鸭疫里默氏菌病研究

鸭疫里默氏菌病研究（共6篇）

鸭疫里默氏菌病研究 篇1

鸭疫里默氏菌病 (Riemerella anatipestifer infection) , 又名鸭传染性浆膜炎 (Infectious Serositis in Duckling) , 由鸭疫里默氏菌 (Riemerella anatipestifer, RA) 感染所致的传染病。1932年于美国首次报道鸭疫里默氏菌病, 尔后相继报道于英国、加拿大、澳大利亚、丹麦、德国等多个国家。我国郭玉璞等于1982年首次报道, 随后, 全国各地相继有本病报道。由于本病感染死亡率及淘汰率高, 给养殖户造成的经济损失颇大, 为当前严重危害养鸭业的主要传染病之一。

1 病原学

鸭疫里默氏菌系革兰氏阴性小杆菌, 无运动性, 不形成芽胞。用纯培养物涂片, 可见菌体呈杆状, 亦有呈椭圆形的, 大多数菌体单个散在, 少数成对, 偶见链状排列。菌体宽0.2~0.4μm, 长1~5μm。大多数细菌瑞氏染色呈两极着染, 印度墨汁染色时有荚膜。韦强等通过透射电镜对Ⅰ、Ⅱ型鸭疫里默氏菌观察发现有些细菌的顶端或侧面有芽状赘生物, 其结构类似细菌的细胞壁或膜, 及内部的核样物质无核酸存在。

鸭疫里默氏菌生长良好的培养基有胰酶大豆琼脂、巧克力琼脂及血液琼脂。在血液琼脂培养基蜡烛缸中37℃培养24h, 形成直径约为1~1.5mm的菌落, 呈圆形, 稍凸起, 边缘整齐的奶油状。在含有血清的肉汤或胰酶酵母肉汤中36℃培养48h, 可见管底有少量白色沉淀物且液体轻微混浊, 。该菌通常不发酵的碳水化合物有葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖等, 但亦有报道称某些菌株可利用葡萄糖、麦芽糖等[11]。一般不产生硫化氢、西蒙氏枸橼酸盐利用阴性、甲基红试验阴性、硝酸盐还原阴性、过氧化氢酶阳性。该菌的抵抗力差, 高温、干燥及常用消毒药均易使其失活。

鸭疫里默氏菌的血清型较复杂, 国际上公认的有21个血清型 (张大丙, 2006) , 不同血清型间交叉保护性低, 仅部分血清型间交叉反应微弱。不同地域, 流行的RA血清型不同, 即使同一地区之不同时期, 其致病菌株的血清型亦会改变, 同一养殖场亦可能发生RA感染多种血清型。据调查, 我国多个地区主要流行的血清型是其中的1、2、6、10型, 同时亦发现许多养鸭地区广泛流行3、4、5、8血清型。

2 流行病学

自然感染易发生于1~8周龄鸭, 其中最易感且发病重的是2~3周龄小鸭, 发病率超过90%, 死亡率5%~80%。本病的发生季节性不明显, 但春冬季节因气温变化无常, 致发病率高。同时, 饲养密度高、环境卫生条件差、缺乏营养等因素均易诱使该病的发生。雏鸭可因皮肤尤其脚掌皮外伤而感染, 亦可通过呼吸道等途径感染。RA除了感染鸭以外, 多种禽类如鹅、火鸡等亦可感染发病。

3 临床症状

本病最急性病例无明显症状突然死亡。一般病例呈急性经过, 多见于2~3周龄雏禽, 1~7天病程。病禽最初常出现精神萎靡, 缩颈嗜眠、少食, 蹲伏甚至行走不稳、排绿色稀粪、眼分泌物增多使眼眶周围毛湿润, 常形成明显的“泪斑”、鼻孔常有分泌物、张口呼吸。部分病例有神经症状, 头颈歪斜, 甚至头朝向背, 呈“观星”状, 死时角弓反张。病程较长耐过者, 大多发育不好, 生长缓慢成“僵鸭”。

4 病理变化

鸭疫里默氏菌病最明显的病理变化是多器官浆膜的浆液纤维素渗出性炎症, 因此又称为“传染性浆膜炎”, 其中以浆液纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎最为常见。心脏早期心包炎性渗出液较多, 随着纤维素渗出逐渐增加, 使心脏表面覆盖一层黄白色蛋皮蛋花样物, 渗出物中还有嗜中性粒细胞和单核细胞等炎症细胞, 后期渗出的纤维素由于机化致心包粘连, 临近心外膜的心肌有不同程度的变性。肝脏肿大, 土黄色质脆, 切面纹理不清, 表面附有薄层灰白色或稍带黄色的蛋皮蛋花样物, 肝变性坏死。气囊壁增厚变浑浊, 有浆液纤维素性渗出物及炎症细胞浸润。脾脏表面亦有纤维素薄膜, 脾小体内网状内皮细胞增多, 淋巴细胞分散。肺脏亦有浆液纤维素性炎症。脑充血, 脑膜增厚水肿, 有大量浆液纤维素渗出物及炎症细胞浸润, 少数病例脑室管周围有小胶质细胞增生。关节腔内有多量黄色渗出液体而肿大, 有的病例可见渗出物呈干酪样。

5 诊断与防治

依疾病流行情况、临床症状和病理变化, 可初步诊断本病, 确诊须进行病原分离与鉴定。实验室的检查方法主要有PCR、琼脂凝胶免疫扩散试验、荧光抗体法、凝集试验、间接血凝试验、间接ELISA法等。曲丰发等建立种特异性PCR快速检测鸭疫里默氏菌利用16S r DNA, 细菌基因组DNA的最小检出量为50pg, 菌落最小检出量为15CFU/m L。陈红梅等建立了鸭疫里默氏菌的环介导等温扩增检测方法通过omp A基因设计并合成一套引物。刘维平等建立了检测雏鸭感染鸭疫里默氏杆菌的间接免疫酶组织化学法应用鸭源血清Ⅰ型鸭疫里默氏杆菌作为抗原, 免疫兔制备兔抗RA的Ig G。张大丙等对于细菌的分型, 大量分离株的血清型范围进行快速筛选提出玻片凝集试验, 发现菌株间是否存在抗原差异则用沉淀试验, 明确菌株之间可能存在的抗原相关性用试管凝集试验更有利。若要分析具有相近血清学相关性的菌株之间的抗原关系, 须进行血清吸收凝集试验。加强饲养管理和搞好环境卫生是预防鸭疫里默氏菌病的首要措施, 定期进行鸭舍的消毒和通风、冬季加强保暖、药物防治和疫苗防治等措施。药物防治主要有各类抗生素和磺胺类药物, 但各地报道的该菌的药物敏感性不同, 因此使用药物治疗前最好进行药敏试验, 选用高敏药物, 以免造成更大损失, 同时平常应加强抗菌药物的敏感性调查, 以指导临床合理经济有效用药。疫苗免疫预防也是控制该病的关键, 因不同血清型之间无保护力或保护力很低, 所以仍需做好鸭疫里默氏菌血清型的监测工作, 针对性研制疫苗以收获更好效果。□

鸭疫里默氏菌病的诊治 篇2

1 发病情况

2009年2月12日邵武市某养殖户从本市某孵化厂购进1日龄北京鸭苗1 700羽, 2月18日起部分鸭出现食欲减退、精神沉郁、摇头、脚软不愿走动, 从2月19日起每天死亡10~20羽, 至21日累计死亡57羽, 发病率达30%左右, 曾用氟哌酸饮水治疗3 d无效。

2 临床症状

患鸭表现食欲减退或不食, 精神沉郁, 缩颈嗜睡;咳嗽、打喷嚏、呼吸困难, 眼和鼻孔有黏性分泌物;排白色或黄绿色稀粪;脚软不愿走动, 有的出现点头、摇头等神经症状;个别患鸭关节肿胀。

3 剖检病变

共剖检12羽病死鸭, 全部表现严重的纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎, 心包积液, 液体浑浊, 心包膜增厚、粗糙, 表面附有大量纤维素性渗出物, 肝脏表面覆盖一层较厚的黄色或黄白色纤维素性膜, 厚薄不均, 易剥离, 肝肿大, 质脆, 呈土黄色或棕红色。胆囊胀大, 充盈着浓稠胆汁。脾肿大, 表面呈大理石样。气囊壁增厚, 表面含有黄白色干酪样渗出物。小肠黏膜出血, 腹腔积有淡黄色腹水。脑壳、脑膜、脑实质充血或点状出血。有的两侧跗关节肿大, 关节液增多。

4 实验室诊断

4.1 镜检

无菌采集病死鸭的脑、肝、脾组织触片或心血、心包液涂片, 革兰氏染色或瑞氏染色, 镜检可见革兰氏阴性和两端浓染的小杆菌, 呈单个存在。4.2细菌分离培养无菌采集病死鸭的心、肝、脑等病变组织, 分别接种于巧克力琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基, 在蜡烛罐37℃恒温箱中培养48 h, 结果在巧克力琼脂培养基上, 肉眼可见生长的菌落表面光滑、稍隆起、圆形、直径约1~2 mm, 并且随着培养时间的延长, 菌落稍有增大, 挑取菌落涂片, 革兰氏染色, 镜检为革兰氏阴性小杆菌;而麦康凯琼脂培养基上基本未见有细菌生长。

4.3 鉴别诊断

4.3.1 与大肠杆菌病鉴别

由大肠杆菌引起的鸭大肠杆菌病以肝脏肿大、出血和脑壳出血、脑组织充血以及坏死灶为特征性病变, 一般不表现心包炎、肝周炎和气囊炎, 而心包炎、肝周炎和气囊炎是鸭疫里默氏菌病的特征性病变。将病料涂片或触片染色镜检, 大肠杆菌较大, 大小不太一致, 而鸭疫里默氏杆菌呈卵圆形小杆菌, 而且大小比较一致。

4.3.2 与巴氏杆菌病鉴别

巴氏杆菌能引起各种日龄鸭发病, 尤其是青年鸭、成年鸭发病率比幼年鸭高, 而鸭疫里默氏菌病主要引起7周龄以内的鸭发病, 7周龄以上极少发病。肝脏有大量灰白色坏死灶, 心冠脂肪出血等是巴氏杆菌病特征性病变, 无心包炎、肝周炎和气囊炎, 而心包炎、肝周炎和气囊炎是鸭疫里默氏菌病的特征性病变。

5 诊断

根据发病情况、临床症状、病理剖检变化和实验室检查结果诊断为鸭疫里默氏菌病。

6 防治措施

1) 对所有病死鸭进行深埋无害化处理, 隔离病重鸭, 用消特灵消毒地面、运动场、饲养用具等, 每天1次, 连用7 d。

2) 每羽患鸭注射富乐星 (10%氟苯尼考注射液) 0.2 m L, 每天1次, 连用2 d, 注射时严格要求1羽鸭1枚针头, 防止人为传染。

3) 在饲料中投喂药物治疗, 每250 kg饲料加入富乐星 (10%氟苯尼考粉) 200 g、阿米粘杆粉100 g, 用电解多维饮水。治疗3 d后, 该群鸭精神状况明显好转, 停止死亡, 食欲增加。

7 小结与体会

1) 鸭疫里默氏菌病是我市肉鸭的多发病, 严重危害肉鸭健康发展, 因此要加强该病的预防, 平时要加强饲养管理, 改善鸭场的卫生条件, 定期在饲料或饮水中投喂预防药物, 定期消毒等。

鸭疫里默氏菌病的诊疗报告 篇3

1 发病情况

2008年4月18日, 明溪县城关乡王桥村陈某送患鸭、病死鸭各3羽前来求诊。主诉:饲养肉鸭400羽, 26日龄开始发病, 个别鸭精神差、少食或不食、排黄绿色稀便, 次日发现死亡2羽, 今天又死亡3羽, 现发病鸭占鸭群总量的20%, 发病后曾用抗病毒药拌料, 疗效不明显。该鸭群接种过细小病毒病、高致病性禽流感等疫苗。

2 临床症状

患鸭表现精神沉郁, 食欲不振, 缩颈嗜睡, 羽毛松乱, 腿软不愿走动、不愿下水、行动蹒跚、共济失调;打喷嚏, 眼、鼻流浆液性或黏液性分泌物、呼吸困难、叫声嘶哑;排黄白色或黄绿色稀便, 气味恶臭, 濒死时出现痉挛、摆头或点头, 最后抽搐而死, 个别鸭关节肿大、拐脚。

3 剖检变化

剖检3羽病死鸭、3羽患鸭, 鼻腔均有黏液性分泌物, 腹腔液体较多;气囊壁浑浊增厚, 表面有灰白色或灰黄色纤维素性渗出物;心包膜增厚、粗糙, 心包积液、浑浊, 心肌松软, 病死鸭有纤维素性渗出物;肝肿大变黄, 患鸭肝周炎明显, 肝表面特别是肝周边缘有灰白色不易剥离的膜, 肝肿大呈红灰色斑驳状。死亡鸭肺瘀血, 患鸭肺脏变化不明显, 气管、食道、胰腺、腺胃、肌胃和前段肠管无明显变化, 直肠有部分出血点, 腔上囊黏液增多, 肾脏无明显变化, 部分病死鸭脑膜充血、出血。

4 实验室检查

4.1 涂片镜检

取心包液、肝、脾等病料涂片、染色, 镜检可见单个或成双排列的小杆菌, 呈明显的两极着色。

4.2 细菌分离培养

无菌取患鸭、病死鸭的心、肝、脑等病变组织, 分别接种于巧克力琼脂培养基、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基, 37℃厌氧培养24 h后观察。巧克力培养基上长出灰白色、半透明、圆形微凸起的菌落, 普通琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上则无细菌生长。挑取巧克力琼脂培养基上的菌落染色镜检, 可见与病料涂片镜检形态一样的小杆菌, 有明显的两极着色。

4.3 药敏试验

挑取巧克力培养基上的典型菌落按常规纸片法进行药敏试验, 结果该分离菌对头孢噻肟钠、利福平、氟苯尼考、红霉素、磺胺嘧啶钠高敏, 对青霉素、链霉素、氟哌酸等低敏。

5 诊断

根据发病情况、临床症状、病理变化及实验室检查结果初步诊断为鸭疫里默氏菌病。

6 防治措施

1) 深埋病死鸭尸体, 隔离病重鸭;用0.1%消特灵消毒地面、运动场所、器械用具, 并保持水源清洁。

2) 根据药敏试验结果, 对病重鸭肌肉注射头孢噻肟钠 (每羽0.02 g) 、鱼腥草注射液 (1 mL/羽) ;对症状较轻、食欲减少的在饲料中投喂药物治疗, 每100 kg饲料拌鸭浆净、鸭疫速灭各100 g (浙江汇邦动物药业有限公司生产, 主要成分分别为利福平和盐酸洛美沙星) , 每天2次, 连用3 d, 并结合补充营养, 用电解多维 (100 g/包加水200 kg) 饮水, 用药3 d后, 该群雏鸭精神明显好转, 症状日渐减轻, 食欲增加, 治愈率达90%以上。

此外, 采用中西医结合方法防治, 如用三九禽康 (由桂枝、细辛、花椒、远志等组成) 500 g拌250 kg饲料、三九奇根130 g拌250 kg饲料, 连用5 d也可取得满意效果。

7 小结与体会

1) 鸭疫里默氏菌病血清型较为复杂。据报道, 血清型至少有21个, 各品种鸭都能感染, 我国目前已发现1、2、6、10、11、13、14、15等8个血清型, 其中1型鸭疫里默氏菌病在国内流行最为广泛, 由于条件所限, 明溪县所流行的鸭疫里默氏菌病血清型未进行鉴定。

2) 鸭疫里默氏菌病一年四季均可发生, 20～30日龄多发, 明溪县在番鸭和半番鸭最为多见, 规模圈养场比散养农户多发, 这可能与规模场保温舍的饲养密度高、通风不良及消毒净化不严等有关。

3) 发病时应及时隔离患鸭, 尽快淘汰病重鸭, 并对鸭舍及所有设备进行消毒, 鸭舍空置2周以上再进第2批鸭苗, 平时对鸭群的生活环境定期消毒, 一般每周至少1次。

4) 治疗时选用高敏药物, 该病原对多种抗生素易产生耐药性, 临床上应了解畜主常用药物, 选用不同类型药物给予治疗, 对患鸭采取肌注和口服同时进行, 对假定健康鸭群采用拌料、饮水给药。鸭群数量小时尽可能逐羽喂服, 以保证用药效果。用药及时、量足, 疗程合理是治疗的关键, 一般为3～5 d, 大群为5 d以上。

5) 该病经常与大肠杆菌病发生混合感染, 引起发病率和病死率升高, 建议雏鸭在12日龄左右选用鸭疫里默氏菌与大肠杆菌双联苗进行接种, 10～15 d后加强免疫1次, 即可达到预防目的。

6) 加强饲养管理, 改善鸭场卫生条件。保持育雏室通风、干燥、温暖, 勤换垫草, 保持合理密度, 饲喂优质饲料, 严禁饲料霉变。每周定期消毒1次, 用1∶ (100～300) 菌毒灭和百毒杀稀释液交替使用。

鸭疫里默氏菌病研究 篇4

1 发病情况

2008年4月, 福州市北郊某养殖户饲养的2 300羽雏番鸭, 于22日龄时有部分鸭发病, 表现精神沉郁、缩颈、采食量和饮水均减少, 4 d内发病鸭近450羽、发病率约19.6%, 病死160羽、病死率近35.6%, 肌肉注射庆大霉素、卡那霉素和使用抗病毒药物饮水, 治疗3 d均无效。

2 主要临床症状

患鸭主要表现为食欲减退、精神沉郁、缩颈、羽毛脏乱, 排绿色稀粪;严重患鸭表现多种神经症状, 如侧翻、头部顶地等。

3 主要剖检病变

剖检病死鸭和濒死鸭, 可见心脏、肝脏和气囊表面均附有一层明显的纤维素性渗出物, 即典型的“三炎”-心包炎、肝周炎和气囊炎;脾脏肿大、质脆, 表面呈大理石样外观;脑壳内壁、脑膜充血、出血。气囊壁增厚、浑浊。

4 实验室诊断

4.1 细菌分离

无菌从病死鸭中采集肝脏样品, 在消毒好的超净工作台中将肝脏组织分别接种在本研究室自制的琼脂平板 (RA-P) 和麦康凯琼脂平板上, 37℃恒温箱中培养24 h后观察, 结果在RA-P琼脂平板上长出单一的灰白色菌落, 而在麦康凯琼脂平板上未见有细菌生长。

4.2 生化试验

在消毒好的超净工作台中, 挑取RA-P琼脂平板上的灰白色单个菌落转接于本研究室自制的液体培养基 (RA-Y) 中, 置37℃恒温振荡培养16 h后, 取少量菌液分别接种于葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、乳糖、果糖、木糖、甘露糖、半乳糖、甘露醇、山梨醇、肌醇等微量生化管中, 置37℃恒温培养24 h后观察, 结果该分离菌均不分解以上糖类和醇类。

4.3 血清型鉴定

在消毒好的超净工作台中, 挑取RA-P琼脂平板上生长的灰白色单个菌落转接于新的RA-P琼脂平板上培养24 h后, 吸取少量磷酸缓冲液洗下菌落, 以1、2、3、13型鸭疫里默氏菌阳性血清按玻片凝集试验方法分别进行血清型鉴定。结果, 待检菌液只与2型鸭疫里默氏菌阳性血清发生特异的明显凝集, 表明所分离的细菌为血清2型鸭疫里默氏菌。

4.4 雏番鸭人工感染试验

购进2日龄健康雏番鸭30羽, 饲养到10日龄时分为A、B两组。A组20羽为试验组, 肌注分离菌的17 h液体纯培养物0.3 mL/羽;B组10羽为对照组, 每羽肌注灭菌生理盐水0.3 mL。两组分隔房间饲养, 观察10 d。结果A组鸭于攻菌后3～5 d内死亡17羽, 致死率85%, 剖检死亡鸭可见心包炎、肝周炎和气囊炎, 从其肝脏中重新分离出细菌, 以2型鸭疫里默氏菌阳性血清鉴定为原攻击菌。A组其余3羽鸭于攻菌后第10 d扑杀, 有1羽表现轻度心包炎;B组鸭扑杀5羽, 均正常, 无肉眼可见病变。

根据以上实验室检查结果, 可将该病例诊断为鸭疫里默氏菌病。

5 治疗

5.1 药敏试验

以青霉素、四环素、链霉素、红霉素、土霉素、庆大霉素、强力霉素、利福平、林可霉素、金霉素、磺胺嘧啶、新霉素、环丙沙星、氧氟沙星、丁胺卡那霉素、卡那霉素、头孢拉啶、头孢唑啉、增效磺胺、壮观霉素等药物纸片, 按常规纸片法在RA-P琼脂平板上进行药敏试验, 37℃恒温培养22 h, 结果详见表1, 从表中可见以上分离的2型鸭疫里默氏菌对利福平、头孢唑啉、头孢拉啶高度敏感, 对磺胺嘧啶、新霉素、林可霉素中度敏感。

5.2 治疗效果

根据以上药敏试验结果, 对发病鸭群使用利福平和头孢唑啉治疗, 即利福平按0.15%饮水5 d, 同时肌注头孢唑啉2万u/羽, 每天1次, 连用3 d。结果于用药后2 d鸭群状况好转, 采食量增加, 患鸭、死亡鸭数量明显减少。到用药后第4 d, 鸭群中未见患鸭和病死鸭, 表明疫情得到有效控制。

6 小结

1) 根据发病情况、临床症状、剖检病变和本研究室的细菌分离培养、生化试验测定和血清型鉴定结果, 确定该发病雏番鸭群感染2型鸭疫里默氏菌, 即诊断该发病鸭群为鸭疫里默氏菌病感染。

2) 自本研究室于1998年确定我省主要养鸭地区鸭感染鸭疫里默氏菌的血清型有2型以来至今10年, 血清2型己成为我省养鸭生产中鸭疫里默氏菌病感染的优势血清型。

鸭疫里默氏菌的研究进展 篇5

1 RA的分类地位

从最初发现RA至今, 其分类地位几经变更。直至Seger等 (1993) [2]通过研究r RNA顺反子相似性, 将其列为同源群的单独一个r RNA分支, 即属于r RNA总科Ⅴ中的一个r RNA同源群, Subramaniam等 (1997) 研究了4株RA编码的16S r RNA的rrs基因, 通过DNA序列分析进一步证实了本菌的系统发育位置, 即属于r RNA总科Ⅴ中的黄杆菌科的一个独立的r RNA分支。为纪念Riemer, 遂将其命名为鸭疫里默氏菌属 (Riemerella anatipestifer gen.nov) , 其典型菌株是LMG11054=ATCC11845=MCCM0568=CCUG14215。这一更名得到了世界其他国家学者的认可, 并被国际权威性专业期刊如Avian disease、Avian Pathology所引用。

2 血清型

RA的血清型众多, 过去不同国家采用不同的分型系统, 结果同一血清型往往有不同的名称, 为避免这种混乱, 后来统一采用美国的阿拉伯数字分型系统。到目前为止, 世界上报道的公认的RA血清型共有21个, 即血清1～21型。Pornpen PathanasopHon等 (2002) [3]利用HaeⅢ酶切分析了80株RA分离株的16S r RNA的rrn基因的PCR扩增片段, 根据HaeⅢ酶切图谱的差异, 认为K—670/89不适合做20型的标准株, 建议以698/95代替之。汪铭书等 (2003) [4]从不同代次的5～90日龄患有典型鸭传染性浆膜炎的病死鸭中分离到4个不属于1～21型的新的抗原型, 分别命名为22、23、24、25型。

Sandhu等 (1979) 认为RA各血清型之间不发生交叉反应, 但张大丙等 (2002) [5]发现2 型与17型在玻片凝集试验中存在明显的双向交叉反应, 在试管凝集试验中表现为单向低度交叉反应。张大丙等 (2002) [6]还证实6型、12型与16型之间存在交叉反应。至于其它血清型RA是否存在交叉反应以及交叉反应程度的强弱还有待于进一步研究。

3 诊断

典型的RA感染可根据流行病学特点、临床症状和病理变化做出初步诊断。但确诊还需进行实验室诊断。对RA的实验室诊断技术包括:病变器官涂片镜检、细菌的分离、生化特性的鉴定、荧光抗体法检查、间接血凝试验、间接ELISA等, 还可以采用平板凝集、试管凝集和琼脂扩散实验相结合的方法进行血清型鉴定。由于鸭传染性浆膜炎与大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鼻气管鸟杆菌、考诺尼亚菌等细菌引起的疾病在临床症状和病理变化上相似, 因此, 亟需建立一种方便、快速、准确的方法进行鉴别诊断。基于此, 一些分子生物学方法应运而生。

3.1 RFLP分析法

限制性片段长度多态性 (restrictionfragment length polymorpHism, RFLP) 分析是第一代以DNA指纹图谱为基础用于微生物分型鉴定的方法。其原理是用限制性内切酶将细胞基因组DNA进行切割, 然后在琼脂糖凝胶上电泳分离, 以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性。RFLP产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定, 但往往会因RFLP产生的指纹图谱十分复杂而造成分析上的困难。Richard B等[7]利用17种内切酶对RA基因组DNA进行了指纹分析, 其中以HinfⅠ和DdeⅠ内切酶消化的RA染色体DNA经琼脂糖电泳后的指纹图谱清晰可见, 可用于试验中89株RA的鉴别, 其余15种内切酶由于酶切图谱杂乱无章而无法应用。

3.2 REP-PCR分析法

重复序列PCR基因指纹分析 (Repet-itive element PCR genomic finger print-ing, REP-PCR) 也是一种以DNA为基础的分型方法, 目前应用于PCR的重复序列主要是BOX片段, 大小为154 bp, 是由保守性不同的亚序列组成。Bin Huang等[8]利用REP-PCR法分析了35株RA的电泳图谱, 得到19个不同的电泳谱型, 并认为可根据电泳谱型不同区分同一血清型的不同菌株。该方法对所有RA菌株的适用情况有待于进一步验证。

3.3 16S r RNA基因序列分析法

16S r RNA为原核生物核糖体中的一种核糖体RNA, 是核糖体小亚基的骨架。其基因在结构上分为保守区、半保守区和非保守区, 保守区序列基本恒定, 半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异。16S r RNA所含信息量丰富且长度适中 (1 500 bp左右) , 易于测序。随着微生物核糖体数据库的日益完善, 16S r RNA分类系统已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。目前已有许多株RA的16S r RNA的部分基因序列被测出, 并存入到GenBank中, 这为直接利用这些序列设计PCR引物或寡核苷酸探针检测RA提供了便利条件。目前利用16S r RNA基因片段设计引物对RA进行PCR检测在临床上已得到广泛应用[9,10,11]。

3.4 外膜蛋白在诊断中的应用

胡清海等[12]根据已发表的RA15型CVL110/89株编码42-KDa主要外膜蛋白的基因序列设计引物, 建立PCR方法对7个血清型的RA纯培养菌及野外病死鸭病料进行检测。结果表明, 7个血清型的RA纯培养菌DNA均可扩增出809bp的DNA片段, 而对照的大肠杆菌和沙门氏菌纯培养菌DNA扩增结果为阴性。由此可见, 针对外膜蛋白建立的PCR方法也可用于RA的鉴定和快速诊断。

4 防制

4.1 药物

鸭传染性浆膜炎作为一种细菌性传染病, 抗生素类药物对其有一定的治疗效果。虽然药敏试验表明RA对多种药物敏感[13], 但实际生产中的应用效果并不理想, 要达到比较好的防治效果, 必须反复投药, 这既增加了生产成本, 又易产生耐药性[14,15,16], 且长期使用抗生素类药物势必会破坏正常菌群, 影响免疫力, 使鸭只更易发生感染。因此, 制备有效力的菌苗来预防鸭传染性浆膜炎是当务之急。

4.2 疫苗

目前, 国内外研制的RA疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗, 亚单位疫苗正在研制中。Sandhu (1984) 等[17]针对美国主要流行株中的1、2、5型RA研制了三价福尔马林灭活苗, 该三价苗对这3个型的细菌均有保护作用, 但保护力持续时间较短。PathanasopHon P (1996) 等[18]证明无细胞滤液制备的灭活苗具有与细胞灭活苗同等的效力。

国内, 张鹤晓等[19]对用不同疫苗免疫鸭的抗体消长规律测定发现, 油佐剂疫苗免疫效果最好, 甲醛灭活苗2次免疫次之, 甲醛灭活苗一次免疫效果最差, 同时, 他们还从抗体水平角度推断, 雏鸭10日龄左右用苗最好。黄瑜等[20]研究了1型RA铝胶苗、蜂胶苗和油乳剂苗3种灭活苗的特性, 证实油乳剂灭活苗能提供最高的免疫保护率。此外, 吕敏娜等[21]、季权安等[22]还进行了鸭疫里氏杆菌—大肠杆菌二联灭活疫苗的研制, 经野外试用效果良好。

4.3 外膜蛋白免疫原性分析

近年来关于细菌外膜蛋白 (outer membrane protein, Omp) 的研究, 国内外学者做了大量工作, 也取得了很大进展。Omp在细菌代谢物质的运输、维持细菌的形态及调节细菌有关物质合成方面起重要作用, 同时在细菌致病性和免疫原性方面也发挥着重要的作用[23]。

PathanasopHon等[24]应用饱和硫酸铵沉淀法和SepHadex G-200凝胶柱提纯了1型RA的外膜蛋白, 对14日龄雏鸭一次性皮下注射氢氧化铝吸附的RA蛋白 (100μg/只) , 免疫后21 d攻以同源菌 (5×109CFU/只) , 可获得100%的保护。苏敬良等[25]用1型RA外膜蛋白抗原加弗氏佐剂免疫北京鸭检测其保护性, 结果表明对同源细菌攻击的保护率为100%。另有试验表明, RA蛋白半数有效剂量为43μg/只, 经甲醛灭活的RA菌体疫苗也能很好地抵抗同源菌的攻击, 经100℃处理1 h或用胰蛋白酶处理后完全丧失免疫原性, 经脂酶处理后丧失部分免疫原性, 表明外膜蛋白是RA的主要免疫原, 这为研制和开发RA蛋白苗奠定了基础。刘燕等[26]分析了四种血清型RA外膜蛋白的电泳图谱, 结果表明相同血清型的电泳图谱相似, 不同血清型的电泳图谱差异较大。是否可据此将RA按电泳图谱划分为不同的Omp型, 需要进一步收集更大量的菌株进行比较, 结合流行病学调查资料, 进行统计分析才能做出定论。

用细菌Omp制备疫苗, 可保护机体抵抗同型或异型菌的攻击, 但由于从菌体中直接提取Omp产量太低, 所以需要采用一种新的能获取大量Omp的方法。随着分子生物学的发展, 克隆表达技术被广泛应用到各种细菌Omp片段的表达中。已有许多基因被克隆并在不同的宿主系统中表达。

虽然广大学者对鸭疫里默氏菌进行了广泛的研究, 但仍有许多问题亟待解决, 如目前使用的菌苗都存在一定的弊端, 因此研制更加安全、有效、省时省力、能重复使用的新一代菌苗势在必行;传统的诊断方法费时费力, 因此探索简便快速特异的诊断方法也是减少经济损失的有效途径;致病机制、免疫原性等尚需深入研究。

摘要：鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的一种重要的鸭细菌病。由于该病分布的广泛性以及引起鸭的高死亡率、发育迟缓和淘汰率增加, 给养鸭业造成巨大的经济损失。所以, 对鸭疫里默氏菌进行深入研究, 以便预防和控制、乃至最终消灭本病, 有着重要的经济意义。文章从血清型、诊断方法、疫苗等方面概述了近年来鸭疫里默氏菌研究进展。

鸭疫里默氏菌的研究进展 篇6

1 RA的分类地位

从最初发现RA至今, 其分类地位几经变更。直至Seger等 (1993) [2]通过研究rRNA顺反子相似性, 将其列为同源群的单独一个r RNA分支, 即属于rRNA总科Ⅴ中的一个r RNA同源群, Subramaniam等 (1997) 研究了4株RA编码的16S rRNA的rrs基因, 通过DNA序列分析进一步证实了本菌的系统发育位置, 即属于rRNA总科Ⅴ中的黄杆菌科的一个独立的r RNA分支。为纪念Riemer, 遂将其命名为鸭疫里默氏菌属 (Riemerella anatipestifer gen.nov) , 其典型菌株是LMG11054=ATCC11845=MCCM0568=CCUG14215。这一更名得到了世界其他国家学者的认可, 并被国际权威性专业期刊如Avian disease、Avian Pathology所引用。

2 血清型

RA的血清型众多, 过去不同国家采用不同的分型系统, 结果同一血清型往往有不同的名称, 为避免这种混乱, 后来统一采用美国的阿拉伯数字分型系统。到目前为止, 世界上报道的公认的RA血清型共有21个, 即血清1~21型。Pornpen PathanasopHon等 (2002[3]利用HaeⅢ酶切分析了80株RA分离株的16S rRNA的rrn基因的PCR扩增片段, 根据HaeⅢ酶切图谱的差异, 认为K-670/89不适合做20型的标准株, 建议以698/95代替之。汪铭书等 (2003) [4]从不同代次的5~90日龄患有典型鸭传染性浆膜炎的病死鸭中分离到4个不属于1~21型的新的抗原型, 分别命名为22、23、24、25型。

Sandhu等 (1979) 认为RA各血清型之间不发生交叉反应, 但张大丙等 (2002) [5]发现2型与17型在玻片凝集试验中存在明显的双向交叉反应, 在试管凝集试验中表现为单向低度交叉反应。张大丙等 (2002) [6]还证实6型、12型与16型之间存在交叉反应。至于其它血清型RA是否存在交叉反应以及交叉反应程度的强弱还有待于进一步研究。

3 诊断

典型的RA感染可根据流行病学特点、临床症状和病理变化做出初步诊断。但确诊还需进行实验室诊断。对RA的实验室诊断技术包括:病变器官涂片镜检、细菌的分离、生化特性的鉴定、荧光抗体法检查、间接血凝试验、间接ELISA等, 还可以采用平板凝集、试管凝集和琼脂扩散实验相结合的方法进行血清型鉴定。由于鸭传染性浆膜炎与大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、鼻气管鸟杆菌、考诺尼亚菌等细菌引起的疾病在临床症状和病理变化上相似, 因此, 亟需建立一种方便、快速、准确的方法进行鉴别诊断。基于此, 一些分子生物学方法应运而生。

3.1 RFLP分析法

限制性片段长度多态性 (restric-tion fragment length polymorpHism, RFLP) 分析是第一代以DNA指纹图谱为基础用于微生物分型鉴定的方法。其原理是用限制性内切酶将细胞基因组DNA进行切割, 然后在琼脂糖凝胶上电泳分离, 以显示不同种群基因组DNA的限制性片段长度多态性。RFLP产生的指纹图谱更适用于细菌种间及种内株间的分型鉴定, 但往往会因RFLP产生的指纹图谱十分复杂而造成分析上的困难。Richard B等[7]利用17种内切酶对RA基因组DNA进行了指纹分析, 其中以HinfⅠ和DdeⅠ内切酶消化的RA染色体DNA经琼脂糖电泳后的指纹图谱清晰可见, 可用于试验中89株RA的鉴别, 其余15种内切酶由于酶切图谱杂乱无章而无法应用。

3.2 REP-PCR分析法

重复序列PCR基因指纹分析 (Repetitive element PCR genomic fingerprinting, REP-PCR) 也是一种以DNA为基础的分型方法, 目前应用于PCR的重复序列主要是BOX片段, 大小为154bp, 是由保守性不同的亚序列组成。Bin Huang等[8]利用REP-PCR法分析了35株RA的电泳图谱, 得到19个不同的电泳谱型, 并认为可根据电泳谱型不同区分同一血清型的不同菌株。该方法对所有RA菌株的适用情况有待于进一步验证。

3.3 16S rRNA基因序列分析法

16S rRNA为原核生物核糖体中的一种核糖体RNA, 是核糖体小亚基的骨架。其基因在结构上分为保守区、半保守区和非保守区, 保守区序列基本恒定, 半保守区和非保守区序列因不同种、属细菌而异。16S rRNA所含信息量丰富且长度适中 (1 500 bp左右) , 易于测序。随着微生物核糖体数据库的日益完善, 16S rRNA分类系统已成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。目前已有许多株RA的16S rRNA的部分基因序列被测出, 并存入到GenBank中, 这为直接利用这些序列设计PCR引物或寡核苷酸探针检测RA提供了便利条件。目前利用16S rRNA基因片段设计引物对RA进行PCR检测在临床上已得到广泛应用[9、11]。

3.4 外膜蛋白在诊断中的应用

胡清海等[12]根据已发表的RA15型CVL110/89株编码42-KDa主要外膜蛋白的基因序列设计引物, 建立PCR方法对7个血清型的RA纯培养菌及野外病死鸭病料进行检测。结果表明, 7个血清型的RA纯培养菌DNA均可扩增出809 bp的DNA片段, 而对照的大肠杆菌和沙门氏菌纯培养菌DNA扩增结果为阴性。由此可见, 针对外膜蛋白建立的PCR方法也可用于RA的鉴定和快速诊断。

4 防制

4.1 药物

鸭传染性浆膜炎作为一种细菌性传染病, 抗生素类药物对其有一定的治疗效果。虽然药敏试验表明RA对多种药物敏感, 但实际生产中的应用效果并不理想, 要达到比较好的防治效果, 必须反复投药, 这既增加了生产成本, 又易产生耐药性同, 且长期使用抗生素类药物势必会破坏正常菌群, 影响免疫力, 使鸭只更易发生感染。因此, 制备有效力的菌苗来预防鸭传染性浆膜炎是当务之急。

4.2 疫苗

目前, 国内外研制的RA疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗, 亚单位疫苗正在研制中。Sandhu (1984) 等针对美国主要流行株中的1、2、5型RA研制了三价福尔马林灭活苗, 该三价苗对这三个型的细菌均有保护作用, 但保护力持续时间较短。PathanasopHon P (1996) 等证明无细胞滤液制备的灭活苗具有与细胞灭活苗同等的效力。

国内, 张鹤晓等对用不同疫苗免疫鸭的抗体消长规律测定发现, 油佐剂疫苗免疫效果最好, 甲醛灭活苗两次免疫次之, 甲醛灭活苗一次免疫效果最差, 同时, 他们还从抗体水平角度推断, 雏鸭10日龄左右用苗最好。黄瑜等研究了1型RA铝胶苗、蜂胶苗和油乳剂苗3种灭活苗的特性, 证实油乳剂灭活苗能提供最高的免疫保护率。此外, 吕敏娜等、季权安等还进行了鸭疫里氏杆菌—大肠杆菌二联灭活疫苗的研制, 经野外试用效果良好。

4.3 外膜蛋白免疫原性分析

近年来关于细菌外膜蛋白 (outer membrane protein, Omp) 的研究, 国内外学者做了大量工作, 也取得了很大进展。Omp在细菌代谢物质的运输、维持细菌的形态及调节细菌有关物质合成方面起重要作用, 同时在细菌致病性和免疫原性方面也发挥着重要的作用。

PathanasopHon等应用饱和硫酸铵沉淀法和SepHadex G-200凝胶柱提纯了1型RA的外膜蛋白, 对14日龄雏鸭一次性皮下注射氢氧化铝吸附的RA蛋白 (100μg/只) , 免疫后21 d攻以同源菌 (5×109CFU/只) , 可获得100%的保护。苏敬良等用1型RA外膜蛋白抗原加弗氏佐剂免疫北京鸭检测其保护性, 结果表明对同源细菌攻击的保护率为100%。另有试验表明, RA蛋白半数有效剂量为43μg/只, 经甲醛灭活的RA菌体疫苗也能很好地抵抗同源菌的攻击, 经100℃处理1 h或用胰蛋白酶处理后完全丧失免疫原性, 经脂酶处理后丧失部分免疫原性, 表明外膜蛋白是RA的主要免疫原, 这为研制和开发RA蛋白苗奠定了基础。

刘燕等分析了四种血清型RA外膜蛋白的电泳图谱, 结果表明相同血清型的电泳图谱相似, 不同血清型的电泳图谱差异较大。是否可据此将RA按电泳图谱划分为不同的Omp型, 需要进一步收集更大量的菌株进行比较, 结合流行病学调查资料, 进行统计分析才能做出定论。

用细菌Omp制备疫苗, 可保护机体抵抗同型或异型菌的攻击, 但由于从菌体中直接提取Omp产量太低, 所以需要采用一种新的能获取大量Omp的方法。随着分子生物学的发展, 克隆表达技术被广泛应用到各种细菌Omp片段的表达中。已有许多基因被克隆并在不同的宿主系统中表达。

5 结语

虽然广大学者对鸭疫里默氏菌进行了广泛的研究, 但仍有许多问题亟待解决, 如目前使用的菌苗都存在一定的弊端, 因此研制更加安全、有效、省时省力、能重复使用的新一代菌苗势在必行;传统的诊断方法费时费力, 因此探索简便快速特异的诊断方法也是减少经济损失的有效途径;致病机制、免疫原性等尚需深入研究。

参考文献

[1]Hinz K H, Ryll M, Kohler B.Detection of acid production from carbohydrates by Riemerella anatipestifer and related organ-isms using the single substrate test.Vet.Mi-crobiol, 1998, 60:277~284.

[2]Seger P, Mannheim W, Vancannyt M, et al.Riemerella anatipestifer gen.nov, comb nov, the causative agent of septicemia anserum exsudativa and its phylogenetic af-filiaton within the Flavobacterium cytophaga rRNA homology group.Int.J.Sys.Bacteriol, 1993, 43 (4) :768~776.

[3]PathanasopHon P, Phuektes P, Tan-ticharoenyos T, et al.A potential new serotype of Riemerella anatipestifer isolated from ducks in Thailand.Avian Pathology2002, 31:267~270.

[4]程安春, 汪铭书, 陈孝跃, 等.我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性.中国兽医学报, 2003, 23 (4) :320~323.

[5]张大丙, 郭玉璞.鸭疫里默氏菌2型与17型之间的交叉反应.中国预防兽医学报, 2002, 24 (3) :192~194.

[6]张大丙, 郭玉璞.鸭疫里默氏菌6型、12型与16型之间的交叉反应.中国兽医学报, 2002, 22 (6) :565~567.

[7]Rimler R B, Nordholm G, E.DNA Finger-printing of Riemerella anatipestifer.Avian Diseases, 1998, 42:101~105.

[8]Bin Huang, Subramaniam S, Chua K L, et al.Molecular Fingerprinting of Riemerella anatipestifer by repetitive sequence PCR.Veterinary Microbiology, 1999, 67:213~219.

[9]刘文华, 苏敬良, 刘颖, 等.16S rRNA基因及外膜蛋白基因分析在鸭疫里默氏菌鉴定中的应用.中国预防兽医学报, 2006, 28 (6) :692~696.

[10]杨苗, 程安春, 汪铭书, 等.基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法的建立和应用.四川农业大学学报, 2007, 25 (3) :343~347.