自身免疫调节因子基因（精选4篇）
自身免疫调节因子基因 篇1
DNA重组技术及将外源基因引入动物幼体的显微注射和胚胎移植技术的发展为异质蛋白在转基因动物任何组织表达提供了基本的必要工具。然而,成功地应用这项技术需要事先知道对于乳腺特意表达及目的基因适当的激素调节和发育调节所必须的重要调节元件的位置等相关知识。这一技术应用于乳腺研究,已获得小鼠乳腺癌模型,该模型用于研究致癌基因和抑癌基因在适宜的发育条件下的功能。此外,这一途径还可操纵转基因家畜的乳汁成分,并利用乳腺作为生物反应器大量生产重要的药用蛋白[1],但要实现乳腺作为生物反应器的商业潜能,还需研究更有效的使得外源基因转入转基因家畜生殖细胞的转基因技术。
Jeffrey M Rosen等致力于激素调节正常乳腺分化功能表达机制的研究,30多年前就开始研究2个鼠乳蛋白基因,分别编码β-酪蛋白和乳清酸蛋白,这2种蛋白被作为乳腺上皮细胞终端分化的分子标志。这些基因的表达在乳腺发育过程中受催乳素和细胞底物相互作用的调节[2],而雌激素、成骨蛋白-4(BMP-4)和TGF-β对产生催乳素的细胞的激素分泌、基因转录和细胞生长都具有重要的调节作用[3]。转基因小鼠和转染乳腺上皮细胞的研究已经得到一些认定,即重要的调节元件对于乳腺特异的表达是必需的,而且这些研究还提供了泌乳刺激素和糖皮质激素调节乳蛋白基因表达活性机制的认知。然而并非所有重要的调节序列都位于乳蛋白基因的侧翼区域,有些位于基因内或非编码区[4,5]。一般的转基因构件特征包括内含子和外显子的位置与大小对于利用乳蛋白基因调控序列设计外源基因构件也是十分重要的因素。这些原理的应用使得许多重要的药用蛋白在转基因小鼠乳汁中成功地大量表达。
1 转基因构件的一般特征
如图1所示,一个长约80 bp对于激素调节非常重要的区域已经通过HC11乳腺细胞系转染的研究及DNA步移试验得以确认。这一复合元件位于鼠β-酪蛋白启动子区域内,启动子可引起转基因小鼠的组织特异性和发育调节[6,7,8]。
β-酪蛋白基因表达的几个复合应答元件
乳清酸蛋白启动子中包括核因子(NF)-I、糖皮质激素受体(GR)和信号转导子与激活子(Stat5)的绑定位点。酪蛋白启动子中包含Stat5、Yin Yang 1(YY1)、GR和CCAAT增强子绑定蛋白(C/EBP)的绑定位点。
转录因子STAT5的绑定位点位于转录起始位点上游90 bp左右,它已显示出对于泌乳刺激素调节鼠β-酪蛋白基因表达的重要性。紧挨STAT5位点5’端的是多功能锌指转录因子绑定位点yin yang-l(YY1),在β-酪蛋白启动子中起到抑制子的作用。YY1位点的突变显示STAT5的绑定变得更加容易。
在YY1绑定位点5’更远处是一个可与STAT5微弱互作的绑定位点,同时该位点也被一致认为是CCAAT增强子绑定蛋白(C/EBP)的绑定位点。C/EBPs是热稳定转录因子家族的一员,这些热稳定转录因子含有一个亮氨酸拉链和一个侧翼(可绑定DNA的基本结构域)。重组C/EBPβ可以绑定于这一位点,尽管或多或少比严格时相基因之一的C/EBP绑定位点弱了些,然而在泌乳期β-酪蛋白基因启动子内该位点的相互作用似乎与C/EBPα关系密切。另外,C/EBPα主要在终端分化后的哺乳期表达,C/EBP家族在乳腺上皮细胞中维持细胞增殖与终端分化方面可能扮演着中枢的角色,C/EBP家族不同成员和翻译调节亚型的相对数量在乳腺发育过程中发生了重大的变化。此外,在HC11细胞中,糖皮质激素和细胞外基质可能对于调节不同的C/EBPs及其亚型起主要作用。类固醇激素依赖于C/EBPβ亚型数量的改变,可能是由于加入糖皮质激素后1-酪蛋白基因表达时对于蛋白质合成的依赖而延迟应答。C/EBPs被认为在调解组织(如肝脏和脂肪细胞)分化中扮演主要角色,而最近对于乳腺干细胞的研究表明,C/EBPβ不但与乳腺组织的发育更与乳腺癌的发生密切相关[9]。在正常乳腺发育过程中,LIP(肝中富含的抑制蛋白,C/EBPβ的一种显性失活的同型体)的表达受激素调节并伴随孕期的细胞增殖。LIP可与C/EBP家族成员形成二聚体并抑制其转录活性,在不同病因的小鼠、大鼠和人乳腺癌中均检测到LIP水平的升高,因此提供给我们一个打破乳腺细胞终端分化、促进其持续增殖的机制。
紧邻C/EBP绑定位点5’方位的是糖皮质激素应答元件(GRE)半位点,该位点可与糖皮质激素受体(GR)微弱相互作用。Jeffrey M Rosen等的假设是加入糖皮质激素导致某种C/EBP1亚型相对数量的改变,以致C/EBPα可随后与GR作用,该作用可以是蛋白质-蛋白质直接相互作用也可以是1-酪蛋白启动子处于其最适度以下的绑定位点以蛋白质-DNA相互作用。GR-C/EBP相互作用可能随后促进YY1的解离,从而使得催乳素激活STAT5绑定。这一模型既有赖于对糖皮质激素应答的延迟又需要糖皮质激素和催乳素对于β-酪蛋白诱导的协同合作。
除激素外,乳腺上皮细胞与细胞外基质的相互作用也对乳蛋白基因表达的调节起到重要作用。在牛β-酪蛋白基因转录起始位点5’上游-1 562～-1 613 bp区域(指定为bce 1)显示可支持激素和细胞底物对报告基因的调节。β-酪蛋白基因的最近区域并未充分显示出对应答反应的促进作用,并含有一些重要的基本变化,这些变化可能会破坏转录因子与DNA间的重要互作(图1)。兔αs1-酪蛋白基因同样含有最近区域和末梢区域,这些(末梢)区域对于适当的激素调节是必需的,并且上游-3 300～-3 410 bp的调节区域含有一个C/EBP和STAT5绑定位点簇[10]。
已证实大鼠肝实质细胞中C/EBPα的浓度是由细胞和胞外基质的互作调节的,因此对于通过激素及细胞底物互作来适当调节酪蛋白基因表达也是很重要的。此外,胞外基质中N-三甲基赖氨酸与βl-整联蛋白的联合显示提高了乳腺上皮细胞中的酪氨酸磷酸化,这里提供了一个潜在的机制,通过该机制细胞底物可与泌乳刺激素信号转导通路相互作用。
2 转基因技术与表达效率
通过显微注射导入动物幼体内的转基因构件在转基因的表达水平上扮演了重要的角色。以显微注射法导入受精卵原核的DNA通常以首尾连接体形式随机插入基因组,由于真核基因组被强迫组织成拓扑性结构,随机整合便产生了位点效应,于是转基因的表达就会受到周围染色体序列的影响。因此,很多时候取决于整合位点的转基因表达水平会相差几个数量级,而转基因阳性鼠中可检测到的表达率小于50%。因此,转基因技术的改进对于外源基因的表达效率具有重要的影响。最近许多学者尝试胚胎肝细胞移植及体细胞核移植技术生产转基因动物[11],为乳腺生物反应器的进一步发展拓展了前景。
3 结语与展望
乳蛋白基因中调节元件的定义已取得重大进展,这些乳蛋白对于外源蛋白在转基因家畜乳汁中的表达具有重要意义。控制乳蛋白基因表达的分子机制也正在进一步研究中。然而,确保转基因有效表达而不依赖于染色体整合位点的必要元件的确定还必需进一步的研究。最后,实现乳腺作为生物反应器的商业潜能,这些研究还需结合转基因技术的不断改进。
参考文献
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自身免疫调节因子基因 篇2
1 HLA
人类白细胞抗原 (HLA) 基因是人类基因组中多态性程度最高、最为复杂的遗传系统。目前已知HLA基因参与多种与自身免疫相关的疾病, 通过基因组扫描及连锁不平衡分析证实白癜风的易感基因位于6p21.3-21.4上[1], 而HLA基因也位于6p21.3, 提示HLA等位基因与白癜风的发病有关, 其相关性已在多个人种中被报道。
1.1 HLA-Ⅰ类基因
通常HLA-Ⅰ类基因主要指经典的A、B、C座位, 它们具有相似的基因结构。目前, 国内外关于HLA-Ⅰ类基因与白癜风联系的研究如表1。
另有早期研究显示, HLA-B46与家族史阳性患者显著相关;HLA-Bw4在家族史阳性白癜风患者中均发现, 在家族史阴性但有血缘关系的患者中为48%;HLA-Cw4在家族史阳性为5.0%。在家族史阴性非节段型白癜风患者为21.1%, 家族史阴性患者HLA-A30、HLA-A31频率显著升高。HLA-A30与泛发型白癜风相关。HLA-Bw60 (40) 仅仅在成人型白癜风显著升高, HLA-Cw6与儿童型白癜风和泛发型白癜风相关。HLA-B27在12岁前发病的白癜风患者频率显著升高。
1.2 HLA-Ⅱ类基因
HLA-Ⅱ类基因区的基因产物常在成熟的B细胞、抗原呈递细胞 (巨噬细胞、树突状细胞) 、活化的T细胞上表达。1983年, Foley等首次报道美国白人白癜风患者HLA-DR4大幅度升高。1990年, Dunston等报道HLA-DR4与20岁之前发病和有自身免疫性疾病家族史相关。此外, 有研究显示DR增长频率高于DQ, 提示DR比DQ在白癜风发病中起着更为重要的作用[2]。目前的主要报道见表2。
此外, HLA-DRB1*070x在散发型、肢端型都呈明显增高, HLA-DRB1*1201, 2仅在散发型呈明显增高;有家族史的患者HLA-DRB1*070x呈明显增高;HLA-DRB1*1201, 2仅在儿童患者中表现出增高[3]。
1.3 HLA-Ⅲ类基因
HLA-Ⅲ类基因区位于Ⅱ类基因与Ⅰ类基区之间, 已检出40多个基因, 含4个补体成分的基因, 分别为:C2、Bf、C4A和C4B。其中, C4AQ0还与恶性贫血有关, 而白癜风患者因补体亢进可能也会有C4AQ0频率下降, 这就在基因水平上解释了白癜风常伴有恶性贫血的情况。
1.4 HLA单倍型
HLA复合体是一组紧密连锁的基因群, 这些连锁在一条染色体上的等位基因很少发生同源染色体间的交换, 构成了一个单倍型。单倍型基因与其它基因连锁形成扩展单倍型。在遗传过程中, HLA单倍型作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代。早期研究发现, 儿童型白癜风与扩展单倍型HLA-BFS-C4A3-C4B1-DR5 (W11) -DQW3相关, 成人发病与HLA-BFS-C4A3-C4B1-DR7-DQw2SHUD相关。Zamani等[4]的研究表明, DRB4*0101-DQB1*0303与白癜风显著相关。我国Xia等[5]的研究发现扩展的单倍型HLA-A25-B13-Cw*0602、HLA-A25-B27-Cw*0602等与中国汉族所有类型的白癜风有关, HLA-A25-Cw*0602-DQA1*0302频率在泛发性白癜风中呈显著增高, HLA-A25-B13-DQB1*0303-Cw*0602频率仅与成人白癜风相关。这些研究都显示出HLA等位基因与白癜风的联系, 为白癜风具有自身免疫方面的发病机制提供了证据。
2 细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)
CTLA-4是重要的免疫调节分子, 一般认为是针对T细胞激活的负调控和控制T细胞的凋亡, 其基因多态性与一些自身免疫性疾病密切相关[6]。有报道表明, CTLA-4与白癜风相关连, CTLA-4基因定位于2q33-q37。目前发现6个与自身免疫病CTLA-4基因的多态性位点:3个位于启动子区 (-1722T/C, CT60, -318C/T) 、1个位于外显子1 (49A/G) 、1个位于第一内含子 (-1822C/T) , 1个在3-UTR (AT) n多态性位点。目前研究较多的有位于外显子1上的+49A/G和3’-UTR上的短串联重复序列 (STR) 多态性。
有研究表明[7], 3’-UTR的STR多态性与多种自身免疫疾病有关, 尤其是106bp的等位基因。他们的研究发现, 白癜风患者的106bp等位频率增加, 不过这种差异仅发生在伴发自身免疫病的患者, 而不伴自身免疫病的白癜风患者与对照组无明显差异。因此, 该106bp等位基因可能与白癜风不直接相关, 而是与自身免疫疾病有关。
另外, 有研究通过PCR-RFLP发现CT60位点G等位基因, -318C/T位点T等位基因与白癜风相关联。其中, CT60多态性联合基因型GA+GG在发病年龄小于20岁组的分布频率显著高于同年龄段的正常对照组[8]。
介于上述报道均未能提供白癜风与CTLA-4基因直接相关的依据, 且研究对象中均有涉及患有其它自身免疫病的患者, 由此可以得出, CTLA-4可能只是自身免疫性疾病的普遍易感基因, 并非对白癜风特异。
3 淋巴蛋白酪氨酸磷酸酶 (LYP)
LYP的作用机制是, 能与Src酪氨酸激酶C端 (Csk) 相互作用, 使Src家族Lck、Fyn和Zap270酪氨酸激酶脱磷酸化而失活, 从而中断T细胞激活信号通路。近期研究发现, 为其编码的PTPN22基因的一个单核苷酸多态 (SNP) 1858C/T (rs2476601) , 可使密码子620编码的精氨酸变为色氨酸 (R620W) , 最终导致其对T细胞激活信号通路抑制不足, 起T细胞活性增强, 从而诱发自身免疫性疾病, 如1型糖尿病、风湿关节炎、系统性红斑狼疮、Graves病等自身免疫性疾病相关。
有研究表明, 1858T与白癜风相关, Canton等[9]对165个白癜风患者和304个对照组进行研究分析, 发现白癜风组中的PTPN22的基因多态1858C/T (R620W) 与白癜风有关, 他们还发现发现330个白癜风等位基因, 发现有48个 (14.5%) 为Trp620变异体编码, 而608对照等位基因中, 仅有52个 (8.6%) , 表明R620W错意的突变可能是泛发性白癜风发展的因素。Laberge等[10]的研究也证实185-8T与泛发型白癜风显著相关, PTPN22上1858C/T的基因型在病例组与对照组存在显著分布差异, 证实[11]PTPN22上1858T等位基因为泛发型白癜风发生的风险之一, 表明基因介导的自身免疫在白癜风发病机制中占有重要地位。不过, 并非所有的PTPN22基因的SNP均与白癜风有关, 在1858C/T的rs2476601、rs3811021、rs247659-9、rs3789607、rs1217407、rs1217418的等位均未发现与白癜风的相关性。这可能是因为所研究的个别SNP不能代表所有位点, 或者SNP对疾病的效率微弱, 当然也可能是由于其它基因的变化影响PTPN22基因的表达, 才使其间接参与白癜风的发病。
4 自身免疫调节因子 (AIRE)
白癜风在自身免疫病APECED中频率增高, 该病是由AIRE基因突变导致的。AIRE位于常染色体21 (21q22.3) 上, 且不同种族的APECED基因组位置相同。有报告称白癜风存在于APECED发病晚期, 是一个病情严重程度的指标[12]。AIRE基因表达于胸腺淋巴结和脾脏, 最新的研究认为AIRE通过胸腺髓质上皮细胞参与异位蛋白的表达, AIRE基因突变导致细胞中AIRE蛋白量减少, 使胸腺中异位蛋白表达明显减少, 增加了自身免疫性疾病发生的可能性[13]。AIRE基因突变一方面可能通过影响TLR2、4的表达而削弱了对自身衰老病变细胞的清除, 从而诱发自身免疫, 还能通过影响TLR9的表达降低T细胞的调节作用, 引起APSI中自身免疫症候群。Tazi-Ahnini R等[14]用病例对照分析法, 对AIRE基因多态进行分析, 发现在6个AIRE的基因多态 (AIREC-103T、C4144G、T5238C、G6528A、T7215C和T11787C) 中, 仅AIRE 7215C与白癜风有显著联系, 不过, 单体型检验分析显示自身免疫调节基因单体型CCTGCC与白癜风有明显相关性。为确定最小的有效单体型, 他们应用单核苷酸标记软件来标记其多态性, 分析该基因的4个SNP:C-103T、G6528A、T7215C和T11787C, 显示自身免疫调节基因单体型CGCC与白癜风相关。
5 自身免疫易感位点
Alkhateeb等[15]应用全基因组的连锁分析, 在多代白癜风的研究中发现, 位于1p31.3-p32.2上的自身免疫易感基因位点 (AIS1) 与白癜风密切相关, 并通过进一步研究将AIS1精确定位于1号染色体的D1S2742-D1S515之间。Fain等[16]通过基因扫描, 验证了这一结论, 并发现了位于1、7、8、11、19和22号染色体上的其它6个与白癜风密切相关的易感基因位点。Spritz等[17]对102个白癜风家系进行了分析及研究, 发现白癜风的7、8和17号位点上的染色体有联系。其中, 8号染色体则只和白癜风家族联系, 而7和17染色体显示出与其它自身免疫性疾病的相关性, 这可能代表了一般的自身免疫易感性。而一些自身免疫病的易感基因同样是白癜风的易感基因, 如位于17p13位点的易感基因SLEV1[18]。我国汉族人白癜风遗传因素复杂, 存在多个易感基因位点。陈建军等[19]发现, 4q13-q21位点与泛发性白癜风存在联系。梁艳华等[20]的研究发现, 22q12和6p21-p22证实为肯定连锁位点, 可能存在白癜风的易感基因;6q24-q25和1p36提示连锁信号进一步增强, 但仍未达到肯定连锁标准;14q12-q13并非为白癜风易感基因所在位点。
6 结语
综上所述, 遗传和免疫在白癜风的发病过程中起着极其重要的作用。近年来, 随着分子生物学、分子遗传学的发展, 人们对白癜风的发病因素有了进一步的了解, 对其易感区域定位、易感基因搜寻的研究也取得了一定的进展, 但其遗传模式、精确定位、基因间相互作用机制等尚有待进一步研究。相信随着科学技术的不断发展, 人们对白癜风的发病机制将会有更加深入的认识。
摘要：白癜风 (vitiligo) 是皮肤科的常见病, 发病机制尚不明确, 目前认为该病与遗传和免疫密切相关。阐述了免疫遗传与白癜风的关系, 并对近年来发现的易感基因作一综述。
自身免疫调节因子基因 篇3
1.1 研究对象
病例采用我院风湿免疫科2004年10月至2007年11月门诊及住院类风湿关节炎患者49例,均符合1987年美国风湿病学会RA分类诊断标准,和早期RA30例,共79例,其中男5例,女74例,男女比例为1.0:14.8,平均年龄(41±5)岁(35至32岁)。对照组61例分为两部分:①其他风湿免疫病人,包括系统性红斑狼疮35例、干燥综合症9例、强直性脊柱10例、混合性结缔组织病7例。②正常人10例,其中男2例,女8例,男女比为1:4,平均年龄32±4岁(30至64岁)。
1.2 研究方法
①APF抗原片制备:刮取人颊粘膜细胞,PBS洗涤三次、打孔、混匀、涂片,显微镜下点片细胞数到1000/10μl,干燥后保存于超低温冰箱-70℃。②间接免疫荧光法检测:我们选类风湿关节炎病人79例、其它风湿免疫病人61例、健康成人10例分为三组,做为研究对象,采其静脉血离心,对血清中存在APF的个体做敏感性及特异性分析。同时用乳胶凝集方法检测lgM-RF。
待测血清1:20稀释后加在抗原片上,室孵漂洗、吹干、加稀释好的荧光素标记羊抗入IgG抗体,用含EB液甘油的PBS液封固,作核复染色荧光镜下观察5个视野,核周均质圆形、椭圆形荧光颗粒为阳性细胞。为避免假阴、阳性出现,我们用北京协和医院提供的已知APF阳性血清做对照。
注意事项:①APF抗原片制备:APF靶抗原表达于人颊粘膜细胞浆内角质蛋白透明颗粒中,是体外感染颊粘膜细胞产生的一种蛋白质,故需取材于阳性,且表达良好的个体,打孔切勿过度,保持细胞完好状状,点片细胞数要足一且均匀,保存于-70℃条件下。②APF间接免疫荧光检测:保证抗原抗体反应良好,做好核复染,异硫氰酸光素标记的羊抗入IgG抗体为进口试剂,由北京协和医院提供。
2 结果
2.1 见表
统计学处理:各组之间阳性、阴性、敏感性和特异性率的分数采用X2检验。
由上表可以看出APF敏感性为70.9%,IgM-RF的敏感性为62.0%(x2=4,P<0.05),APF特异性90.3%,IgM-RF的特异性为64.5%(x2=12.54,P<0.001)二者有显著差别。APF敏感性特异性均明显优于Igm-RF,可以作为类风湿关节炎的诊断指标之一。
2.2 结果判定
阳性结果标准:核周阳性细胞大于5个为APF抗体阳性,5个以下为可疑,少于2个为阳性。
3 研究结论
抗核周因子抗体(APF)对RA的诊断感染性70.9%,特异性达90.3%,主要存在于RA病人血清中,且在疾病第一年内出现,为诊断RA提供了有利依据,而高滴度类风湿因子阳性也可见于其它风湿免疫病人26例,尤其是干燥综合症病人,类风湿因子阳性也见于正常人1例,部分类风湿性关节炎的病人也可表同为类风湿因子阴性有30例,在类风湿因子阴性的类风湿关节炎病人中检测有11例抗核周因子抗体阳性,阳性率36.7%,随诊一至两年后发展为典型的类风湿关节炎,此研究与国内文献报导40%基本相符,而抗核周因子抗体又极少见于其它风湿免疫病人,本实验的正常人群中未见APF阳性病例。故可见APF的补充诊断价值,从而提高了诊断的准确性,是早期诊断RA的有效指标之一。抗核周因子抗体对RA的诊断特异性随血清稀释倍数的增加而增加,而敏感性随之下降。抗本的出现可能与病性活动或严重性相关,可指导我们适时使用“倒金字塔”方案,合理联合用药既能有效治疗又能减少药物副作用,故对转归进展预后可做出判断。从而又见其在治疗RA方面的价值。
4 讨论
RA早期表现多种多样,有的以滑囊炎或多肌病关节痛起病,有的却以缓慢单关节以影响大关节(膝或肩)起病,故我们从基础理论实验实研究用间接免疫荧光法检测APF的角度出后,结合观察RA早期发病规律,寻找早期或明确诊断RA的根据。英国Emery经验报道,其早期RA多中心研究观察的800例病例显示:RA病人在头三个月内即可有骨质疏松:APF可出现在RA早期阶段一疾病的起病阶段,甚至其发病之前,这有助于早期诊断RA,充分体现了APF早期诊断价值。APF阳性率与放射学病情进展相关,多认为与病情活动性指标呈正相关,可见APF不仅可作为早期诊断RA的指标之一。
摘要：目的：旨在研究APF抗原片的制备及对RA的诊断意义。方法：以健康人口腔颊粘膜细胞为底物，待测血清稀浓度为1：20，用于检测RA病人、其它风湿免疫病及正常人的血清中是否存在APF抗体。同时检测类风湿因子IGM-RF，比较两者对RA诊断的敏感性和特异性。结果：在待测血清1：20稀浓度下APF对RA诊断敏感性为79．9%，特异性为90．3%，均优于IGM-RF，APF可作为RA的诊断指标之一，其抗原片底物细胞较稳定，易于存放便于临床推广应用。
自身免疫调节因子基因 篇4
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
新生Wistar大鼠 (同窝别, 出生后第7天) 、胎牛血清 (美国sigma) 、DMEM培养液 (美国Gibco公司) 、链霉素、青霉素、IL-1β、胶原酶 (美国sigma) , DAB (中山) 、Ⅱ型胶原一抗、二抗 (美国sigma) 、甲苯胺蓝、MMP-1 ELISA检测试剂盒 (美国sigma) 、MMP-1原位杂交试剂盒 (美国sigma) , IGFⅡ、倒置显微镜、酶标仪、96孔细胞培养板、CO2培养箱、超净工作台。
1.2 实验方法
1.2.1 体外培养关节软骨细胞
在无菌条件下取新生Wistar大鼠 (出生后第7天) 双后肢股骨髁软骨, GBSS平衡液漂洗4次后剪碎组织, 使用0.05%的透明质酸酶37.5℃消化6min, 0.2%胶原酶37℃振荡消化。4h后收集关节软骨细胞, 使用离心机1500r/min离心3min, 沉淀物用磷酸盐缓冲液 (PBS) 悬浮3次, 离心后至细胞沉淀, 使用10%胎牛血清DMEM液悬浮关节软骨细胞倒置显微镜下计数, 并且按照5×105/ml的细胞浓度移入细胞培养瓶中, 定时更换培养液待关节软骨细胞增殖为单层。胰蛋白酶消化, 按1×105/ml的浓度传代。将培养的第二代关节软骨细胞用于实验研究[3,4]。
1.2.2 实验分组与方法
待细胞贴壁增殖成单层细胞, 更换为0.1%牛血清清蛋白 (BSA) DMEM培养基中培养24h, 以去除内源性生长因子的影响, 然后更换含IL-1β1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml的培养基, 每一浓度分别作用于8孔, 另设8孔对照组。分别于24h、48h、72h后留取培养细胞上清液[5]。
1.2.3 ELISA技术检测MMP-1基因蛋白
对离心后的关节软骨细胞培养上清液进行检测, 取100μl关节软骨细胞上清液并加入大鼠MMP-1单克隆抗体包被的96孔酶标板中, 在室温下孵育120min, PBS洗涤4次, 生物素化抗体工作液密封板。然后在室温下孵育60min, PBS洗涤4次添加酶结合物工作液封板。最后在室温下孵育30min, PBS洗涤4次加显色剂避光室温20min, 呈现蓝色后加终止液, 混匀后在酶标仪450nm处读取光密度 (OD) 值。
1.2.4 原位杂交检测方法
关节软骨细胞培养48h贴壁, 固定后进行MMP-1mRNA原位杂交。使用Cmais-2000型图像分析系统, 每组均为4个观测孔, 同时每孔随机选定2个观测视野, 选择切片的空白区域进行图像校正并调整光源及灰度, 由计算机图像分析系统自动计算出应性物质每200倍视野下平均OD值[6]。
1.3 统计学方法
应用SPSS15.0统计软件进行统计学分析, 计量资料采用F检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 IL-1β对软骨细胞分泌MMP-1蛋白的影响
用酶联免疫吸附法检测IL-1β作用于关节软骨细胞后MMP-1基因蛋白的表达情况, IL-1β增加了体外培养关节软骨细胞MMP-1基因蛋白的分泌量, 组间比较差异有统计学意义 (P<0.05, 见表1) 。
注:与IL-1β0ng/ml比较, *P<0.05
2.2 IGFⅡ对关节软骨细胞MMP-1mRNA基因蛋白表达的影响
用原位杂交技术检测关节软骨细胞中MMP-1mRNA基因蛋白的表达, IL-1β可提高体外培养关节软骨细胞MMP-1mRNA基因蛋白的表达程度, 而IGF-Ⅱ可减弱MMP-1mRNA基因蛋白的表达情况, 在关节软骨细胞培养48h后可减弱MMP-1mRNA基因蛋白的表达情况。组间比较差异有统计学意义 (P<0.05, 见表2) 。
注:与IL-1 IL-1β0ng/ml+IGFⅡ10μg/ml比较, *P<0.05
3 讨论
关节软骨细胞是关节软骨的三大重要组成成分之一、软骨修复及损伤的主要标志, 同时也是软骨代谢活动的主要场所。MMPs家族对细胞外基质具有显著的分解作用, 对关节软骨的破坏有着极为重要的作用, 家族中的MMP-1基因蛋白又称为间质胶原酶, 有很多的MMP-1基因蛋白在病理组织中呈现出高表达, 而在正常关节软骨组织中却很难发现, 这极可能是与关节软骨组织中的表达浓度过低或者是与关节软骨组织中金属蛋白酶结合有着重要的关系[7]。
越来越多的资料证实了IL-1β对OA病变发生、发展有着重要的作用, 因为这些结果不仅被用于评价OA患者的病变程度, 也为临床上评价预后、防治病情的恶化指明了方向。因为IL-1β在OA的发生和发展过程中起着极为重要的作用, 被广泛的用于OA体外模型的构建, 同时在OA的病理改变中也发挥着极为重要的作用[8,9]。IL-1β是关节软骨细胞中胶原酶的有力刺激因子。在OA发病过程中, 关节软骨细胞在IL-1β因子的刺激下, 能够合成类型和数量异常的基质成分, 并且能够导致关节软骨基质丧失其固有的性质及特性[10,11]。IL-1β炎性因子在一定条件下还可以减少Ⅱ型胶原蛋白mRNA基因蛋白在关节软骨细胞中表达的增加, 同时能够导致金属蛋白酶基因蛋白表达的增加, 导致关节软骨基质的降解。相比之下, 生长代谢因子IGFⅡ可刺激关节软骨细胞基质蛋白的合成, 并减少细胞外基质的降解。