氟烷预处理组,测定细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽(GSH)水平,采用Real-time PCR和Western blot法检测低氧诱导因子(HIF-1α)和核转录因子-B(NF-κB)的表达。结果 与对照组比较,模型组细胞活力、SOD活性和GSH水平降低,LDH活性、MDA含量、HIF-1α和NF-κB表达升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,异氟烷预处理组的细胞活力、SOD活性、GSH水平和HIF-1α表达,增加LDH活性、MDA含量和NF-κB表达降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 异氟烷能清除细胞氧自由基,上调HIF-1α表达,下调NF-κB表达,提示其能降低IH引起氧化应激和炎性反应,减轻内皮细胞IH损伤。
细胞缺氧 篇4
1 材料与方法
1.1 试验药物与试剂
苦参素(南京泽朗医药科技有限公司,批号:20141025,纯度≥98%);舒血宁注射剂(神威药业有限公司,7.0 mg/2 m L,批号:Z14030182);DMEM培养基、小牛血清(美国Gibco公司);MTT(美国Sigma公司);谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CPK)含量测定试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);caspase-3单抗(碧云天生物技术有限公司);RNA提取液TRIzol试剂盒(北京Trans Gen公司);c DNA逆转录试剂盒(上海斯信生物科技有限公司);B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2S相关X蛋白(bax)的上下游引物(上海博亚生物公司)。
1.2 实验动物
清洁级SD大鼠1 d~3 d乳鼠[8],雄性,购自河北省实验动物中心,许可证号:SCXK(冀)2008-1-003,动物批次号:20150324。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞分离与培养
参照闵清等[8]报道的方法,无菌条件下开胸取心脏并剪取心室组织,剪碎后加入0.1%的胰酶,37℃振荡消化6 min,去上清,沉淀继续用0.1%胰酶于37℃振荡消化6 min,直至组织碎块消化完毕,收集消化上清液,1 500 r/min离心10 min,取沉淀物,加入心肌细胞培养基(10%胎牛血清DMEM,内含105 U/L青霉素和链霉素),垂打均匀,立壁1.5 h。收集未贴壁细胞,调整细胞至6×108个/L,接种于35 mm培养器皿中,37℃,5%CO2,100%湿度,培养72 h,用于实验。
1.3.2 分组与H/R模型制备
取经培养72 h后状态良好的原代乳鼠心肌细胞,随机分为空白对照组、缺氧/复氧(H/R)模型对照组、OMT(20μg/m L、40μg/m L和80μg/m L)干预组和舒血宁注射液(SXN,100μg/m L)干预组(阳性对照组),每组设10个复孔。除空白对照组外,其余各组均参照闵清等[4]的方法制备H/R损伤肌细胞模型:弃去培养基,每孔加入预先以95%N2、5%CO2混合气饱和15 min无糖台氏液2 m L;敞盖放入缺氧盒内,通入95%N2、5%CO2混合气,流速1 L/min;15 min后,夹闭进气管和出气管,将缺氧盒置于细胞培养箱内2.5 h,此过程为缺氧。打开缺氧盒,取出培养皿,吸出上清液,每孔加入2 m L 2.5%胎牛血清DMEM培养基,置于培养箱内继续培养2 h,此过程即为复氧。复氧后各组立即给药进行干预,干预时间为6 h。
1.4 检测指标
1.4.1 细胞存活率检测
将各组细胞分别接种于96孔培养板内(n=8),每孔加入噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/m L)2 0μL,3 7℃孵育4 h后弃上清,每孔加入150μL二甲基亚砜(LDMSO),振荡15 min后用酶标仪测定波长490 nm处的OD值,各组取平均值,然后计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.4.2 AST、CPK、LDH含量检测
分别取各组心肌细胞培养液,按照试剂盒操作方法步骤,通过全自动生化分析仪平行测定各组细胞培养液中AST、CPK、LDH活性。
1.4.3 SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量检测
弃去培养基取细胞,每孔加入2 m L磷酸盐缓冲溶液(PBS),通过超声波细胞破碎仪冰浴中处理30 s,经3 500 r/min低温(4℃)离心10 min后取上清液,然后按试剂盒操作方法步骤,通过紫外-可见分光光度计平行测定各组细胞裂解液中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。
1.4.4 细胞凋亡检测
用不含EDTA的胰酶(0.25%)消化细胞,离心后弃上清液,经PBS溶液洗涤两次后,按照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒操作方法步骤:加入5 0 0μL Binding Buffer、5μL Annexin V、5μL PI,混匀,室温避光孵育10 min后采用流式细胞仪进行检测,观察各组细胞凋亡情况并在流式二维图中计算凋亡率。
1.4.5 bcl-2mRNA、Bax mRNA表达的检测及bcl-2/Bax表达比值的计算
从基因库中查阅大鼠bcl-2、Bax基因c DNA序列,应用Oligo软件程序设计上、下游引物;bcl-2引物:上游5'-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3',下游5'-TGATTT GACCATTTGCCTGA-3';Bax引物:上游5'-ATCCAGGATCGAGCAGGGAGGATGG-3',下游5'-AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3';β-actin引物:上游5'-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3',下游5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3'。常规消化并收集各组细胞,加入适量TRIzol试剂提取总RNA,测定总RNA浓度,取1μgRNA反转录为c DNA,然后进行PCR反应,扩增完毕后,取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像仪观察并照相。以β-actin为内参,通过灰度值进行半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达,并计算bcl-2/Bax比值。
1.4.6 caspase-3蛋白表达检测
低温离心取细胞后经PBS溶液洗涤3次,超声波细胞破碎仪冰浴中处理30 s,12 000 r/min低温(4℃)离心20 min取沉淀,通过BCA法进行蛋白定量,蛋白变性后上样、电泳:待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜、春红溶液染色,室温下5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗(caspase-3,β-actin)4℃过夜;洗膜,二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色,实验结果应用Quantity One软件进行分析。
1.5 统计学处理
采用SPSS15.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析;计数资料采用χ2检验;以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组细胞存活率比较
与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞存活率显著降低(P<0.01);与SXN干预组H/R模型对照组比较,OMT 40μg/m L、80μg/m L干预组乳鼠心肌细胞存活率显著升高(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。详见表1。
%
2.2 各组细胞培养液心肌酶含量比较
与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH含量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH含量显著降低(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。详见表2。
2.3 各组细胞抗氧化酶活性和MDA含量比较
与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低且MDA含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞中SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低(P<0.05或P<0.01),其中OMT80μg/m L干预组GSH-Px活性显著升高(P<0.05),差异有统计学意义。详见表3。
2.4 各组心肌细胞状况
通过流式细胞术分析发现:H/R模型对照组乳鼠心肌细胞凋亡细胞数量较正常对照组明显增多,而经OMT40μg/m L、80μg/m L干预6h能明显减少凋亡细胞数量;计算凋亡率发现,与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。详见图1和表4。
注:A为空白对照组;B为H/R模型对照组;C为OMT 20μg/m L干预组;D为OMT 40μg/m L干预组;E为OMT 80μg/m L干预组;F为SXN100μg/m L干预组。
%
2.5 各组心肌细胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA和bcl-2/Bax比较
经RT-PCR检测并进行半定量分析发现:与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞中bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达均显著升高(P<0.05或P<0.01),但bcl-2/Bax表达比值显著降低(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞中bcl-2mRNA表达显著升高且Bax mRNA表达显著降低,bcl-2/Bax表达比值显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表5。
2.6 各组心肌细胞caspase-3表达
通过Western blot方法检测发现:与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞caspase-3表达量显著升高(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞caspase-3表达量显著降低(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。详见图2和表6。
注:A为空白对照组;B为H/R模型对照组;C为OMT 20μg/m L干预组;D为OMT 40μg/m L干预组;E为OMT 80μg/m L干预组;F为SXN100μg/m L干预组
3 讨论
冠心病急性心肌梗死已逐步发展成为严重危害人类生命健康的主要疾病之一,通过溶栓、介入手术等使冠状动脉恢复血流供应,可极大降低心肌梗死病人死亡率,但再灌注损伤严重影响病人愈后。缺血再灌注损伤病理机制复杂,至今尚未明确。近年来随着病理生理学研究的深入,发现再灌注后出现的氧化应激损伤及继发细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发生发展过程的重要环节[9,10,11],为今后研发抗心肌缺血再灌注损伤药物提供方向。
OMT是一种具有多种药理学作用的喹诺西啶类生物碱;舒血宁注射液具有扩张血管、改善微循环的功效。本实验通过分离培养并建立缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞模型、以舒血宁注射液为阳性对照研究发现,OMT能有效改善缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞形态、提升细胞存活率并抑制其凋亡率,提示OMT对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞具有保护作用。
心肌酶学检查是诊断心肌细胞损伤的重要技术手段,临床上多以血清中AST、CPK、LDH含量水平升高作为心肌细胞损伤诊断指标[12]。SOD被称为体内防御氧自由基损伤的第一道屏障,它能提供氢原子配体而催化还原氧自由基生成过氧化氢[13],且在GSH-Px或CAT催化下能进一步生成对人体无害的水和氧[14];心肌组织脂质过氧化终产物MDA含量能间接反映心肌细胞氧化应激损伤程度。本实验研究发现,OMT干预组能显著降低乳鼠心肌细胞培养液中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量,提高抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性并降低MDA含量,提示OMT能有效提高缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞自由基清除能力、降低氧化应激损伤。
bcl-2和Bax基因都属于Bcl-2基因家族,其中bcl-2为抑凋亡基因、Bax为促凋亡基因,二者间相互作用、共同调控细胞凋亡过程[15];进一步研究发现,细胞凋亡调控可能更依赖于bcl-2/Bax表达比值,bcl-2/Bax比值越低,提示凋亡状况严重[16]。半胱天冬酶(caspases)蛋白家族是细胞调控基因中非常重要的成员,其中caspase-3参与细胞凋亡的启动以及整个过程的调节。徐强等[17]研究发现cspsase-3激活并介导的心肌细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要机制之一。本实验发现,OMT干预能有效上调缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞bcl-2 mRNA表达,下调Bax mRNA表达,提高bcl-2/Bax表达比值,并下调caspase-3表达,提示OMT具有抑制缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡的作用。
细胞缺氧 篇5
1 材料和方法
1.1 材料
人乳腺癌MCF-7细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所。DMEM细胞培养基购自上海立菲生物技术有限公司。胎牛血清购自BI生物科技公司。Transwell小室购自美国康宁生物科技公司。BD基质胶购自上海前尘生物公司。Trizol裂解液购自美国Ambion生物公司。莫洛尼鼠白血病病毒 (Moloney murine leukemia virus, MMLV) 逆转录试剂盒, SYBR green试剂盒均购自美国Invitrogen公司, miR-210及其内参U6 RNA的引物也由该公司设计并合成。miR-210基因逆转录聚合酶链反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 引物序列为5’-GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGG ATACGACTCAGC C-3’, 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 上游引物序列为5’-GTGCAGGGTCCGAG GT-3’, 下游引物序列为5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’。U6基因RT-PCR引物序列为5’-AACGCT-TCACGAATTTGCGT-3’, PCR上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’, 下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。二氯化钴购自美国Sigma公司。二甲基亚砜购自北京百灵威科技有限公司。4%多聚甲醛固定液购自北京Solarbio科技有限公司。
1.2 MCF-7细胞常规培养由10%胎牛血清, 1%的青霉素-链霉素双抗混合液 (10 000 U/m L) 及达尔伯克氏必需基本培养基 (dulbecco's minimum essential medium, DMEM) 高糖培养基组成完全培养液, 在37℃、5%二氧化碳的细胞培养箱中进行MCF-7细胞的培养, 每隔1~2 d更换培养液一次, 待细胞90%融合时常规传代。
1.3 实验分组
取70%~80%融合的细胞, 分为缺氧组和对照组。缺氧组分为4个处理组, 依次加入含二氯化钴终浓度为50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L的完全培养液;对照组加入含等剂量磷酸盐缓冲液的完全培养液, 两组均置于CO2孵箱中湿润培养24 h, 留做Transwell侵袭实验。根据Transwell侵袭实验结果筛选出侵袭力最强的处理组, 与对照组一起重复之前的处理过程后, 留做PCR实验。
1.3 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力
Transwell上室加入100μL无血清DMEM培养基制备的细胞悬液 (密度为5×105个/m L) , 下室加入含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基500μL, 37℃、5%CO2培养箱中培养36 h。取出上室, 用棉签轻轻擦去上室未转移细胞和基质胶, 切下聚碳酸酯膜, 浸入4%多聚甲醛液中固定30 min, 用磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline, PBS) 清洗3次, 常规苏木素染色, 中性树胶封片。在100倍倒置显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞, 每个样本随机计数5个视野, 以穿过基质膜的细胞总数为指标评价乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力, 计算出平均值, 每组重复试验3次。
1.4 实时荧光定量PCR检测miR-210基因表达
使用Trizol提取200μmol/L二氯化钴缺氧组和对照组细胞的总RNA, 紫外分光光度计测定RNA的纯度与浓度, 琼脂糖凝胶电泳观察RNA完整性, 以miR-210为目的基因, 以U6 RNA为内参照基因, 取2μg浓度和纯度符合要求的RNA, 采用特异性茎环引物逆转录后, 行RT-PCR检测, 体系为20μL, 反应条件为95℃预变性10 min;95℃15 s;58℃60 s;72℃90 s;45个循环。以2-△△CT (△△CT=△CT缺氧组miRNA-△CT对照组miRNA, △CT=CT miRNA-CT U6 RNA) 表示miR-210的相对表达量。重复试验步骤至少3次。
1.5 统计学处理
应用SPSS 17.0软件分析数据, 数据以±s表示, 各组细胞穿透基底膜数量比较均采用单因素方差分析 (Analysis of single variance, ANOVA) , 二氯化钴浓度与各实验组细胞穿透基底膜数量的相关性采用皮尔森相关系数分析, 两组乳腺癌细胞miR-210表达量比较采用t检验分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 缺氧对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响
不同终浓度的二氯化钴处理组 (50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L) 穿膜细胞数分别为 (168.60±7.50) 、 (276.73±9.79) 、 (320.27±8.66) 、 (516.87±9.51) 个/视野, 均高于对照组 (65.60±2.58个/视野) , 差异有统计学意义 (P<0.01) , 各缺氧组穿膜细胞数组内比较, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。且伴随缺氧剂浓度的升高, 细胞侵袭力不断增强, 呈正相关性 (R=0.978, P=0.000) 。在观测范围内, 200μmol/L二氯化钴处理组穿膜细胞数达到最大, 见图1。
a为对照组, b为50μmol/L二氯化钴组, c为100μmol/L二氯化钴组, d为150μmol/L二氯化钴组, e为200μmol/L二氯化钴组
2.2 缺氧微环境中miR-210的表达
将对照组miR-210的表达水平定为1.00。同对照组相比, 200μmol/L二氯化钴缺氧组miR-210的表达显著升高, 相对表达量为7.82±1.53, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 说明特异性的缺氧环境可以有效的促进人乳腺癌MCF-7细胞miR-210的表达, 见图2。
3 讨论
缺氧是人类实体肿瘤中普遍存在的现象, 肿瘤细胞的恶性增殖以及肿瘤组织中血管结构的变异都可以引起肿瘤微环境的缺氧, 并且与肿瘤的进展有着密切的关系。二氯化钴可稳定细胞内低氧诱导因子 (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α) 的表达, 常被用作缺氧诱导剂。本实验采用二氯化钴来模拟机体内真实的缺氧微环境, Transwell侵袭实验结果显示, 不同终浓度的二氯化钴处理组 (50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L) 穿膜细胞数分别为 (168.60±7.50) 、 (276.73±9.79) 、 (320.27±8.66) 、 (516.87±9.51) 个/视野, 均高于对照组 (65.60±2.58) 个/视野, 且随缺氧程度的升高, 穿膜细胞数也逐步增多, 表明缺氧微环境有效的促进了乳腺癌细胞的侵袭, 且细胞的侵袭能力会随着缺氧的加重而逐步增强, 本研究进一步证实缺氧可以导致乳腺癌MCF-7细胞侵袭力增强, 且癌细胞的侵袭能力与其所处微环境的缺氧程度二者之间呈正相关, 或至少在一定的缺氧程度范围内是正相关的。
缺氧诱导肿瘤细胞侵袭力增强可能涉及多种分子机制, 而miRNAs是近些年肿瘤学研究的热点之一, 随着研究的深入有望进入临床成为新的治疗靶点。miR-210是一个独立的显著受HIF-1调控的缺氧型核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) 分子, 低氧引起的miR-210表达的上调与肿瘤及心血管疾病的发生发展关系密切。miR-210与乳腺癌的关系也很密切, 有研究发现miR-210在转移性乳腺癌中的表达明显升高[1]。还有研究表明, miR-210在三阴性乳腺癌中显著高表达, 这可能与该类患者易出现复发和远处脏器转移有关[2]。Toyama等[3]的研究也证实三阴性乳腺癌患者miR-210的高表达提示预后不良。本实验RT-PCR检测miR-210的变化显示, 缺氧组miR-210的相对表达量明显增高, 说明缺氧微环境可以有效促进MCF-7细胞miR-210的表达。结合Transwell实验结果可以推论, miR-210参与了在缺氧条件下乳腺癌细胞侵袭力增强这一过程。这些研究提示miR-210可以作为乳腺癌细胞缺氧与否的一种判断指标, 进而有望应用于乳腺癌患者的诊断参考及预后评判[4]。张楠等[5]的研究也发现miR-210在乳腺癌组织和细胞中过表达, 转染miR-210 inhibitor后乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱, 提示miR-210可能会成为乳腺癌治疗的一个新的靶点, 而它的抑制剂可能会对乳腺癌的治疗产生重要的作用。
参考文献
[1]Volinia S, Galasso M, Sana ME, et al.Breast cancer signatures for invasiveness and prognosis defined by deep sequencing of microRNA[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109 (8) :3024-3029.
[2]Radojicic J, Zaravinos A, Vrekoussis T, et al.MicroRNA expression analysis in triple-negative (ER, PR and Her2/neu) breast cancer[J].Cell Cycle, 2011, 10 (3) :507-517.
[3]Toyama T, Kondo N, Endo Y, et al.High Expression of MicroRNA-210 is an Independent Factor Indicating a Poor Prognosis in Japanese Triple-negative Breast Cancer Patients[J].Jpn J Clin Oncol, 2012, 42 (4) :256-263.
[4]陈俊青, 王晓稼.微小RNA在乳腺癌转移及预后评估中的作用[J].肿瘤学杂志, 2014, 20 (3) :238-243.
细胞缺氧 篇6
Co Cl2是常用的化学性缺氧诱导剂,作为一种螯合剂,可以与线粒体中的细胞色素氧化酶结合抑制氧化磷酸化过程,阻止线粒体产生ATP,使线粒体内呼吸障碍,从而达到细胞缺氧的目的。该方法简便易行,不能进行肿瘤缺氧环境的定量研究是其不足之处。肿瘤瘤体自外向内,缺氧逐渐加重,在不同的缺氧环境,肿瘤的生物学行为自然也有所不同。基于以上认识,本实验参照文献[3],结合本校实验室条件,以培养液氧分压为标准,模拟体内肿瘤不同程度的缺氧环境,建立简单、稳定可靠的离体缺氧模型,比较各缺氧梯度对HT-29细胞生长活力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
人结肠癌细胞株HT-29由重庆医科大学病理生理教研室提供;RT-PCR试剂盒(杭州博日);含4.8%氧(O2)、90.2%氮(N2)和5%二氧化碳(CO2)三元混合气体;含7.2%O2、87.8%N2和5%CO2三元混合气体;含2.4%O2、92.6%N2和5%CO2三元混合气体;含1.2%O2、93.8%N2和5%CO2三元混合气体;HACH溶解氧测定仪;四甲基偶氮唑盐(MTT)(上海华舜公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 溶解氧测定仪实时动态监测
制作缺氧检测装置由一次性胸腔闭式引流瓶改制而成,瓶内加入10%FBS/RPMI-1640培养液。瓶盖有2孔,1个为入气口,另1个为出气口,入气口接塑料管,其长度以距瓶内液面1 cm为宜。
将该装置置于37℃的水浴箱内,溶解氧测定仪探头放入培养液进行实时动态监测。经检测,常氧、37℃下培养液氧分压为116.20 mbar(87 mm Hg)。分别从入气口输入含7.2%O2、87.8%N2、5%CO2或含4.8%O2、90.2%N2、5%CO2或含2.4%O2、92.6%N2、5%CO2或含1.2%O2、93.8%N2、5%CO2混合气体(流量3 L/min),溶解氧测定仪实时动态监测培养液氧分压的变化。
1.2.2 自行设计缺氧培养装置
粗输血针在4side-locked密闭盒转注4孔,502胶封闭四周,输血针尾接输液管,三通阀。4孔分别用作入气口,出气口,接真空泵,抽吸培养液。缺氧条件参照文献[3]并稍作改进,将密闭的缺氧培养装置置于37℃恒温水浴箱内,真空泵反复3次抽尽装置内空气,打开出气口阀门,从入气口输入上述混合气体20 min(流量3L/min),气体达到平衡后,减少混合气流量至0.1L/min以维持装置内缺氧状态,缺氧组细胞置于该装置内培养。
1.2.3 细胞培养及细胞形态学观察
HT-29细胞在10%FBS/RPMI-1640培养液中贴壁生长,以0.1%胰酶传代。分为对照组和缺氧组,缺氧组依据体内肿瘤瘤体内的氧分压分布又分为PO230 mm Hg、PO220mm Hg、PO210 mm Hg和PO25 mm Hg 4个梯度组。对照组细胞置于常氧下、37℃、5%CO2的培养箱内培养;缺氧组细胞置于上述装置内培养。缺氧培养24 h后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化并拍照。
1.2.4 细胞处于缺氧状态的验证
实验分组及处理条件同1.2.3。RT-PCR检测不同氧环境下HT-29细胞HIF-1αm RNA的表达。在Gen Bank查询H IF-1α基因序列(NM-001530),用Primer 5.0软件自行设计引物序列,上游引物为:5′-CCCTGCAGTA GGTTTCTGCT-3′;下游引物为:5′-CTCAAAGTC GGACAGCCTCA-3′,预计扩增片段为390 bp。内参β-actin的上游引物为:5'-TTGTAACAAACTGGGAC GATATGG-3';下游引物为:5'-GATCTTGATCTTCAT GGTGCTAG-3',预计扩增片段为764 bp。反应条件为:94℃变性3 min,94℃变性45 s,55℃退火复性45s,72℃延伸45 s,共32个循环后再72℃延伸5 min。凝胶内PCR产物在Bio-Rad的UⅥ图像处理系统上分析、计算。
1.2.5 MTT检测缺氧对HT-29细胞增殖活性的影响
细胞培养及分组同1.2.3。收集对数生长期HT-29细胞,胰酶消化制成5×104个/m L细胞悬液,以200μL/孔接种于96孔板,常氧下、37℃、5%CO2培养24 h待细胞贴壁。缺氧培养6、12、24、48和72 h,对照组在常氧下培养相同时间。同时设不加细胞的背景对照,每组设8个复孔,实验重复3次。到达预设时限点时,每孔加入(5 mg/m L)MTT溶液20μL,37℃孵育4 h。弃旧液,每孔加入150μL DMSO,37℃,水平振荡5 min,酶联免疫检测仪于波长570 nm处测定各孔吸光度(A570)。扣除背景对照的A570值即代表存活细胞数量,绘制细胞生长曲线。
1.3 统计学处理
计量资料以表示,用SAS 9.0统计软件进行统计学处理,数据显著性检验采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 溶解氧测定仪实时动态监测结果
在37℃、密闭的环境,输注低氧混合气体后,10%FBS/RPMI-1640培养液的氧分压迅速下降,各时间点氧分压与注气前氧分压比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。在输注20 min后,氧分压达到最低点,此后再延长注气时间,氧分压再也不降低,注气20 min与注气30 min之间的差异无统计学意义(P>0.05)。在输入7.8%、4.8%、2.4%和1.2%O220min后,10%FBS/RPMI-1640培养液的PO2分别恒定于30、20、10和5 mm Hg,见图1。
2.2 不同氧环境下HT-29细胞HIF-1αmRNA的表达
缺氧培养6 h后,RT-PCR结果显示:对照组及缺氧各梯度组均分别在390 bp和764 bp处出现特异性的HIF-1α条带和内参照β-actin条带。HT-29细胞HIF-1αm RNA的表达随培养液PO2的降低逐渐上调,于PO220 mm Hg时达到最高点。此后随着PO2的进一步降低,HIF-1αm RNA的表达有所下降,但其表达水平仍高于对照组。结果表明细胞处于缺氧状态,离体缺氧模型构建成功(图2)。
2.3 缺氧下HT-29细胞的形态学变化
在倒置显微镜下观察,缺氧培养24 h后,PO230 mm Hg、PO220 mm Hg和PO210 mm Hg梯度组的细胞形态与对照组相似,HT-29细胞呈梭形,贴壁伸展生长,有较长的伪足,折光率高。PO25 mm Hg梯度组细胞数减少,伪足回缩,细胞皱缩为圆形,胞核固缩,染色体致密,折光率减弱,贴壁能力下降,部分脱落漂浮于培养液中(图3)。
2.4 缺氧对HT-29细胞增殖的影响
PO220 mm Hg梯度组HT-29细胞的(A570)值除6 h时段外,明显高于对照组,与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)。PO230 mm Hg、PO210mm Hg梯度组HT-29细胞的(A570)值也高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。PO25 mm Hg梯度组HT-29细胞的(A570)值最低,除6 h时段外,各时段(A570)值明显低于其他各组,增殖活性受到显著抑制。各组中,以PO220 mm Hg梯度组HT-29细胞的(A570)值最高,增殖活性最强。生长曲线见图4。
3 讨论
缺氧是在实体瘤的发生中逐渐形成的。肿瘤细胞呈克隆性生长,其起源为单个突变的恶性细胞。然而,从单个细胞起源的肿瘤,若没有新生血管的形成,其生长是有限度的,瘤体直径在达到200～300μm前,靠肿瘤细胞群周围毛细血管的氧弥散尚能维持其生长。此后,肿瘤组织诱导新生血管生成以维持氧供。但肿瘤组织内的毛细血管分布不均匀并且有缺陷,经常出现氧供中断现象,其周围毛细血管的氧有效弥散又不能满足肿瘤快速生长增殖的需要,处于瘤体中心的细胞便处于相对缺氧的状态[4]。缺氧通常在距离功能性血管100～150μm处发生,在肿瘤组织的不同区域,缺氧程度有所不同,肿瘤组织的氧分压为0～20 mm Hg,肿瘤中心的氧分压最低,而正常组织则为40 mm Hg以上,缺氧乃实体肿瘤物理微环境的基本特征[5,6]。
由于实体瘤所处的物理微环境是缺氧的,肿瘤是在缺氧的环境下发生、发展、乃至恶性演进的。对缺氧下肿瘤细胞生物学行为的探讨已逐渐成为肿瘤学研究的热点。离体缺氧模型由于研究的对象是活细胞,有利于排除体内众多的干扰因素,并能较好地模拟体内肿瘤细胞的缺氧环境,具有良好的统一性,可控性,便于观察和记录,已经成为肿瘤缺氧研究常用的技术手段。
离体缺氧模型按细胞培养液的氧剥离速度,可分为快速缺氧和慢性缺氧。快速缺氧以化学性缺氧为代表,即通过药物阻止能量的产生,如氰化物可通过与细胞色素氧化酶紧密结合抑制氧化磷酸化过程,阻止线粒体产生ATP。此模型的优点是无需特殊设备,制备迅速,可在正常空气环境下检测细胞,缺点是与真实缺氧有一定差异,并且对缺氧程度不能量化。国外常使用特殊的缺氧培养箱,使细胞迅速达到缺氧状态,该方法精确且能迅速达到缺氧的目的,却需要较为昂贵的缺氧培养箱,国内大多实验室不具备此条件。慢性缺氧一般是将无菌石蜡油覆盖于培养液的表面,使培养液与空气隔离,细胞不断消耗油层下的氧气,从而达到慢性缺氧的状态。
本研究参考文献[3]结合实验室条件,用溶解氧测定仪实时监测,摸索出在37℃、密闭的环境,持续低流量灌注7.2%、4.8%、2.4%和1.2%O2低氧混合气体,10%FBS/RPMI-1640培养液氧分压分别恒定于30、20、10和5 mm Hg。此外,本研究所采用的混合气体含有5%二氧化碳,在缺氧培养时,缺氧培养装置置于37℃的恒温水浴箱内,以保持与普通二氧化碳培养箱的培养条件一致。既往有关缺氧的研究大多单纯以输注气体的氧浓度或完全无氧为标准。本实验根据瘤体内氧分压分布,设立PO230 mm Hg、PO220 mm Hg、PO210 mm Hg和PO25 mm Hg 4个梯度组,以培养液氧分压为标准,建立离体缺氧模型,该模型更切近体内瘤体的缺氧环境,此方法尚未见报道。
缺氧条件下,肿瘤相关基因的转录和表达发生变化,对缺氧作出应激反应,这些基因被称之为缺氧反应基因(hypoxia response gene,HRG),HRG中备受关注的是HIF-1α。HIF-1α是广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子,在缺氧下特异性地表达上调[7]。为验证设计的离体缺氧模型的有效性和可靠性,本研究用RT-PCR方法检测HT-29细胞HIF-1αm RNA的表达。由于HIF-1α表达有很强的时间依赖性,本研究选择缺氧6 h作为观察点。实验结果表明,缺氧各梯度组的低培养液氧分压均可诱导HIF-1αm RNA的表达上调,表明细胞处于缺氧状态,离体缺氧模型构建成功。该模型无需昂贵的缺氧培养箱,具有操作方便,制备迅速,效果可靠,重复性强的特点。离体缺氧模型的成功构建为后续实验奠定了坚实的基础。
缺氧对肿瘤的影响是多方面的。严重缺氧导致线粒体氧化磷酸化受到抑制,ATP生成减少,造成细胞膜Na+-K+泵、钙泵功能低下和胞浆内蛋白质合成、脂肪代谢障碍等,引起无氧糖酵解过程的活化。酵解会使细胞酸中毒,溶酶体破裂,并损伤核染色质,导致细胞死亡。实验中笔者发现,培养液氧分压降低均可诱导HIF-1αm RNA的表达上调,其中以4.8%O2(PO220 mm Hg梯度组)的表达最高,此后随着O2浓度的降低,HIF-1αm RNA的表达有所下降,分析其原因可能是在严重缺氧时,细胞能量代谢发生障碍,活性受到抑制所致。MTT结果显示:在PO25 mm Hg梯度组,随着缺氧时间延长,HT-29细胞的生长增殖受到明显抑制。在倒置显微镜下,也观察到严重缺氧直接对HT-29细胞产生的损伤性形态改变。
在MTT法细胞增殖活性的测定中,与对照组常氧状态相比,缺氧程度较轻微时,在适度缺氧的应激下,PO230 mm Hg梯度组细胞增殖加快,但差异不显著。随着缺氧的应激加强,细胞的增殖进一步加快,PO220 mm Hg梯度组HT-29细胞的增殖活性显著高于对照组。但当缺氧进一步加重后,缺氧对细胞的损伤便占主导作用。PO210 mm Hg组HT-29细胞的增殖活性在缺氧的损伤下急转下降;在PO25mm Hg缺氧梯度,增殖活性受到显著抑制。各组中,以PO220 mm Hg梯度组HT-29细胞的(A570)值最高,增殖活性最强。在倒置显微镜下,也观察到PO220 mm Hg梯度组HT-29细胞的生长状况与对照组相似。因此,在适度的缺氧下,肿瘤细胞能对外界环境的缺氧应激作出适应性反应,相关的缺氧反应基因表达上调,诱导细胞增殖加快,通过刺激增殖和细胞保护而使肿瘤细胞在缺氧环境中长期生存。肿瘤瘤体内PO220 mm Hg位于瘤体边缘,提示:位于瘤体边缘的肿瘤细胞在缺氧的诱导下增殖活性更强。这为后续深入探讨该缺氧水平下肿瘤细胞的侵袭能力及其机制奠定了基础。
摘要：目的 模拟体内肿瘤不同程度的缺氧环境,建立简单、稳定可靠的离体缺氧模型,比较各梯度缺氧对HT-29细胞生长活力的影响,以筛选出最适HT-29细胞生长的微缺氧环境。方法 制作缺氧检测装置,灌注不同氧浓度的混合气体,溶解氧测定仪实时动态监测培养液氧分压的变化;RT-PCR检测低培养液氧分压下HT-29细胞HIF-1α mRNA的表达,以检验细胞是否处于缺氧状态;倒置相差显微镜下观察缺氧各梯度组HT-29细胞的形态变化;MTT检测各梯度缺氧对HT-29细胞增殖的影响,描绘细胞生长曲线。结果 输入7.8%、4.8%、2.4%和1.2%氧(O2)后20min,10%FBS/RPMI-1640培养液的氧分压(PO2)分别恒定于30、20、10和5mmHg。缺氧各梯度组HIF-1α mRNA的表达均较对照组明显上调,尤以PO220mmHg组为著。PO230mmHg、PO220mmHg和PO210mmHg梯度组HT-29细胞的形态与对照组相似;而PO25mmHg梯度组则出现损伤性形态改变,其(A570)值最低;PO220mmHg梯度组(A570)值则显著高于对照组。结论 该实验成功构建离体缺氧模型。在适度缺氧下,缺氧的应激作用,可能使相关缺氧反应基因表达上调,诱导细胞增殖加快,通过刺激增殖和细胞保护使肿瘤细胞在缺氧环境中长期生存。而严重缺氧导致增殖受到抑制,细胞形态出现损伤性改变。在对照组和缺氧的4个梯度组中,PO220mmHg组处于缺氧的应激和损伤作用的平衡点,其生长活力最好。肿瘤瘤体内PO220mmHg位于瘤体边缘,提示:位于瘤体边缘的肿瘤细胞在缺氧的诱导下增殖活性更强。这为后续深入探讨该缺氧水平下肿瘤细胞的侵袭能力及其机制奠定了基础。
关键词：缺氧,离体缺氧模型,细胞增殖
参考文献
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细胞缺氧 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
实验中用到的3 d龄SD大鼠 (SPF级, 雌雄不计,体重8~10 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2007-0001],充入的氮氧混合气体(8%O2+92%N2) 由首都医科大学附属北京友谊医院(以下简称“我院”)提供,本实验室自制封闭容器。
1.2 缺氧模型的建立
实验所用到的3 d龄SPF级SD大鼠, 日常在我院SPF级动物房饲养,条件如下,照明时间;黑暗时间=12 h∶12 h,温度:23~25℃,湿度保持在40%。将乳鼠随机分为两组:对照组和缺氧组,每组各24只,对照组不做处理, 缺氧组放入本实验室自制容器,在37℃水浴中充以氮氧混合气 (O2占8%),持续时间为90 min,之后回笼,继续行母乳喂养。
1.3 大鼠脑组织标本获取
分别于缺氧模型建立后第1、3、7、14、21天和第28天6个时间点处死两组大鼠 , 其中每个时间点对照组和缺氧组大鼠各4只,每组大鼠的左侧脑组织立即放入10%的中性福尔马林溶液固定,之后进行切片、备用,右侧大脑立即放入液氮保存,用于进行Westernblot检测。
1.4 HE 染色
将脑组织用10%的中性福尔马林液中固定8 h,依次放入20%、30%蔗糖溶液分别过夜(24~48 h)沉底,组织沉底之后即可进行冰冻切片,切片厚度为12μm,进行HE染色,参见既往发表文章[9],拍照保存。
1.5 Western blot 检测 ERK-1 表达量
预冷RIPA蛋白抽提试剂, 加入蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail(Roche)。按组织重量9倍比例加入裂解液,冰上用组织匀浆器进行匀浆3次。冰上进行孵育20 min后,4℃15 000 r/min离心20 min,取上清,分装深低温冰箱保存,按照BCA蛋白定量试剂盒(cwbiotech)测定蛋白浓度。之后进行蛋白PAGE凝胶电泳,10%分离胶,5%浓缩胶(丙烯酰胺,双丙烯酰胺,TEMED,Amresco)。电泳条件:浓缩胶恒压90 V,约20 min;分离胶恒压130 V,通过预染蛋白Marker(Biomed)来确定电泳停止时间。湿转法 ,转膜条件 :300 m A恒流 ;0.45μm孔径PVDF膜 (Millipore),转膜时间1 h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色,观察转膜效果。之后将膜完全浸没TBST溶液中(含5%脱脂牛奶),室温下摇床孵育1 h。将膜与ERK-1一抗(Santa cruz)或者β-actin一抗(Santa cruz,封闭液稀释)一起孵育,ERK-1的一抗稀释浓度1∶500,β-actin的一抗稀释浓度1∶1000,4℃冰箱过夜。次日TBST洗膜3次。二抗孵育:羊抗兔Ig G HRP(1∶20 000),孵育40 min(在室温),洗膜。滴加ECL,反应3 min;曝光,显影,定影。照相,用Lab Works软件对图像进行灰度分析,计算出每个样本的ERK-1灰度值与相应的β-actin的灰度值,取其比值进行计算,并进行统计学分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验 ;计数资料用率表示 ,组间比较采用χ2 检验 ,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠乳鼠缺氧后表现
缺氧后早期大鼠出现兴奋症状的表现: 躁动不安、翻滚,呼吸加深加快,45 min~1 h后逐渐出现抑制症状:反应迟缓淡漠、间断发作的痉挛、抽搐等。最后进入比较稳定的反应淡漠期,此反应一直持续至缺氧完成,恢复氧供后乳鼠反应逐渐恢复正常。
2.2 HE 染色结果
对照组大鼠脑组织结构清晰, 海马锥体细胞致密、完整,缺氧组大鼠海马锥体细胞核淡染、甚至细胞核缺如,见图1。
2.3 两 组大鼠 不同时间点 细胞外 信号 调节蛋白激酶 1表达情况比较
缺氧组ERK-1表达呈现动态性变化, 与对照组相比, 缺氧后ERK-1表达量基本处于低于正常对照的水平,但是与对照组的变化趋势趋于一致,第14天时ERK-1的表达较对照组有所升高, 到第21、28天时ERK-1的表达与对照组比较又有所降低。虽然有变化趋势,但是经过统计学t检验分析,差异均无统计学意义(P > 0.05),具体见表1,图2、3。
3 讨论
缺氧性脑损伤的病理发生是一个多因素的复杂过程,在此过程中,众多分子参与其中,ERK-1蛋白在脑内广泛存在,是脑功能活动中重要的信号转导分子[10],ERK-1接受刺激信号后活化为磷酸化的ERK-1,从胞浆转位至胞核,通过磷酸化转录因子等途径发挥细胞调节作用。脑缺血再灌注损伤中有ERK-1广泛参与, 但其所发挥的是保护性作用还是损伤性作用,目前仍存在很大争议[11,12,13]。有文献报道, 自由基清除药———依达拉奉可以通过激活ERK-1来减轻缺氧/复氧诱导的神经元损伤中毒[14]。Ban等[15]的研究发现抑制ERK-1能够恶化肠缺血/再灌注损伤。缺氧发生之后ERK-1的表达模式如何尚不明确, 本研究通过探讨缺氧发生后ERK-1的动态表达模式来进一步明确缺氧发生过程中ERK-1的可能作用,研究发现,缺氧后脑组织ERK-1表达水平呈现动态变化, 缺氧后第1天开始ERK-1表达降低, 一直到缺氧后第7天达到表达的最低值,之后出现表达情况的上升,缺氧后第14天时表达高于正常情况, 表达情况一直持续到缺氧后第21天达到最高峰,但是低于正常情况,缺氧后第28天时表达又有所降低。根据折线图可以看出,ERK-1在大鼠乳鼠发育过程中呈现一种动态模式的表达情况, 存在一个表达高峰和一个表达低谷,提示ERK-1在细胞的正常发育过程中也发挥着重要作用,缺氧组的ERK-1的表达总体比正常情况低下,虽然经过分析差异无统计学意义(P > 0.05),但是存在降低的趋势,提示在大鼠乳鼠脑组织缺氧损伤过程中ERK-1也存在剂 量的变化 。需要进 一步研究ERK-1基因与其他缺氧相关的基因 , 如缺氧诱导因子(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)等基因表达的相互关系,从而更加明确其参与缺氧脑损伤过程的作用机制。
摘要：目的 通过了解细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)在缺氧脑损伤大鼠脑中的表达,了解其参与缺氧脑损伤的过程。方法 48只3 d龄新生SD大鼠,随机分成2组:对照组和缺氧组,每组各24只,缺氧组SD大鼠置于自制密闭容器中,充以含8%氧气的氧氮混合气体,时间为90 min,对照组SD大鼠不进行处理。分别于造模后6个时间点——1、3、7、14、21 d和28 d后留取两组SD大鼠脑组织,采用Western blot检测ERK-1总蛋白在脑组织中的表达情况。结果 缺氧组大鼠脑组织ERK-1呈现动态表达;变化规律:在缺氧早期(缺氧后1~7 d),ERK-1总蛋白的表达均有降低的趋势,缺氧后第14天开始其表达具有升高的趋势,缺氧后第21天和第28天ERK-1表达量又有所下降,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 缺氧造成新生大鼠脑损伤时,ERK-1总蛋白的表达谱没有明显变化的趋势,提示在早产儿缺氧性脑损伤时ERK-1并不通过剂量的变化对缺氧后脑组织损伤进行调节。