非结核分枝杆菌（精选10篇）
非结核分枝杆菌 篇1
结核分枝杆菌复合群和麻风分支杆菌以外的非结核分枝杆菌 (non tuberculous mycobacteria, NTM) 引起的疾病称为非结核分枝杆菌病, 主要引起肺部病变, 亦可侵犯淋巴结、皮肤、软组织和骨骼系统。近年随着检验技术的发展, NTM感染检出率呈增加趋势, NTM肺病和肺结核的临床表现相似, 且抗酸杆菌培养均为阳性, 临床易将NTM肺病误诊为肺结核而导致治疗迁延, 故早期诊断意义重大。现收集2004-2012年经临床确诊的18例NTM肺病的CT图像作一回顾性分析, 旨在探讨其CT影像表现特点, 为临床诊疗提供参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组18例NTM肺病患者均有完整的CT资料, 均经过临床及细菌学分离、培养、菌型鉴定而确诊, 符合我国关于非结核分枝杆菌肺病的诊断标准[1]。其中男10例, 女8例;年龄32~76岁, 平均48岁, 40岁以上14例。临床主要症状:咳嗽、咳痰12例, 咯血丝痰或咯血4例, 乏力10例, 低热8例, 盗汗7例, 消瘦2例, 胸痛1例。合并糖尿病2例、矽肺1例, 本组无合并艾滋病者。
1.2 CT检查方法
使用GE Prospeed FⅡ双螺旋和GE 64排Light speed VCT螺旋CT扫描机, 常规自肺尖至肺底螺旋扫描, 120 k V, 200 m As, 层厚5 mm。13例加HRCT扫描或重建:层厚1.0 mm或0.625 mm, 骨算法重建。
2 结果
2.1 NTM肺病CT表现
结节状影:本组18例均可见大小不等结节状影, 呈散在多发, 密度略高, 周边欠光整。其中<1 cm小结节共11例, 1~3 cm结节6例, >3 cm块状影1例, 可见晕征4例。另可见9例“树芽征”, 表现为直径2~4 mm的小叶中心密度增高结节影和与之相连的分支线状影, 状如树芽。
斑片状影:16例可见斑片状浸润影, 大小不等、形态不规则、境界欠清、密度不均, 其中中等密度的斑片影9例, 密度较低的磨玻璃影3例, 密度较高的斑片实变影4例, 其中可见支气管通气征4例。
支气管扩张:13例合并支气管扩张, 其中柱状扩张7例、囊状扩张4例、囊柱状混合型扩张2例, 未见静脉曲张样扩张。累及上叶8例, 其中左上肺舌段2例;累及右肺中叶3例, 下叶2例。
空洞:11例可见空洞, 薄壁空洞7例, 厚壁空洞4例, 内壁光整9例, 略毛糙2例, 未见偏心空洞, 1例洞内见少许液平。空洞<3 cm者9例, >3 cm者2例, 最大5 cm;多发空洞8例, 单发空洞3例, 空洞周边见浸润病灶的6例。
纤维条索影:11例可见纤维条索影, 长度>2 cm者较多, 粗细不均, 境界清楚, 密度较高, 走行较僵直。
胸膜病变:胸膜肥厚8例, 胸膜钙化1例, 只1例见少量胸水。
其他改变:小叶中心型肺气肿7例, 肺内病灶见有钙化的3例, 本组未见肺门及纵隔肿大淋巴结。
本组病例以多种病变共存, 上述3种以上主要病变混杂共存者共15例 (15/18) , 占83%;其中以结节或斑片状影、空洞、支气管扩张混杂共存者最多, 占72% (13/18) 。
2.2 NTM肺病影像分布特点
两肺多叶受累共16例, 上叶病变明显比下叶多, 累及上叶17例, 下叶2例, 右肺中叶受累3例, 左肺上叶舌段2例。
3 讨论
3.1 临床表现
临床主要症状为咳嗽、咳痰、低热和疲乏, 偶有咯血。NTM的毒力较结核菌低, 临床症状大多较轻, 有些患者可无明显临床症状和体征, 多在机体抵抗力低下时发病。其临床症状、影像表现和实验室检查都与肺结核十分相似, 如果只进行痰涂片及分枝杆菌的培养而忽视菌型鉴定, 极易误诊为肺结核, 有的患者因此长期按照肺结核进行抗结核药物治疗, 而NTM肺病对抗结核药物耐药非常常见, 治疗效果差而列为肺结核难治病例[2]。
3.2 影像特点
本组病例显示, NTM肺病CT影像主要表现为结节影、树芽征、斑片状影 (磨玻璃影、斑片实变影) 、空洞、支气管扩张及纤维条索影, 多种病变同时累及多个肺叶是该病的特点, 文献[3-4]报道结节、实变和支气管扩张同时存在提高了非结核分支杆菌肺部感染的可能性, 本组中以结节或斑片状影、空洞、支气管扩张混杂共存者最多, 占72% (13/18) , 上叶病变比下叶多, 本组上叶受累94% (17/18) , 上述所见与文献报道基本相同。
3.3 鉴别诊断
总结以上特点, 结合文献, NTM肺病与肺结核的鉴别要点: (1) NTM肺病以40岁以上男人多见, 肺结核患者年龄和性别无特殊关系;NTM肺病患者家庭接触史少, 人与人间的感染罕见, 而肺结核患者接触史较明显, 人群间感染为其特点。 (2) NTM肺病结节以<1 cm小结节较多, 散在多发, 分布不均, 少见弥漫性粟粒, 弥漫性粟粒更多见于肺结核;>3 cm以上的块状影亦少, 结节内少见钙化, 这一点, 与肺结核不同。弥漫性支气管扩张、右肺中叶及左上肺舌段支气管扩张多见于NTM肺病, 由普通细菌感染引起的支气管扩张以双肺下叶多见, 结核引起的支气管扩张多分布于上肺尖后段及下叶背段[5]。NTM肺病空洞性病变主要为多发薄壁空洞, 洞内少见液平, 空洞直径常比结核性空洞小, 本组50%以上空洞<3 cm, 所以较大、壁较厚的空洞更多见于结核性[6]。NTM肺病钙化、胸腔积液较肺结核少, 本组肺内钙化占17%, 胸腔积液只占6%, 且为少量。肺门及纵隔淋巴结肿大较少见[6,7], 本组均未见。 (3) 由于NTM的毒力较结核菌低, 病变要比活动性肺结核进展缓慢, 可维持多年不变或缓慢发展, 临床表现大多轻微, 而感染的时间较长, 所以容易出现影像表现严重而临床症状较轻的“影像临床背离”现象。
综上所述, NTM肺病具有一定特点, 但单从影像上难以和继发型肺结核区别, 当初次影像学表现为结节、斑片样影、空洞及支气管扩张等主要征象同时存在且累及多个肺叶时, 或难治性肺结核患者具备上述表现时, 应考虑到NTM肺病的可能, 应及早行痰培养及菌型鉴定以明确诊断。
摘要：目的:探讨非结核分枝杆菌肺病CT表现特点及其与肺结核病的鉴别要点。方法:回顾性分析经临床确诊的18例非结核分枝杆菌肺病的CT表现特点。结果:CT上最常见为结节影, 本组18例均可见;其次为斑片状影16例、支气管扩张13例、空洞及纤维索条各11例。以上病变均以多种形态混杂共存, 多数为两侧多叶散在分布, 双肺累及12例, 2个肺叶及以上受累16例;上叶比下叶多, 上叶受累17例。结论:非结核分枝杆菌肺病的CT主要表现结节影、斑片状影、支气管扩张、空洞及纤维条索, 影像表现具备一定特点, 但单从影像上和继发型肺结核鉴别困难, 多种性质病变同时累及多个肺叶是该病的特点, 当出现上述表现或临床规则抗结核治疗疗效欠佳时, 应考虑到非结核分支杆菌肺病的可能。
关键词：非结核分枝杆菌肺病,CT
参考文献
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非结核分枝杆菌 篇2
模块三,临床细菌学
学习任务二 第14章 分枝杆菌、放线菌与诺卡菌 【学习目标】
1.掌握结核分枝杆菌的基本特性及实验室检查方法 2.熟悉结核分枝杆菌的临床意义 3.了解分枝菌属的分类 【教学重难点】
重点：结核分枝杆菌的基本特性及实验室检查方法 难点：实验室检查方法 【教学方法】 讲授+自主+讨论 【导入新课】
复习前面的内容、提问及一些关于结核杆菌的故事，临床上对结核病的检测依据是是什么，通过什么样的检查才能尽快尽早对病情进行临床诊断，这就是我们今天要学习的内容。【教学内容】
第14章 分枝杆菌 放线菌与诺卡菌 概 述
分枝杆菌与放线菌属放线菌目（Actinomycetates）
分枝杆菌属（Mycobacterium）是一类细长略带弯曲专性需氧性杆菌。该菌一般认为革兰染色阳性。多数细菌在生长的一定时期抵抗酸-醇（acid-alcohol-fast），故又称抗酸杆菌（acid-fast bacillus）
放线菌（Actinomyces）是一群在生物学特性上与细菌类同的原核细胞型微生物，与分枝杆菌、棒状杆菌等有着亲缘关系
放线菌是多数不致病，对人致病的主要有放线菌属和诺卡菌属。
前者为厌氧或微需氧菌，细胞壁中不含分枝菌酸，多引起内源性感染。
后者为需氧菌，细胞壁中含有分枝菌酸，非人体正常菌群的成员，常引起外源性感染。
第一节 结核分枝杆菌
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）简称结核杆菌、人和动物结核病的病原菌
一、分 类 MTB包括
人结核分枝杆菌（M.tuberculosis）
牛分枝杆菌（M.bovis）
非洲分枝杆菌（M.africanum）
坎纳分枝杆菌（M.canettii）
田鼠分枝杆菌(M.microti)等
前四种对人类致病，其中人型MTB感染率最高
二、临床意义
大约1/3的人口已感染MTB 有2000万活动性结核病患者
每年新发病900万人，死于结核病300万人
近年来，AIDS的发病率上升，AIDS患者又极易患结核病，结核病已成为威胁人类健康的一个严重的全球性公共卫生问题 WHO已把结核病与AIDS、疟疾一起列为人类的最主要杀手
(一)所致疾病
通过呼吸道、消化道和损伤的皮肤等多途径 感染机体，引起多种脏器的结核病，其中以肺结核为多见(二)免疫性
有菌免疫或称传染性免疫 细胞免疫
迟发型超敏反应(三)变异
• 结核分枝杆菌易发生形态、菌落、生长温度、毒力以及耐药性的变异
• 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）是有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株 • 现已广泛用于人类结核病的防治 •
二、临床意义(四)耐药性
• 对常见抗菌药物天然耐药
• 多重耐药结核病(multiple-drug resistance tuberculosis，MDRTB)是指对2种或2种以上的抗结核药产生耐药性的结核菌感染。临床治疗相当棘手，死亡率很高
三、微生物学检验
（一）基本特性
结核分枝杆菌尚未发现产生内毒素、外毒素及侵袭性酶
• 致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、代谢物质的毒性以及菌体成分引起的免疫损伤有关
• 结核分枝杆菌的致病物质主要是荚膜、脂质和蛋白质
（二）标本采集
• 据感染部位的不同采集不同的标本
• 疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检
• 疑泌尿系结核：清晨一次全部尿量或24小时尿沉淀10～15ml送检，必要时作无菌导尿送检（诊断泌尿道结核通常需3～5份标本）
• 采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检
• 其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养
（三）标本直接检查
1.形态学检查
（1）直接涂片染色镜检
（2）浓缩集菌涂片检查法
2.核酸检测 • 形态学检查
• 齐-尼染色（Ziehl-Neelsen technique）是常用的抗酸染色法，染色后结核分枝杆菌呈红色，背景呈蓝色 • 形态学检查
• 用荧光染料金胺“O”染色，在荧光显微镜下菌体呈橘黄色 • 用PCR法快速诊断MTB感染
• PCR法检测DNA特异性更强，敏感性更高
• PCR须按法规要求规范操作，应防止标本污染出现假性结果
（四）分离培养与鉴定
1.培养特性
– 专性需氧 – 3％～5％CO2能促进其生长
– 营养要求高:须在含血清、卵黄、马铃薯、甘油以及含某些无机盐类的特殊培养基上才能生长良好。常用罗氏培养基
– 最适生长温度为35～37℃，最适pH6.5～6.8 – 14～18h分裂1次，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落
– 典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样
2.分离培养
• 标本接种于选择性培养基中(常用罗氏，所含的孔雀绿或青霉素可抑制杂菌生长)• 37℃，5％～10％CO2培养8周
• 结核杆菌出现干燥呈颗粒状、灰白色菌落 • 涂片染色为抗酸阳性 •
三、微生物学检验 3.菌种鉴定(1)生化反应
（2）噬菌体鉴定法
（3）分子生物法菌种鉴定
(4)高效液相色谱（HPLC）检测分枝菌酸
• 生化反应--烦琐、费时（4～8 周）,影响因素多 • 结核分枝杆菌不发酵糖类 • 能产生触酶
• 人型MTB能合成烟酸，还原硝酸盐，耐受噻吩-2-羧酸酰肼，而牛型MTB则不能 • 人型和牛型的毒株中性红试验均阳性，无毒株则为阴性，并失去索状生长现象 • 噬菌体鉴定法（PhaB）
• Wilson 等于1997年建立的快速检测新技术
• 原理：是分枝杆菌噬菌体D29能感染活的分枝杆菌,未进入感染菌体内的噬菌体被随后加入的杀毒剂灭活 ,已进入菌体内的噬菌体不受影响。噬菌体在感染菌体内大量增殖 ,并将菌体裂解 ,释放出的子代噬菌体可感染随后加入的指示细胞 ,并将其裂解 ,在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。
• 分子生物法菌种鉴定
• PCR 限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）• PCR单链构象多态性分析（PCR-SSCP）• 核酸探针 • 核酸序列分析 • 多重PCR • 高效液相色谱（HPLC）
• 检测分枝菌酸：由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，所以利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。•
三、微生物学检验
（五）免疫学诊断 1．结核菌素试验
2．结核分枝杆菌抗原检测 3.结核分枝杆菌抗体检测 4.全血干扰素测定法
结核菌素试验
• 针对旧结核菌素(OT)与结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)两种菌体蛋白
• 原理：当将蛋白注入皮内后，如受试者已感染结核杆菌，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，在局部释放淋巴因子，形成迟发性超敏反应性炎症，若受试者未感染MTB则无反应。结核分枝杆菌抗原检测
• 用ELISA 方法在血清中检测结核分枝杆菌抗原-结核菌外分泌特异性抗原(external secreted specific antigen)浓度。
• 任何体液如血液、痰液、脊髓液、尿液和各式组织萃取液等体液可用于检测特异蛋白抗原。结核抗体
• 作为活动性MTB感染的快速诊断方法之一
• 比传统的痰涂片抗酸染色、MTB培养等方法简便、快速、敏感性高，但存在一定的假阳性。•近年，胶体金、蛋白芯片检查结核杆菌IgG抗体抗体，特别是后者，针对三种抗原（脂阿拉伯甘露糖、38K Da和16K Da蛋白质抗原），其灵敏度和特异性均有所提高。全血干扰素测定法
• 原理：当全血与PPD和对照抗原（植物血凝素）共同孵育后，致敏的淋巴细胞可分泌IFN-γ，通过检测IFN-γ的含量来鉴定菌种。
• 2004年，Quantiferon-TB Gold assay 问世，应用结核分枝杆菌RD1区域编码的早期分泌抗原靶（ESAT）和培养滤液蛋白（CFP-10）特异抗原刺激细胞检测。
•近来ESAT/CFP-10融合蛋白-ELISPOT用于诊断活动性结核病，准确、灵敏、特异、快速。• 结果与结核菌素试验相当，干扰因素小。
（六）药物敏感性试验
• 将纯培养物菌悬液，接种含各种浓度药物的固体培养基上，同时做不含药物的对照组。• 经过培养，含有药物的培养基上菌落数目是对照组的75％以上，则认为该菌对该药物浓度为完全耐药，如无菌落生长则为敏感。
【小结】
结核分枝杆菌为专性需氧，营养要求较高。生长缓慢，在固体培养基上2～5周才出现肉眼可见的菌落。典型菌落为粗糙型，表面干燥呈颗粒状，不透明，乳白色或淡黄色，如菜花样。微生物检验包括染色镜检、核酸检测、分离培养、鉴定试验、免疫学诊断和药物敏感性试验。
【课后预习】非结核分支杆菌，放线菌、卡诺菌 【课后作业】
1、如何进行结核分支杆菌的微生物学检验？
非结核分枝杆菌 篇3
【摘要】 目的：了解本地区结核分枝杆菌临床耐药性的特点以及对7种抗结核药物的药敏检测情况，为临床制定合理的治疗方案提供更多的参考依据。方法：对收集的广东顺德区555例结核患者的结核分枝杆菌用比例法对所用的7种药：异烟肼（INH，H）、乙胺丁醇（EMB，E）、链霉素（SM，S）、利福平（RFP，R）、阿米卡星（AKW，A）、左氧氟沙星（LOF，L）、对氨基水杨酸（PAS，P）进行敏感性试验，分析它们的耐药性。结果：总耐药率为33%，耐药频度由高到低依次为SM198%、INH128%、LOF86%、RFP45%、EMB36%、PAS31%、AKW14%。结论：本地结核菌的耐药性相比其他地区略偏高，应进一步加强对结核杆菌的耐药性监测以便为临床制定更合理的治疗方案提供参考依据。
【关键词】 结核分枝杆菌；耐药性；临床研究
【中图分类号】R521【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）12-0082-02
结核病是一种重大的传染病，严重威胁着人类的生命健康，同时也是死亡率最高的一种疾病[1]。随着耐药性结核病不断地呈现上升趋势，人类的生命安全正受到严重考验，中国结核病的总数位居世界前列，是严重的灾区。结核病的耐药性严重影响了我国在控制结核病方面的水平。对结核杆菌的耐药性检测，不仅可以为临床用药提供方向，还可以评价地区控制结核病的成功与否，同时也能够为未来用药指向正确的方向[2]。据此，收集的广东顺德区555例结核患者的结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验，分析本地结核菌的耐药性，为临床制定合理的治疗方案提供更多的理论参考依据，现将具体的情况报道如下。
3讨论
结核病是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。根据世界卫生组织的统计，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位。为了及时了解结核病的疫情和耐药基本情况，开展结核病耐药监测具有重要意义。根据2013年本地区的结核分枝杆菌药敏试验结果显示，我区结核病的总耐药率为33%（183/555），略高于全国27.8%的水平；总耐多药率为34%（19/555），远低于全国107%水平[3]，也明显低于全国第五次结核病流行病学抽样调查的耐多药率68%[4]的水平。这可能与不同地方菌株的耐药性不同有关。治疗管理不规范及患者治疗遗依从性差，长期被认为是最直接影响到结核病患者并使之产生耐药性的因素。结核菌对7种药物的耐药率（频度）由高到低依次为SM198%、INH128%、LOF86%、RFP45%、EMB36%、PAS31%、AKW14%。在四种一线抗结核药物中，以SM的耐药率最高，其次是INH、RFP，这和报道一致[5]，可能与早期的化疗方案是以SM、INH的组合为主，应用较普遍有关，因此在结控项目中已不再将SM应用于初治病人。至于RFP由于其抗菌谱广，在早期也曾是普遍单一使用，从而引起耐药性的增加。对于新药PAS以及AKW，它们的耐药性很低，较为敏感，提示在治疗中可以有选择性地选用这类药物。
坚持联合用药，合理选择用药和制定化疗方案是治疗耐多药结核病的重要原则[6]，在制定的方案中，应该至少包含两种以上的抗结核药物，在巩固期至少需要3种以上的药物，对于强化期，最好用5～6种药物。左氧氟沙星作为一种新型、高效率的抗菌素，不仅是广谱抗菌药物，同时还具备良好的抗结核作用，能够抑制DNA旋转酶A亚单位，以此来抑制细菌DNA的复制以及转录，从而达到抗菌作用。另外，左氧氟沙星与其他抗结核药之间没有出现交叉耐药，是目前医学上治疗耐多药结核的重要药物之一。从药敏结果可知，左氧氟沙星的耐药率较高，可能是由滥用氟喹诺酮类药物引起的，应引起足够的重视。阿米卡星在试管中对结核菌是一种高效杀菌药，通过观察，以阿米卡星联合左氧氟沙星组成的用药方案，协同效果好，而且在临床中副作用也很少，是治疗结核病的有效方案之一[7]。
综上所述，我区2013年结核病的总耐药率略高于全国278%水平。为减少和防止耐药结核病的发生，一方面在技术上要建立一种更快更准确的药敏试验方法，如引进全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪，为临床患者尽早提供合理的化疗方案；另一方面在管理上必需加强结核病患者归口管理，实行结核药物统一管理和推行全程督导化疗。
参考文献
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（收稿日期：20140428）
【摘要】 目的：了解本地区结核分枝杆菌临床耐药性的特点以及对7种抗结核药物的药敏检测情况，为临床制定合理的治疗方案提供更多的参考依据。方法：对收集的广东顺德区555例结核患者的结核分枝杆菌用比例法对所用的7种药：异烟肼（INH，H）、乙胺丁醇（EMB，E）、链霉素（SM，S）、利福平（RFP，R）、阿米卡星（AKW，A）、左氧氟沙星（LOF，L）、对氨基水杨酸（PAS，P）进行敏感性试验，分析它们的耐药性。结果：总耐药率为33%，耐药频度由高到低依次为SM198%、INH128%、LOF86%、RFP45%、EMB36%、PAS31%、AKW14%。结论：本地结核菌的耐药性相比其他地区略偏高，应进一步加强对结核杆菌的耐药性监测以便为临床制定更合理的治疗方案提供参考依据。
【关键词】 结核分枝杆菌；耐药性；临床研究
【中图分类号】R521【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）12-0082-02
结核病是一种重大的传染病，严重威胁着人类的生命健康，同时也是死亡率最高的一种疾病[1]。随着耐药性结核病不断地呈现上升趋势，人类的生命安全正受到严重考验，中国结核病的总数位居世界前列，是严重的灾区。结核病的耐药性严重影响了我国在控制结核病方面的水平。对结核杆菌的耐药性检测，不仅可以为临床用药提供方向，还可以评价地区控制结核病的成功与否，同时也能够为未来用药指向正确的方向[2]。据此，收集的广东顺德区555例结核患者的结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验，分析本地结核菌的耐药性，为临床制定合理的治疗方案提供更多的理论参考依据，现将具体的情况报道如下。
3讨论
结核病是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。根据世界卫生组织的统计，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位。为了及时了解结核病的疫情和耐药基本情况，开展结核病耐药监测具有重要意义。根据2013年本地区的结核分枝杆菌药敏试验结果显示，我区结核病的总耐药率为33%（183/555），略高于全国27.8%的水平；总耐多药率为34%（19/555），远低于全国107%水平[3]，也明显低于全国第五次结核病流行病学抽样调查的耐多药率68%[4]的水平。这可能与不同地方菌株的耐药性不同有关。治疗管理不规范及患者治疗遗依从性差，长期被认为是最直接影响到结核病患者并使之产生耐药性的因素。结核菌对7种药物的耐药率（频度）由高到低依次为SM198%、INH128%、LOF86%、RFP45%、EMB36%、PAS31%、AKW14%。在四种一线抗结核药物中，以SM的耐药率最高，其次是INH、RFP，这和报道一致[5]，可能与早期的化疗方案是以SM、INH的组合为主，应用较普遍有关，因此在结控项目中已不再将SM应用于初治病人。至于RFP由于其抗菌谱广，在早期也曾是普遍单一使用，从而引起耐药性的增加。对于新药PAS以及AKW，它们的耐药性很低，较为敏感，提示在治疗中可以有选择性地选用这类药物。
坚持联合用药，合理选择用药和制定化疗方案是治疗耐多药结核病的重要原则[6]，在制定的方案中，应该至少包含两种以上的抗结核药物，在巩固期至少需要3种以上的药物，对于强化期，最好用5～6种药物。左氧氟沙星作为一种新型、高效率的抗菌素，不仅是广谱抗菌药物，同时还具备良好的抗结核作用，能够抑制DNA旋转酶A亚单位，以此来抑制细菌DNA的复制以及转录，从而达到抗菌作用。另外，左氧氟沙星与其他抗结核药之间没有出现交叉耐药，是目前医学上治疗耐多药结核的重要药物之一。从药敏结果可知，左氧氟沙星的耐药率较高，可能是由滥用氟喹诺酮类药物引起的，应引起足够的重视。阿米卡星在试管中对结核菌是一种高效杀菌药，通过观察，以阿米卡星联合左氧氟沙星组成的用药方案，协同效果好，而且在临床中副作用也很少，是治疗结核病的有效方案之一[7]。
综上所述，我区2013年结核病的总耐药率略高于全国278%水平。为减少和防止耐药结核病的发生，一方面在技术上要建立一种更快更准确的药敏试验方法，如引进全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪，为临床患者尽早提供合理的化疗方案；另一方面在管理上必需加强结核病患者归口管理，实行结核药物统一管理和推行全程督导化疗。
参考文献
[1] 朱长太，胡忠义.结核分枝杆菌耐药性检测技术进展[J].中华结核和呼吸杂志，2011，34（10）： 768-770.
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[5] 钟球，钱明，李建伟，等.广东省WHO结核病耐药监测研究[J].中国防痨杂志，2001，23（1）：5-8.
[6] 王湘，张丽霞.2008-2010年结核分枝杆菌的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志，2011，21（20）： 4394-4395.
[7]杨彩娥，王琰，雷红，等. 结核分枝杆菌利福平依赖株与耐药株的耐药状况比较[J]. 中国防痨杂志，2011，33（3）： 9.
（收稿日期：20140428）
【摘要】 目的：了解本地区结核分枝杆菌临床耐药性的特点以及对7种抗结核药物的药敏检测情况，为临床制定合理的治疗方案提供更多的参考依据。方法：对收集的广东顺德区555例结核患者的结核分枝杆菌用比例法对所用的7种药：异烟肼（INH，H）、乙胺丁醇（EMB，E）、链霉素（SM，S）、利福平（RFP，R）、阿米卡星（AKW，A）、左氧氟沙星（LOF，L）、对氨基水杨酸（PAS，P）进行敏感性试验，分析它们的耐药性。结果：总耐药率为33%，耐药频度由高到低依次为SM198%、INH128%、LOF86%、RFP45%、EMB36%、PAS31%、AKW14%。结论：本地结核菌的耐药性相比其他地区略偏高，应进一步加强对结核杆菌的耐药性监测以便为临床制定更合理的治疗方案提供参考依据。
【关键词】 结核分枝杆菌；耐药性；临床研究
【中图分类号】R521【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）12-0082-02
结核病是一种重大的传染病，严重威胁着人类的生命健康，同时也是死亡率最高的一种疾病[1]。随着耐药性结核病不断地呈现上升趋势，人类的生命安全正受到严重考验，中国结核病的总数位居世界前列，是严重的灾区。结核病的耐药性严重影响了我国在控制结核病方面的水平。对结核杆菌的耐药性检测，不仅可以为临床用药提供方向，还可以评价地区控制结核病的成功与否，同时也能够为未来用药指向正确的方向[2]。据此，收集的广东顺德区555例结核患者的结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验，分析本地结核菌的耐药性，为临床制定合理的治疗方案提供更多的理论参考依据，现将具体的情况报道如下。
3讨论
结核病是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。根据世界卫生组织的统计，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。目前我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14.3%，位居全球第2位。为了及时了解结核病的疫情和耐药基本情况，开展结核病耐药监测具有重要意义。根据2013年本地区的结核分枝杆菌药敏试验结果显示，我区结核病的总耐药率为33%（183/555），略高于全国27.8%的水平；总耐多药率为34%（19/555），远低于全国107%水平[3]，也明显低于全国第五次结核病流行病学抽样调查的耐多药率68%[4]的水平。这可能与不同地方菌株的耐药性不同有关。治疗管理不规范及患者治疗遗依从性差，长期被认为是最直接影响到结核病患者并使之产生耐药性的因素。结核菌对7种药物的耐药率（频度）由高到低依次为SM198%、INH128%、LOF86%、RFP45%、EMB36%、PAS31%、AKW14%。在四种一线抗结核药物中，以SM的耐药率最高，其次是INH、RFP，这和报道一致[5]，可能与早期的化疗方案是以SM、INH的组合为主，应用较普遍有关，因此在结控项目中已不再将SM应用于初治病人。至于RFP由于其抗菌谱广，在早期也曾是普遍单一使用，从而引起耐药性的增加。对于新药PAS以及AKW，它们的耐药性很低，较为敏感，提示在治疗中可以有选择性地选用这类药物。
坚持联合用药，合理选择用药和制定化疗方案是治疗耐多药结核病的重要原则[6]，在制定的方案中，应该至少包含两种以上的抗结核药物，在巩固期至少需要3种以上的药物，对于强化期，最好用5～6种药物。左氧氟沙星作为一种新型、高效率的抗菌素，不仅是广谱抗菌药物，同时还具备良好的抗结核作用，能够抑制DNA旋转酶A亚单位，以此来抑制细菌DNA的复制以及转录，从而达到抗菌作用。另外，左氧氟沙星与其他抗结核药之间没有出现交叉耐药，是目前医学上治疗耐多药结核的重要药物之一。从药敏结果可知，左氧氟沙星的耐药率较高，可能是由滥用氟喹诺酮类药物引起的，应引起足够的重视。阿米卡星在试管中对结核菌是一种高效杀菌药，通过观察，以阿米卡星联合左氧氟沙星组成的用药方案，协同效果好，而且在临床中副作用也很少，是治疗结核病的有效方案之一[7]。
综上所述，我区2013年结核病的总耐药率略高于全国278%水平。为减少和防止耐药结核病的发生，一方面在技术上要建立一种更快更准确的药敏试验方法，如引进全自动快速分枝杆菌培养鉴定药敏仪，为临床患者尽早提供合理的化疗方案；另一方面在管理上必需加强结核病患者归口管理，实行结核药物统一管理和推行全程督导化疗。
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[5] 钟球，钱明，李建伟，等.广东省WHO结核病耐药监测研究[J].中国防痨杂志，2001，23（1）：5-8.
[6] 王湘，张丽霞.2008-2010年结核分枝杆菌的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志，2011，21（20）： 4394-4395.
[7]杨彩娥，王琰，雷红，等. 结核分枝杆菌利福平依赖株与耐药株的耐药状况比较[J]. 中国防痨杂志，2011，33（3）： 9.
非结核分枝杆菌 篇4
非结核分枝杆菌引起的手部感染, 在过去由于分枝杆菌培养阳性率低或基层医院条件的限制, 经培养证实的手部非结核分枝杆菌仅有零星报道, 且都是皮肤感染[1]。随着检测技术的不断进步, 越来越多的非结核分枝杆菌感染性疾病被发现并经细菌学检测得到证实, 成为了临床研究的热点[2]。目前现有的研究多数针对NTM所引起手部感染的病因、临床表现、诊断、治疗等方面进行较为全面的分析, 但在预防及护理干预方面, 在国内外鲜少涉及。美国疾病控制中心数据显示, 在所有非结核分枝杆菌所致手部特殊感染中, 海分枝杆菌占49%, 其次是鸟、堪萨斯、偶发、龟脓肿等[3]。
1 临床表现
NTM的皮肤感染是因皮肤的屏障被破坏后, 从环境中感染NTM而患病, 水和土壤是重要的传播途径。其临床表现为丘疹、斑块、脓疱、脓肿、感染性结节、弥漫性肉芽肿、炎症性硬结、窦道等。临床表现主要取决于所感染的菌种不同而异。
1.1 海分枝杆菌
其感染多发生在游泳池或海水中游泳, 长期接触海产品者, 海水养殖场的工作人员皮肤擦伤处和刺伤处, 如手、足、踝、指 (趾) 等部位的皮肤。开始为红褐色小丘疹、小结节或斑块, 其后软化脓肿破溃, 呈现浅表性溃疡, 沿淋巴管向心性发展, 很少有全身感染症状, 由于海水分枝杆菌最适生长温度为28 ℃～32 ℃, 它很少导致骨骼或大肢体的感染, 正是因为这些部位的温度相对高于肢体远端。而外周如皮肤、手等处是最常发生感染的部位[1,4]。从流行病学角度上分析, 沿海地区从事海洋渔业工作者, 尤其是经常接触海洋生物者, 是其高发人群[5]。
1.2 鸟细胞内分枝杆菌复合群
它不仅可引起肺炎, 还能导致全身扩散、淋巴结炎和皮肤感染。常伴有贫血、发热、盗汗和腹泻等症状。
1.3 堪萨斯分枝杆菌
其生长的温度范围为32 ℃～42 ℃。可引起肺部、颈淋巴结和皮肤感染, 表现为红斑、结节、脓疱、疣状、脓肿、溃疡等[6]。
1.4 偶发分枝杆菌
皮肤感染的早期, 局部病变表现为硬结、肿胀, 皮肤颜色无变化, 无明显的灼热感及疼痛。随着脓肿的形成, 皮肤色素沉着或后期呈暗褐色, 脓肿破溃后流出黄色或暗红色分泌物, 糜烂溃疡周围界线清楚, 创面直径2 cm～5 cm, 最大10 cm以上, 中心可见脓性分泌物, 呈肉芽肿样改变。
1.5 龟分枝杆菌
此类分枝杆菌感染, 可见皮内或皮下结节型、脓肿型、窦道型、混合型及发病区淋巴结感染5种类型。早期呈现红色丘疹, 逐渐增至鸡蛋大, 皮损无痛痒[7]。
1.6 脓肿分枝杆菌
脓肿分枝杆菌与偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌同属快速生长的分枝杆菌, 其临床表现基本相似, 所不同的是龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌易被老年和抵抗力差的人群感染, 而偶发分枝杆菌易被有外伤、手术史或有药物注射史的年轻人感染[7]。
Hurst 将这类型的手部感染分为三型:Ⅰ型, 皮肤出现丘疹;Ⅱ型, 皮下肉芽肿伴或不伴有溃疡;Ⅲ型, 深部感染包括腱鞘炎、滑囊炎、骨及关节炎等。但是门诊就诊的病人中没有Ⅰ型表现者, 尽管有50%的Ⅱ型损伤可能是由Ⅰ型演变而来 (这些病人可能在病变初期自行处理, 或误诊为其他疾病而局部应用类固醇激素) 。在所有病例中约30%病人有皮下肿块, 57%有腱鞘炎。NTM感染一般有2周～4周的潜伏期[8]。
2 治疗
国外多数学者认为手部分枝杆菌感染的治疗以局部创面的彻底清创结合抗分支杆菌化疗为主[9]。手部感染Ⅰ型通常是自限性的, 但也有可能会持续相当长时间才最终痊愈。抗分枝杆菌药物的应用可能会缩短治疗时间。由于NTM对大多数广谱抗生素不敏感, 这给NTM感染的预防和治疗带来了很大困难。不同种的分枝杆菌对药物的敏感性不同, 应根据分枝杆菌菌种或药敏试验结果选择相应的治疗方案。当病人长期使用单一药物防治NTM感染时, 常会导致NTM发生适应性耐药, 应采取联合选择性应用多种抗生素治疗。另外, NTM感染常为慢性感染, 病程长, 故疗程也相应较长, 一般为18个月～24 个月。常见的治疗方案是根据药敏试验选择一二种抗结核药物联合一种大环内酯类 (克拉霉素、阿奇霉素) 药物治疗[9]。Ⅱ型皮下损伤的治疗包括手术切除所有已形成的肿块并进行抗生素治疗。Hurst 等建议连续应用抗生素2个月～6个月, 后期如仍有遗留病灶, 应再次手术切除。Ⅲ型深部组织的感染在治疗上采用外科清创, 包括滑膜切除、骨质切除或关节清创[9]。深部感染的治疗对外科医生和感染病学专家都是一个艰难的挑战。恰当的清创术和抗生素治疗对于个别毒性大、破坏力强的病原体来说收效甚微。有时截指 (肢) 是唯一可以控制感染进一步发展的手段[10]。
3 护理
3.1 心理护理
需要手术治疗的病人怕失去手的功能, 影响今后的工作、婚姻、生活等, 表现出焦虑、恐惧心理。此时应耐心地向病人介绍病情, 让病人了解自己感染的程度和手术难度, 让病人正视病情, 积极配合手术, 保证手术顺利进行。
3.2 手部护理及观察
需要手术者, 由于手术病人伤前工作场所污染较重, 个人卫生条件较差, 手术前要对病人作个人卫生处理, 对伤肢进行肥皂水清洗, 包括备皮范围 (整个伤肢加腋窝) 。术后保持手部清洁, 伤口周围保持干燥, 及时换药, 操作时严格按无菌技术操作执行。护理上要求保持床单位干净整洁, 每日用0.1%过氧乙酸消毒液对床单位进行消毒, 更换垫于手下和覆盖支架上的无菌单。观察手术部位的皮肤情况, 通过对指温、皮肤颜色、毛细血管回充盈试验等观察, 监测有无感染及血液循环危象的发生[11]。
3.3 服药指导
针对不同种的分枝杆菌对药物的敏感性不同, 应根据分枝杆菌菌种或药敏试验结果选择相应的治疗方案。坚持规范用药坚持全程化疗, 不过早停药。坚持个体化给药原则, 抗结核药在人体内清除率个体差异大, 病人的年龄、性别、体重、病理、生理以及正在使用的其他药物等因素, 从而决定抗结核药的使用剂量。由于抗结核药使用周期长, 有条件的病人应定期监测血药浓度, 以便及时调整给药剂量, 适应病人个体特性。对肝肾功能受损者调整给药方案。
4 康复及预后
非结核性分枝杆菌普遍存在耐药性, 分枝杆菌的培养需要较长时间, 如果再加上缺乏临床经验, 抗生素选择不当, 常导致病程的延误, 另外, 手部感染后造成的肌腱粘连、软组织硬化、瘢痕挛缩、关节僵硬等是造成不同程度的手功能丧失甚至截指 (肢) 的主要原因[10]。因此, 手部感染除应用药物和手术治疗外, 同时进行康复治疗, 早期可控制炎症, 后期可促进创面愈合和恢复手部功能, 能明显提高手部感染的治疗效果。一般在感染初期, 感染后期 (感染处切开引流、扩创术后及慢性感染者) 配合超短波电疗、中频治疗、紫外线、高压氧 (HBO) 治疗;在感染治愈期, 针对手部关节僵硬、组织粘连等后遗症进行治疗:手部蜡疗配合关节松动手法、主动被动等运动疗法以及超声波治疗等。最终的治疗效果与患病时间长短呈负相关, 病程越短最终预后越好;病程越长, 关节及肌腱受累越严重[12]。
5 健康宣教
非结核分枝杆菌 篇5
[关键词] 结核分枝杆菌 耐药 基因突变 katG 基因
[中图分类号] R378.911 [文献标识码] A [文章编号] 1009- 6019-(2011)02-08-03
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的人类严重传染病，近年来由于耐多药结核菌的出现与扩 散以及艾滋病的广泛传播，造成结核病的广泛流行。据资料统计，全球已有600万人受到了 耐药结核分枝杆菌的感染，我国每年新发耐多药结核病患者12万例[1]。异烟肼(IN H)是临床常用的一线抗结核药物，国内外均已发现结核分枝杆菌对INH的耐药性日益严重 [2.3]。结核分枝杆菌对其耐药的分子机制涉及多个基因，其中主要是通过过氧化氢 酶-过氧化物酶的编码基因(katG)序列突变所致[3.4]。本实验通过聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法，对西安地区结核杆菌临床分离株耐INH与katG基 因突变的关系进行研究，建立快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法。
1 材料与方法
1.1 标本来源 50株结核分枝杆菌临床分离株来源于西安市结核病医院， 已按常规进行药敏试验；结核分枝杆菌H37Rv标准株来源于中国疾病预防控制中心，由西安 市结核病医院细菌室培养并保存。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 采用北京TIANGEN公司细菌基因组提取试剂盒提取基因 组，－20℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增 根据结核分支杆菌katG基因序列(GenBank：x68081)设 计引物，由于结核杆菌katG基因编码的315位氨基酸密码子最易于产生突变，因此，我们设 计针对结核杆菌katG基因进行PCR特异性扩增的引物1对，PCR产物覆盖katG基因的315位密码 子。设计扩增产物长度为193bp具体序列如下：正向引物：5′-GAGCAGATGGGCTTGGG-3′，反 向引物：5′-CGTCCTTGGCGGTGTATT-3′引物由北京奥科公司合成。在50霯反应体系中，DNA 模板5霯，上下游引物各1霯，ddH[2]O18霯，2×PCR MasterMix 25霯。PCR循 环参数如下94℃预变性3m分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，循环30次 ，最后72℃延伸5分钟。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，在193bp处出现明显条带即为扩增 阳性。
1.2.3 PCR-RFLP分析 取7靗PCR产物，2.0靗10譌astDigest Green B uffer酶切缓冲液，1.5靗 Fast Digest enzyme限制性内切酶MspⅠ(MBI公司产品)，19.5 靗去离子水，混匀后置37℃保温5min。katG基因扩增片段经酶切消化后，行2%琼脂糖凝胶 电泳，无315位密码子突变的菌株被消化后可出现148bp片段。若发生突变，则增加1个酶切 位点，酶消化后电泳可见较小的128bp片段。
1.2.4 序列测定 挑选RFLP分析中泳动条带正常与异常的菌株各1例，取 其PCR扩增产物，送北京奥科生物技术有限责任公司进行序列测定。测序结果与H37Rv标准株 进行BLAST分析[5]。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌临床分离株药敏试验 通过药敏表型检测发现，50株临 床分离结核分枝杆菌中5株为INH敏感株，45株为INH耐药株，其中9(20%)株对INH单耐药，15 (33.33%)株为耐多药，21(46.66%)株为多耐药。
2.2 PCR扩增 50株临床分离株及H37Rv标准株基因扩增后，H37Rv标准株和 50株临床分离株均得到长度为193bp的片段(图1)
1 50bp DNA Ladder；2～11 样本PCR产物；12 阴性对照
图1 katG基因PCR产物琼脂糖电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of katG PCR products
2.3 RFLP分析 以H37Rv标准株为对照，5株敏感株与标准株一致，均被限 制性内切酶MspⅠ消化为3个较小片段，电泳可见1条条带，大小约为148bp，6bp和39bp片段 由于过小故不可见。45株耐药株中，14株与标准株一致，而有31株被MspⅠ消化成4个片段， 电泳可见1条条带，大小约为128bp，6bp、20bp、39bp片段由于过小故不可见。占全部耐药 菌株的68.88%(图2)。
1 50bp DNA Ladder；2 H37Rv标准株酶切结果；
3、4、7、8 野生型；5、6 突变型
图2 katG基因PCR产物RFLP分析
Fig.2 RFLP analyses of katG PCR products
2.4 序列测定 RFLP分析中出现异常泳动带的突变标本，其katG基因315位 氨基酸密码子第2位碱基发生点突变由AGC突变为ACC，与文献报道的突变位点一致。SSCP和R FLP分析中未见异常动带的标本，其序列比对与标准株相同。
3 讨论
INH是酰肼类化学合成药物，其抗结核作用主要是抑制结核菌DNA的合成，阻碍细菌细胞壁的 合成，同时也能抑制分枝菌酸(mycolic acid)的合成，使细菌丧失耐酸性、疏水性和增殖力 而死亡。
KatG基因位于结核分枝杆菌的染色体上，其表达的过氧化氢酶-过氧化物酶是一种既有过氧 化氢酶活性又有过氧化物酶活性的热稳定的酶，在INH作用中起关键作用。过氧化氢酶-过氧 化物酶可能在细胞内将INH氧化成异烟酸，成为烟酸的类似物，参与辅酶Ⅰ的合成，使其不 能起同工酶的作用，抑制细菌细胞壁分枝菌酸的合成。使保护分枝杆菌抵抗氧化和侵袭的屏 障受到损害。若KatG缺失或突变，使过氧化氢酶-过氧化物酶活性丧失或降低，阻止INH转换 成活性形式，就会导致耐INH。近年的研究表明，KatG基因完全缺失不是细菌耐药的主要原 因，KatG基因突变才是导致细菌产生耐药性主要分子机制。在耐药性相关的基因突变中，以 315位密码子突变的检出率最高[6、7]。
本研究采用PCR-RFLP等方法[8]，对西安地区结核分枝杆菌INH耐药基因KatG进行了 检测和分析。本研究结果显示，临床INH耐药现象已非常普遍，且耐多药株比例比较高，单 独只对INH耐药的菌株很少。50株临床分离株中，5株敏感株RFLP分析均与标准株一致，没有 发生变异。而45株INH耐药株中，有31株RFLP分析异常，结果提示其变异存在于KatG基因315 位密码子AGC→ACC类型突变。本次试验中45株耐药分离株中RFLP检测突变率为68.88%，与 文献报道略高[9]。本研究提示西安地区的结核杆菌临床分离株对INH耐药与KatG基 因突变有关，尤其是315位密码子的突变占了很大比例。经挑选特异菌株测序后证实，突变 发生在KatG基因315位密码子的第2位碱基，其突变形式为AGC(Ser)→ACC(Thr)，验证了RFLP 结果的可靠性。
传统的药敏试验对结核分枝杆菌的检测时间长(4～8周)，不能及时有效指导临床用药。DNA 测序操作复杂，成本较高。PCR-RFLP可分析特定基因位点的点突变，具有高度的特异性。本 次实验采用的方法简单易行，成本较低，并且显著缩短了实验周期(1～2天)，弥补了常规药 敏试验的不足，是快速鉴定结核分枝杆菌INH耐药性的有效工具。
4 参考文献
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非结核分枝杆菌 篇6
1 临床资料
1.1 一般资料
患者,男,82岁。因“反复咳嗽、咳痰40余年,活动后气喘20年,加重3 d”于2008年10月6日收入我科。3 d前患者受凉后出现咳嗽、咳痰明显增多,咳中等量黄脓痰,轻度活动即可出现气喘、呼吸困难,伴头痛,胸闷感。无畏寒、寒战、发热,无咯血痰,胸痛等症,遂入我院行进一步治疗。入科查体:体温 36.5 ℃,脉搏 104次/min,呼吸 22次/min,血压145/86 mmHg,神志清楚、对答切题,全身皮肤无黄染,浅表淋巴结未扪及。桶状胸,双肺叩诊过清音,听诊呼吸音稍低,左下肺可闻及呼气相干性啰音,双下肺可闻及湿性啰音,腹软,无压痛、反跳痛,肠鸣音尚可,四肢无水肿。既往有慢性阻塞性肺疾病(COPD)极重度、慢性呼吸衰竭Ⅱ型、肺源性心脏病、支气管哮喘、高血压、直肠癌根治术后、前列腺增生、慢性胃窦炎等病史。入科治疗后病情得到短期控制但仍反复发作。2008年11月24日出现重症肺炎并Ⅱ型呼吸衰竭, 11月25日因病情危重行经鼻气管插管+呼吸机辅助呼吸,12月31日转为气管切开留置套管接受长期机械通气。此后多次发生VAP及泌尿系统真菌感染,每次经抗感染、解痉、平喘、祛痰、心肌保护、抑酸护胃、营养支持等积极治疗,病情好转。2010年12月15日患者出现咯血痰,量少,痰液与暗红色血液混合均匀,偶可吸出鲜血痰伴胸闷、气短,考虑吸痰时黏膜受损所致,给予云南白药口服,安络血肌注处理,疗效欠佳。至12月28日患者出现低热,体温升至37.4 ℃。
1.2 实验室检查
2010年12月28日血常规:白细胞 6.63×109,中性粒细胞81.1%,血红蛋白91 g/L。12月28日行胸片检查提示右上肺可见大片渗出灶及囊性病灶(图1)。12月31日、1月5日、1月6日多次痰涂片找抗酸杆菌阳性。2011年1月7日行分枝杆菌菌种鉴定(芯片法)示NTM,龟/脓肿分枝杆菌。2次痰培养提示脓肿分枝杆菌。
1.3 治疗及转归
2011年1月7日起予以利福平胶囊,0.45 g,每日1次,乙胺丁醇0.75 g,每日1次,克拉霉素500 mg,每日1次,口服治疗。1周后患者血痰消失。治疗期间患者反复诉头晕、恶心、四肢乏力及全身发热感,并自觉难以耐受,予以保护胃黏膜及心理安慰处理。每周予以复查肝功能无异常,每2周找抗酸杆菌均阳性。3月1日起患者出现气短,体温尚正常,查体双肺闻及哮鸣音,予以复方异丙托溴铵溶液2.5 ml+吸入用布地耐德混悬液1 mg,雾化吸入,症状减轻。2011年3月2日行胸部CT检查见右上肺及左下肺囊状无肺纹理透亮影,考虑肺大泡,对比2008年10月10日胸部CT见肺气肿及肺大泡病灶明显进展。右中上肺可见多发薄壁空洞,近胸壁处一大小约3 cm×3 cm团块影,内见蜂窝状透亮影,伴渗出灶、局部支气管扩张(图2)。为防止肺大泡破裂,调整呼吸机参数,吸气压降为20 mmHg,吸气次数调整为20次/min。3月5日患者频繁主诉胸闷、气短,胸片证实左侧气胸,即行胸腔闭式引流,终因并发休克、心跳骤停,抢救无效死亡。
2 讨论
随着我国老龄化进程的到来,机械通气一方面在老年急危重症患者救治方面发挥了重要作用,是治疗COPD慢性呼吸衰竭的主要手段,另一方面由于老年人基础疾病多,各脏器功能减退,一旦并发VAP,死亡率明显增高。因此及早明确病原学,予以及时有效治疗很重要。2000年流行病学调查显示我国NTM感染和发病率呈逐渐增多趋势[2]。一方面是由于现代微生物学检测方法的进步,另一方面各种危险因素也在增加,如感染人类免疫缺陷病毒等,医源相关性因素也不能忽视[3],因此临床上需要对NTM感染引起重视。
2.1 NTMLD易感性
目前认为NTM是条件致病菌,只有在局部或系统免疫功能受损的情况下才会发病[4]。有三类人群为NTMLD的高危人群,一是有结构性肺病的患者;二是中年、非吸烟,既往没有肺部疾患的人(包括Windermere女士综合征);三是先天或者是继发细胞免疫功能缺陷的患者,如人类免疫缺陷病毒感染、获得性免疫缺陷综合征、干细胞或者器官移植等,另外白介素-12/干扰素-γ/STAT1通路的异常[5]、人白细胞抗原等位基因[6]、CFTR基因突变[7]、SLC11A1基因多态性都能增加对NTM易感性[8]。
慢性肺部疾病会导致气道持续炎症、纤毛功能丧失、痰液成分异常、大小气道的黏液堵塞、右中叶及舌叶以支气管延长和缺乏附带通气为特征,这些因素损伤气道局部免疫功能[4]。另外与结核杆菌吸附完整气道黏膜发病不一样,体外研究发现NTM仅仅吸附在受损的气道黏膜上[9]。所以既往有COPD、肺结核、囊性纤维化、尘肺、肺泡蛋白沉积征、肺癌等有慢性肺部疾病病史的患者NTMLD发病率明显增高。本例患者高龄,既往有COPD病史20余年,机械通气2年余,由于气道黏膜受损导致NTM易吸附,加之反复使用抗生素及全身或局部使用激素,导致局部免疫功能减低,因此该患者为NTMLD的高危人群,可能进一步对患者进行诸如以上相关基因的检测,也许可以提供更有价值的资料。Wang等[10]报道67例台湾南部NTMLD患者,其中88.1%有肺部疾患,这其中61.2%是COPD患者。我们提供的病案基础疾病与之相符。因此对于临床上有结构性肺病,尤其是COPD、肺结核等合并特殊感染时,要考虑NTMLD的可能性。
2.2 NTMLD临床特点
结合此病例可总结NTMLD有以下特点:(1) 临床症状无特异性。本例患者早期主要表现为咳嗽、咯血痰,后期出现发热、气促、胸闷。谭守勇等[11]对63例NTMLD患者进行临床分析,发现所有病例均有不同程度的咳嗽、咳痰及气促等症状,其中34例有咯血(痰)症状。因此其临床症状与肺科常见病所共有。(2) 胸部影像学表现需与肺结核鉴别。本例患者发病时胸片见右上肺大片渗出灶及囊性病灶,痰中多次找到抗酸杆菌,诊断为继发性肺结核,曾予以抗痨治疗3 d。后期CT检查发现影像学为多形态混合性改变,同时发现渗出、多发薄壁空洞、右下肺支气管扩张、双侧纤维化等病变。这与肺结核的影像学还是有一定差别,后者主要以渗出、增殖、干酪性病变、空洞、纤维化、钙化性病变改变为特征。渗出灶、小结节影、薄壁空洞、支气管扩张共存是本病影像学基本特征,CT在发现、检出这些病变的敏感性和准确性方面远优于平片[12]。目前认为NTMLD影像学随菌种不同而各异。以本例培养出脓肿分枝杆菌为例,在美国该菌种是引起NTMLD第3位病原体,占快速生长菌群80%。高分辨CT显示其以多发小结节(<5 mm)及柱形支气管扩张等非空洞性病变为主[13]。Wang等[10]发现脓肿分枝杆菌出现空洞病变者仅20%,主要以伴或不伴结节渗出病变为主,占86.7%。文献报道堪萨斯分枝杆菌肺病患者中有85%～95%发现薄壁空洞病灶[14]。(3) 实验室检查需要解决两方面问题,一是如何快速检测指导临床治疗,二是如何区别感染菌、污染菌及定植菌。由于NTMLD的临床症状、X线、痰涂阳性与结核十分相似,很多患者初治给予一线抗痨治疗,但多数NTM对抗结核药物欠敏感甚至高度耐药,因此导致误诊误治。该例患者在抗酸阳性后就曾予以抗痨治疗3 d。国外报道表明,确诊NTM感染的患者预后较好,而疑似NTM感染患者预后较差[15],说明及时正确的诊断是指导治疗的关键。因此有肺结核临床表现,同时伴其他肺部基础疾病或者细胞免疫功能低下患者,在对支气管物进行结核杆菌培养,建议同时送NTM培养。NTM培养是诊断的金标准,可是培养时间长达8周不利于早期开始临床治疗。本例患者在发现痰涂阳性同时,立即送痰进行DNA微阵列芯片法进行分枝杆菌菌种鉴定。该方法具有快速、准确的特点,6 h内可以检测完毕并且直接鉴定到菌种水平,有文献报道其敏感性及特异性达100%,值得在医院推广。另外由于NTM广泛存在于自然界中,临床标本容易污染,尤其是痰标本,因此单次痰培养出NTM阳性不能肯定为非结核分枝杆菌病。ATS与IDSA对于NTMLD微生物学诊断标准建议至少2次独立痰标本NTM培养阳性、支气管刷检或灌洗液至少1次阳性才能诊断,如果培养出罕见的或者通常代表环境污染的NTM时,更要高度怀疑结果的可信性。所以临床上必须多次送痰标本进行NTM培养。总之,明确诊断必须将临床表现、影像学表现以及可信的微生物学检查结合起来,三者缺一不可。
2.3 治疗及转归
非结核分枝杆菌 篇7
1 材料
14株NTM菌株(来自吉林省),由吉林农业大学预防兽医学实验室保存,分别命名为 FJ-1～14,其中FJ-1、FJ-6、FJ-11来自猪颌下淋巴结,FJ-4、FJ-12～14来自牛颌下淋巴结,其他菌株均来自牛肠系膜淋巴结。
2 方法
2.1 DNA的提取
采用酚-氯仿抽提法提取DNA,参照标准方法进行,将提取得到的DNA于-20 ℃保存,备用。
2.2 16S rDNA片段PCR扩增
根据16S rRNA基因高变区位置[4]设计合成 1对引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成),即上游引物P1 5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3′(位于结核分枝杆菌16S rDNA 62～85位核苷酸处)和下游引物P2 5′-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3′(位于结核分枝杆菌16S rDNA 626～647位核苷酸处),以上、下游引物扩增16S rRNA基因5′端长为570 bp左右的片段。PCR反应体系(20 μL):10×Ex Taq Buffer(含Mg2+) 2 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/ L)1.5 μL,上、下游引物(10 μmol/ L ) 各0.5 μL,DNA模板1 μL,ExTaq(5 U/μL) 0.25 μL,H2O 14.25 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环;72 ℃延伸10 min。循环结束后取PCR产物3～5 μL用1.0% 琼脂糖凝胶电泳,观察扩增结果。
2.3 PCR 扩增产物纯化及序列测定
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后,应用DNA 回收试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司生产]从凝胶上回收、纯化目的片段,并送至宝生物工程(大连)有限公司测序。
2.4 16S rDNA序列分析
将16S rDNA的测序结果与GenBank上标准序列比较,从中列出与该序列最相近的细菌,相似度达99%以上者为所得到的鉴定结果[7]。用DNAMan软件对14株NTM序列与GenBank上下载的标准16S rDNA序列进行同源性比对,以及构建系统发育树。试验所用的已知NTM菌株16S rDNA序列名称见表1。
3 结果
3.1 16S rDNA片段PCR扩增结果
14株NTM菌株均扩增得到长为570 bp左右目的片段(见图1) ,与预期片段大小相符。
1～4.分别为FJ-1～4菌株PCR扩增结果;5,13.DL- 2 000 Marker; 6～12.分别为FJ-5～11菌株PCR扩增 结果; 14～16.分别为FJ-12～14菌株PCR扩增结果。
3.2 NTM菌株16S rDNA 序列分析
试验所测定的NTM菌株16S rDNA片段5′端500 bp序列既含有属特异性的保守区域,又含有2个种特异性的高变区,分别是位于120～254,388～490位核苷酸的区域。14株NTM菌株中FJ-1与FJ-3,FJ-7、FJ-8与FJ-9,FJ-4与FJ-14 16S rDNA序列重合部分完全一致,其他菌株16S rDNA序列相似水平为94.8%～99.8 %(见表2) ,具有较好的同源性。各分离菌株序列与GenBank 序列库中相同或最相似序列的比较见表3。
3.3 系统发育树构建结果
以14株NTM菌株与从GenBank上下载的5株NTM标准菌株的16S rDNA 5′端570 bp左右序列构建系统发育树(见图2),结果菌株均得到良好区分。
3.4 NTM菌株的鉴定结果
14株NTM菌株16S rDNA的测序结果与GenBank上的标准序列比较结果显示:FJ-2、FJ-6为浅黄分枝杆菌;FJ-1、FJ-3、FJ-11为偶发分枝杆菌;FJ-4、FJ-14为母牛分枝杆菌;FJ-7、FJ-8、FJ-9、FJ-10为新金色分枝杆菌;FJ-5与Mycobacterium sp. Myc399的同源性达99.5%,提示二者可能为同一种型;FJ-12与新金色分枝杆菌,FJ-13与偶发分枝杆菌同源性分别为98.8%与98.6%,显示其亲缘关系非常相近,FJ-12、FJ-13是否为分枝杆菌新种或是这些已知分枝杆菌的亚种仍需进一步确认。
4 讨论
NTM对人的感染途径有3种说法,即环境感染、动物感染及人与人之间的传染,但至今这些观点均未得到证实 [8]。有日本学者报道,可从猪、牛等多种动物体内分离出NTM,因此认为动物作为传播媒介的可能性有探讨的必要。至今,我国关于动物NTM的研究相对较少,相关报道主要集中在人医临床分离与药敏试验方面。2005年,林世平等[9]报道,从广东地区174份牛鼻腔分泌物标本中分离出88株NTM,阳性率高达50.5% ,提示在广东地区NTM可能广泛存在于自然环境中。
目前,基因分析的细菌鉴定方法已成为快速检测和鉴定分枝杆菌的重要手段。rRNA进化速度十分缓慢,具有“分子进化钟”的特点,是目前细菌的系统发育分类与鉴定的最常用的靶基因,其中16S rDNA序列分析是细菌系统分类的“金标准”[10],16S rDNA在分枝杆菌的分类和鉴定中的作用已得到充分肯定[11,12]。
本试验选择的14株NTM中,有3株被证实为偶发分枝杆菌。偶发分枝杆菌是临床上常引起人肺部感染的NTM,其他一些菌株虽属条件致病菌,也有学者报道可引起人类的感染。在本研究中发现,部分菌株16S rDNA与GenBank序列库中的相似程度为98.6%～98.8%。用临床分离菌株的16S rDNA序列和与其最相似的已知NTM菌株的序列构建系统发育树,结果提示这些菌株可能是与新金色分枝杆菌、偶发分枝杆菌密切相关的新种,或是它们的亚种,但这些均需要进一步研究加以证实。本研究结果显示,吉林地区的NTM临床分离株的种类与国内外报道的临床分离的NTM种类有明显的不同,这可能与地域、气候的差异密切相关。本研究为寻找NTM疾病可能的传染源、了解其致病性及今后对家畜NTM的防制提供了科学依据。
摘要：为了对非结核分枝杆菌菌株进行分类与鉴定,试验采用PCR方法从14株非结核分枝杆菌中扩增16S rDNA基因5'端片段,并对所得DNA基因片段进行测序;同时用DNAMan软件对所获得的序列与GenBank中分枝杆菌序列进行比较,计算种间相似性,构建系统发育树。结果表明:14株非结核分枝杆菌中有浅黄分枝杆菌2株、偶发分枝杆菌3株、母牛分枝杆菌2株、新金色分枝杆菌4株,另有3株分别与Mycobacterium sp.Myc399、新金色分枝杆菌与偶发分枝杆菌有较好的亲缘关系。
关键词：非结核分枝杆菌,菌株鉴定,PCR,16SrRNA
参考文献
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结核分枝杆菌药敏试验分析 篇8
1资料与方法
1.1 资料
1.1.1 一般资料
本试验样本病例来自于大庆市疾病预防控制中心结核病防治科, 市第二人民医院, 龙凤区、萨尔图区、让胡路区疾病预防控制中心结核病防治科2010年-2012年门诊有低热、倦怠、食欲不振、咳嗽、咯痰及少量咯血等症状[1], 胸透X线摄片显示肺结核征象、两次痰标本涂片镜检抗酸杆菌阳性[2]。包括初治传染性肺结核患者和复治传染性肺结核患者。在患者进行抗结核治疗之前, 采集清晨第一口深咳痰盛无菌痰盒内送检[3]。
1.1.2 试剂
酸性罗氏培养基由杭州天和微生物试剂有限公司生产。结核分枝杆菌药敏培养基 (比例法) 由广州凯升生物科技有限公司生产。
1.2 方法
1.2.1 培养
取确诊肺结核患者的深咳痰1 ml加2%氢氧化钠2～4 ml, 室温30 min, 其间振荡2～3次, 促痰液化, 将液化后的痰液混匀, 用来菌的刻度毛细吸管取0.1 ml缓缓均匀地接种在酸性罗氏培养基斜面上, 每份痰液标本接种二次培养基, 接种完毕置37℃恒温培养箱内培养。
1.2.2 药敏试验
将所有培养出的阳性标本待测菌液制备成10～2 g/L和10～4 g/L菌悬液, 分别用22SWG标准接种环蘸取1环 (即0.01 ml) 的菌液, 用划线法将10～2 g/L菌悬液均匀接种分别含异烟肼 (INH) 、利福平 (RFP) 、链霉素 (SM) 、吡嗪酰胺 (PZA) 、乙胺丁醇 (EMB) 、对氨基水杨酸 (PAS) 、丙硫异烟胺 (1321TH) 、卡那霉素 (KM) 、卷曲霉素 (CPM) 药敏培养基表面, 将10～4 g/L菌悬液接种于对照培养基表面, 应注意是菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。接种后培养基置于37℃培养, 4周后读菌落数, 计算耐药百分比, ≤1%为敏感, >1%为耐药。
耐药率 (%) =含药培养基上菌落数/对照培养基上菌落数×100%
2结果
结核分枝杆菌的耐药情况 在总共分离培养出的96株结核分枝杆菌中, 共有41株产生耐药, 来自初治肺结核患者的菌株为7株, 占17%, 来自复治肺病人的菌株为34株, 占82.9%, 结核病人总耐药率为42.7%, 其中耐多药菌株为29例, 占30.2%, 具体内容见表1。
3讨论
结核分枝杆菌本引起慢性传染性疾病, 可以累及全身各个器官, 其中以肺结核最为常见。在结核病防治工作中, 首先要积极开展对未受感染的新生儿、儿童和青少年 进行卡介苗接种。此外对结核病患者进行早期、联用、适量、规律、全程的科学抗结核治疗是唯一的原则。合理的抗结核药物治疗可以达到治愈结核病, 痰中带菌转阴性, 从而消除传染源。目前在许多国家和地区耐药结核病 (DR-TB) 特别是耐多药结核病 (MDR-TB) 的流行严重, 正在使搞结核治疗面临新的挑战。通过本次实验, 在筛选出的96株结核分枝杆菌对9种常规抗结核药物 (INH、RFP、SM、PZA、EMB、PAS、1321TH、KM、CPM) 总耐药率为42.7%, 其中耐多药结核分枝杆菌菌株占30.2%。从结果看出, 在国家防痨规划的抗结核治疗药物中RFP+INH占20.7%, RFP+INH+PZA占13.8%, EMB+RFP+INH+PZA占10.3%, SM +RFP+INH +PZA占6.9%, TH+INH占20.7%, EMB+INH占13.8%, SM+INH+ PZA占13.8%。
本试验结果显示, 在本市结核分枝杆菌对国家方案几种药物 (INH、RFP、 SM、EB、PAZ等) 都有不同程度的耐药, 并有逐渐向多耐药发展趋势。产生耐药情况的原因很复杂, 既有生物因素, 也存在着人为因素。在我们调查中发现, 在复治的传染性肺结核患者中, 大部分人都有未严格按照医嘱的要求坚持服药的情况, 主要原因是, 对药物的副作用耐受性差, 或惧怕药物的副作用, 不肯坚持足量足疗程, 在临床症状稍稳定时中断了服药, 或阶段性中断服药。所以在抗结核病治疗过程中, 做好宣传和监督作用, 让患者遵从医嘱的要求进行抗结核化疗是非常重要的。
摘要：目的 了解本市结核分枝杆菌耐药状况, 为选择更为有效、科学、合理的抗结核病药物治疗提供依据。方法 对本市区筛选初诊疼涂片阳性的患者, 在抗结核治疗前, 取经液化痰液接种于酸性罗氏培养基培养分离结核分枝杆菌, 然后接种于结核分枝杆菌药敏培养基 (比例法) 进行药敏试验。结果 96例药敏试验中, 结核分枝杆菌总耐药菌株为41例, 总耐药率为42.7%, 其中耐多药菌株29株, 耐药率为30.2%。结论 本市结核患者已出现耐药趋势, 且有向耐多药发展, 而在没有出现更有效新药替代已产生耐药的药物前, 必须坚持科学合理的抗结核病药物治疗原则, 从而减少传染性肺结核患者的复治。
关键词：结核分枝杆菌,药敏试验,抗结核病治疗,耐多药菌株
参考文献
[1]陆再英.内科学第7版北京人民卫生出版社, 2008.
[2]中国疾病预防控制中心.传染性肺结核诊断标准及处理原则.GB15987-1995.
非结核分枝杆菌 篇9
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2007年—2009年确诊肺结核患者98例, 均留取痰液, 抽取静脉血3 m L.
1.2 试剂
涂片染色采用萋尼抗酸染色法, 按照《全国临床检验操作规程》[1]第三版进行实验操作。血清结核抗体检测:采用上海奥普生物医药有限公司诊断药盒胶体金法, 严格按照操作说明进行操作。PCR全自动实时荧光定量仪 (由上海罗氏诊断产品有限公司提供) ;检测试剂盒和阴、阳性质控物由中山大学达安基因有限公司提供。
1.3 方法
痰液直接涂片抗酸染色, 在显微镜检下计数100个视野 (观察时间不少于4 m in) , 未发现抗酸杆菌者继续观察至300个视野, 仍未发现抗酸杆菌者报告抗酸菌阴性;镜检按100~300个视野见到1~3条抗酸杆菌为阳性。荧光定量PCR痰液标本处理:痰液根据不同性状, 加入4倍体积的4%N a O H液化30 m in, 取1 m L液化好的痰液离心, 再用生理盐水洗涤沉淀2次, 离心取沉淀加入50μL脱氧核糖核酸 (D N A) 提取液, 主要反应步骤为92℃2 m in预变性, 93℃5 s~57℃45 s复性, 37℃1s引物延伸, 40个循环。反应完毕后, 自动算出循环数 (CT值) 和病毒D N A含量。结核杆菌特异性抗体测定采用胶体金法, 采集血液离心取血清按照操作说明进行操作及阴阳性的判断。
1.4 统计学方法
采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
见表1.
χ2=100.64, P<0.01, 三种方法检测结核分枝杆菌阳性率比较有极显著差异。
3 讨论
3.1
结核分枝杆菌可导致全身性疾病, 特别是在发展中国家, 其发病率较高, 危害性极大, 结核病至今仍是世界上一个严重的公共卫生问题, 是一种较严重的传染病。近几年结核分枝杆菌的变异性较大, 对抗结核药物的耐药性增加, 从而使结核病的发病大幅度增高, 目前的疫情呈上升趋势。因此, 找到一种方便迅速、敏感性高、特异性强的检测方法, 对疾病的预防和早期诊断治疗尤为重要。
3.2
目前, 结核病的诊断方法很多, 抗酸染色涂片法是目前最广泛采用的方法之一, 该方法检测速度快, 价格低廉, 能检出含菌量较高的标本, 但对含菌量较低的标本检出率相对较低, 无法早期诊断结核病。
3.3
PCR是一种在体外由引物介导的特异D N A序列的酶促扩增技术的基因诊断方法, 荧光PCR检测主要是在一定的反应体系中通过首先查找到样本中结核分枝杆菌本身的基因, 进而对其基因上某特定区段进行体外快速复制增殖, 使其迅速被放大到巨大的信号量而能够被检测到。它的敏感性很高, 一般每毫升标本含1~100个细菌即可检出, 纯化的结核分枝杆菌D N A, 相当于1~20个结核分枝杆菌, 一般涂片法检测需细菌数每毫升5×103个才可检出, 标本中细菌数少于此数时不易获得阳性结果, 敏感性明显高于涂片法和血清学方法。PCR检测结核分枝杆菌D N A不受抗结核治疗的影响, 可以准确观察抗结核疗效, 早期诊断和治疗结核分枝杆菌菌血症。
3.4
本组血清学结核杆菌特异性抗体检测结果显示, 血清结核抗体测定对诊断活动性肺结核的敏感性为76.5%.血清结核抗体测定在临床实际应用中还存在假阳性和假阴性同题, 有文献报道, 血清学检测方法胶体金法的假阳性率为5.8%[2].本组98例肺结核病患者中23例血清结核抗体假阴性, 假阴性率为23.5%.我们探讨肺结核病患者出现假阴性可能与多种因素有关, 如:患者就诊时间、抗体检测时间、结核病变的轻重、患者个体的反应性差异等。
经过对比分析, 对于基层医院来说, 细菌学检验方法由于培养要求的时间过长, 即使经过改良的培养方法, 依然需要13 d~15 d的时间, 所以结核菌的培养对于基层医院来说不适合。而涂片染色镜检, 方法简单, 易于操作, 比较适合于基层医院, 由于其只能检出含菌量较高的标本, 检出率较低, 所以应该与其他方法联合使用, 来提高其检出率。PCR的方法虽然检出率较高, 特异性好, 但需要有特殊的仪器 (酶联免疫扩增仪) , 不易于基层医院的普及。血清学方法胶体金法, 由于操作简单, 检出率也相对较高, 对于出现的假阳性, 可以配合涂片法进行滤除。所以涂片法和血清学方法胶体金法配合使用, 可以达到快速诊断结核病的目的, 适合在基层医院开展。
参考文献
[1]叶应妩, 王毓三, 申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社, 2006:726-727.
非结核分枝杆菌 篇10
近年来,分子诊断技术为结核杆菌检测开辟了一条新路,如环介导恒温扩增检测技术、RNA恒温扩增技术、基因芯片技术等。但这些技术的应用都是以获得高质量结核杆菌的DNA和RNA为前提,而结核分枝杆菌的mRNA半衰期极短,细胞壁脂质含量又很高且细胞壁裂解困难,这些加大了结核分枝杆菌RNA提取的难度[3]。本研究分别采用玻璃珠处理法、超声破碎法和甲醇裂解法对结核菌细胞壁处理后进行提取,探讨三种方法对结核分枝杆菌RNA提取的效果,以期获得一种简单、高效的结核分枝杆菌RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
结核分枝杆菌H37Rv标准株(吉林市结核病防治研究所);Trizol试剂(Invitrogen);直径0.5mm玻璃珠(美国Sigma)。
1.2 试验方法
1.2.1 结核分枝杆菌菌悬液的制备
取H37Rv标准株,接种于改良罗氏培养基,37℃培养28~42d[4]。称取9份湿重约30mg的H37Rv标本,分别标记为玻璃珠法、超声波法和甲醇裂解法,每组设三个平行对照。
1.2.2 结核分枝杆菌总RNA的提取前处理
各加入1 m L Trizol后涡旋振荡混匀,分别用三种破壁方法进行前处理。玻珠法加玻珠0.2 g,静止5 min;超声波法先-80℃放置10 min,沸水速融后240 W超声波处理3次,每次3 min,间歇15 s;分别加入200μL氯仿,涡旋振荡1 min,冰置10 min。甲醇裂解法加入1 m L新配置的氯仿甲醇溶液(氯仿∶甲醇=3∶1),涡旋振荡1 min,冰置10 min[5]。
1.2.3 结核分枝杆菌总RNA的提取
4℃,12 000×g离心15 min,取上层水相加入等量的异丙醇混匀,-20℃静置1 h。4℃,10 000×g离心10 min弃上请,70%乙醇洗2次,干燥后加DEPC水溶解。
1.2.4 结核分枝杆菌总RNA鉴定
取5μL RNA样品进行1%的变性琼脂糖凝胶检测,判断RNA的完整性;并取1.5μLRNA样品用快速微量紫外测定仪测定RNA的浓度和纯度。
2 结果与讨论
2.1 结核分枝杆菌RNA的浓度和纯度检测
由表1可知,三种方法均能获得一定浓度的RNA。其中甲醇裂解法提取的RNA浓度最高,为115.05 ng/μL,其OD260/280值甲醇裂解法最好,在1.9~2.0,OD260/230在2.0~2.3,说明此法提取的样品中,蛋白质、盐类等基本去除干净。其次为玻璃珠法,超声波法提取的RNA浓度最低,可能是产生了热量影响了RNA得率。
2.2 结核分枝杆菌RNA的完整性检测
采用1%变性琼脂糖凝胶电泳对提取的结核分枝杆菌RNA进行完整性检测,图1中三种方法均看到了23SrRNA、16SrRNA和5SrRNA三条带,但超声法中条带发生弥散现象,说明高热量导致RNA降解;而甲醇裂解法条带更明亮清晰,且23S近乎16S条带浓度的2倍,说明RNA较完整,无降解现象。玻璃珠法虽不如甲醇法好,但也可用于结核杆菌RNA的提取。
Lane 1:甲醇裂解法;Lane 2:玻璃珠法;Lane 3:超声波法Lane 1:methanolysis method;Lane 2:glass bead method;Lane 3:ultrasonic disruption
3 结论
结核分枝杆菌由于其细胞壁脂质含量高,很难像其他细菌细胞一样用通用的裂解剂将结核分枝杆菌细胞快速裂解。本研究采用三种方法处理结核分枝杆菌细胞壁,并用Trizol进行RNA提取,结果超声波法由于产生较大热量影响了RNA得率和完整性,玻璃珠法虽不如甲醇裂解法好,但避免了甲醇的毒性。甲醇裂解细胞壁法提取的结核分枝杆菌RNA的得率明显高于其他两种方法,因为甲醇能迅速溶解脂质,瞬间穿透并破坏结核分枝杆菌的脂质细胞壁,使细胞质中的RNA释放[3]。因此,甲醇裂解法和玻璃珠法均可以用于RNA的提取,但甲醇裂解法更好。
摘要：分别采用玻璃珠处理法、超声破碎和甲醇裂解法对结核菌细胞壁处理后进行提取。结果表明:甲醇裂解法提取的RNA浓度和纯度较高,完整性也最好。玻璃株法次之,超声波法有降解。虽然三种方法提取的RNA都能直接用于下一步实验操作,但甲醇裂解法效果更好。
关键词：结核杆菌,RNA,提取
参考文献
[1]Shamim Akhtar,Sampa Sarkar,Abhishek Mishra,Dhiman Sarkar.A method to extract intact and pure RNA from mycobacteria[J].Analytical Biochemistry,2011,(417):286-288.
[2]M.D.Bashyam,A.K.Tyagi.An efficient and high yielding method for isolation of RNA from mycobacteria[J].Biotechniques,1994,(17):834-836.
[3]贾红彦,李自慧,杜博平,等.结核分枝杆菌总RNA提取方法的比较研究[J].临床肺科杂志,2012,17(7):1246-1248.
[4]罗影殊,高文凤,黄偌颖,等.不同破壁方法提取结核分枝杆菌总RNA的比较[J].中国防痨杂志,2013,35(3):183-186.