精原细胞

精原细胞（精选4篇）

精原细胞 篇1

精原干细胞是指位于曲细精管基膜上,既能自我更新,维持自身群体数量恒定,又能定向分化产生精母细胞的成体干细胞,是雄性成体内唯一可将遗传物质传递到下一代的永生细胞,在研究雄性生精过程、转基因动物生产及优良畜种繁育方面有着至关重要的作用[1]。精原干细胞(spermatogonia stem cells,SSCs)作为干细胞中的典型代表,具有较强的自我更新及形成生殖细胞的能力。自1994年R.L.Brinster等人通过生殖细胞移植试验验证了SSCs的存在后,科学家们对SSCs细胞展开了深入研究。

1 SSCs的生物学特性

精原干细胞由来源于原始生殖细胞(PGCs)的未分化的生殖母细胞构成。出生后不久,原始生殖细胞形成的生殖母细胞将转变为精原干细胞。2000年,L.R.Franca等[2]在小鼠中发现,原始生殖细胞在受精10.5 d后迁移到生殖嵴,分化为生殖母细胞。在自我复制几天后,生殖母细胞停滞在G0/G1期。随后M.Culty在2009年发现动物出生后,生殖母细胞恢复有丝分裂,由精细管中央向周边迁移,最后到达基底膜分化为精母细胞。

精原干细胞像绝大多数成体干细胞群一样,其功能的维持和生存所需物质的提供由“龛”来完成。这里所说的龛就是维持细胞自我更新和分化的微环境。M.Kokkinaki等[3]和J.M.Oatley等[4]研究发现,支持细胞、小管周肌样细胞、睾丸间质细胞对SSCs生存环境的维持起到重要作用。支持细胞为SSCs及其分化成的生殖细胞提供营养并协调信号传导,保证精子的产生。此外,支持细胞产生的神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)和碱性成纤维细胞生长因子(b FGF),均对SSCs体外培养、自我更新具有重要作用。小管周肌样细胞和睾丸间质细胞产生的集落刺激因子(CSF1)与GDNF有协同作用,促进SSCs生长。此外,睾丸间质细胞还能够产生对维持精子发生有重要作用的物质。R.L.Brinster[5]和F.K.Hamra等[6]研究发现,SSCs作为成体干细胞,可在亲本和子代之间传递遗传信息,在动物遗传育种繁殖中有重要的应用价值。同时,SSCs可以通过基因转染、同源转染生产转基因动物,可大幅提高生产力,具有重要的商业价值。另外,通过研究SSCs微环境也为研究干细胞自我更新和分化机制提供了良好的模型。

2 SSCs的分子标记

细胞表面标志在细胞分离纯化过程中起着至关重要的作用。在SSCs体外培养和移植过程中,对SSCs进行分离纯化都是极为重要的。长期以来,研究人员一直在寻找SSCs的特异性标志,但直到目前还未发现。关于小鼠SSCs表面分子标记物已有大量研究,如Itga6、Itgb1、Gfra1、Thy1、Cd9、Cdh1、Lin28、Gpr125、Zbtb16(Plzf)、Pou5f1(Oct4)、Id4和Nanos2均已有研究。2011年,M.J.Oatley等[7]研究发现,DNA结合抑制剂4(Id4)可标记小鼠的单个精原细胞,并具有特殊的表达形式,可作为鉴别小鼠SSCs的表面标志物,此发现在SSCs特性研究的道路上具有里程碑的意义。对家畜精原细胞表型标记方面只有少量的标记物被发现。其中具有代表性的是UCHL1(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1),又被称作PGP9.5,是Y.Kon等人1999年在鼠精原细胞上首次发现的。之后有研究者对睾丸中UCHL1在猪、牛、水牛和山羊上的表达进行了进一步验证,结果发现,UCHL1在雄性生殖细胞中表达,而在体细胞中不表达,是家畜鉴别精原细胞最有效的分子标记物。PLZF(promyelocytic leukemia zinc-finger protein)又被称作ZBTB16,是维持SSCs生长及其自我更新的重要转录因子,2004年在鼠精原细胞中被发现,随后在猪、牛、绵羊、山羊及马的生殖母细胞和生殖精细胞群中都发现了PLZF的表达。与UCHL1和PLZF不同的是,DBA(dolichos biflorus agglutinin)在鼠生殖细胞中不表达,在其他动物上的表达也不同。S.Goel等[8]研究发现,在公猪上,DBA只标记原始生殖细胞、生殖母细胞和精细胞,且随着雄性动物年龄的增长表达量降低。在牛和水牛上,DBA在生殖母细胞和A型精原细胞上均表达,且其表达谱与UCHL1相似;但在绵羊的不同生长发育阶段的生殖细胞中,DBA的表达规律依旧不清楚。因此,尽管DBA可以在一些大型动物中标记生殖母细胞和精细胞,但在羊上还不成功。

小鼠SSCs分子标记研究的成功为小鼠SSCs建系提供了巨大保证,因此为SSCs寻找一个独特的表面标记物在未来的研究中将面临巨大挑战,其研究对促进SSCs的研究起巨大推动作用。此外,对家畜SSCs及其祖细胞的生物学标记研究需进行更深层次的探索,从而促进家畜SSCs建系的早日实现。

3 SSCs的分离、纯化

由于动物体内精原干细胞数量仅占生精细胞总数的0.02%~0.03%,不易分离,因此取材时间及分离方法对获得较纯的精原干细胞有至关重要的作用。取材过早,SSCs尚未形成;取材过晚,SSCs已分化为其他细胞类型。分离方法效率的高低直接决定后续试验是否能够顺利进行,在SSCs本身含量很少的情况下,分离方法的选择至关重要。

根据前人的研究总结发现,在取材时间方面,一般选取出生后不久或青春期前的动物来分离培养精原干细胞。通常采用出生后6~8日龄小鼠、9~10日龄大鼠、15~19日龄鸡胚、5~7月龄牛、4月龄羊及1月龄猪进行精原干细胞的分离培养。前人总结出进行精原干细胞分离纯化的方法主要有流式细胞仪分选(FACS)、磁珠分选(MACS)、差速贴壁、细胞外基质分选(ECM)、差速沉降和密度梯度离心法等。F.Izadyar等人通过结合使用差速贴壁和Percoll细胞分离法均提高了A型精原细胞的纯度,在对牛和水牛的研究中,纯度分别提高到70%和55%以上。S.Ahmad等[9]研究发现,在水牛上使用ECM(层黏连蛋白和明胶)结合Percoll梯度分离法分离获得的A型精原细胞的纯度高达90%。在羊上,U.Borjigin等[10]通过试验比较了不同差速贴壁的纯化效率,结果发现,睾丸成熟度是影响精原细胞复苏的重要因素。研究发现,使用层黏连蛋白和纤连蛋白通过ECM方法分离奶山羊精原细胞效果最好[11]。在公猪上用不同方法纯化的效果不同,其中Y.Yang等[12]采用差速贴壁后以Nycodenz离心法分离新生的生殖母细胞,结果纯度高达90%。流式细胞仪分选(FACS)是通过使用分子生物学信号标记细胞来纯化大动物的精原细胞。在猪上,Y.H.Kim等[13]对细胞进行SSEA1标记,通过FACS分选获得大量未分化的精细胞。但在牛上,M.Herrid等[14]通过FACS分选使DBA阳性表达的细胞产生大量四聚体。目前,磁珠分选(MACS)越来越多地被国内学者用于研究精原细胞的分离和纯化。2010年,S.C.Reding等[15]用MACS方法获得牛未分化的精原细胞,其中PLZF阳性表达细胞占THY1阳性表达细胞的64.4%。MACS与其他方法相比具有操作简单节、省时间等优点。但另一方面,MACS虽然不需要对细胞处理,但分选时选择生存能力较强的细胞对后续SSCs细胞的培养和处理有促进作用。与FACS相比,MACS可以按照比例缩小,从而适应含有大量细胞的单细胞悬液,而FACS需要时间来增加细胞量。MACS在分离纯化精原细胞研究中的作用日益突出。精原细胞分离纯化的方法日益成熟,为SSCs的收集奠定了基础,但由于SSCs特殊标志物的缺乏,目前只能通过体内移植获得大量SSCs。

4 SSCs的体外培养

体外培养是扩增SSCs并验证其自我更新和分化能力的先决条件。至今为止,科学家们已经建立了小鼠、兔子和仓鼠的体外培养体系。尽管研究人员对家畜SSCs体外培养进行了大量研究,但只能在体外进行少于2个月的短时间培养。据相关报道得出,在体外易获得家畜SSCs细胞,并且原代培养可顺利进行。但后续的继代培养,伴随着时间的推移,细胞分化和细胞凋亡逐渐占据了主导作用,最后细胞增殖停滞。如何解决上述问题成为科学家关注的焦点。

在培养基使用方面,高糖DMEM和DMEM/F12目前被广泛应用于家畜SSCs的体外培养。研究表明,DMEM极有可能同时促进SSCs的自我更新和分化。Stem Pro培养基自身含有特殊成分,常被应用于小鼠和仓鼠SSCs的长时间体外培养。P.M.Aponte等[16]和E.W.Kuijk等[17]分别尝试使用Stem Pro培养基体外培养公牛和猪的SSCs,但是结果都不理想。因此,对家畜SSCs进行体外培养使用的培养基仍有待进一步研究。

在添加生长因子方面,人们普遍认为在培养基中添加神经胶质源性细胞生长因子(GDNF)对小鼠SSCs体外培养有促进作用。研究表明,Gfra1作为GDNF家族中的一种,在家畜SSCs体外培养中具有不可代替的作用。然而,碱性成纤维生长因子(b F-GF)、表皮生长因子(EGF)、白血病抑制因子(LIF)等因子在啮齿类动物SSCs培养过程中起到的作用已有深入研究,但在家畜SSCs培养过程中这些因子的作用拥有广阔的研究前景。

在使用血清和饲养层方面,2011年M.KanatsuShinohara等[18]建立了鼠SSCs的无饲养层和无血清培养体系,但在家畜SSCs体外培养上尚未成功。血清自身成分不明确,却能促进体细胞的大量增殖,其对体外培养体系的建立有一定阻碍作用。M.Bahadorani等[19]和Y.Zheng等[20]分别在2012年和2013年研究发现,高浓度血清会影响山羊和猪SSCs的增殖。因此,降低血清浓度有利于促进SSCs的增殖。另外,使用组分明确的血清替代物也日益受到研究人员的青睐。在饲养层使用方面,小鼠胚胎成纤维细胞饲养层(mouse embryonic fibroblast,MEF)是常用饲养层,近年来自身物种的支持细胞也常被用作SSCs的培养。但以其作为饲养层的一个缺点是,其自身分泌多种生长因子,其中也包含促使SSCs分化的因子。

因此,如何解决上述问题成为SSCs长时间体外培养的突破口,成为未来几年精原干细胞研究的重中之重。

5 SSCs的移植

将SSCs注入受体不育睾丸中,可使受体完成精子发生并产生精子。自1994年Brinster等人建立了生殖细胞移植模型以来,此项技术成为鉴定体外培养SSCs功能干细胞特性的有效方法。在过去的十年中,科学家们尝试使用睾丸异种移植代替生殖细胞移植。2002年,A.Honaramooz等[21]将新生仔猪和山羊的睾丸移植到免疫缺陷的小鼠上,实现了精子发生。自此异种睾丸移植在家畜动物上有了广泛的应用。2010年,M.Nakai等[22]通过睾丸异种移植,第一次在活猪上实现了精子发生。2007年,A.Honaramooz等[23]研究发现,睾丸组织从头合成技术在SSCs体外培养研究上具有重大意义。K.Kita等人从出生猪获得体细胞和原始生殖细胞的混合细胞,植入免疫缺陷小鼠背部皮肤,4周后植入的细胞重新构建了类似曲细精管的结构。30周后,精子细胞出现在从头合成的组织中。但此方法中精子发生率只有10%~20%,还需后续试验不断提高。

6 小结

精原干细胞作为精子发生的前体细胞,并且是唯一在自然条件下将自身遗传信息传递给下一代的细胞,在动物繁殖领域研究中有重要作用。近几年对其生理特性、体外培养及移植技术的研究加快了科学家们对动物精子发生机制、生产转基因动物及保护濒危动物研究的步伐,研究精原干细胞自我更新及分化调控将对未来研究起到不可估量的作用。

精原细胞瘤的围术期护理 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年1月-2013年6月笔者所在医院收治的15例睾丸肿瘤患者, 年龄17~38岁, 平均 (25.14±3.30) 岁;其中左侧9例, 右侧5例, 双侧1例;临床分期[2]:Ⅰ期11例, Ⅱa期1例, Ⅱb期3例。肿瘤标志物检测:甲种胎儿球蛋白 (AFP) 均在正常范围, 人绒毛膜促性腺激素h CG (9.42±2.31) ×103U/L, 乳酸脱氢酶LDH (396.51±28.32) U/L。均于肿瘤根治性切除术后病理检查证实为精原细胞瘤, 其中伴有合体滋养细胞层细胞2例。依据梅骅等[3]的手术方法均予行睾丸肿瘤根治性切除术。

1.2 方法

1.2.1 术前护理

1.2.1. 1 心理护理

患者确诊睾丸肿瘤后, 明显表现出焦虑、恐惧及悲观情绪, 其主要原因是患者对疾病本身、手术治疗及继后的放/化疗效果缺乏正确的认识和对生育功能及性功能的担忧等, 可导致患者放弃治疗。因此, 需向患者讲解该疾病的治疗过程、手术方式、放/化疗的意义、方法及以后可能出现的不良反应, 消除患者疑虑, 使之处于良好的心理状态。重视家属对患者的关心, 无微不至的关怀和理解给患者以安慰和希望, 缓解患者的恐惧感。医护人员及家属共同配合使患者在精神上有可依靠感, 树立战胜疾病的信心, 对治疗的顺利进行起到重要的作用[4,5]。

1.2.1. 2 术前准备

(1) 检查心、肺、肝、肾功能及全身情况, 以防发生意外。 (2) 加强术前体位训练, 因睾丸肿瘤根治术通常需要切除会阴部、腹股沟处的大量淋巴组织, 术中缝合皮肤会产生术后不适, 因此术前对患者进行卧床体位训练, 用枕头垫衬减少过分活动来减少牵拉和缝线张力, 使患者熟悉术后卧位及方法, 减少术后不适[6]。 (3) 术前一晚灌肠, 睡前口服舒乐安定, 保证睡眠质量。术日晨禁食12 h, 禁水6 h, 术前30 min给予安定10 mg和阿托品25 mg肌内注射。

1.2.2 术后护理

1.2.2. 1 一般护理

(1) 术后给予去枕平卧6 h, 头偏向一侧。严密观察术后患者的病情变化, 视病情测量患者体温、血压、脉率、呼吸、血氧饱和度及心率等生命体征的变化。 (2) 手术切口每天用0.5%聚维酮碘消毒, 更换创可贴, 1次/d。穿宽松衣服, 活动时避免挤压切口[7]。

1.2.2. 2 阴囊局部的观察和护理

阴囊组织结构疏松, 术后容易出血, 形成血肿, 特别是淋巴切除术患者出血危险性更大, 应当充分观察出血情况。在巡视患者和为患者换药过程中, 认真观察皮肤颜色变化、阴囊有无肿胀、伤口敷料有无渗血, 渗血多时, 及时更换敷料, 防止切口感染。嘱患者平卧时拾高阴囊, 预防对侧阴囊水肿。

1.2.2. 3 预防术后泌尿系感染

术后遵医嘱应用抗生素抗感染, 换药过程中要严格无菌操作。保持尿道口的清洁, 每天两次用消毒液擦拭外阴及尿道口、龟头周围导尿过程中防止逆行感染。若有留置导尿者必须保持导尿管通畅, 防止压迫、扭曲或脱落。护士巡视病房时注意观察尿液的颜色、性质和量, 观察有无血凝块、沉淀及尿管堵塞等。本组无一例出现泌尿系逆行感染。

1.2.2.4饮食及排便护理

加强营养支持, 进行饮食指导。若患者有肛门排气则可进食流质食物, 一般术后第2天即可进食, 逐渐过渡到普食。指导患者进食高蛋白、低脂肪、营养丰富易消化的食物, 多食粗纤维食物, 避免刺激性食物。嘱患者多饮水, 防止便秘, 以防用力大便引起活动。

1.2.3 术后放、化疗护理

1.2.3. 1 术后放、化疗方案

Ⅰ期精原细胞瘤辅助性放疗针对主动脉旁区域或联合同侧髂腹股沟区域的中等剂量 (20~24 Gy) , 应在术后1个月内进行[1]。辅助化疗则选择单周期卡铂辅助化疗方案。Ⅱa/Ⅱb期术后放疗剂量分别是30 Gy和36 Gy, 放射野从主动脉旁扩展到同侧的髂血管旁区域。对于不愿意接受放疗的Ⅱb期患者可以实施3个疗程BEP (顺铂、鬼臼乙叉苷和博来霉素) 或4个疗程的EP (顺铂、鬼臼乙叉苷) 化疗。

1.2.3. 2 放、化疗的心理护理

放、化疗前详细讲解药物的性能、作用以及可能出现的不良反应, 消除患者顾虑, 增强治疗信心, 以最佳的心理状态积极配合治疗。加强心理护理可显著提高睾丸肿瘤根治术后患者放化疗期间治疗的依从性, 改善其生活质量[8,9]。

1.2.3. 3 放、化疗常见副作用的护理

放疗的副作用包括生精能力减弱、胃肠道症状 (消化性溃疡) 和继发性肿瘤。以顺铂为主的化疗方案的主要不良反应是肾毒性、胃肠道反应及骨髓抑制。给予加强对症支持和肾功能的监测。

1.2.4 出院指导

随访应列为出院指导的主要项目。随访的目的在于发现复发病灶或第二原发肿瘤病灶, 监测化疗和 (或) 放疗的毒副作用, 监测远期心理健康 (例如对心功能的影响) , 监测放射反应等。随访的项目包括临床体格监测、血清肿瘤标志物、血清生化指标、影像学检查和心理健康程度。笔者所在医院随访方法:两年内血清肿瘤标志物、血清生化指标每3个月复查一次, 影像学检查如胸片、CT等每半年一次, 以后每年一次, 直至5年随访结束。

2 结果

15例患者全部配合顺利完成手术, 平均住院 (8.2±1.5) d, 病愈出院。向患者发放自拟评分表调查患者住院满意度, 设十分满意、一般满意、不满意三个等级。其中十分满意12例, 一般满意2例, 不满意1例, 患者满意度93.33%。

3讨论

睾丸肿瘤的治疗已经成为实体肿瘤综合治疗的成功典范。及早完善相关检查, 是早发现精原细胞瘤的重要手段, 对疾病的预后起着重要的作用。阴囊超声是诊断睾丸肿瘤的有效手段, 敏感度达到90%以上。胸片能判断有无胸部转移。CT对于腹膜后淋巴结评价具有很高的敏感性, 但是同时具有一定的假阳性率[10]。肿瘤标志物, 尤其是甲胎蛋白对于睾丸肿瘤的诊断和预后有显著的意义。但本组病例全部患者甲胎蛋白正常, 人绒毛膜促性腺激素、乳酸脱氢酶在任意范围, 说明精原细胞瘤与肿瘤标志物无相关。这点与非精原细胞瘤不同[11]。

患者治疗方式的选择对预后有重要的影响。董培等[12]对72例临床Ⅰa期睾丸肿瘤分为观察组、化疗组和腹腔镜下腹膜后淋巴结清扫术 (LRPLND) 组并对疗效进行分析, 发现观察组复发率显著高于RPLND组。其中5年无疾病进展生存率RPLND组为100%, 化疗组也达到93.3%, 显著高于对照组的84.0%。随着腹腔镜技术的提高, LRPLND治疗睾丸癌逐步受到泌尿外科医师的重视。目前LRPLND是治疗睾丸精原细胞瘤比较好的方法, 既获得了有无肿瘤转移的准确诊断, 又可同时进行治疗。那彦群等[1]建议术后辅助性放疗作为Ⅰ期精原细胞瘤的标准治疗方案, 可把肿瘤复发率降至1%~3%。而张学齐等[13]对58例Ⅰ期精原细胞瘤根据睾丸癌根治术后治疗方式不同分为化疗组30例、放疗组8例、观察组20例, 发现化疗组疗效优于观察组, 而放疗组与观察组差异无统计学意, 可能是因为放疗组例数过少。

腹部隐睾精原细胞瘤的CT诊断 篇3

1 材料与方法

1.1 一般资料

搜集2003年2月~2010年5月间经手术病理证实有CT扫描资料的腹部精原细胞瘤7例,均为男性;年龄28~53岁,平均38.5岁;病程3个月~2.5年;临床患者均以无痛性、进行性肿大腹部包块来诊,其中1例入院后未做外生殖器体检,忽略了患者有隐睾病史,肿块较大,病程约2.5年,并有腹膜后多个淋巴结肿大,CT诊断不除外恶性淋巴瘤。其余6例均在术前考虑为精原细胞瘤。

2.2方法

本组病例采用SIEMENS HIGHQ和岛津SCT-4500TE CT机,扫描层厚、层距10 mm,部分用薄层5 mm,全部做平扫加增强。

2 结果

2.1 肿瘤的CT表现

4例单侧腹部肿块中,右侧3例位于腹膜后右肾下方至盆腔入口处,左侧1例位于第4腰椎左缘旁,肿块长轴与正常睾丸下行路径一致;3例较大的肿块跨越脊柱前方,位于腰3至骶1前水平,其中1例肿块中心偏右。

2.2 肿瘤的大小

最小者4 cm×5 cm×7 cm,最大者8 cm×10 cm×11.6 cm。

2.3 肿瘤的形态

6例为类圆形或椭圆形,1例呈不规则形肿块。

2.4肿瘤的密度及边缘

7 例肿块平扫时为不均匀软组织密度,内有不规则斑片状低密度坏死区,增强扫描肿块实质部分中等度均匀强化,坏死区不强化;6例肿块边缘清晰,其中4例有浅分叶,周围结构受压移位;1例边缘模糊,与周围组织结构呈浸润改变,伴腹膜后腹主动脉旁多个淋巴结肿大。

3讨论

睾丸肿瘤在我国的发生率相对较低,约占男性恶性肿瘤的2%,其中最多见精原细胞瘤,在所有精原细胞瘤中,9%发生于隐睾[1],隐睾是胎儿期腹膜后腰部的睾丸在下降过程中出现异常,而停留于腹膜后、腹股沟或其他部位,称为隐睾。正常胎儿在第9个月睾丸已下降进入阴囊,部分出生时睾丸未进入阴囊的,出生后4~6周下降完全,早产儿出生后到12周才下降完全,有0.3%~0.4%成年后睾丸完全未降[2]。位于腹内型隐睾易发生萎缩或产生肿瘤,其肿瘤发生率比较高,约22.7%[3],比正常睾丸发生肿瘤的几率高20~40倍[4],以精原细胞瘤最为多见。主要发生于25~40岁之间[5]。本文收集7例患者中,该年龄段有5例,平均年龄38.5岁,与文献报道基本相符。隐睾发生恶变的病理生理机制尚不完全清楚,多数学者认为,与腹内隐睾温度较高于阴囊的因素有关;近年来文献显示[6],下丘脑-垂体-性腺轴功能异常,导致激素水平的改变,也可能是睾丸癌发生的原因。

腹内型隐睾精原细胞瘤的CT征象:(1)肿块为软组织密度影,中央多有不规则囊变坏死,很少有钙化,增强扫描肿块实质部分较均匀中度强化,其内坏死灶不强化;(2)肿块长轴与正常睾丸腹内下降路径一致,较大的肿块跨越脊柱前方位于腹膜后;(3)肿块大部分边缘光整清楚,多有浅分叶,晚期可侵犯周围组织结构,而境界不清;(4)以淋巴转移为主,腹主动脉旁多见,转移性淋巴结一般较大并常出现坏死[7],此有助于CT影像鉴别诊断,血行转移较少见;(5)CT增强动脉期见增粗扭曲的睾丸动脉供血,静脉期见睾丸静脉引流,是提示肿瘤发生于腹内未降睾丸的直接CT征象,具有特征性[8];(6)隐睾精原细胞瘤异位于腹部,虽具有一定的特征性,诊断应与恶性淋巴瘤、神经类肿瘤、畸胎瘤鉴别。

综上所述,腹部隐睾的精原细胞瘤的CT表现具有一定的特征,密切结合临床对腹部隐睾的精原细胞瘤的诊断具有重要意义。

摘要：目的:探讨腹部隐睾精原细胞瘤的CT特点,以提高对本病在腹部肿瘤中的诊断。方法:总结分析经手术病理证实的7例精原细胞瘤,对其影像表现进行回顾性分析。结果:4例表现为单侧腹部肿块,内见不规则小片状低密度坏死灶,肿块长轴与睾丸下行路径一致,3例较大肿块跨越脊柱前方位于腹膜后。结论:隐睾精原细胞瘤的CT征象具有相对的特征性,密切结合临床综合分析,对于本病的诊断有重要价值。

关键词：腹部肿瘤,隐睾,精原细胞瘤,体层摄影术

参考文献

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精原细胞 篇4

1994年, Brinster等建立了精原干细胞移植技术, 实现了供体小鼠的精原干细胞在受体进行精子发生和单倍体的生殖遗传, 这为治疗雄性不育和保护濒危物种提供了一种可能的新途径。但精原干细胞的数量非常少, 睾丸中的精原干细胞与全部生殖细胞的比例为2∶10 000～3∶10 000, 并且随着出生后时间的延长精原干细胞分化形成各级生精细胞。为了提高移植效率, 需要将精原干细胞分离出来以达到富集的目的;同时为了有效评价移植效率, 还要区别受体和供体来源的精原干细胞, 这都需要采用有效的标记方法对这些细胞进行标记。从单纯的免疫组织化学技术到直观简单的荧光标记, 再到可用于活体示踪的磁共振成像技术, 细胞标记技术经历了漫长的发展和改良过程。文章对这些标记技术的原理、优缺点及应用进行了探讨。

1 光镜及电镜的常用标记物质

1.1 胞浆标记物

常用的精原干细胞胞浆标记物主要有Hoechst、PKH和DiI等。Hoechst是与DNA特异性结合的活性染料, 在紫外光激发时发射出明亮的蓝色荧光。用Hoechst33342染精原干细胞时, 精原干细胞胞膜表面有ATP BINDING CASSETTE (ABC) 蛋白, 此蛋白能够将部分染料转移出细胞, 表现为细胞核不着色或者很低程度着色, 利用流式细胞仪可以将这些不着色的细胞分离, 因此能利用免疫荧光激活细胞分选术 (FACS) 分选精原干细胞。PKH包括发绿色荧光的PKH67和发红色荧光的PKH26, 稳定结合于细胞膜的脂质双分子层, 产生稳定、清晰、精确和可重复的荧光标记细胞, 广泛用于动物、植物细胞和其他含颗粒胞膜细胞的标记, 无细胞毒副作用, 标记的细胞仍保留生物学和增殖活力, 标记时间在100 d以上, 适合体内外细胞迁移研究。但随着细胞的分裂, 标记物也几乎等份地分配给2个子细胞, 子细胞的荧光强度也随之下降, 只能靠观察到的荧光判断细胞的存在, 难以观察细胞形态。PKH26被广泛用于牛、猪、鸡、山羊等动物精原干细胞的标记、追踪方面。DiI是一种亲脂性碳花青染料, 容易嵌入生物质膜内并在膜内进行定向扩散从而标记整个细胞。

1.2 核酸标记物

常用的核酸标记物有4, 6-联脒-2-苯基吲哚 (DAPI) 和溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU) 等。4, 6-联脒-2-苯基吲哚是一种显现活细胞或固定细胞DNA 的荧光染料, 产生的荧光强度与细胞内DNA含量成正比。没结合DNA 的4, 6-联脒-2-苯基吲哚荧光很弱, 而一旦和DNA结合则表现出很强的蓝色荧光, 并且对细胞相对无毒, 不改变细胞的超微结构。4, 6-联脒-2-苯基吲哚最大的优点就是标记技术简单, 标记效率很高 (起初达100%) , 能清楚地观察到被标记的细胞。缺点是细胞分裂将导致4, 6-联脒-2-苯基吲哚淬灭及收缩蛋或其他蛋白染色产生的强背景色等引起标记强度降低。4, 6-联脒-2-苯基吲哚仅适于短期定量分析, 很少在精原干细胞的活体追踪中使用。溴脱氧尿嘧啶核苷是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物, 通过竞争掺入S期细胞, 只要细胞不消亡, 溴脱氧尿嘧啶核苷就在胞核的DNA 中长期存留, 经免疫组织化学染色可观察到溴脱氧尿嘧啶核苷向细胞内掺入的情况, 故溴脱氧尿嘧啶核苷标记和检测的准确性高, 标记率高, 方法简便、迅速、安全, 是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。供体来源的精原干细胞被标记后移植到受体, 在受体睾丸中的增殖和分化可以利用抗溴脱氧尿嘧啶核苷抗体免疫组织化学方法进行鉴定。但细胞移植经过一段时间之后, 标记细胞如果发生凋亡或死亡, 释放的溴脱氧尿嘧啶核苷就可掺入处于S期的任何细胞, 溴脱氧尿嘧啶核苷标记的细胞将不仅仅限制在供体细胞内, 从而无法区分供体和受体。因此, 溴脱氧尿嘧啶核苷仅适合短期标记。

1.3 报告基因标记物

标记精原干细胞时, 常使用绿色荧光蛋白 (GFP) 和增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 作为报告基因。绿色荧光蛋白是1962 年由Shimomura O 等首次从多管水母属中分离纯化得到的, 该蛋白能自身催化形成发色团结构且在蓝光激发下还可发出绿色荧光。作为报告基因, 绿色荧光蛋白具有分子质量小、能在活细胞中表达、对细胞无毒性的优点;作为荧光标记分子, 绿色荧光蛋白具有敏感的标记检测率, 并且没有放射性的危害, 荧光的产生无需任何底物或辅助因子, 可耐受光漂白及甲醛固定, 可制成长期保存的标本, 因此在精原干细胞的标记和活体追踪中被广泛应用[1]。目前, 通行的方法是先以逆转录病毒或慢病毒为载体将绿色荧光蛋白或增强型绿色荧光蛋白转入精原干细胞中, 再移植到受体睾丸中 (受体可先用白消安或X射线照射除去生精小管中的内源精原干细胞) , 移植的精原干细胞在受体睾丸中成活并开始增殖和分化成精子, 最终产生绿色荧光蛋白转基因动物。目前, 已成功地生产出绿色荧光转基因小鼠[2]。

除了绿色荧光蛋白之外, lacz基因也是常用的报告基因。lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因, 是由以Beckwith博士为首的研究小组于1969年首次分离得到的。该基因编码一种由4个亚基组成的四聚体beta-半乳糖苷酶 (beta-gal) , 该酶能催化乳糖水解, 使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-beta-半乳糖苷 (X-gal) 分解产生6种蓝色化合物, 从而使转导阳性细胞呈蓝色, 而被用作标志基因。用5-溴-4-氯-3-吲哚-beta-半乳糖苷作为底物进行染色时呈蓝色, 便于检测和观察, 并且对转导细胞的活力及生长无损害。lacz基因的诸多优点使其成为基因工程实验中的一个常用标记基因[3]。

值得注意的是, 经基因修饰的细胞其遗传特性并不稳定, 可能在分析正常基因对子代细胞分化方向时产生影响, 因而其应用价值有待于进一步评价。

2 活体示踪精原干细胞常用的细胞标记物质

有关精原干细胞在体内迁徙能力的研究, 目前采用的方法多是在移植后的一定时间内先阉割或者处死实验动物, 再对睾丸组织进行切片。而这种侵袭性的方法, 不能对同一动物精原干细胞在睾丸中迁徙、增殖情况进行动态观察。而且与动物实验不同, 精原干细胞移植后组织取材、体外检测不适于人体。故需要用非侵袭性的手段对移入人体内的精原干细胞进行监测。如何在活体监测精原干细胞的存活或分化情况, 是各国学者面临的一个共同问题。目前, 可以用于精原干细胞移植研究的无创伤性手段主要有以下两种技术:核医学分子显像技术活体示踪精原干细胞和磁共振成像 (MRI) 活体示踪精原干细胞。

核医学分子显像技术包括单光子发射计算机断层 (SPECT) 显像和正电子发射断层 (PET) 显像。各种组织或细胞都有特异或相对特异的分子标志物, 利用适当的放射性核素标记将可以与这些标志物特异结合的分子作为探针, 能够在活体显示组织、细胞的存在和状态, 并且具有灵敏度高、可定量等优点[4]。这对精原干细胞移植非常重要, 尽管在移植前可以在体外对精原干细胞进行富集, 但移植到受体睾丸内的精原干细胞数量相对于睾丸组织仍然很少, 其分子表达更是微量。

磁共振成像是Jeff B设计出的一种小的磁性标记, 用于追踪受标记的移植细胞在体内的运动信息, 从而得知移植细胞的未来命运。磁共振成像是一种非侵入性技术, 利用强磁铁和无线电波生成人体组织或一些内部结构的图像, 具有多功能、多序列、多参数、多方位成像及较高的软组织分辨力等优点, 通过该技术对精原干细胞进行可视化和追踪需要将精原干细胞进行磁性标记以便它们与其他组织有所区别。

3 结语

有关精原干细胞标记和活体追踪方面的研究虽然取得了一定进展, 但尚有许多问题需要解决, 尤其是使用核医学分子显像技术和磁共振成像活体示踪精原干细胞还没有重要突破。相信随着科技的发展及相关试验的不断深入, 精原干细胞的活体标记检测必定能够得到有效解决。

参考文献

[1]唐孝青, 李斌, 伍小兵, 等.绿色荧光蛋白及其应用的研究进展[J].陕西农业科学, 2007 (1) :145.

[2]BRINSTER C J, RYUB Y, AVARBOCKMR, et al.Restoration offertility by germ cell transplantation requires effective recipientpreparation[J].Biol Reprod, 2003, 69 (2) :412-420.

[3]何维, 吴鹤龄.广泛用于基因表达调控研究中的lacz基因[J].遗传, 1995, 17 (5) :45-46.