分子流行病学调查

分子流行病学调查（精选9篇）

分子流行病学调查 篇1

为了解四川地区CSFV的流行情况, 笔者于2011年10月至2013年1月对四川省7个市的部分猪场的67份公猪精液进行CSFV抗原检测, 然后对所得4株CSFV进行分子流行病学调查, 以期为四川省猪瘟的科学防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2011年10月至2013年1月共采集了67份四川地区部分猪场疑似感染猪瘟的公猪精液及正常公猪的精液 (每头约5 m L) , -20℃保存。各样品来源及对应公猪的流行病学信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 RT-PCR引物的设计和合成。

参照已发表的CSFV Alfort-187株E2基因组序列, 设计了一对特异RT-PCR引物用于CSFV E2部分基因的扩增, 引物序列及在Alfort株全基因组中的位置见表2, 引物送至上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 精液中CSFV的RNA提取。

采用Trizol法提取病毒总RNA。

1.2.3 采用两步法进行RT-PCR扩增。

病毒c DNA的合成:反转录采用25μL反应体系;PCR采用25μL反应体系。

1.2.4 电泳观察结果。

反应结束后, 取5μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳, 并在凝胶成像系统上观察、拍照。

1.2.5对PCR阳性产物进行克隆及CSFV E2基因测序。

将DNA片段与p MD18-TVector克隆载体连接, 制备感受态细胞及转化质粒;将鉴定为阳性的转化菌落作穿刺后, 封口写上标签送上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.6 CSFV E2基因的分子进化分析。

登陆Gen Bank下载国内外15株CSFV代表株的E2基因核苷酸序列 (登陆号如表3所示) 。利用DNAStar软件分析本研究中扩增出的CSFV各毒株的E2基因核苷酸序列, 按照DNAstar软件中的Clustal W方法比较所测毒株的基因序列的同源性, 以及由基因序列推导的氨基酸序列同以上参考毒株的同源性, 并构建系统发生进化树。

2 结果与分析

2.1 公猪精液中CSFV的检测结果

从样本中检测出4份CSFV阳性精液, 检出率为5.97%, 具体结果如表4所示。

2.2 各CSFV株间其核苷酸序列的同源性比较

利用DNAstar软件中的Meg Alin, 将测序结果与Genebank上查到的15条CSFV E2基因的核苷酸序列进行同源性比对, 结果如图1所示。

2.3 各CSFV株间其氨基酸序列的同源性比较

从CSFV E2基因序列推导的氨基酸序列比对结果如图2所示。

2.4 建立遗传进化树

把本研究所得的4株CSFV同国内外15株CSFV序列进行比较, 构建遗传进化树, 如图3所示。

3 结论

本试验证实了CSFV可以通过公猪精液进行传播, 也说明四川省部分地区仍存在猪瘟病毒。

本次试验发现的4株CSFV与来自武汉的AF092448同源性较高, 与来自台湾的AF352565同源性较低。与国外毒株比较, 同来自日本的D49533有着较高的同源性 (分别为LS-1:95.2%, MS-1:95.0%, PJ-1:95.1%, QL-1:95.1%) ;与来自美国的AY578687同源性较低 (分别为LS-1:91.7%, MS-1:91.6%, PJ-1:91.9%, QL-1:91.4%) 。

从遗传进化树中可知, 所扩增出的4株CSFV处于一个大的分支上, QL-1与武汉的AF092448同源性最高, 亲缘关系最近;LS-1与MS-1在同一个小分支上, PJ-1则与其他3株 (QL-1、LS-1、MS-1) 都处于一个大分支上。

参考文献

[1]朱良全, 彭隽, 刘明荣, 等.猪瘟诊断方法研究进展[J].中国畜牧兽医, 2005, 32 (12) :10-15.

[2]余兴龙, 涂长春, 李红卫, 等.猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究[J].中国病毒学, 2000, 15 (3) :264-271.

[3]王琴.猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究[J].中国农业科技导报, 2006, 8 (5) :13-18.

分子流行病学调查 篇2

调 查 报 告

××年6月12日17点20分，我中心疫情室接到××镇中心卫生院××同志电话报告：××中学八（5）班有疑似流感病例15例。接到电话后，疫情室立即将此信息报告给疾控中心主任××、卫计局副局长××、分管副主任××、急控科科长××。疾控中心决定由急控科科长××带队及相关流调人员前往调查处置。流调组于17点30分出发，21时到达现场，22时处置完毕，现将调查处理的情况报告如下：

一、基本情况：

××镇位于县城北面，距县城138公里，东抵××镇，南与××镇接壤，西与××镇相邻，北与××镇相连，全镇面积176.7平方公里，有8个行政村、60个村民组，总人口：26354人，现有学校9所（其中：中学1所）。

××中学位于××镇××村××街上，共有学生××人，教师××人，共有三个年级××个班。其中：七（1）班有学生××人，七（2）班有学生××人，七（3）班有学生××人，七（4）班有学生××人，七（5）班有学生××人，七（6）班有学生××人，八（1）班有学生××人，八（2）班有学生××人，八（3）班有学生××人，八（4）班有学生××人，八（5）班有学生××人，九年级共××人。经现场调查，现有症状学生10名，均为八（5）班学生。发病年龄在14－16岁之间，以15岁组为高发，均以咳嗽、流涕、头痛、咽痛、扁桃体肿大、咽部充血、轻中度发热为主要表现，偶有高热，恶心，乏力等症状。

二、调查结果：

首发患者××、男、14岁、××中学八年级（5）班。家住××镇二××村××街上新区，于××年6月8日发病，主要症状为咳嗽、咽干、流涕，最高体温39.1℃,发病前未外出。截止6月12日类似病例增至10例。三间分布情况见表

1、表

2、表3。表

1、发病时间分布表

发病时间 6月8日 6月9日 6月10日 6月11日 6月12日 发病数 构成比% 1 10 10 20 20 40

合计 100 表

2、发病年龄分布表 发病年龄 发病数 构成比% 14岁 2 20

15岁 7 70

16岁 1 10

合计 42 100 表

3、发病人群分布表

年 级 学生数 发病数 发病率%

三、流行病学特征

10例病例全部集中在八（5）班，其余班级均无发病情况，发病的10例学生中男生 6名，女生4名，男女构成比为1.5:1。

四、调查分析：

八（5）班

10 21.74

其余15个班

合计

××

0 0

××

×× 根据临床表现、现场流行病学调查初步诊断流行性感冒（已采集现症病人咽拭子10份送往市CDC实验室，结果待定）。引起本次流行的主要原因：

1、首例病人发病后未引起家长和老师的足够重视，加上近段时间气候很不稳定，也是流感的发病季节，传染源没有得到很好的控制，导致传播给其他学生。

2、该校通风条件较差，部份学生不爱户外活动。学习用品、日常用品、课桌及环境消毒达不到要求。

3、该学校多数学生都未接种过流感疫苗，学生对流感病毒普遍易感，没有建立免疫屏障。

五、处理措施：

1、立即成立疫情领导小组和医疗救治组。

2、对现症学生进行对症隔离治疗，防止并发症的发生；对病例集中的班级建议停课一周。

3、作好环境消杀工作，由卫生院派专人指导学校进行消杀，对患者的生活场所和就诊医院进行彻底消杀，每天至少两次以上，并作好记录，同时加强对教室、图书室（阅览室）教研室等学生和教职工，学习、工作、生活场所的卫生与通风，保持空气的流通，直至本次疫情结束。

4、每天观察是否有新发病例，由该校和卫生院负责人每天向疾控中心报告疫情的发展动态及疫情控制情况，监测到本次疫情结束；同时对辖区内其它学校进行主动监测，做到“早发现、早诊断、早隔离、早治疗”。

5、积极开展形式多样的健康教育，普及流感防病知识，倡导健康生活，科学洗手等卫生行为，提高广大学生、教职工对流感防治的正确认识和自我防护能力。

6、学校要落实好晨检制度，因病缺课登记追踪制度，发现类似的疫情要第一时间报告给卫生和教育行政部门。

分子流行病学调查 篇3

关键词：副猪嗜血杆菌,阆中市,流行病学,血清型鉴定

副猪嗜血杆菌 (HPS) 起初被称为猪嗜血杆菌或猪流感嗜血杆菌, 是猪上呼吸道的一种常在菌[1]。该菌常与其他呼吸道病原混合或继发感染[2,3,4], 主要的攻击对象是仔猪和青年猪。本试验对阆中市16个规模化猪场进行了HPS流行病学调查, 为当地有效防控该病提供依据。

1 试验材料

1.1 病料来源及实验动物

病料来源于阆中市的16个规模化养猪场, 采集自疑似患副猪嗜血杆菌病的猪的肺脏、鼻拭子、气管黏液、淋巴结、肾脏、脾脏、关节液和心包渗出液等。

副猪嗜血杆菌的阳性病料由四川农业大学动物医学院动物检疫实验室保存并提供。试验中用于制备各个分型血清的健康家兔 (体重3~4 kg/只) , 购自四川农业大学农场。

1.2 所需分子生物学试剂

蛋白酶K、SDS、Ttis饱和酚, 2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker DL2000、p MD19-T Vector, 琼脂糖, NAD (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸) , Column DNABACK柱式DNABACK, 细菌基因组DNA提取试剂盒, 其他试剂如无水乙醇、氯仿等均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50FB, 电热恒温鼓风干燥箱DHG-9146A, 高速冷冻离心机Sigma 3-18K, 恒温水浴锅, 微量加样器, PCR仪Mycycler, 核酸电泳系统DYY-2C, 稳压稳流型电泳仪DYY-III-8B, 全自动凝胶成像分析系统, 涡旋混合振荡器, 水浴锅。

1.4 培养基

LB培养液、LA培养基、TSA培养基、TSB培养液和氨苄平板, 其制备均按照说明书进行。1.5引物的设计与合成从Genbank上下载已经公布的HPS 16S r RNA核苷酸序列, 根据HPS 16S r RNA序列设计引物, 引物由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列见表1。

按使用说明将引物稀释为10 pmol/μL, 放-20℃冰箱中备用。

2 方法

2.1 细菌分离培养

用无菌接种环蘸取肺脏组织、气管黏液、心包渗出液和关节液接种在含0.05%NAD的TSA培养基上, 置37℃温箱中培养24~48 h, 观察细菌菌落, 再进行细菌纯培养。

2.2 HPS的PCR鉴定

PCR鉴定按Oliveira等建立的HPS PCR鉴定方法进行HPS 16S r RNA基因的PCR扩增, 扩增片段大小为821 bp。细菌基因组DNA的抽提按细菌基因组DNA提取试剂盒的说明书进行。采用PCR技术对提取的DNA进行扩增, 同时做阴性对照和阳性对照。反应体系 (20μL) 为:2×Taq PCR Master Mix 10μL, 双蒸水5μL, 上游引物和下游引物各1μL, DNA模板3μL。

取8μL PCR产物加入1%琼脂糖凝胶板加样孔中, 同时取8μL DNA Marker DL2000作为参照物, 在120 V电压下电泳20 min, 结束后将1%琼脂糖凝胶放于紫外凝胶成像仪中观察并保存图像。

2.3 HPS 16S r RNA克隆与序列分析

若2.3中出现正确的目的条带 (821 bp) , 则进行基因克隆与序列分析。

2.3.1 凝胶块中DNA的胶回收、纯化

胶回收按照下列步骤进行:在胶回收离心管中按重量比1∶3~1∶5加入通用溶胶液 (即:100 mg的琼脂糖凝胶需要加入300~500μL通用溶胶液) , 放50℃水浴锅中使胶完全溶化;将离心管中的溶液转到离心吸附柱中, 套上收集管, 静置3 min, 12 000 r/min离心1 min, 倒掉收集管中的液体, 加入0.7~0.8 m L的通用洗柱液, 室温静置2 min, 12 000 r/min离心1 min, 倒掉收集管中的液体, 再以12 000 r/min离心30 s, 以除去离心柱中的残留液体;将离心柱放于一支新的干净的离心管中, 加入30~100μL 50~65℃的DNA洗脱液, 静置3 min, 12 000 r/min离心1 min, 离心管里所得的溶液即为胶回收产物。放于-20℃冰箱中备用。

2.3.2 感受态细胞的制备

将大肠杆菌DH5α贮存液在无菌LA平板上划线, 37℃培养箱培养过夜, 挑取单个菌落接种到一只装有5 m L LB培养液的灭菌试管中, 37℃200r/min振荡培养过夜, 按照1% (V/V) 比例接入新鲜LB培养液, 取2m L接种于100m L LB培养液中, 37℃200 r/min振荡培养2~2.5 h, 测得OD值为0.5左右 (此时细菌处于对数生长期) 。将菌液加入到无菌EP管中, 冰上放置10min后, 4℃5000r/min离心10 min, 弃上清, 将菌体悬浮于10 m L的无菌、预冷的0.1 mol/L的Ca Cl2溶液中, 4℃3 000 r/min离心10 min, 弃上清, 再将菌体悬浮于2 m L的无菌、预冷的已经加入甘油的0.1 mol/L Ca Cl2溶液中 (甘油按照15%比例加入) , 分装到无菌1.5 m L EP管中, 放4℃冰箱过夜后, 置于-70℃冰箱中保存备用。

2.3.3 连接

将胶回收产物与p MD19-T载体连接, 反应体系 (10μL) 为:Solution I 5μL, p MD19-T 1μL, 胶回收产物4μL。16℃连接过夜。

2.3.4 转化

在无菌条件下, 将新鲜制备或者在-70℃保存备用的DH5α感受态细胞在冰上溶解后轻轻混匀。取10μL连接产物, 无菌加入已经均匀悬浮的100μL DH5α感受态细胞中, 温和摇匀, 冰浴30 min, 42℃水浴, 热激90 s。冰浴3~5 min (使感受态细胞的细胞膜通透性增加, 让质粒充分进入细菌内) , 加入37℃的900μL LB培养液 (无Amp) , 在37℃水浴锅内250 r/min温和振荡1 h, 使细菌恢复耐药性。室温下, 3 000 r/min离心5 min, 弃去700μL上清液, 用剩余的培养液将细菌沉淀悬浮, 均匀涂布于氨苄平板上, 在37℃培养箱中正向放置30 min吸取掉多余液体后, 倒置, 培养10~16 h。无菌挑取单个菌落接种于3~4 m L含Amp溶液的LB培养液中, 37℃250 r/min振荡培养6~8 h。然后按7∶3 (菌液∶甘油) 分装至无菌EP管中, 其中一管用于测序, 其余放-70℃冰箱内保存。2.3.5序列比较从NCBI上下载已经公布的HPS16S r RNA序列 (登录号:AB004039.1、AB004037.1、AB004036.1、AB004035.1、AB004034.1) , 将这些基因的相应区域与测序结果用DNAMAN软件进行比对, 查看其同源性。

2.4 血清型的确定

本试验用兰州兽医研究所馈赠的血清型1~15标准株来制备副猪嗜血杆菌分型血清, 并根据玻板凝集试验[5]确定HPS的血清型。

2.4.1 分型血清的制备

分别用血清型1~15标准株划线接种于TSA平板上, 37℃培养24~48 h, 挑取单个菌落, 接种于含4~5 m L TSB培养液的试管中, 37℃250 r/min振荡培养6~8 h后涂布于TSA平板, 放37℃培养箱中培养24~48 h, 然后用含0.2%福尔马林的PBS (p H=7.2) 冲洗下来, 37℃过夜灭活, 4℃4 000r/min离心10 min, 洗涤两次, 调整菌液浓度, 使得OD600约等于1。然后均分成两份, 其中一份与等量的弗氏完全佐剂制成弗氏完全佐剂疫苗, 另一份与等量弗式不完全佐剂制成弗式不完全佐剂疫苗。

每株标准株都按以下程序免疫健康家兔2只:用1.5 m L弗氏完全佐剂疫苗于背部多点注射 (第一次免疫) , 14 d后再用1.5 m L弗氏完全佐剂疫苗于背部多点注射 (第二次免疫) , 11 d后用3 m L弗式不完全佐剂疫苗于背部多点注射 (第三次免疫) ;11 d后用0.5 m L病菌新鲜培养物 (OD600值≈1) 对每只家兔进行耳静脉注射攻毒, 7~14 d后采血, 无菌分离血清, 做玻板凝集试验测血清抗体, 若出现明显肉眼可见的凝集物就放血收集血清, 若没有凝集物出现, 就继续用0.5 m L病菌新鲜培养物攻毒, 7~14 d后再采血检测, 仍然不合格就重新免疫。以健康家兔的血清作阴性对照。所有血清于-20℃保存备用。

2.4.2 血清学分型

用PBS冲洗下TSA平板上生长的各分离株菌苔作为待检菌液, 将0.3 m L待检菌液与0.3 m L分型血清混匀, 同时用健康家兔血清作阴性对照。数分钟后, 若混合液仍均一浑浊, 则为阴性反应;若出现肉眼可见的凝集物, 则为阳性反应, 表示分离株与产生凝集物的标准株的血清型相同。

3 结果

3.1 流行病学调查结果

196份疑似HPS病料主要采集自21~60日龄的断奶仔猪和保育猪, 疑似病例全年都有发生, 但在4~9月份相对集中。在所调查的196份病料中, 共分离出了11株HPS, 分离率只有5.61%, 其中有9株是4~9月采集病料时分离出的, 表明该病在4~9月发生明显;分离出的HPS病料主要来自断奶仔猪和保育猪, 分离部位主要在肺脏和支气管, 肺脏、支气管和关节液的分离率分别为54.5% (6/11) 、36.4% (4/11) 和9.1% (1/11) , 说明肺脏和气管是HPS存在的主要器官。

3.2 细菌分离培养结果

培养基上的细菌菌落光滑湿润, 呈针尖大小、无色透明的露珠状, 约0.5 mm左右。取纯培养36 h的菌落涂片、革兰氏染色、镜检, 结果为革兰氏阴性细小杆菌。

3.3 HPS的PCR鉴定

使用HPS 16S r RNA基因扩增引物对分离的细菌进行16S r RNA基因扩增, 结果从分离的细菌基因组DNA中均扩增出821 bp的目的片段。

3.4 HPS 16S r RNA序列分析

结果见表2。根据HPS 16S r RNA序列设计引物, 经PCR技术扩增后, 电泳发现产物条带大小为821bp, 与预期相符。将分离到的11株HPS的PCR产物送到华大基因公司测序, 将测序结果与标准株进行比对, 结果发现其同源性为96.2%~99.76%, 说明检测出的确实是副猪嗜血杆菌阳性病料, 而且HPS 16S r RNA序列保守性较高, 不会因为地域不同发生很大的变异。

3.5 HPS分离株的血清型鉴定结果

将分离到的11株HPS的菌液0.3 m L与各分型血清0.3 m L混合均匀, 通过玻板凝集试验进行血清型分型, 同时用健康家兔血清作阴性对照, 结果显示有8株能够准确分型, 有2株出现交叉反应, 难以判断, 有1株不能与这15种分型血清发生阳性反应, 不能分型。在能分型的菌株当中, 血清型依次是5型4株、4型3株、12型1株。各分离株的血清型及其分布地区见表3。

4 讨论与小结

本试验从196份疑似病料中检出了11份阳性病料, 阳性检出率较低 (为5.61%) , 可能是临诊时把副猪嗜血杆菌病与支原体肺炎、传染性胸膜肺炎、猪链球菌病等病混淆, 致使所采集的病料不完全是副猪嗜血杆菌病阳性病料。从采集时间推断该病在春、冬季的发病率低于夏、秋季。该试验还成功地克隆了这11株HPS的16S r RNA, 将这些序列与NCBI上已公布的HPS序列进行同源性分析, 发现其同源性在96.2%~99.76%之间, 具有较高的保守性。

目前副猪嗜血杆菌的分型方法主要有血清学分型、基因分型、多态性图谱分型。副猪嗜血杆菌血清型众多, 制备血清型1~15的各个分型血清是一件很困难且耗时耗力的工作。本试验发现, 不同血清型的菌株刺激动物机体产生抗体的水平有很大差异, 其中血清型15、14、13、12、11、9、6、5、3的菌株在第一次攻毒后就可与相应的热稳定性抗原发生明显的阳性反应, 而血清型10、8的菌株需要连续攻毒3次才能获得比较满意的结果。

有研究报道, 采用琼脂扩散方法对HPS进行血清型分型时, 抗原制备的方法对HPS血清学分型的效果有较大影响[6,7]。本试验用玻板凝集试验对分离株进行血清分型, 避免了琼脂扩散方法中抗原制备不当而对试验结果造成影响。

近年来, 副猪嗜血杆菌的耐药性越来越明显, 国家对抗生素在动物饲料中的应用限制得比较严格, 所以疫苗会逐步取代抗生素, 成为预防、控制本病的主要措施[8]。但在实际生产中, 有的疫苗免疫效果并不明显, 这可能与血清型有关;也可能是因为临床上用的大都是灭活苗, 而灭活苗的交叉保护性低、免疫原性差, 不能刺激机体产生免疫应答反应;还有可能与猪群的健康状况有关。

不同血清型的副猪嗜血杆菌的毒力和致病力存在差异, 毒力和免疫保护作用呈正相关。母安雄等[9]研究报道:血清型5、1、10、13、12、14为高毒力菌株, 血清型4、2、15为中等毒力菌株, 血清型6、3、7、8、11为无毒力菌株。本次在阆中市分离出的HPS的血清型主要是5型、4型和12型, 这些血清型的菌株基本上都是高毒力菌株。在制备针对阆中市HPS的有效疫苗时, 可以将高毒力的血清型5、4、12菌株通过诱导发生突变, 再选出毒力减弱的菌株制备成弱毒疫苗, 这样应该有明显的免疫效果且对仔猪的安全性较高。

参考文献

[1]贺英, 赵萍, 储岳峰, 等.福建省部分地区副猪嗜血杆菌病的流行病学调查[J].贵州农业科学, 2010, 38 (2) :130-131.

[2]Oliveira S, Pijoan C.Computer-based analysis of Haemophilus parasuis protein fingerprints[J].Canadian Journal of Veterinary Research, 2004, 68 (1) :71.

[3]Biberstein E L, White D C.A proposal for the establishment of two new Haemophilus species[J].Journal of Medical Microbiology, 1969, 2 (1) :75-78.

[4]王祝荣, 卢寄军, 张进.副猪嗜血杆菌16S rR NA基因的克隆及序列分析[J].中国畜牧兽医, 2012, 39 (3) :92-94.

[5]赵冉, 陈琼, 蔡振鸿.副猪嗜血杆菌病的研究进展[J].福建畜牧兽医, 2008, 30 (3) :20-23.

[6]陆国林, 何海健.副猪嗜血杆菌病的研究进展[J].中国畜牧兽医, 2009 (12) :162-165.

[7]涂玉蓉, 李美娣, 卓曲, 等.副猪嗜血杆菌分型方法的研究进展[J].福建畜牧兽医, 2012, 34 (5) :44-46.

[8]苏丹萍, 王文豪, 章胜, 等.副猪嗜血杆菌弱毒疫苗的研制[J].中国畜牧兽医, 2012, 39 (11) :169-173.

分子流行病学调查 篇4

2009年动物疫病流行病学调查工作方案

为摸清动物疫病发生的原因和传播条件，掌握本地区主要动物疫病的发生规律，科学评估动物疫病的发生风险和流行趋势，为动物疫病预报预警提供技术储备和支持，根据《中华人民共和国动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》、结合农业部、吉林省有关文件要求，按照目标明确、系统规范、科学有效的工作原则，制定本方案。

一、职责分工

（一）梅河口市动物疫病预防控制中心防疫科负责全市动物疫病流行病学调查、分析、技术指导工作，制定和发布全市动物疫病流行病学调查方案；成立由梅河口市畜牧业管理局防疫科和梅河口市动物疫病预防控制中心防疫科工作人员组成的市级动物疫病流调队，组织实施畜禽和宠物疫病的流行病学调查工作；定期向通化市动物疫病预防控制中心报送动物疫病流行病学调查情况。

（二）各乡镇畜牧兽医站负责辖区内动物疫病流行病学调查工作；依据本方案，结合当地实际情况，制定本辖区具体工作方案；并组建动物疫病流行病学调查工作队，由专人负责，具体实施辖区内动物疫病流行病学调查工作；定期向市动物疫病预防控制中心防疫科报送动物疫病流行病学调查情况。

（三）村级防疫员负责所辖行政区域内动物饲养和动物疫病发生情况的日常统计和巡查工作，认真填写动物疫病流行病学调查表和动物存栏调查表，并定期上报乡镇畜牧兽医站。

二、流行病学调查范围

梅河口市的动物疫病流行病学调查覆盖面要求达到100%，包括以下几方面：

（一）调查区域

涵盖全市21个乡镇，其中梅河口市城区以宠物疫病流行病学调查为主；其它乡镇以畜禽重大疫病和常发病调查为主、宠物疫病调查为辅。

（二）调查对象

包括养殖场/户、动物诊疗机构（含畜牧兽医站）、屠宰场、等。

（三）动物种类

包括鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、马、、犬、猫等。

（四）疫病种类

1、重大传染病。包括高致病性禽流感、口蹄疫、猪瘟、鸡新城疫、猪伪狂犬、猪蓝耳病、布病、结核病、马传贫、马鼻疽、炭疽、疯牛病、痒病、狂犬病、布鲁氏杆菌病、弓形虫、等。

2、常发疫病。包括：猪圆环病毒病、禽白血病、衣原体病、细菌性疾病、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、猫瘟热、猫白血病、猫传染性腹膜炎等。

三、工作内容

（一）市级流行病学调查

1.流行病学抽样调查

随机选取有代表性的流调点，通过部分实际调查结果来推断整个动物群体的一种

统计调查方法。

市动物疫病预防控制中心每星期到2个乡镇开展现场流行病学调查，每个乡镇负责4个养殖场及10个养殖农户的联系和确定工作。流行病学调查采用填写流调表、临床解剖、采集病料并开展实验室检测等形式进行，诊断结果和防治建议于7-10个工作日内反馈。

2、流行病学定点调查

通过有代表性的定点抽样调查，更准确地了解梅河口市动物疾病的流行状况，定向监测动物疫病流行的变化情况，为宏观和科学分析评估、预警动物疫情、制定防控策略提供依据。

各乡镇畜牧兽医站在本辖区内设立猪、鸡、牛、羊四种动物各一个饲养场做为市级定点调查对象，负责日常疫病动态观察，每周填写《养殖场疫病流行病学调查表》，并按规定时间上报；每月至少收集和留存病例样品四份以上（同畜种或不同畜种），以备市兽医实验室及时接样诊断。

3、流行病学紧急调查

当梅河口市区域怀疑或确认重大动物疫病发生、疯牛病和非洲猪瘟等外来动物疫病出现、猪瘟等主要动物疫病流行特征出现明显变化、牛瘟等已消灭疫病再次发生时，市动物疫病预防控制中心将紧急启动流行病学调查工作程序，组织实施现地调查，填写紧急流行病学调查表。根据调查情况，流调队要描述动物疫情现状（空间、时间和群间分布等），分析疫病来源，判断疫情发展趋势，提出控制措施建议，形成调查评估报告。怀疑疫情扩散时，应在高风险地区开展追踪调查。

4、流行病学专项调查

围绕特定目的，灵活设臵的调查项目。市动物疫病预防控制中心根据全市动物防疫工作中存在的问题或问题影响因素，适时开展各种专题流行病学调查工作。

（二）乡镇级流行病学调查

各乡镇动物疫病流行病学调查采取随机抽样和定点调查相结合的方式进行。每月至少对猪、禽、羊、牛养殖场各2个，开展动物疫病流行病学调查。关于紧急流行病学和专项流行病学调查，各乡镇要根据本方案要求，制定流行病学调查预案或方案，并根据需要积极配合市动物疫病预防控制中心开展相关工作。开展常规流行病学调查时应包括以下信息来源:

1、畜禽养殖场：地理特点、饲养数量、疾病种类、发病数、死亡数、发病率、治疗情况、损失程度，免疫情况等信息；填写《养殖场流行病学调查表》。

2、动物诊疗机构（包括乡镇兽医站）：通过对辖区内动物诊疗机构的调查，了解动物疫病的发生情况，填写《动物疫病诊疗机构畜禽疫病流行病学调查表》和《动物疫病诊疗机构宠物疫病流行病学调查表》。

3、屠宰场：通过对屠宰场检疫过程中，发现疾病的流行情况并填写《动物屠宰场动物疾病流行病学调查表》。

4、动物饲养数量动态调查：通过对辖区动物的引入和转移情况进行跟踪调查，了解辖区内动物的饲养情况并填写《动物存栏情况调查表》。

四、分析评估与信息交流

（一）动物疫病预防控制中心建立辖区动物疫病风险评估工作机制，结合本地畜牧业生产、流行病学调查和监测数据，定期评估疫情发生风险。

（二）在开展流行病学调查过程中，对疾病诊断结果及时反馈养殖场，指导畜牧生产，要及时与各调查点交换流行病学调查工作意见。

五、其他工作要求

1、各乡镇兽医站于每月十五日前将流调情况报市动物疫病预防控制中心防疫科。

2、市动物疫控中心于每月二十日前将流调情况报通化市动物疫病预防控制中心防疫科。

分子流行病学调查 篇5

关键词：乙型肝炎分子流行病,传播性,危害性

乙型肝炎分析病毒, 由于自身传播性较强, 传播形式相对复杂, 并且发病率较高, 因此成为了现代社会危害性较强的流行病之一。我们通过对当前乙型肝炎分子流行病学进行深入分析研究, 对后期的防治工作提供有力的科学依据。

1 现代乙型肝炎分子流行病现状概述

根据当前世界卫生组织的调查数据显示, 目前全世界每年大约会有一百万人由于乙型肝炎分子流行病毒感染而去世, 已经成为全世界所关注的公共卫生问题了。由于我国是当前乙肝分子流行病的高爆发区, 在去年乙肝流行病感染率超过了60%, 所以我国对于其防治工作方面还需要努力, 而究其原因是由于我国人口众多, 市场经济发展相对不协调, 人们乙肝疫苗接种计划难以得到普及;在另一方面, 我国大部分公民对于乙肝分子流行病毒的认识不足, 对于乙肝分子流行病的预防观念较为薄弱。在近几年, 我国开始在社会中普及乙肝疫苗免费接种的政策, 让我国乙肝疫苗防治计划实现了广泛传播, 进而让我国乙肝分子病毒感染率较低;许多医院对新生儿乙肝疫苗的接种工作依然存在着滞后问题, 因此提升站点疫苗接种效果成为我们日后需要研究的重要内容。

2 现代乙型肝炎分子流行病防治工作

第一, 选择有效的抗病毒药物。当前我国在医学领域中公认有效的抗病毒药物分为两大类, 其中一种是干扰性的药物, 另外一种是核苷酸类的药物。可以说这两种抗病毒性的药物具有自身的优缺点, 在干扰类药物除了具有一定的抗病毒的作用, 还具有一定的免疫调节的作用, 但是核苷酸类的药物却只能单纯地进行抗病毒。在另一方面, 核苷酸类的药物有着较强的病毒抑制作用, 人们服用方便, 但是却有着较长的治疗时间, 缺少明显的效果。而干扰素不但具有抗病毒的作用, 还具有一定的免疫作用, 具有稳定的治疗效果, 但是干扰素药物需要进行人为注射, 因此使用起来不太方便。要想使用抗病毒性的药物, 需要根据医生们的科学指导来进行合理的选择, 显然我们在实际治疗过程中要尽量地选择高效的药物。

第二, 要明确日常抗病毒疗程与停药标准。我们需要按照新《慢性乙型肝炎防治》的标准, 在当前乙型肝炎分子抗病毒治疗过程中, 对于HBe Ag阳性患者中的HBe Ag血清学转换之后, 对患者进行一年的巩固, 在整个抗病毒过程中应当不少于两年。对于阴性患者所达到的HBV DNA转阴与ALT的痊愈后进行一年半的巩固。在整个治疗过程中应当不少于两年半。延长相应的医疗过程是为了防止患者的病情再一次复发, 尤其是部分肝硬化患者, 则需要更长的时间来进行抗病毒治疗。另外, 还有在患者停药刚买, 需要根据实际情况来考虑到停药或者是不停药。

第三, 要以乙肝疫苗预防接种为主要工作。日常工作中, 我们需要采取以乙肝疫苗预防接种为主要内容, 加强对群众的乙肝病毒防治工作。我们需要在稳定新生儿的高接种率的过程中, 成人群体也需要成为当前乙肝疫苗的接种防治重点对象。我们对乙肝疫苗的预防接种的普及, 能够提升社会群众的免疫功能, 进而降低了乙肝病毒的传播率。而地区乙肝病毒的防控中心也需要对人们乙肝病毒的疫情进行科学有效的监测, 防止多种危害疫情的产生。而相关部门也需要对社会人群进行深入教育, 以提升社会群众对乙肝病毒的防患观念。

3 乙型肝炎分子流行病学新成果概述

第一, 传播途径的阻隔。当前我国乙肝病毒的母婴传播渠道已经进行了人为有效的阻隔, 在几十余年的研究中, 我们可以看到大量经验表明, 如果在新生儿出生后及时为他们注射乙肝疫苗与乙肝免疫球蛋白, 亦或是在妇女怀孕期间服用相关的抗病毒药物, 就能够进行有效预防。我们通过这些阻隔技术, 是可以达到阻隔乙肝病毒在母婴体内传播复制的作用。第二, 传染源逐渐减少。我们通过近几年的调查数据显示, 社会群众携带乙肝病毒的人群是主要的乙肝病毒传播媒介, 但是人数是逐渐减少的, 尤其我们对二十岁以下的人群进行了有效的控制。根据2009年的全国调查结果显示, 从20岁到50岁的年龄层次的人群乙肝表面所携带的抗原比例是最高的, 而一到五岁的婴幼儿群体的乙肝表面携带抗原是最低的, 从整体来看, 乙肝分子流行病承载的传染源逐渐减少数量。当前我们是通过检测人们血液中的HBe Ag来作为判断携带乙型肝炎病毒的客观标准。而再通过相应的分子生物学理论的研究, 我们可以讲HBV-DNA来作为乙型肝炎分子病毒的重要标志物。我们在实际研究中, 能够发现所存在的乙型肝炎病毒传染源要比通过判断HBe Ag的传染源数量还要少。

4 结语

我们通过多种防治工作的实行以及相应的乙肝疫苗接种方式的普及, 使得现代乙肝流行病毒的广泛传播起到一定的抑制性作用, 并且取得了较大成果。然而乙肝流行病毒并不能完全消除, 所以我们应当继续努力抓好多种流行病毒防治工作, 进一步抑制住乙型肝炎分子病毒的广泛传播。

参考文献

[1]张智淦.烹饪专业大学生HBV感染的流行病学及3年追踪调查结果分析[J].预防医学情报杂志, 2002年06期.

[2]王素霞, 邹万忠, 张波.乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中HBVDNA的原位检测[J].北京大学学报 (医学版) , 2001年02期.

[3]吴岷岷, 唐引荣, 郭彩玉, 方之勋.采用阻断措施的乙型肝炎病毒携带产妇哺乳结果的观察[J].中华妇产科杂志, 2002年04期.

[4]闵福援, 孙桂珍, 王健, 辛永梅.前S1蛋白在乙型肝炎诊断及判断预后中的作用[J].中华检验医学杂志, 2004年04期.

鸭坦布苏病毒的分子流行病学特点 篇6

1 鸭坦布苏病毒的生物学特性

电镜下鸭坦布苏病毒为带囊膜的球形病毒粒子, 直径为40~60 nm, 内含1个直径约30 nm由衣壳蛋白和病毒基因组构成的核心, 其外被膜蛋白Pr M和外膜蛋白E包裹着。

1.1 发病情况

我国部分地区所饲养的种鸭和蛋鸭发生一种以突发产蛋急剧下降为特点的疾病, 并从鸭胚分离到病毒, 根据该病的病变特征, 将该病称为“种 (蛋) 鸭出血性卵巢炎”。

1.2 临床症状

感染鸭群采食量突然下降、产蛋率急速下降, 可从高峰期的90%~95%下降到5%~10%, 甚至停止产蛋, 发病率几乎100%, 死淘率5%~15%。病鸭体温升高, 排绿色稀粪, 肉鸭主要以神经症状为主, 表现为行走、站立不稳, 头颈抽搐, 倒地不起, 后期瘫痪、翻个、共济失调[2]。

2 鸭坦布苏病毒的实验室检查

2.1 组织病理学变化

组织学病变主要表现为卵泡膜出血, 炎性细胞浸润, 卵泡发育停止、闭锁或崩解, 心肌出血, 心肌纤维坏死, 钙化并有大量散在炎性细胞。肝脂肪变性严重, 毛细胆管扩张, 充满胆色素, 血管周围浸润炎性细胞。

2.2 病毒的理化特性

病毒对酸、热、乙醚和氯仿敏感, 50℃度处理1 h病毒失去活性, 在p H5的酸性环境以及p H10的碱性环境处理2 h后丧失活性。病毒纯化后负染, 在电镜下可观察到直径为30~50 nm大小的病毒粒子, 病毒粒子呈球形, 有囊膜, 囊膜上带有纤突。病毒不能凝集鸡、鸭、鹅、兔、鼠、猪和人体红细胞[3]。

2.3 血清学检测

酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是血清学诊断的常用方法, 该方法具有较高的敏感性和特异性, 既可以检测抗体, 又可以检测抗原, 特别适用于大批样品的血清学检测。目前黄病毒属的血清学检测方法有ELISA、AGP、血凝抑制试验 (HI) 、补体结合试验 (CF) 和中和实验 (NT) 等, 但鸭坦布苏病毒 (DTV) 是新发病原, 很多检测方法都还没有建立起来, 现已建立的比较好的检测方法为间接ELISA。已有研究利用超速离心纯化的鸭坦布苏病毒奉贤株 (FX2010) 作为包被抗原, 建立了检测鸭坦布苏病毒血清抗体的间接ELISA方法。

3 总结

2010年4月以来我国江苏、浙江、福建、山东、上海、河南、江西、河北、北京等多个地区饲养的蛋鸭、种鸭、鹅、蛋鸡暴发了1种以食欲急剧减退、产蛋量骤降为主要特征的疫病, 对我国鸭业造成巨大的经济损失。目前国内外关于RNA病毒全基因组测序的方法一般有3种:鸟枪法、分段克隆法长距离RT-PCR, 通过了解病毒的结构及生物学特性对该病毒的分子生物学研究有重要意义, 对进化分析以及一些快速的鉴定方法的建立都有重要意义。

参考文献

[1]殷震, 刘景华.动物病毒性[M].2版.北京:科学出版社, 1997:631-645.

[2]苏敬良.鸭的新型黄病毒BYD引起的产蛋下降综合征[J].兽医导刊, 2011 (4) :27-29.

分子流行病学调查 篇7

关键词：轮状病毒,分子流行病学,疾病负担

1 轮状病毒分子流行病学特点

世界很多国家多年来对RV进行调查研究, 20世纪80年代在欧洲、美国和亚洲的一项流行病学调查显示[2]:RV腹泻流行的G血清型主要是G1～G4, G1～G4血清型的分布是世界范围的, 发达国家和发展中国家无明显差异;同一地区不同年份RV血清型不同, 不同国家、地区同一年份的RV血清型也可不同。1996年Gentsch对全球2700份20世纪80年代至90年代所收集的标本作分型, 发现G1～G4型占优势, G1型比重最高占53%, P[8]基因型几乎都与G1、G3和G4型联系在一起, 而P[4]基因型几乎总是与G2型联系在一起[3]。一种自然重配株P[4]G1有6个国家报道过, 表明这种型的毒株分布很广泛, 也有一些其它毒株的报道包括G5、G8、G9和G10, 它们常常与各种P蛋白相组合, 有时在一个国家内还是流行株。

在美国1998年A组RV流行毒株依次为:P[8]G1占66.4%、P[4]G2占8.3%、P[8]G3占6.9%、P[6]G9占5.5%[4]。在英国A组RV主要血清型为P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4。在澳大利亚2000年7月至2001年5月HRV监测显示其主要流行株为G1占49.5%、G9占18.1%、G2占12.5%、G4占9.7%[5]。在巴西, 能分出型别的单一感染RV的标本中有1/3的血清型在其它地区不常见, 包括P[6]G1、P[6]G3、P[6]G4和P[3]G1型, P[8]G5型占了巴西某些地方单一感染标本的13%, 成为第二常见的流行株[6]。非洲9个国家1996～1999年HRV监测表明, P[8]G1为各监测国流行的主要血清型, 其次为G3, 而G4几乎消失, G2仅在加纳、布基纳法索两国为主要流行株[7]。在孟加拉, 10%的RV毒株类型为自然重配株 (P[4]G1或P[4]G4) 或者是不常见的毒株 (P[6]G1) , G9在1995年检出后成为优势型占16%[8]。在泰国RV G1型为优势血清型, 其次是G2、G4、G3, 至少有3个G型在流行季节同时存在, 1996年～1997年研究显示G9为继G1、G2之后的第三流行型[9]。在印度G1、G2是最常见的RV毒株, G9是新生儿中最常见的毒株, 并且P[6]与常见G型的组合型占可分型的腹泻儿童粪便标本检测总数的43%, 而在1993年及1996～1998年RV流行期间G9检出率为17%～22%, 占第一位[10]。在韩国从开始研究RV到1997年调查表明G1最为流行, 但1998年和1999年的RV爆发主要血清型是G4。Zhou等总结日本1984～1999年RV研究表明, 其主要流行株为G1～G4, 但在1998～1999年, Tokyo和Sappor两市G9成为最主要血清型, 分别占52.9%和71.4%[11]。

在我国流行的轮状病毒同样具有多样性, 我国在1982～1997年13个地区共报告1268株RV血清分型[12]。方肇寅等[13]在1998年4月至2005年3月全国RV流行病学监测期间, 共对3567份RV抗原阳性标本进行G型鉴定, 其毒株血清型依次为G3 (40%) 、G1 (37%) 、G2 (7%) 、G4 (1%) 和G9 (1%) 。7年中G1型的比例逐年降低, G3型比例逐年增加, G3型自2001年代替G1型成为我国主要流行株的趋势很明显。选取837例有单一G分型结果的标本进行P分型, 结果表明P[8]型为主要毒株, 依次为P[4]、P[6]、P[9], 除1999年外, P[8]一直是中国的主要P型, 我国常见3种G、P组合:P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3, 占所有不同毒株的77%。

在我国, 很多地区都开展了R V的分子生物学研究, 福建省大部分地区婴幼儿轮状病毒流行型别以G1P[8]为主, 个别地区以G2P[4]为主[14]。广州研究表明, RV G型以G1为主, P型以P[8]为主, G1P[8]组合占所检测到的标本的84.1%, 其次为G2P[4]型站5.7%和G3P[8]型占2.3%[15];兰州地区RV流行的主要血清型为G 3型;上海地区的研究结果表明R V流行血清型为G 1-G 3型, G4型很少见[16];苏州市研究结果表明轮状病毒G分型以G3为主要流行株, P分型结果以P[4] (39.68%) 为主[17];重庆市1999～2000年度对RV监测结果显示1998～1999年RV以G1型为主, 1999～2000年RV以G3型为主;长春市研究结果表明, 长春地区轮状病毒主要流行血清型由G1转变为G3[18]。

2 轮状病毒腹泻的经济负担

报道显示无论发达国家还是发展中国家, 因腹泻住院的儿童70%左右是RV感染。美国死于RV腹泻的儿童很少, 但是用于和RV感染有关的医疗费用每年可达到3.52～10亿美元。实行免疫计划可以节约0.79亿美元用于卫生保健, 4.66亿美元用于社会其他方面[19]。在澳大利亚RV腹泻的人均住院费用为1744奥元, 每个家庭需支付493奥元[20]。

在2005年的轮状病毒国际研讨会上, 对RV在我国及部分地区引起的经济负担进行的研究显示:在我国, 初步估计<5岁儿童中每年RV引起1300万人次腹泻, 其中250万人需要门诊治疗, 23万人需要住院, 在经济水平不同的地区, <5岁RV腹泻患儿门诊就诊所需费用64～248元/次, 而住院治疗所需费用则为842～1920元/次, 平均门诊治疗费用约为100元, 平均住院费用约为839元, 仅2004年用于治疗<5岁RV腹泻患儿的医疗费用近8亿人民币;在中国台湾, 每例RV腹泻患儿门诊就诊的平均医疗费用估计为23.5美元, 急诊费用约为72.9美元, 而住院费用为344.3美元;在中国香港, 根据2001年4月1日至2003年3月31日的监测结果显示每年到公立医院住院RV腹泻相关费用估计为409万美元;在我国苏州市RV腹泻的人均住院费用为1538.11 (1417.55±635.52) 元, 每日人均费用为266.12元。

RV造成的直接费用是最主要的经济负担, 通过比较可以看出我国RV腹泻患儿的医疗费用要比发达国家低, 但是我国儿童医疗保险体系还在建设中, 这些费用是由患儿家庭支付的, 给患儿家庭带来不同程度的直接经济负担。由于RV腹泻的流行季节集中, 对医院资源的占用和消耗是巨大的, 对地方的卫生保健体系完善有较大的影响。RV造成的间接费用所存在的经济负担不容忽视, 家长陪护所导致的误工费, 疾病所致的许多无形费用如患者及亲友因病而遭受的痛苦、忧虑等精神负担难以用货币衡量, 这些无形的经济损失对RV腹泻造成总费用的影响可能占很大比重。

3 结语

分子流行病学调查 篇8

1对象与方法

1.1研究对象

采用随机数字表法,从广西壮族自治区钦州市钦南区361名HIV-1感染者中随机抽取100人,作为研究对象。所有感染者均经ELISA初筛和WB试验确认。

1.2方法

2014年8月至9月对研究对象进行流行病学调查,并采集外周静脉血。

1.2.1病毒RNA或前病毒DNA提取全血经2500g离心8min,分离血浆 和血细胞,-80℃ 保存。血浆使用病毒RNA提取试剂盒 (德国Roche公司)。 对于RNA扩增失败的样本,则改用DNA提取试剂盒 (北京艾德莱公司)提取前病毒DNA。RNA和DNA提取按产品说明书进行操作。

1.2.2 gag基因序列扩增病毒RNA经逆转录和两轮巢式PCR扩增gag基因,前病毒DNA直接进行巢式PCR。逆转录体系为20μl,取6μl RNA作为模板,反应条件:37℃ 30min;85℃ 5sec。第一轮巢式PCR体系为25μl,取5μl cDNA或DNA作为模板, 反应条件:94℃ 5min;94℃ 30sec,55℃ 30sec,72 ℃ 1min 30sec,40个循环;72℃10min。第二轮巢式PCR体系为50μl,取5μl第一轮产物作为模板,反应条件: 94℃ 2min;94℃ 30sec,55 ℃ 30sec,40个循环;72℃ 10min。扩增和测序引物序列见表1。

1.2.3扩增产物鉴定与测序扩增产物经1% 琼脂糖凝胶,与标准参照物比较,出现目的扩增条带, 长度1080bp,将第二轮扩增产物送北京天一辉远生物公司测序。

1.2.4序列亚型分析与系统进化树分析序列经比对、校正后,用美国国立生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/)提供的在线亚型分析工具Genotyping对序列进行初步分型。从Los Alamos实验室的HIV Database下载标准亚型的gag序列,与样本序列比对,用MEGA 5.03软件构建 邻接系统 进化树 (重复运算1000次)进行分型验证,以Bootstrap值>70%检验进化树拓扑结构的正确性。

1.2.5序列遗传变异特征分 析使用MEGA 5.03软件中的Distance程序(碱基替代模型为Kimura-2parameter model)计算基因离散率。

1.3统计学分析

利用SPSS 16.0软件进行统计学分析。两均数的比较采用t检验;3个或以上样本均数的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1流行病学资料

在100名研究对象中,排除血样不合格者3名,其余97名HIV-1感染者的基本特征如下:年龄9~89岁,20~49岁占62.8%;以异性性 传播为主 (占86.60%),也存在静脉吸毒传播、同性性传播和母婴传播。感染者职业有农民、工人、家务及待业、干部职工、 教师、公共场所服务员等,大部分为农民、民工及工人。 CD 4细胞计数平均为415个/μl。

2.2基因亚型鉴定

97份血样中,成功扩增62份样本的病毒RNA和28份样本的前病毒DNA,7份样本核酸扩增失败。90份核酸扩增成功的样本中,72份测序成功,获得72株HIV-1的gag基因序列。对序列进 行Genotyping分型及进化树验证(见图1),二者分型一致(见表2)。 72份序列中,CRF01_AE重组型占72.2%(52/72), CRF07_BC重组型占13.9%(10/72),CRF08_BC重组型占12.5%(9/72)为,G亚型占1.38%(1/72)。

2.3基因离散率

CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC的gag基因及其编码区段p17、p24的基因离散率见表4。3种重组型的gag基因离散率经方差分析,差异有统计学意义(P<0.01);经SNK检验,CRF08_BC重组型的gag基因离散率大于CRF01_AE(P<0.01)和CRF07 _BC(P<0.01)。不同亚型p24基因的离散率均低于p17,差异有统计学意义(P<0.01)。

注:*与 CRF01_AE比较,q=9.79,P<0.01,与 CRF07_BC 比较,q=4.61,P<0.01;与p17比较,a:t=-33.62,P<0.01; b:t=-14.42,P<0.01;c:t=-9.00,P<0.01。

3讨论

广西早期的HIV-1流行亚型主要有B'亚型、E亚型(即CRF01_AE)和C亚型[3]。当时,CRF01_AE主要在静脉吸毒人群中流行,此后,CRF01_AE通过多种途径尤其是性途径广泛传播,至2008年,CRF01_ AE成为了最主要的流行毒株,同时也有CRF08_BC、 CRF07_BC和B(B')亚型少量存在[4]。本次调查发现钦南区有4种HIV-1亚型,即CRF01_AE重组型 (72.2%)、CRF07_BC重组型(13.9%)、CRF08_BC重组型(12.50%)和G亚型(1.38%)。亚型分布特点与广西其他地区相似[5]。可以看出,CRF01_AE仍然是近年来该 地区及广 西其他地 区的主要 流行亚型。 CRF01_AE为何能在中国南方以及东南亚地区的异性性传播及IDU人群中大量传播[6,7],是否由于病毒传播速度、传播途径、宿主免疫水平等诸多因素使得CRF01_AE成为特定传播途径的优势毒株,确切的生物学机制值得进一步深入研究。CRF01_AE为CXCR4嗜性,其使用CXCR4辅助受体进入细胞的比例高于其他亚型[8],感染后病 情的进展 也快于其 他亚型[9],这提示广西多数HIV-1感染者可能较早地进入艾滋病发病期,同时导致较高的病死率,CRF01_AE的这种生物学特性无疑进一步增加了艾滋病防治工作的难度。

G亚型在国内较为少见,只在部分省份有少量报道[10,11]。2008年研究人员首 次在北海 发现1例经静脉吸毒感 染G亚型的病 例[12]。 本研究在 与北海毗邻的钦 南区发现 的1例经异性 传播的G亚型毒株,二者是否存在传播 关系以及G亚型是否 已经在广西南部小范围流行还有待更深入的流行病学调查 来确认。

HIV-1的gag基因编码HIV-1结构蛋白,包括基质蛋白p17、衣壳蛋白p24、核衣壳蛋 白p9等, p17基因参与病毒复 制的早期 阶段、RNA定位于细 胞膜、病毒颗粒的装配,p24形成特殊的壳体结构,与p9包裹的病毒RNA共同形成病毒颗粒的核心。基因离散率可反映 序列间的 变异程度,以往的研 究认为流行时 间越长离 散率越大。 本研究3种亚型的gag基因离散率 以CRF08_BC最大,CRF07_BC次之,CRF01_AE最小,该结果与陈立力等[13]的研究一致,但各亚型的离散率都有所增大,提示当地HIV1毒株仍在持续进化和多样 化。CRF01_AE重组型在广西流行多年,但基因离散率的变化不甚明显,其原因可能是不同亚型毒株的变异速度还受到病毒宿主相互作用、细胞噬性、选择压力 等因素的 影响。 选择压力还可致各区段离散率的差异,本研究发现,不同亚型p24基因的离散率均低于p17,说明了p17作为体液免疫和细 胞免疫的 靶点,受到宿主 免疫应答的选择压力大于p24。

本次调查为了解当前钦州市钦南区HIV-1分子流行病学特征,以及为今后在该地区开展HIV-1流行病学监测提供了基础数据,这将有助于全面了解当地艾滋病的流行情况和演变趋势。本研究的主要不足是未能成功扩增部分样本的病毒RNA。血样保存、试剂、实验操作等多 个环节都 对RNA有影响,尤其是HIV-1基因序列的高度变异性增加了病毒RNA扩增的难度。考虑到前病毒DNA与RNA的总体进化模式相似[14],为获得更多序列信息,对于病毒RNA扩增失败的样本,我们改用了扩增前病毒DNA的办法, 实验结果可反映病毒RNA的真实情况。

摘要：目的:了解钦州市钦南区HIV-1分子流行病学特征。方法:在钦南区采集100名未抗病毒治疗HIV-1感染者的血液样本,提取病毒RNA或前病毒DNA,采用逆转录/巢式PCR对HIV-1gag基因片段进行扩增并测序。使用MAGA5.03软件对所得序列进行系统进化树分析,并计算gag区及各编码区段的基因离散率。结果:获得72份样本gag基因序列,其中CRF01_AE重组型占72.2%(52/72),CRF07_BC重组型占13.9%(10/72),CRF08_BC重组型占12.5%(9/72),G亚型占1.38%(1/72)。CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC的gag基因离散率分别为0.049±0.004、0.053±0.005和0.059±0.005,差异具有统计学意义(P<0.01)。各亚型p17基因离散率均大于p24基因(P<0.01)。结论:钦南区HIV-1主要流行亚型是CRF01_AE,CRF 08_BC亚型离散率大于CRF 01_AE亚型和CRF 07_BC亚型。

分子流行病学调查 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

采集2009年6月-2010年9月发病的418例哈尔滨市腹泻儿童粪便样本, 通过PCR扩增, 确定yst B基因阳性菌株。

1.2 主要试剂及耗材

生物分型使用的糖类及VP试剂均购自日本和光纯药工业株式会社;分型血清为日本生研株式会社生产;yst B及GAPDH上下游引物、Taq聚合酶、d NTP及琼脂糖购自Takara公司;NotΙ限制性内切酶购自New England Bio Labs Inc (USA) 。

1.3 主要仪器

PCR仪为PCT-200 (美国MJ公司) ;脉冲场凝胶电泳仪为CHEF MAPPER System (美国Bio-Rad公司) ;凝胶成像系统为Labwork-Analyst (美国Gene公司) 。

1.4 yst B基因及其他毒力基因的PCR扩增

参照以往的试验方法[5、6], 取一EP管加入100 p L灭菌dd H2O, 挑取枪头大小的经培养24 h的细菌菌落于灭菌dd H2O中制成悬液, 置-80℃冻存1 h后, 迅速置入沸水浴中20 min;然后12 000 rpm离心5 min, 取上清为细菌粗提模板, -20℃保存备用。取模板DNA1μL, 按照Ta Ka Ra公司PCR试剂盒说明书进行操作。yst B基因引物序列见表1。反应条件:94℃5min, 94℃45s, 61℃45s, 72℃45s, 72℃5min, 共25个循环。反应结束后, 取10μLPCR产物于2.0%琼脂糖凝胶电泳, EB染色, 紫外灯下观察结果, Lab Works 3.0图像软件进行处理, 每个反应均重复3次。

1.5 血清分型及生物型鉴定

通过特殊分离培养基分离的怀疑菌株, 首先进行初步生化鉴定, 然后进行玻片凝集法鉴定;生物型用10%蔗糖、10%木糖、10%密二糖、10%鼠李糖及VP试验。

2 结果

2.1 腹泻儿童的带菌情况

2009年6月-2010年9月发病的哈尔滨市腹泻儿童小肠结肠炎耶尔森菌yst B的阳性率为0.718%。

2.2 yst B基因在小肠结肠炎耶尔森菌中的检测结果

在418例腹泻患儿检测中, 有3例通过PCR扩增yst B基因阳性, 阳性率为0.718%。

2.3 生物分型

3例yst B基因阳性小肠结肠炎耶尔森菌株均符合典型的1A型菌株的生化反应结果。

2.4 血清分型

所有测试菌株, 检测到血清型O∶6为2例, O∶8为1例。

3 讨论

由于生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌不携带毒力质粒及ail、myf A、yst A等致病基因, 一直以来被认为是非致病性菌株, 因此生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌的致病性问题仍然没有得到全面而有效的研究。然而越来越多的临床以及流行病学研究表明部分生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌也可引起类似于致病型小肠结肠炎耶尔森菌的胃肠道症状[7~9], 因此受到越来越多的重视。yst B基因广泛存在于生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌中, 它编码的耐热肠毒素 (YST-b) 可能是生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌感染引起腹泻的主要原因[4、10]。笔者首次选择编码耐热肠毒素基因B (yst B) 阳性的小肠结肠炎耶尔森菌, 对哈尔滨市儿童腹泻患者从分子流行病学角度对其进行全面的分析和研究。

在所有418例被检测的腹泻患儿中, yst B基因阳性表达为0.718%, 并且3例菌株均为生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌。血清型O∶6为2例, O∶8为1例。yst B这一耐热肠毒素于1994年被发现, 其蛋白序列与同源的yst A有着较高的同源性, 在动物试验中, 也可表现出毒力致泻作用[11]。以往的研究发现, 所有O∶3和O∶9致病血清型小肠结肠炎耶尔森菌均不携带yst B基因;而在其他非O∶3和O∶9血清型, 如O∶6, O∶7, O∶8和O∶5等的小肠结肠炎中, yst B基因阳性率为53.6%。本试验中, 虽然yst B基因阳性表达比例并不高, 但由于其仍然可以导致患儿腹泻及相关并发症, 因此仍然需要引起高度重视。

综上所述, 笔者对哈尔滨市携带yst B基因的小肠结肠炎耶尔森菌进行了相关的流行病学分析。所有菌株均属于生物1A型, 以O∶6血清型为多。这些工作可为有效预防、干预和控制小肠结肠炎耶尔森菌的暴发流行提供理论依据和参考。关于yst B基因在生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌感染中的致病机制以及其致病力的具体作用还需要做进一步研究。

摘要：目的 了解哈尔滨市儿童腹泻患者携带ystB基因小肠结肠炎耶尔森菌的分子流行病学特征。方法 通过PCR扩增患儿ystB基因, 通过血清凝集实验及生化反应分析其血清型和生物型。结果 所分析418例腹泻患儿中, 有3例为小肠结肠炎耶尔森菌ystB基因阳性表达;均为生物1A型;检测到血清型O∶6者2例, O∶8者1例。结论 ystB基因阳性表达者均为生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌;血清型以O∶6略多。

关键词：小肠结肠炎耶尔森菌,分子流行病学,ystB基因

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