红细胞超氧化物歧化酶（共8篇）
红细胞超氧化物歧化酶 篇1
据国际糖尿病联盟 (IDF) 预测, 2035年全球糖尿病患者将增加到5.92亿[1]。活性氧增加是糖尿病高血糖损伤脏器的原因之一[2], 活性氧积累会使细胞损伤和伤口新生血管障碍, 直接导致肢体皮肤缺血溃疡, 发生在下肢的缺血性溃疡为糖尿病足 (DF) , 该病发病率为13.5%~16.7%, 致残率为1‰~2.1‰, 严重危及患者生命[3], 目前移植MSC到糖尿病伤口, 可以通过促血管新生、毛囊再生等途径促使伤口愈合[4], 但是MSC自身也受到高血糖的影响, 如何在高血糖条件下, 促进MSC抗自由基作用, 发挥MSC的治疗效果, 是值得探讨的重要课题, 超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽氧化还原酶 (GSHPX) 等物质, 锰超氧化物歧化酶 (Mn SOD) 和铁超氧化物歧化酶 (Fe SOD) 等是重要的SOD家族成员, Mn SOD在SOD家族中发挥重要作用, 但是高糖条件下通过Mn SOD逆转自由基损害, 发挥对MSC的保护作用研究较少[5]。该研究于2012年9月—2013年2月进行试验研究, 阐明Mn SOD转染的MSC对抗氧化应激反应的能力, 探索Mn SOD-MSC促进糖尿病足愈合的效果, 对促使MSC细胞疗法的临床应用广泛开展具有重要经济意义和社会效益, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
人脐带血间充质干细胞 (MSC) 购自广州赛业生物有限公司 (广州, 中国) 。用含10%胎牛血清 (FBS, Gbico, USA) , 1μmol/L青霉素, 100 U/m L链霉素 (Sigma) 的α-MEM基本培养基培养MSC, 第3~4代进行实验。分别在α-MEM基本培养基中培养Mn SOD转染的MSC实验组、pc DNA3.1空质粒转染的MSC对照组、未转染的MSC空白对照组, 各组实验条件相同。
1.2 Mn SOD基因转染MSC
上海生工生物有限公司设计Mn SOD基因引物。pc DNA3.1-Mn SOD由该实验室构建保存并提取质粒DNA。添加500μL 1%DNA-Lipofectamine2000, 孵育48 h, PBS清洗, 提取蛋白质, Western blot检测Mn SOD基因的表达。
1.3 动物模型的建立
动物实验得到齐齐哈尔医学院伦理委员会批准。按文献记载[6], 选择6周龄, 体重 (21.5±0.5) g的雄性C57BL/6J小鼠 (齐齐哈尔医学院动物实验中心提供) , 以40 mg/kg链脲佐菌素, 连续5 d腹腔注射, 于7、14、21、28 d尾静脉检测血糖, 空腹血糖持续>16.9 mmol/L为糖尿病小鼠;糖尿病模型成功后, 显微外科手术分别结扎股动脉起点和在膝关节处的分支, 多普勒超声在体检测股动脉丧失血液供应, 即为结扎股动脉成功, 然后在小鼠大腿后部做一个5×5 cm的圆形皮肤全层缺损, 建立糖尿病足模型, 模型鼠在恒温、恒湿的代谢笼中单独饲养[6]。
1.4 糖尿病足的治疗以及取材
2×104MSC、Mn SOD-MSC、pc DNA3.1-MSC在糖尿病足伤口周围3、6、9、12点位置注射, 3、7、10、14 d观察愈合效果并取材, 每块组织分为两份, 一份用4%多聚甲醛溶液固定用于免疫组化等实验, 另一份在-80℃保存待用。
1.5 糖尿病足伤口修复率
在治疗后3、7、10、14 d, 固定焦距、光圈等参数, 以尼康D90数码相机 (日本) 拍摄伤口, 并以IPP图像软件测量伤口面积, 计算伤口修复率[6]。伤口修复率=1-[各观察点 (3、7、10、14 d) 测量伤口面积/0 d伤口面积]×100%
1.6 GSHPX、SOD检测
收集-80℃保存的各组皮肤组织, 0.01 mol/LPBS清洗2遍;冰浴下, 用3 m L 50 m M Tris缓冲液 (p H=7.5, 含1 m M EDTA, 10m M DTT, 0.2%Triton X-100) 裂解细胞;4℃, 12 000×g, 上清液使用Endogen公司生产的超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽还原氧化酶 (GSHPX) 试剂盒测定SOD和GSHPX活性[7]。
1.6 统计方法
每组实验至少重复3次。实验数据采用SPSS 18.0软件进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 并进行t检验。
2 结果
2.1 各组MSC表达Mn SOD
Western blot检测Mn SOD-MSC实验组, MSC对照组, 空白质粒组Mn SOD蛋白表达, 发现Mn SOD-MSC组有外源性Mn SOD表达, 而空质粒组和空白组无Mn SOD蛋白表达, 见图1。
2.2 糖尿病足愈合情况
相比空质粒组, Mn SOD-MSC实验组可以明显加快糖尿病足伤口愈合速度, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见图2。
A.各组治疗糖尿病足的治愈率 (%) 。Mn SOD-MSC实验组与空质粒组比较差异有统计学意义, *P<0.01 (n=20) 。B.各组典型照片。
2.3 各组SOD、GSHPX变化
空质粒组SOD、GSHPX含量较低, Mn SOD-MSC实验组SOD、GSHPX含量与空质粒组皮肤组织, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 见表1。
3 讨论
糖尿病伤口延迟愈合的形成与血管匮乏, 血液供应下降密切相关, 虽然各种治疗手段正被用于治疗糖尿病溃疡, 但是效果不甚理想, 所以促进糖尿病足的愈合一直是糖尿病研究领域的热点[8]。伤口愈合时, 各种组织和细胞、细胞因子等对损伤区进行填充[9], 使人们联想到干 (祖) 细胞的应用, 间充质干细胞 (MSC) 属于多潜能干细胞, 具有适应局部微环境, 多分化的特点, MSC在心血管损伤、肾功能衰竭、神经和骨骼等许多人类疾病有广泛应用, 对于DF这种兼有血管、神经等混合性病变而言, MSC移植疗法尤为合适[10], 该研究也发现利用MSC可以促使糖尿病足溃疡愈合, 与学者研究的结果一致。
糖尿病性高血糖会导致动脉发生硬化变性, 出现微血管梗阻, 导致组织局部缺氧而坏死。高血糖乏氧损伤会通过NADPH等途径产生大量活性氧[11], 而糖尿病时高血糖状态促使体内抗氧化酶活性降低, 机体清除自由基的能力受损, 加重糖尿病并发症的发生, 这也是糖尿病足经久不愈的原因之一[12]。文献报道糖尿病鼠皮肤Mn SOD蛋白等抗氧化酶的活性显著降低[13], 该研究利用Mn SOD转染MSC可以促进糖尿病足的愈合, 比空转染组和对照组具有显著差别, 并证明在体模型上, Mn SOD可以促进MSC分泌SOD等抗氧化酶类, 保证MSC对抗自由基的损伤, 达到促进组织修复的目的[14]。该研究也从侧面验证提高糖尿病足溃疡周围Mn SOD蛋白等抗氧化酶的含量, 可以对抗自由基损伤作用, 同时避免MSC等细胞免受氧自由基的伤害, 提示如果利用抗氧化酶转染MSC、内皮祖细胞 (EPC) 等干细胞, 会保护干 (祖) 细胞免受活性氧的伤害, 最大程度发挥细胞的作用。
虽然利用Mn SOD转染MSC治疗糖尿病足取得一定效果, 但是关于具体机制的研究, 还需要深入探索, 下一步将利用Western blot、实时定量PCR等方法检测Akt等信号通路在Mn SOD转染的MSC中具体机制, 相关研究结果必将为在糖尿病足的干细胞疗法的普及奠定研究基础, 其发挥的经济效益和社会效益非常巨大。
摘要：目的 阐明锰超氧化物歧化酶 (MnSOD) 转染间充质干细胞 (MSC) 对糖尿病足 (DF) 的治疗作用和机制, 为干细胞技术治疗疾病奠定研究基础。方法 链脲佐菌素法建立C57BL/6J小鼠糖尿病足模型, 分别以2×104 MSC的实验组 (pcDNA3.1-MnSOD转染MSC) 、空白质粒组 (仅转染pcDNA3.1) 和对照组 (未转染者为MSC) 进行局部注射治疗, 在7、14 d观察伤口愈合情况, 并分别切取皮肤组织, 进行CD34免疫组化染色, 观察血管密度变化, ELISA法检测各组观察点的匀浆皮肤组织中超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽氧化还原酶 (GSHPX) 变化。结果 与空白质粒组相比, MnSOD-MSC实验组伤口愈合明显加快, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;MnSOD-MSC实验组血管密度比空白质粒组高, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;MnSODMSC实验组GSHPX、SOD含量明显比空白质粒组表达增高, 差异有统计学意义 (P<0.01) 1。结论 MnSOD转染MSC可以促进抗氧化酶类表达增高, 促进血管内皮细胞抗自由基损伤, 加速血管新生和糖尿病足愈合。
关键词：锰超氧化物歧化酶,间充质干细胞,自由基,糖尿病足,血管
红细胞超氧化物歧化酶 篇2
关键词：水稻；雄性不育系；分蘖期；超氧化物歧化酶；丙二醛
中图分类号：S511.03 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0081-02
雄性不育是雄性器官退化、发育不良或花粉败育，不能行使生殖能力而雌蕊发育正常的现象。雄性不育起源于遗传性远缘异质的植物杂交，后代产生了生理、代谢紊乱，致使雄性生殖细胞败育。植物雄性不育有2种类型：一种为生理上的雄性不育，是由逆境胁迫及各种理化因素造成的，不育性不能传给后代，育种上不能连续利用；另一种为遗传上的雄性不育，是受雄性不育基因控制，这种基因一般属隐性，有重要的利用价值[1]。核质互作型雄性不育又称细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），属于遗传不育。植物育性的表达是由基因控制的生理过程、生化反应、形态构建的最终结果，包括一系列物质代谢、能量代谢，涉及各种复杂的生理生化反应。基因控制酶蛋白的合成，酶又调控代谢反应，多个代谢反应的综合集中表现便是性状。因此育性的变化也是酶活性变化引起的结果之一[2]。植物在代谢过程中产生有氧自由基，遇逆境胁迫时，植物体内大量增生自由基，致使膜脂过氧化严重，造成膜结构受损，蛋白质结构被改变，最终对生物体产生伤害。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）是植物抗氧化酶促防御系统中的3个主要酶类。SOD对活性氧的清除反应过程为：2O-2+2H+→H2O2+O2，POD、CAT进一步催化H2O2分解成H2O从而彻底解毒，使植物体内活性氧保持在较低水平，这3种酶协同作用，可减轻自由基对生物体造成的毒害，提高机体抗逆能力。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的产物，它的含量高低可反映细胞膜受损害的程度。前人对水稻生殖生长阶段的生理生化反应进行了研究，但是关于水稻营养生长阶段的动态研究还比较少。本研究以核质互作型雄性不育水稻为材料，调查了分蘖期水稻叶片中SOD、POD、CAT、MDA含量变化，以探讨水稻不育系不育的生理机制，旨在为进一步丰富水稻雄性不育理论提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
核质互作型雄性不育水稻451A及保持系451B均由河南省新乡市农业科学院秋粮研究所提供。供试水稻种植于河南省新乡市农业科学院内，采用常规管理。水稻分蘖初期到后期每隔5 d取1次材料。取每株主茎上面第1张全展叶，每次取3张叶中部，放冰上带回实验室统一进行酶活测定。
1.2 粗酶液提取和酶活性测定
称取叶片样品0.5 g置于预冷的研钵中，加入1 mL预冷的磷酸缓冲液（pH值为7.8），冰浴研磨成浆，加缓冲液使终体积为5 mL，于11 000×g、4 ℃下离心15 min，上清液即为SOD、POD、CAT粗提液，3次重复[3-4]。采用NBT（氮蓝四唑）光还原法测定叶片SOD活性。反应液为3 mL NBT、1 mL酶液，对照液为3 mL NBT、1 mL磷酸缓冲液（pH值为7.8），25～30 ℃、4 000 lx于日光下反应20 min，调零液遮光，560 nm 下测定吸光度值。SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位来表示。采用愈创木酚法测定POD活性。反应液为2.7 mL磷酸缓冲液、100 μL愈创木酚、100 μL H2O2、100 μL酶液，470 nm下测定吸光度值，每隔 1 min 读数1次，共测4 min，磷酸缓冲液调零。采用紫外吸收法测定CAT活性。反应液为2.8 mL磷酸缓冲液（pH值为7.8）、100 μL H2O2、100 μL酶液，240 nm下测定吸光度值，每隔1 min读数1次，共测4 min，磷酸缓冲液调零。MDA提取与活性测定：称取叶片样品1 g置于预冷的研钵中，加入2 mL 10% TCA、少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 mL TCA进一步研磨匀浆，4 000 r/min离心10 min，上清液为样品提取液。采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量。吸取离心的上清液 2 mL，加入2 mL 0.6% TBA溶液，混匀于沸水浴上反应 15 min，迅速冷却后再离心。取上清液测定532、450 nm波长下的吸光度值，蒸馏水调零。
2 结果与分析
2.1 MDA含量的变化
由表1可见，分蘖期前期不育系水稻叶片中MDA含量极显著高于保持系，分蘖期后期不育系仍然显著高于保持系，但是没有分蘖前期显著。总体来说，不育系由分蘖前期到分蘖后期有下降的趋势，保持系变化没有不育系大。
2.2 SOD活性的变化
由表1可见，分蘖期前3个时间点不育系及保持系水稻叶片SOD活性均下降，分蘖期后3个时间点不育系及保持系水稻叶片SOD活性均上升。每个时期不育系水稻叶片SOD活性均高于保持系。
2.3 CAT活性的变化
由表1可見，从分蘖期开始到最后，不育系水稻叶片CAT活性有波动但是整体变化不大，保持系水稻叶片CAT活性下降趋势明显，总体而言，不育系水稻分蘖期不育系叶片CAT活性略低于保持系。
2.4 POD活性的变化
由表1可见，分蘖期前2个时间点不育系及保持系水稻叶片POD活性均下降，分蘖期后4个时间点不育系及保持系后3个时间点水稻叶片POD活性均上升。从总体趋势来看，不育系水稻叶片POD活性高于保持系。
3 结论与讨论
酶是生物体内的一种特殊的催化刑，由活的生物体合成。酶的活性取决于其蛋白质结构的完整性，任何破坏酶蛋白的因素都能导致酶活性丧失。酶有调控代谢反应的功能，正是由于酶、代谢、生理功能之间的相互关系，使得酶活性变化与育性变化有着密切的关系。植物体内酶的种类、存在量的多少、酶的方向都会直接影响植株生长发育、可育与不育等特性。
植物生长过程中，不断吸收H2O及CO2进行光合作用，生产有机物质并放出O2，氧在自身还原过程中形成阴离子自由基、羟自由基的活性氧。在光合作用中，植物不可避免地要经受强光、高温环境，光激发产生的多余能量在光合器中形成单线态氧[5～8]。在光呼吸等代谢过程中，也会有许多H2O2产生，这些H2O2可以通过Habcr-Weiss反应产生毒性更强的OH·自由基。OH·可引发脂质尤其是膜不饱和脂的过氧化，损害生物膜结构，改变蛋白质结构，损伤DNA等生物大分子的结构与功能等。在生物进化过程中，生物也形成了抵抗活性氧伤害的防御系统。SOD是植物体内解除O-2毒害作用的关键性酶。CAT、POD则将H2O2通过Habcr-Weiss反应进一步分解而彻底解毒。
以往学者们对于不育水稻抗氧化酶促防御系统几种关键指标的研究结果不尽相同。陈贤丰等以PTGMS不育系农垦58S和w6154S为材料研究发现，单核早期、单核晚期、二核及三核期的不育花药2种酶在每小穗花药中的总活性普遍低于其可育花药[9]。张明永等比较了CMS水稻不育系珍汕97A及其同核异质保持系珍汕97B，结果表明，与可育三核期花药相比，不育三核期2种酶活性较低[10]。梅启明等研究发现，从穗发育雌雄蕊原基分化期到三核期，不育系农垦58S幼穗或花药中SOD活性明显比其可育状态下的高[11]。邹国林等研究发现，穗分化第2次枝梗原基分化期至花粉母细胞形成期，农垦58S叶片SOD比活力高于农垦58，同一品种，长日SOD活性高于短日，农垦58S 叶片CAT比活力变化较显著，但无规律[12]。
本研究表明，分蘖期不育系水稻SOD活性比保持系高，推测不育系受到了更强的H2O2伤害，在此时期不育系水稻CAT活性反而远远小于保持系，由此可推测不育系有更多的OH·自由基没有被清除，导致MDA含量增大。分蘖期不育系水稻SOD活性始终高于保持系也从侧面证明了不育系受到比保持系更多的H2O2伤害。不育系水稻CAT的酶活性比保持系少，由此可推测在此过程中不育系受OH·自由基的损害作用大，证明不育系一直有较多的脂质尤其是膜不饱和脂过氧化。前人发现，细胞质雄性不育水稻的花粉败育大多数发生在减数分裂期到二核期，分蘖期要远远早于花粉败育时期。根据MDA、SOD、POD、CAT一系列变化结果说明了水稻核质互作型雄性不育花粉败育是一个逐渐积累的、由量变到质变的过程，而不是一个“跃迁”的过程，推测可能从分蘖期甚至更早的发育时期花药的酶促系统已出现了异常，最后发育至花粉败育时期。本试验中，不育系水稻营养生长阶段的分蘖期SOD、POD、CAT活性以及MDA含量表现异常，不育系水稻SOD活性高于保持系，不育系水稻CAT活性低于保持系，导致不育系水稻MDA含量较高，这可能引起了水稻能量、物质代谢异常，膜脂过氧化逐渐积累，从而造成了花粉败育。
参考文献：
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红细胞超氧化物歧化酶 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
2 01 2年1月至2 01 3年1 2月我院正常体检标本75人, 均无器质性病变, 肝、肾、心、肺功能正常, 排除急慢性炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤性疾病、糖尿病和冠心病。其中成人30人, 男、女各15人, 年龄20~49岁, 平均 (33.2±1 0.7) 岁;老年2 5人, 男13人, 女12人, 年龄70~85岁, 平均 (77.8±6.2) 岁;儿童20人, 男、女各10人, 年龄7~12岁, 平均 (9.2±2.9) 岁。同时收集我院患者血清标本125例, 其中, 恶性肿瘤40例, 所有患者均经血液肿瘤标志物检测、活体组织病理学检查、B超或CT确诊, 男22例, 女18例, 年龄38~61岁, 平均 (42.3±8.7) 岁, 其中胃癌10例 (25.0%) , 肝细胞癌、食管癌各8例 (各20.0%) , 乳腺癌、直结肠癌各7例 (各17.5%) ;糖尿病30例, 男、女各15例, 年龄35~50岁, 平均 (38.5±6.3) 岁;自身免疫性疾病30例, 男10例, 女20例, 年龄27~48岁, 平均 (36.2±7.8) 岁, 其中类风湿性关节炎15例 (50.0%) , 系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、系统性硬化症各5例 (各16.7%) ;乙型肝炎 (乙肝表面抗原、乙肝e抗原、乙肝核心抗体阳性) 25例, 男13例, 女12例, 年龄21~47岁, 平均 (30.2±8.6) 岁。
1.2标本采集
所有受试者空腹静脉采血3ml。使用奥林巴斯AU2700全自动生化分析仪, SOD试剂和校准品由宁波美康生物科技股份有限公司提供, 使用比色法, 严格按试剂说明书操作。
1.3 统计学方法
采用S P S S 1 3.0软件, 计量资料以表示, 用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
正常儿童、成人、老年血清SOD值分别为 (154.3±30.0) U/ml、 (138.8±17.2) U/ml、 (82.9±36.9) U/ml, 提示SOD活性水平随年龄增长呈逐渐下降趋势。恶性肿瘤、自身免疫性疾病、糖尿病、乙型肝炎的血清SOD值分别为 (87.6±29.6) U/ml、 (102.3±18.4) U/ml、 (127.9±12.8) U/ml、 (133.7±12.0) U/ml, 4种疾病SO D活性水平较正常成人均降低, 前3种疾病与正常比较, 差异有统计学意义 (t=8.46、7.94、2.79, P<0.01) 。
3 讨论
SOD是机体内广泛存在的一类金属抗氧化酶, 是一种源于生命体活性物质, 有清除自由基作用, 测定SOD可以了解机体抗氧化、抗衰老、抗辐射能力。生物体内SOD水平高低意味着衰老与死亡的直观指标, SOD可对抗与阻断氧自由基对细胞造成的损害, 并及时修复受损细胞, 复原因自由基造成的细胞损害[1]。本文结果显示, 正常老年血清SOD活性水平显著低于正常成人和儿童, 老年人因抗氧化、抗衰老能力减弱, 故血清SOD活性水平下降, 而儿童相对较高。糖尿病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤血清SOD活性水平较正常成人显著降低, 其中恶性肿瘤最低。乙型肝炎较正常有轻微下降, 可能与炎症侵袭时吞噬细胞杀菌伴大量氧自由基生成, 自由基损伤严重, SOD耗损较多有关。自身免疫性疾病早期以B淋巴细胞增生为主, SOD可减少过氧化物游离基对机体造成的损害, 促使过氧化物游离基转化成过氧化氢和氧, 从而清除炎症过程中伴随产生的过氧化物游离基, 而有强大抗炎作用。故随着自身免疫性疾病病程延长, SOD值呈下降趋势, SOD对提高机体免疫功能具有重要作用[1]。
血清SOD活性水平检测可作为炎症感染、恶性肿瘤、自身免疫病、心血管病等疾病辅助监测指标, 不同疾病和病程自由基生成与清除反应强弱不一样, 血清SOD活性水平也会随之改变, 其水平降低提示机体抵抗力下降。
参考文献
红细胞超氧化物歧化酶 篇4
目前,对超氧化物歧化酶( SOD) 的研究已从抗氧化及抗衰老机制拓展到化妆品、食品和医药等方面的应用研究,SOD已开始应用于研究新一代生物传感器。从动物、植物、微生物中提取出SOD的相关报道很多,但从蜡状芽孢杆菌中提取的报道还很少。为此,试验通过从蜡状芽孢杆菌中提取SOD,并测定其活力,为蜡状芽孢杆菌SOD的提取提供理论参考,现报道如下。
1 材料
1. 1 菌种和培养基
蜡状芽孢杆菌,吉林农业科技学院生物工程学院微生物实验室提供。
分别称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g,混合于1 000 m L水中,调p H值为7. 4 ~7. 6［2］,加热到煮沸至琼脂完全溶解,分别装入试管中,121 ℃灭菌30 min,制备成斜面培养基,备用。
1. 2 仪器和设备
超净工作台、手提式高压蒸汽灭锅、超声波破碎仪、恒温生化培养箱、高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、电子天平、常用玻璃器皿及接种工具,均由吉林农业科技学院生物工程学院生物技术实验室提供。
1. 3 试剂
50 mmol / L邻苯三酚、50 mmol / L Tris - HCl磷酸缓冲液、10 mmol/L HCl溶液、冷丙酮、10 mmol/LCu SO4溶液,由吉林农业科技学院生物工程学院生物技术实验室提供。
2 方法
2. 1 菌种的活化
取蜡状芽孢杆菌菌种,在无菌条件下接种到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上,放至35 ℃ 恒温培养箱中培养24 h,备用。
2. 2 液体菌种的培养
液体培养基配方: 牛肉膏0. 5% 、蛋白胨1% 、氯化钠0. 5% ,调p H值为7. 4。取150 m L液体培养基装入300 m L三角瓶中,在121 ℃下灭菌30 min,灭菌后在无菌条件下接种蜡状芽孢杆菌,放入振荡培养箱中,37 ℃振荡培养48 h,得到液体菌种。用平板菌落计数法检测活菌菌数,菌数为1 × 107~1 × 109个/m L,备用。
2. 3 SOD的提取工艺( 见图1)
2. 4 邻苯三酚自氧化速率测定及酶活力的测定
2. 4. 1 邻苯三酚自氧化速率的测定取2 只试管,按表1 所示,加入25 ℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚( 空白管用10 mmol/L HCl代替邻苯三酚) ,迅速摇匀,立即倾入1 cm比色杯中,在325 nm波长处测定光吸收度,每隔30 s读数一次,测定4 min内每分钟光吸收值的变化,自氧化速率控制在每分钟的吸光度为0. 07［3］。
m L
2. 4. 2SOD样液活性的测定样品管取代自氧化管,样品管测定时先加入预热的待测酶液0. 1 m L,再加0. 1 m L邻苯三酚,其余步骤同表1。
2. 4. 3计算酶活力单位定义: 在25 ℃ 恒温条件下,每毫升反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50% 的酶量定义为1 个酶活力单位［4］。
酶活性( U · m L－ 1) = ( 0. 070 - A0) /0. 070 ×100% /50% × A2× ( A1/ A3) ( A0- 样液速率,A1- 样液稀释倍数,A2- 反应液总体积,A3- 样液体积) 。
2. 5 单因素试验
2. 5. 1缓冲液的p H值与酶活力在超声波功率150 W条件下,分别选取缓冲液p H值6. 0,6. 5,7. 0,7. 5,8. 0,30 ℃ 提取30 min,测定酶活力。
2.5.2提取时间与酶活力在温度为30℃、缓冲液p H值为7.0、超声波功率为150 W条件下分别选取时间为25,30,35,40,45 min进行提取,测定酶活力。
2.5.3超声波功率与酶活力在温度为30℃、缓冲液p H值为7.0、时间为30 min分别选取超声波功率100,150,200,250,300 W进行提取,测定酶活力。
2. 5. 4温度与酶活力在缓冲液p H值为7. 0、时间为30 min、超声波功率为150 W条件下,分别选取温度为25,30,35,40,45 ℃进行提取,测定酶活力。
2. 6 正交试验
采用正交试验确定SOD提取的最佳条件。分别以缓冲液p H值、提取时间、超声波功率、提取温度为试验因素进行L9( 34) 正交试验,每组重复3 次。试验设计见表2。
3 结果与分析
3. 1 单因素试验
3. 1. 1 不同缓冲液的p H值对酶活力的影响结果见图2。
由图2 可知: 起初随着p H值的增大,所测酶活力逐渐增大,在p H值为7. 0 时酶活力最大,而后逐渐降低。说明p H值为7. 0 为最适p H值。
3. 1. 2不同提取时间对酶活力的影响结果见图3。
由图2 可知,随着提取时间的延长,酶活力逐渐增大,在提取时间为30 min时酶活力最大,而后逐渐降低。说明提取30 min最适宜。
3. 1. 3不同超声波功率对酶活力的影响结果见图4。
由图4 可知,随着超声波功率的不断增大,酶活力逐渐增大,在150 W时最大,而后逐渐降低。说明150 W为最适功率。
3. 1. 4不同提取温度对酶活力的影响结果见图5。
由图5 可知,随着提取温度的升高,酶活力逐渐增大,提取温度为35 ℃时酶活力最大,而后酶活力下降。说明35 ℃为提取最适温度。
3. 2 正交试验结果
在单因素试验基础上,以缓冲液p H值、提取时间﹑超声波功率和提取温度为试验因素,进行L9( 34)正交试验,结果见表3。
从表3 可知,正交试验最佳组合方式为A3B3C2D2,即缓冲液p H值为7. 5、提取时间为40 min、超声波功率为150 W和提取温度为35 ℃ 时酶活力最高。从极差分析结果可以看出,对SOD提取影响的排序为提取温度> 缓冲液p H值> 超声波功率> 提取时间。
4 讨论与结论
在缓冲液p H值为7. 5、提取时间为40 min、超声温度为35 ℃、超声波功率为150 W条件下提取蜡状芽孢杆菌,SOD酶活力最强,为66. 3 U/m L,此时超声波功率越大,SOD溶出效果越好; 但功率太大,导致局部过热,部分SOD失活。
红细胞超氧化物歧化酶 篇5
关键词：超氧化物歧化酶,制备工艺,行业发展,研究
一、超氧化物歧化酶的应用领域
1. 化妆品。
SOD作为高级化妆品中常用的抗氧化剂之一, 具有明显的减少皱纹和祛斑作用。目前, 国内外许多高级化妆品都添加了SOD, 因为SOD是特殊的氧自由基清除剂;具有明显的防晒效果和抗炎效果。国内外对SOD毒性进行的广泛研究表明, SOD无毒、副作用, 故用于化妆品十分安全。全球十大化妆品公司旗下产品中均可找到含有SOD成分的产品。
2. 饮食。
SOD是超氧负离子自由基的转专一清除剂, 是氧自由基的克星。实验表明, 它具有抗氧化剂功能, 起着调节胃肠功能、增强机体免疫力、抗辐射、抗疲劳、改善心血管等功能。目前国内外已经将它广泛应用于奶制品、饮料 (如果汁、啤酒等) 、糖果 (如SOD口香糖) 以及保健胶束等食品中。将SOD作为天然抗氧化剂加到面包、糕点、方便面及罐头食品中, 保鲜效果良好。
3. 医疗。
SOD的功能是清除O-2。医学界将其用于治疗与O-2伤害有关的疾病。目前, SOD在临床应用中主要集中在炎症、自身免疫性疾病, 尤其是类风湿性关节炎、肺气肿、红斑狼疮、氧中毒和老年性白内障、衰老及多种皮肤病上。此外, SOD还用于治疗心血管疾病。美国把开发SOD用于心血管疾病作为重点, 西欧和日本也积极开发此产品。
二、超氧化物歧化酶的研究进展
1. 动物SOD的研究进展。
脊椎动物一般含Cu Zn-SOD和Mn-SOD, 人、鼠、猪、牛等红细胞和肝细胞中含Cllzn-SOD。而从人和动物肝细胞中也纯化了Mn-SOD。Cu Zn-SOD主要存在于细胞质, 也存在于线粒体内外膜之间, Mn-SOD一般存在于线粒体基质中。SOD是细胞内酶。但在人血清中分离到一种独特的细胞外Cu Zn-SOD (Ec-SODextracellular superoxide dismutase) , 这种SOD已在多种动物细胞里发现。Cu Zn-SOD是真核生物酶, 能进一步提升SOD的活性。
2. 微生物SOD的研究进展。
近几十年, SOD研究大多集中于从动物血液或脏器中提取SOD, 但这一方法易受原料来源、产品得率、稳定性及安全性等方面的限制。微生物具有原料便宜易得, 可大规模生产的优势, 因而, 近些年很多学者都致力于用微生物发酵生产SOD的研究。上世纪80年代后, 美、日先后开发了用发酵法生产SOD, 大大降低了生产成本。目前, 国内外在微生物SOD的菌种选育、发酵工艺、分离提纯、生理学研究、基因克隆表达及SOD应用方面都取得一定的进展。
3. 植物SOD的研究进展。
植物细胞在正常代谢活动和逆境条件下均能产生活性氧。植物细胞中的Ire-SOD主要存在于叶绿体中, 实验证明SOD活性主要存在于细胞质中, 约占细胞内SOD的87.3%, 其次分布于线粒体中, 这部分约占6.8%~7.2%。实验又表明细胞质的SOD以Cu Zn-SOD为主, 占胞质SOD的86%, 线粒体SOD主要是MnSOD, 占线粒体全部SOD的74%~76%。在将线粒体分离为外膜、内膜、基质、膜间溶质4个部分后, 进一步证明大豆下胚轴线粒体内SOD主要在基质 (80%~97%) , 且验证为Mn-SOD, 其次分布在膜间溶质 (16%.17%) , 且验证为Cu Zn-SOD。线粒体的内膜, 一侧为基质, 另一侧为膜间溶质。内膜呼吸链上产生的自由基能迅速被两侧SOD清除。可见植物线粒体在正常情况下, 自身对自由基的防卫能力已经相当完善。
4. 基因方法的研究进展。
SOD由于半衰期短、分子量大、易失活等缺点不利于临床使用。用基因工程手段对SOD分子进行化学修饰成为近些年的研究热点。实验表明, 修饰酶不仅完全保留了天然酶的活性, 在耐热、耐酸碱度、抵抗蛋白酶水解以及稳定性方面也明显优于天然酶, 大大延长了它在体内停留的时间。环境胁迫能诱导植物SOD基因的表达。当前, 不同类型的SOD基因已被转化到多种植物中。有实验结果表明, SOD在转基因植物中的过量表达可以不同程度地提高植物对环境胁迫的抵抗能力。因此, 可利用基因工程方法来获得抗逆植株。
三、超氧化物歧化酶制备工艺的改进
1. 从动物原料中分离。
从动物原料中直接分离SOD的方法主要包括分离、除血红蛋白、提纯三个步骤, 原料多为牛、猪等动物血液, 方法为盐析法、热变性法、超滤法、亲和层析法等。当前, 国内外对SOD的分离纯化工艺的研究日益深入, 如采用沉淀、热变、再沉淀、上层析柱等一系列步骤进行纯化, 牛血SOD比活由1 834 U/mg提高到2 325U/mg;采用热变性、硫酸铵盐析、层析纯化来提纯SOD;采用二次热变性方法, 免除了使用氯仿等有机溶剂;采用50%-75%硫酸铵沉淀部分蛋白质, 依次用DEAE252、Sephadex、G2200层析, 获得高纯度的SOD等。这些新方法利用凝胶层析和离子交换层析进行纯化分离, 大大简化了传统工艺。
2. 通过发酵法得到SOD。
新的生产SOD的微生物发酵法具有不受季节、气候和地域的限制, 生产周期短、产量高、成本低、能大规模生产的特点, 近年来广为采用。菌种是发酵生产酶制剂的重要条件, 可考虑筛选或选育能在嗜热、耐酸、耐碱、抗压等条件下生长的SOD生产菌;必要时还可采取诱导手段, 如用5-溴尿嘧啶诱导酵母SOD表达活性效果明显。目前, 我国用于SOD发酵生产的酵母株Y222、SIP I2215y、ZDF248、嗜热栖热菌ATCC27634、嗜热脂肪芽孢杆菌BS211215、IT28701等菌种已批量化, 可完全满足国内需求并有部分出口。
3. 从植物原料中分离。
植物超氧化物歧化酶的制备工艺, 运用尖端生化科学技术通过对植物酶活性中心进行包衣技术处理, 开发了包衣SOD粉 (coated powde-rate SOD, CP+RSOD, ) 包衣SOD液 (coated powde-juice, CP+JSOD) 等高活性高稳定能量精粹产品, 彻底攻克人体SOD吸收难关。CP-SOD对热及PH值超强稳定, 解决了SOD酵素在胃肠易分解失效的难题;CP-SOD补充剂使有效成分直达肠道, 通过血液运送全身, 人体吸收更加迅速。目前, 科学家已从多种植物中提取出纯度较高的SOD产品, 如土豆、大蒜、藻类、玉米、人参、三七等。低等植物以Fe SOD和Mn SOD为主, 高等植物以Cu/Zn-SOD为主, Cu/Zn-SOD主要位于细胞质和叶绿体中, Mn-SOD主要位于线粒体中, Fe-SOD一般位于一些植物的叶绿体中。目前工业上从植物中提取超氧化物歧化酶主要以玉米为原料。
4. 用基因工程的方法得到基因重组蛋白。
在基因工程领域, 一般采用由基因重组人源SOD的生产方法。提取的人SOD基因经PCR扩增, 构建人SOD的CDNA文库, 构建质粒, 再经质粒转到受体细胞, 在受体细胞中得以大量表达。基因工程生产具有不存在免疫排斥和外源性污染、生产工艺稳定、成本低等优点。例如, 将具有超氧化物歧化酶活性的17肽和具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的15肽通过3肽Linker串联起来, 并通过天然酶活性部位氨基酸同源保守序列的比对、二级三级结构预测及分子动力学模拟进行优化, 得到结构合理、催化机理明确的35肽序列, 并利用E.coli掺入铜离子后的Cys营养缺陷型表达系统把双酶活性中心分别引入N、C两端, 制备出分子量小、透膜性好、免疫原性低、结构稳定的兼具SOD和GPx双功能酶活性的抗氧化酶。
参考文献
[1]MECORD J M, FRIDOVICH I.Superoxide dismutase:an enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein) [J].J BiolChem, 1969, 244:6049-6055.
红细胞超氧化物歧化酶 篇6
鲁梅克斯K—1杂交酸模牧草是由新疆鲁梅克斯绿色产业有限公司与新疆农业大学在1995年引进的“酸模K—1”的基础上选育成功的牧草。其特点为:寿命长, 春天返春早, 生长快, 高产优质, 抗寒, 较抗旱和耐盐碱, 禽畜类适口性好。亩产鲜草10至15吨 (干草1至1.5吨) , 一次种植, 可维持10至15年的高产期。
鲁梅克斯K—1杂交酸模营养丰富, 特别是蛋白质含量高于一般植物。经国家肉类食品质量监督中心等多个国家级检验部门检验, 其蛋白质叶簇达30%~34%, 现蕾期28%~29%, 可消化蛋白质含量71%~74%, 20种氨基酸含量都很高, 特别是人体必需的8种氨基酸含量丰富, 配比较为均衡。采用现代高新技术, 从鲁梅克斯K—1中分离提取的叶蛋白、白蛋白、叶绿素粉、维生素C以及从其根部提取的分离抗氧化剂, 可用于食品添加剂、饲料添加剂、植物生长调节剂、新型营养补充剂、生物肥料和健康保健品、高纯氨基酸试剂、新型药物等高附加值的产品, 不仅可替代进口产品, 而且在国内外都具有极大的开发潜力。在测定中发现, 酸模中含有较高的SOD活性, 至今没有人对其工艺进行深入研究及工业化生产, 酸模SOD的提取及生产SOD应用产品, 其市场前景广阔, 将会取得很好的经济效益。
超氧化物歧化酶 (SOD) 的功效
自由基是需氧生物生命活动过程中多种生化反应的中间代谢产物, 是机体有效的防御系统, 但当其产生过多或清除过慢时, 便会通过攻击生命大分子物质及各种细胞器官而造成机体在分子水平、细胞水平及组织器官水平的各种损伤, 加速机体的衰老进程并诱发包括肿瘤在内的多种疾病。自由基清除剂是一类能够清除机体中过多自由基的活性物质, 超氧化物歧化酶 (SOD) 是其中较为重要的一种。
SOD广泛存在于动物、植物及微生物中, 是超氧阴离子自由基 (O2) 为底物的一种金属酶。由于SOD能够清除, 所以在防御氧的毒性、抗辐射损伤以及预防衰老等方面起着重要作用, 已作为一种生化新药在临床上广泛使用, 并且作为一种生物活性成分广泛应用于保健食品、化妆品和牙膏等日化产品中。目前所用SOD产品均为从人血或动物血液中提取, 但由于国际上疯牛病、口蹄疫等传染性疾病的漫延, 动物血液中提取的SOD的使用给人们带来了不少的危险因素。从植物, 特别是人们日常食用的无污染蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD, 如大蒜、沙棘果、仙人掌、刺梨、余甘子、五味子、花粉、小白菜及其它果蔬等植物中含有丰富的SOD, 资源丰富, 使用安全性非常高, 避免可能发生的交叉感染, 受到广大SOD应用者的欢迎。
SOD是一种生化新药, 能治疗由氧自由基引发的疾病, 目前国内外的临床应用主要集中在自身免疫性疾病和抗辐射上, 且应用范围正在扩大, 已开展的临床应用主要应用在:炎症、辐射损伤、家庭性肌萎缩性侧硬化、关节痛、自身免疫性疾病、缺血再灌注综合症、氧中毒、肿瘤的放疗与化疗、老年性白内障、烧伤及多种皮肤病等。作为一种有益的活性成分, SOD已成为多种保健食品、化妆品和牙膏等日化产品的功效因子或添加剂, 其生理功能的基础同样是清除过量的, 可以概括为:抗衰老, 包括皮肤的抗皱与去斑;提高机体对多种疾病的抵抗力;增强机体对外界环境的适应力;减轻肿瘤患者在放疗、化疗过程中的严重毒副作用。
SOD提取制备工艺及设备1、SOD提取制备工艺流程
鲜牧草洗净→粉碎→压榨取汁→加热变性→
→浓缩→真空脱水干燥→维生素混合制剂缓冲液稀释→层析柱→浓缩→透析→冻干→SOD
产品
2、加工设备
破碎机、打浆机、研磨机、分离设备、脱水干燥设备、粉碎筛分机、夹层锅、柱层析设备、超滤浓缩设备、纳滤机、冻干机等。
3、加工厂房及场地
厂房面积:50000m2, 工厂用地:100亩。总计投资:3500万元。
4、三废排放
无废弃物丢弃及废水排放。成本、效益分析
1、成本
原料:1000万元, 人工工资:1200万元, 其它:1500万元, 共计:3700万元。
2、投资
设备投资:4800万元, 厂房:3500万元, 流动资金:1500万元, 其它:600万元。
共计:10400万元。3、产值及利润
产值:10亿元, 毛利润:9.63亿元。4、投入产出分析
投资利润率:926%, 投资回收期:1.4个月, 全员劳动生产率:83.3万元/人。
5、说明
1) 该项目按委托方的要求, 只提取“SOD”一项, 实际上可提取:叶蛋白、白蛋白;氨基酸;叶绿素粉;膳食纤维;功能性酸模饮料;饲料添加剂;生物肥料等。
2) 一般鲁梅克斯K—1杂交酸模牧草售价:0.06元/kg~0.08元/kg, 本项目收购价0.20元/kg (即工业反哺农业, 农民得利) , 若每户种植该牧草1亩, 年收入2000元到3000元, 可带动5000农户增收。另, 该项目需工人1200人, 可解决部分人员就业。
3) 该项目若进行综合深加工, 可获产值20亿元以上, 惠及农户10000人以上, 并可带动一批相关产业的发展。根据相关政策规定, 此项目可免税3至5年。
4) 该加工项目投资可大可小, 凡合作投资额在200万元以上者, 我们均可免费提供1至2个产品收购单位 (服务一年) , 直到满意为止。其它服务, 协商解决。
市场前景
红细胞超氧化物歧化酶 篇7
1 材料和方法
1.1 标本来源
随机选取湖北科技学院附二医院80例体检者, 前40例体检者同时分别用分离胶促凝真空管 (标记为A组) 和无抗凝真空管 (标记为B组) 采集血液标本, 后40例体检者用分离胶促凝真空管 (标记为C组) 采集血液标本, 尽快离心分离血清备用。分离胶促凝真空管和无抗凝真空管由广州阳普医疗用品有限公司生产。
1.2 仪器
日本日立公司7170A型全自动生化分析仪, B320A白洋离心机, BCD-280e伊莱克斯冰箱。
1.3 试剂及校准品
SOD试剂由北京华宇亿康生物工程技术有限公司提供, 试剂批号为111014。伯乐质控物, 批号为45613。分析参数参照说明书设定。
1.4 方法
1.4.1 测定原理
本试剂盒为双试剂, 采用速率法测定。即邻苯三酚自氧化法, 在碱性条件下, 邻苯三酚自氧化成红桔酚, 同时产生·O2-, SOD催化·O2-发生歧化反应从而抑制邻苯三酚的自氧化, 样品对邻苯三酚自氧化速率的抑制率可反映样品中的SOD含量。
1.4.2 测试方法
(1) 所有体检标本采集后室温放置, 观察血液凝固时间, 待血样完全凝固后以3 000 r·min-1离心10 min, 观察血清分离效果, 并于每次上机测定前肉眼观察是否溶血、黄疸或脂血。 (2) A组血清放置于室温, 分别于0、4、6、8、10 h测定SOD活性;B组血清放置于室温, 于0 h检测SOD活性;C组血清置于2~8℃冰箱, 分别于0、10、14、21 h测定SOD活性。
1.4.3 统计学处理
测定结果以±s表示, 应用SPSS 17.0统计软件分析, 两组样本比较采用配对t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
1.4.4 临床可接受范围
本研究基于临床经验和被分析物 (SOD) 检测试剂盒的分析性能, 确定允许总误差 (TEa) 为20%, 检测结果偏倚<1/2TEa (即10%) 为满足临床应用。
2 结果
分离胶促凝真空管和无抗凝真空管SOD检测结果的比较 (0 h) , 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。室温下保存的分离胶促凝真空管血清SOD于4、6、8、10 h检测, 与0 h比较差异具有统计学意义 (P<0.01) , 见表2;与0 h比较相对偏倚分别为3.719%、5.341%、6.807%和8.306%。2~8℃冰箱保存的分离胶促凝真空管血清SOD于10、14、21 h检测, 与0 h比较差异具有统计学意义 (P<0.01) , 见表3;与0 h比较相对偏倚分别为3.213%、4.552%和5.816%。
两种采集管比较, t=1.431, P>0.05
与0 h比较, a P<0.01
与0 h比较, a P<0.01
3 讨论
血清分离胶具有抗氧化、耐高温、抗低温、高稳定的特性。其结构中含有大量氢键, 容易缔合形成网状结构, 在离心力的作用下网状结构被破坏, 变成黏度低的流体;当离心力消失之后又重新形成网状结构, 恢复成黏度高的流体, 这种性质被称为触变性 (thixotropy) 。分离胶置于试管底部, 当分离胶与凝固后的血液在同一试管中离心时, 由于比重不同, 在离心力的作用下移到管中央, 离心后固化形成屏障, 使血清和血细胞完全分离[1,2]。
为了评价血清分离胶对SOD测定结果的影响, 笔者以无抗凝真空管的血清标本为标准, 观察血清分离胶对血液凝固时间、血清分离质量及对SOD结果的影响, 根据日常工作中测定SOD的均值和标准差, 设定样本量为40例, 然后进行配对t检验, 显示差异无统计学意义 (P>0.05) 。不少医院检验科常规生化标本采用分离胶促凝真空管, 这样可与其它生化项目合并, 减少采血管数, 节约人力、物力。更重要一点, 血清分离胶可使血清和血细胞完全分离, 由于红细胞膜上存在SOD, 这样可减少假阳性率。因此, 可以采用分离胶促凝真空管采集标本。
血清分离胶可加速血流凝固、简化样品处理步骤;防止血细胞对血清的干扰, 提高检验准确度;样品可原位进行仪器分析;吸取血清方便;便于血清贮存和远途传递;避免了纤维蛋白和溶血的影响[3]。此外, 血样在分析前、分析中、分析后都在同一支管中进行, 防止血液中病毒的感染, 减少了医疗废物。
在实际工作中, 由于各种不同的原因不一定能尽快检测, 为了进一步探讨血清分离胶在保存温度和保存时间上对SOD检测的影响, 笔者分别检测在室温保存和在2~8℃冰箱保存的样本, 根据北京华宇亿康生物工程技术有限公司提供说明书样本要求, 15~25℃保存可稳定4 h, 2~8℃保存可稳定10 h, 因此, 从采血后实时送检、待凝固后实时离心并实时上机测定, 以此为0 h测定值, 同一批样本随后计时, 在室温保存样本分别在4、6、8、10 h测定, 在2~8℃冰箱保存样本分别在10、14、21 h测定。结果显示:室温下保存样本4、6、8、10 h SOD检测结果与0 h比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 相对偏倚均小于10%;同样, 2~8℃冰箱保存样本10、14、21 h SOD检测结果与0 h比较, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 相对偏倚均小于10%, 但下降幅度较室温下保存的为小。t检验要求严格, 只要少许差异都能被检出, 本研究虽然显示差异有统计学意义, 然而, 在临床上更多是采用临床可接受范围, 实验设定检测结果偏倚<10%为满足临床应用。血清中SOD相对保存时间较短, 研究结果证明, 置于室温、2~8℃冰箱保存时间都较说明书的延长1倍以上, 且结果差异在临床可接受范围, 这为实际工作带来方便。另外, SOD随时间而逐渐下降, 可能由于环境中存在自由基, SOD会与超氧阴离子自由基发生歧化反应所致, 因此必须尽快上机测定, 否则需用分离胶促凝真空管离心后置于2~8℃冰箱保存, 这样能减缓其下降速度。
有文献报道, 实验前误差频率占总误差的46.0%~68.2%[4]。分析前的质量控制, 常被临床医生和检验工作者所忽视, 不恰当地收集标本、不注意影响标本成分变化的各种因素, 常是导致实验不可靠的主要因素, 且又不容易被发现, 因而必须加以重视[5,6]。
摘要：目的:探讨标本采集管与保存方式对超氧化物歧化酶 (SOD) 测定结果的影响。方法:随机选取湖北科技学院附二医院80例体检者, 前40例体检者同时分别用分离胶促凝真空管 (标记为A组) 和无抗凝真空管 (标记为B组) 采集血液标本, 离心分离血清, 两组都放室温, A组分别于0、4、6、8、10 h测定SOD活性, B组于0 h检测SOD活性;后40例体检者用分离胶促凝真空管 (标记为C组) 采集血液标本, 离心分离血清, 置于28℃冰箱下保存, 分别于0、10、14、21 h测定SOD活性。采用配对t检验分析各组结果差异性。结果:分离胶促凝真空管和无抗凝真空管血清的SOD比较 (0 h) , 差异无统计学意义 (P>0.05) ;室温下保存的分离胶促凝真空管血清 (A组) 的SOD于4、6、8、10 h检测, 与0 h比较差异具有统计学意义 (P<0.01) , 与0 h比较相对偏倚分别为3.719%、5.341%、6.807%、8.306%;28℃冰箱保存的分离胶促凝真空管血清 (C组) 的SOD于10、14、21 h检测, 与0 h比较差异具有统计学意义 (P<0.01) , 与0 h比较相对偏倚分别为3.213%、4.552%、5.816%。结论:可采用分离胶促凝真空管采集标本;室温下放置10 h及28℃冰箱放置21 h对结果的影响均在临床可接受范围内, 与产品说明书上要求的时间相比, 室温与冰箱中放置时间都能延长1倍以上。
关键词：分离胶,超氧化物歧化酶,保存方式
参考文献
[1]焦连亭, 耿洁.真空采血器的技术特点及应用[J].中华检验医学杂志, 2002, 25 (6) :376-378.
[2]郑宇琼, 周焕槟, 张凌玲.分离胶促凝管与普通干燥管在生化分析中的差异性研究[J].国际检验医学杂志, 2008, 29 (7) :581-582.
[3]高清, 刘晓茹, 王迎春.应用血清分离胶对生化检验质量影响的探讨[J].沈阳部队医药, 2004, 17 (4) :303-304.
[4]张丽霞.临床化学检验血液标本的采集和处理[J].中华检验医学杂志, 2000, 23 (4) :251-252.
[5]王峰, 陈瑜.不同真空采血管对38项生化检验项目的可比性分析[J].浙江临床医学, 2008, 10 (10) :1380-1381.
红细胞超氧化物歧化酶 篇8
1 资料与方法
1.1 资料
2009年3月至2011年3月共收治急性胰腺炎患者共42例, 年龄32～72岁, 平均 (47.6±12.8) 岁;男28例, 女14例;均符合中华医学会外科学胰腺学组急性胰腺炎的临床诊断标准。全部患者均排除高血压病、冠心病、糖尿病、COPD、自身免疫性疾病和严重感染者, 排除近期服用调脂药物和抗氧化治疗者;剔除内科治疗无效转手术治疗患者。
1.2 方法
1.2.1 分组与治疗方法
将42例急性胰腺炎患者按双盲、随机的原则分为实验组 (21例) 和对照组 (21例) , 两组患者年龄、性别、病程和症状等方面差异无统计学意义 (P>0.05) 。对照组患者给予禁食, 胃肠减压, 抑酸, 生长抑素和抗生素等常规治疗。实验组在常规治疗的基础上加用姜黄素胶囊 (陕西四大华特科技实业有限公司生产, 每次100mg, 3次/d) 治疗。两组患者治疗期间均避免使用抗氧化剂和自由基清除剂, 总疗程2周。
1.2.2 实验方法
所有病例均在用药前24h内及治疗2周后分别空腹静脉采血5mL, 分离血浆置于-20℃冰箱保存。测定患者治疗前、后血浆NO水平及SOD活性的变化。NO测定采用用硝酸还原酶法, SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法, 试剂盒均由南京建成生物工程公司提供, 严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.3 统计学方法
采用SPSS16.0软件进行统计学分析, 计量数据以表示, 治疗前、后比较采用配对t检验, 计数资料的比较采用χ2检验, 以P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
治疗前, 两组患者血浆NO水平和SOD活性无显著性差异 (P>0.05) 。治疗2周后, 实验组中患者NO水平较治疗前显著降低 (P<0.05) , 与对照组比较, 差异有显著性 (P<0.05) 。治疗1月后, 实验组患者SOD活性较治疗前显著增高 (P<0.05) , 与对照组比较, 差异有显著性 (P<0.05) 。结果见表1。
注:与对照组治疗后比较, *P<0.05;与治疗前比较, △P<0.05
3 讨论
急性胰腺炎是消化系统的常见病, 并且其发病率呈逐年上升趋势, 急性重症胰腺炎死亡率极高, 严重危害人类健康。目前, 关于胰腺炎的发病机制尚未完全明确, 胰腺细胞的自身消化、炎症级联反应和脂质过氧化损伤等多种病理机制参与其中[2]。急性胰腺炎发生早期的病理改变主要与氧自由基和NO等血管活性物质大量合成和释放有关[3]。SOD是机体很重要的一种抗氧化酶类, 它具有透脂性强的优点, 对细胞内多数氧化基团具有一定的清除作用, 从而能够维持胰腺细胞结构和功能的稳定。目前, 关于姜黄素对急性胰腺炎患者血浆NO及SOD水平的影响尚未见报道。
实验研究表明NO通过介导IL-6、TNF-α等促炎细胞因子的病理作用, 引起炎症细胞聚集, 使炎症效应级联放大而促进胰腺的充血、水肿和坏死[2]。另一方面, NO还能与超氧化物反应产生过氧化亚硝酸加速脂类和巯基化合物的氧化反应, 导致氧化应激效应增加, 对胰腺炎的病理进程起促进作用[3]。另外, NO还可降低SOD、PON1等抗氧化物质清除自由基的能力, 导致自由基聚集, 引起胰腺组织通透性增加[3]。姜黄素主要来源于姜黄的根茎, 是姜黄中的主要活性成分。最近, 国内外许多文献相继报道了姜黄素的抗感染、抗炎、抗凝等药理作用, 此外, 它还具有抑制血小板的聚集、增加纤溶系统的活性、抗氧化和清除自由基等生理功能[4]。实验研究则表明姜黄素对重症急性胰腺炎模型小鼠COX-2表达及自由基的产生有一定抑制作用[5]。
本项研究发现经过姜黄素治疗后, 急性胰腺炎患者体内NO水平显著降低, 而SOD活性增加, 结果表明姜黄素可通过刺激机体SOD的产生和增加NO的清除而使急性胰腺炎患者受益。关于姜黄素对急性胰腺炎患者机体氧化/抗氧化系统的影响及具体的分子机制, 尚需通过进一步基础与临床研究明确。
参考文献
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[4]王念林, 陈恳.姜黄素对消化系统作用的研究进展[J].广东药学院学报, 2004, 20 (2) :172.