苏云金杆菌悬浮剂（通用8篇）
苏云金杆菌悬浮剂 篇1
稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medianalis Guenee)属螟蛾科,是水稻上的主要害虫之一,近年来,在万安县呈趋重发生态势,2015年发生面积3.08万hm2,占全县总面积的75%,严重影响万安县粮食生产安全。目前,防治稻纵卷叶螟的农药品种很多,但效果不一,通常使用1.8%阿维菌素乳油防治稻纵卷叶螟,为促进粮食增产、农民增收,保护环境生态安全,探索在控制水稻病虫危害的同时,减少农药用量,降低农药残留,作者开展了8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂防治稻纵卷叶螟药效试验。
1试验材料与方法
1.1试验材料
供试作物为晚稻五优308,防治对象为稻纵卷叶螟。试验药剂为8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂(湖北康欣农用药业有限公司生产),对照常规用药为1.8%阿维菌素乳油(广西田园生化股份有限公司生产)。
1.2试验方法
1.2.1试验处理
试验设4个处理,处理A为8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂1500g/hm2;处理B为8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂3000g/hm2;处理C为1.8%阿维菌素乳油1050mL/hm2;处理D为空白对照。
1.2.2试验地点
试验设在万安县窑头镇第2试验点的晚稻大田内,大田面积为3hm2,每处理区面积为667m2,水稻管理较好,土壤为泥壤土,各试验区的水肥和管理条件一致。
1.2.3施药方法
于2015年8月27日,稻纵卷叶螟低龄幼虫高峰期施1次药,水稻处于分蘖末期。
1.2.4药效调查方法
于药后7、14d分别调查活虫数、卷叶数,计算卷叶率、虫口减退率、保苗防效和杀虫防效。卷叶率(%)=卷叶数/调查总叶数×100;保苗防效(%)=(CK-PT)/CK×100,式中:CK为空白对照区卷叶率,PT为药剂处理区卷叶率。
2试验结果分析
试验药剂8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂1500g/hm2药后7d的保苗效果为61.28%,杀虫效果为63.49%;药后14d的保苗效果为68.36%,杀虫效果为65.63%。8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂3000g/hm2药后7d的保苗效果为80.13%,杀虫效果为83.08%;药后14d的保苗效果为86.75%,杀虫效果为88.54%。1.8%阿维菌素乳油1050mL/hm2药后7d的保苗效果为62.58%,杀虫效果为64.87%;药后14d的保苗效果为65.42%,杀虫效果为68.03%。8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂3000g/hm2对稻纵卷叶螟的防效较好,建议在稻纵卷叶螟低龄幼虫高峰期施药,按3000g/hm2对水750kg/hm2均匀喷雾。
摘要：选用8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂与对照常规用药1.8%阿维菌素乳油防治水稻稻纵卷叶螟,结果表明,8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂3000g/hm2药后14d的保苗效果为86.75%,杀虫效果为88.54%;对照药剂1.8%阿维菌素乳油1050mL/hm2药后14d的保苗效果为65.42%,杀虫效果为68.03%。8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂3000g/hm2防治稻纵卷叶螟的效果明显高于1.8%阿维菌素乳油1050mL/hm2。
关键词：8000IU/μL苏云金杆菌悬浮剂,稻纵卷叶螟,田间药效
苏云金杆菌悬浮剂 篇2
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性肽由三个典型的结构域组成.结构域Ⅰ位于肽链的N 端,为一组由6～7个两亲的`α螺旋围绕着一个疏水的α螺旋形成的α螺旋束,参与了细胞膜的穿孔;结构域Ⅱ位于肽链的中间,为三组以“希腊钥匙”(Greek key)拓扑结构连接在一起的反平行的β折叠片层,其顶端的突环参与了毒素与受体蛋白的结合;位于C端的结构域Ⅲ是由两组反平行的β折叠片层组成的夹心结构,以β果酱卷(jelly roll)拓扑结构排列 ,可能能够防止蛋白酶对毒素分子的过度降解.
作 者：邵宗泽 刘子铎 喻子牛 SHAO Zong-Ze LIU Zi-Duo YU Zi-Niu 作者单位：邵宗泽,SHAO Zong-Ze(华中农业大学微生物科学技术系,农业部农业微生物重点开放实验室,武汉,430070;山东农业大学生命科学院,泰安,271018)刘子铎,喻子牛,LIU Zi-Duo,YU Zi-Niu(华中农业大学微生物科学技术系,农业部农业微生物重点开放实验室,武汉,430070)
刊 名：生物化学与生物物理进展 ISTIC SCI PKU英文刊名：PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 年，卷(期)：2000 27(5) 分类号：Q71 关键词：苏云金芽胞杆菌 杀虫晶体蛋白 结构域★ 植物细胞教学心得体会
★ 植物细胞说课稿课件
★ 生物细胞的基本结构知识点
★ 浩辰结构剪力墙功能介绍
★ 《生态系统的结构和功能》的教学反思
苏云金杆菌悬浮剂 篇3
关键词：苏云金芽孢杆菌；大肠杆菌；质粒；cry8基因；克隆；表达；生物信息学分析
中图分类号：Q785文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）10-0028-04
收稿日期：2014-01-07
基金项目：国家“863”计划（编号：2011AA10A203、2010RCB54）。
作者简介：孙钰航（1984—），男，黑龙江牡丹人，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：weiweiabcd222@163.com。
通信作者：高继国，教授，博士生导师，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是目前应用最多也是应用最广泛的生物杀虫剂。它是天然的昆虫病原菌，对无脊椎动物中的4个门（包括节肢动物门中的16个目的3 000种以上）的害虫有活性[1]，而对非目标生物安全，从而广泛用于防治鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）等农林害虫[2]。苏云金芽孢杆菌能够产生多种杀虫活性物质，其中主要有Cry蛋白、Vip蛋白、Sip蛋白，其中对Cry蛋白与Vip蛋白的研究较深入[3]。随着研究与应用的深入，Bt杀虫基因在杀虫工程菌和转基因抗虫植物广泛应用的过程中已发现多种昆虫在实验室条件下对Bt毒素产生抗性，在田间也发现了具有抗性的个体[4]，因此，筛选、克隆新的高毒力、杀虫谱广且不易产生抗性与交互抗性的基因是解决问题的重要途径之一[5]。Cry8类蛋白质在Bt中分布比较广泛，它们对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀灭作用[6]。但目前成功防治鞘翅目害虫的Bt菌株和产品数量还相对较少，鞘翅目害虫是粮食作物、经济作物、园艺和森林的重要害虫，因此分离新的对鞘翅目害虫具有较高杀灭效果的Bt菌株并研究其杀虫蛋白基因，对于开发高效安全的生物杀虫剂和生产转基因作物有重要的理论和实践意义[7]。近些年发现的Bt杀虫活性物质另外一种Sip蛋白也具有鞘翅目害虫活性，Sip蛋白的发现为Bt杀虫活性蛋白提供了一条新思路[8]。笔者所在实验室自行分离出QWH132、QZL1-2、QWH7-2、QZL144-1、QZL144-2、QWH101菌株，经鉴定这些菌株中含有cry8类具有鞘翅目杀虫活性的基因。本研究以这些菌株为模板，分离克隆菌株中的cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因，并对其中所含的cry8类基因进行克隆与表达。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株来源本试验所用菌株分离自辽宁千山采集的土样，采用醋酸钠-抗生素筛选法进行分离[9]。其余菌株质粒见表1。
1.1.2酶及生化试剂2×Taq mix、2 × Primer Star mix均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自美国Axygen公司；其他均为市售国产或进口分析纯或电泳级纯化学试剂。
1.1.3主要仪器主要仪器包括Labnet PCR仪[Multigene Gradient（TC9600-G-230V）]、蛋白电泳仪（BIO-RAD MiNi-PROTEAN Tetra system）、离心机Beckman（AllegraTM64R Centrifuge）、北京赛智创业科技有限公司生产的ChampGel 6000全自动凝胶成像系统Gel Documentation And Image Analysis System等。
1.1.4培养基与抗生素液体LB：蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，加水定容到1 000 mL，调pH 值为70；固体LB：在液体培养基中加入1.3%琼脂。1/2固体LB：蛋白胨5.0 g，酵母粉2.5 g，NaCl 5.0 g，加水定容至1 000 mL，加入1.3%琼脂，调pH值至7.0；将氨苄青霉素、卡那霉素配制成100 mg/mL的水溶液，经0.22 μm过滤器过滤除菌，-20 ℃ 保存。
1.2方法
1.2.1从土壤中分离Bt菌Bt菌株分离纯化的方法参照文献[10]。表1菌株与质粒
菌株质粒特点描述来源大肠杆菌
（Escherichia coli）Rosetta
F-ompT hsdSB （RB-mB-） gal dcm λ（DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]） pLysSRARE（CamR）笔者所在实验室
JM109
rpsL（strr）、thr、leu、thi-1、lacY、galK、galT、ara、tonA、tsx、dam、dcm、supE44、Δ（lac-proAB）、[F′，traD36，proAB，laclqZΔM15]笔者所在实验室苏云金芽孢杆菌QWH132笔者所在实验室QZL1-2笔者所在实验室QWH 7-2笔者所在实验室QZL144-1笔者所在实验室QZL144-2笔者所在实验室QWH101笔者所在实验室PlasmidspMD19-T VectorAmprTaKaRa公司pEB
lac 操纵子、T7 启动子、多克隆位点、HisoTag、HSVoTag、lacZ 起始密码子、大肠杆菌启动子，Ampr笔者所在实验室
pEB8C-likepEB载体和cry8C-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室pEB8D-likepEB载体和cry8D-like基因重组质粒，Ampr笔者所在实验室pEB8E-likepEB载体和cry8E-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室pEB8F-likepEB载体和cry8F-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室pEB8K-likepEB载体和cry8K-like基因重组质粒， Ampr笔者所在实验室
1.2.2Bt总DNA的提取将菌株在固体LB培养基上培养12 h左右，再放入到1.5 mL EP管中，加入TE、2%十二烷基硫酸钠（SDS）各 200 μL，充分混匀；加入200 μL Tris饱和酚与200 μL 三氯甲烷，混匀，12 000 r/min离心10 min；取上清，加入1.5倍上清体积的异丙醇，50 μL的5 mol/L NaCl溶液，轻微振荡混匀；12 000 r/min离心10 min，弃上清，并加入200 μL 无水乙醇，沉淀DNA；离心，弃上清，干燥沉淀，用适量的ddH2O溶解。
1.2.3cry基因的扩增和克隆参照GenBank中公布的cry8类基因序列设计引物（表2），以提取的Bt基因组为模板，利用高保真DNA聚合酶和DNA聚合酶分别进行PCR扩增，方法参照文献[11]。
表2各的引物序列情况
引物名称序列（5′→3′）cry8-like F1ATGAATTCAAATAATCAAAATGAATcry8-like R1AATGGAGTTACGAACCTGAATcry8-like F2CCAAATGAAAAACGGTTGTTATGGGATGCcry8-like R2TGAGTCGTTTTGCCTCTTTCACTGCcry8-like R3TTACTCTACGTCAACAATCAATT
1.2.4基因测序基因测序由博仕生物医学服务中心完成，DNA序列分析采用DNAMAN、NCBI-BLAST软件进行。
1.2.5基因在大肠杆菌中的表达用KOD酶对cry8类基因进行克隆，胶回收产物连接pEB表达载体、转化到大肠杆菌JM109中[12]进行PCR鉴定，筛选出阳性转化子转化到大肠杆菌Rossetta中进行IPTG诱导表达，具体方法参照文献[13]。收集诱导物，离心，弃上清，用10 mmol/L Tris-HCl（pH值为8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎，取样，进行 SDS-PAGE 分析[14]。大肠杆菌质粒DNA 提取、酶切、连接、转化及Bt质粒提取参照文献[15-16]中的方法，杀虫晶体蛋白样品制备和SDS-PAGE 电泳检测方法参照文献[17]。
2结果与分析
2.1菌株分离
将分离得到的菌株接种于LB 固体培养基上，30 ℃培养48 h，涂片、烘干、固定、镜检，通过光学显微镜与电镜观察（图1）可知，菌体均为长杆状，芽胞为长圆棒状，晶体为球形。
2.2cry8类基因全长的克隆
采用TaKaRa公司生产的聚合酶与其设计的通用引物对菌株DNA模板进行PCR扩增，回收PCR产物，通过测序确定其基因类型分别为1个cry8C基因片段、1个cry8D基因片段、2个cry8E基因片段、1个cry8F基因片段、1个cry8K基因片段，参照GenBank中公布的cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因序列设计全长引物，利用TaKaRa公司生产的聚合酶进行PCR扩增，得到3 548、3 435、3 534、3 495、3 525、3 522 bp 的6个片段。扩增产物进行胶回收后和pMD19-T载体连接，获得了重组质粒，这些质粒被命名为pMD8C-like、pMD8D-like、pMD8E-like1、pMD8E-like2、pMD8F-like、pMD8K-like。转入大肠杆菌JM109中，通过蓝白斑筛选阳性克隆子，并对其测序。
2.3菌株中cry8C、cry8D、cry8E、cry8F、cry8K基因的序列分析
对pMD8C-like、pMD8D-like、pMD8E-like1、pMD8E-like2、pMD8F-like、pMD8K-like进行序列测定，得到6个核苷酸序列，其编码区长度分别为3 548、3 435、3 534、3 495、3 525、3 522 bp，琼脂糖凝胶电泳结果见图2。
pMD8C-like DNA序列碱基分布为A：988、C：733、G：599、T：1 228，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ca1相似度最高，最大同源性为100%。pMD8D-like DNA序列碱基分布为A：1 179、C：576、G：706、T：974，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Da1相似度最高，最大同源性为100%。pMD8E-like1 DNA序列碱基分布为A：1 229、C：584、G：766、T：955，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ea1相似度最高，最大同源性为98%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778984。pMD8E-like2 DNA序列碱基分布为A：1 215、C：576、G：761、T：943，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ea1相似度最高，最大同源性为99%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778985。pMD8F-like DNA序列碱基分布为A：1 253、C：572、G：728、T：972，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Fa1相似度最高，最大同源性为99%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778983。pMD8K-like DNA序列碱基分布为A：1 244、C：581、G：732、T：965，应用NCBI Blast比对同源性发现其与Cry8Ka2相似度最高，最大同源性为99%，该基因已在GenBank中注册，登记号为KC778982。
2.4菌株氨基酸的序列分析
对pMD8C-like、pMD8D-like、pMD8E-like1、pMD8E-like2、pMD8F-like、pMD8K-like进行氨基酸序列分析，其中Cry8Ca1与pMD8C-like蛋白序列无差别，全长共1 160个氨基酸，分子量为126.3 ku；Cry8Da1与pMD8D-like蛋白序列无差别，全长共1 144个氨基酸，分子量为125.8 ku；Cry8Ea1 DNA与pMD8E-like1 蛋白序列对比发现，起始端中多出一段MVDLQAAANSLVI氨基酸残基序列，全长共1 177个氨基酸，分子量为128.0 ku；Cry8Ea1 DNA与pMD8E-like2 蛋白序列对比后发现，第341位F被C替换，第492位F被L替换，第818位K被N替换，第872位D被G替换，第946位Q被R替换，全长共1 164个氨基酸，分子量为126.5 ku；Cry8Fa1 DNA与pMD8F-like 蛋白序列对比发现，第1 042位L被K替换，第1 126位S被T替换，全长共1 174个氨基酸，分子量为127.6 ku。Cry8Ka2 DNA与pMD8F-like 蛋白序列对比后发现，第9位E被G替换，第891位V被I替换，第1 144位P被Q替换，全长共1 173个氨基酸，分子量为 127.6 ku（图3）。
2.5Cry8C、Cry8D、Cry8E、Cry8F、Cry8K蛋白在大肠杆菌中的表达
将全长PCR片段回收后，与表达载体pEB连接，转入大肠杆菌Rosetta中进行SDS-PAGE电泳检测，结果表明基因能在Bt中表达，其表达蛋白为126～128 ku。
3结论与讨论
Bt杀虫晶体蛋白广泛应用于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目以及线虫、螨类和原生动物等多种重要的农林害虫的防治[18]。但是，目前能够用于转基因植物的Bt基因种类单一，我国具有自主知识产权的新型基因较少，用于转基因抗虫作物开发的基因十分有限[19]。地下害虫是国内外公认的难防治的土栖性害虫，已成为制约我国农业、林业、畜牧业的重要因素之一，Bt菌由于具有毒力高、专一性强、对非靶标生物无害等特点，成为防治地下害虫的重要途径。
Cry8类蛋白质在Bt中分布较广泛，它们对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有抑杀作用[14]。对蛴螬有杀虫活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cry23、cry18、cry37、cry43等基因[14]。其中，研究最多的是cry8类基因，cry8类基因由 1 160～1 210个氨基酸组成，分子量在128～137 ku之间。笔者所在实验室筛选到了7株cry8类基因，但这7株菌株中除了含有已经鉴定的基因外，还可能含有一些其他的cry8类杀虫基因，需要新的方法去发掘。
本研究对笔者所在实验室采集并保存的包括辽宁千山地区分离得到的120株Bt菌株进行Bt cry基因的鉴定，共检出7株包含cry8类基因菌株，其中cry8C类2株、cry8E类3株、
cry8F类1株、cry8K类1株，其中2株菌基因型完全相同，由于分离时间差异可排除同菌株污染。cry8类基因检出率为9.2%，本试验中所用的土样采取于东北地区不同地域，该地域纬度偏高、年均温度较低，可能导致出菌率较低。
辽宁千山地区植被丰富、昆虫种群丰富且土壤含腐殖质丰富，能从这些土壤中分离出多个含有cry8类基因的菌株，证明该菌株在自然环境中存在较为普遍，充分证明我国地域辽阔、生境类型多样、生物多样性丰富，是生物物种的天然基因库[20]。
本研究从菌株QZL144-2所得到的cry8Ea基因与已知基因5个位点存在差异，与已知菌株对比，其上氨基酸序列第341位F被C替换，第492位F被L替换，第818位K被N替换，第872位D被G替换，第946位Q被R替换；从菌株QWH101中得到的cry8Ka基因与已知基因3个位点存在差异，其上氨基酸序列第9位E被G替换，第891位V被I替换， 第 1 144 位P被Q替换，有研究表明Cry毒力蛋白中只要有几个氨基酸位点发生变化，就会引起毒力和杀虫谱的显著变化[16]，所以对其后续的活性研究依旧具有重要意义。
将菌株QZL144-1序列得到的cry8Ea基因与已知的cry8Ea对比发现，其起始氨基酸序列中多出一段MVDLQAAANSLVI氨基酸残基，这个发现与已知的模式基因cry7A、cry7B的起始序列差别很像，可能会有比较大的活性差异[16]。本研究从1株菌株中成功克隆了含有2个8类基因cry8Ca、cry8Ea的菌株，虽然其同源性为100%，但研究价值较高，证明cry8基因在对蛴螬有活性的Bt菌株中经常是共存的[15]。本试验分离出来的cry8类菌株均完成了大肠杆菌Rosetta（DE3）的异源表达，表达蛋白均为128 ku左右。由于试验条件所限，进行鞘翅目生物活性测定的结果并不理想，蛋白的试验组杀虫活性与对照组差异不显著，可能是由于实验室环境下鞘翅目幼虫生存环境产生较大差异，从而导致幼虫死亡。
本试验分离出多个cry8类基因，其中不同种类的cry8类基因是否有协同作用有待后续研究，尤其是对同一菌株含有2个以上Cry8类蛋白是否会有增效作用需要着重研究。由于试验菌株来自天然的Bt菌株，其中天然存在的cry8基因并且成功地进行异源表达可以为构建高效杀地下害虫活性重组微生物提供重要的基因来源，丰富了抗虫基因库且对于其后续的杀虫活性与交互抗性研究提供了很好的试验素材与理论价值。
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苏云金芽孢杆菌的研究进展 篇4
随着Bt的应用, 害虫产生耐药性的问题随之出现。Bravo等人对Cry蛋白片段进行系统进化分析, 表明进化主要有两个途径:即三个结构域的独立进化和不同杀虫蛋白之间结构域III的交换。三个结构域的独立进化主要是不同的结构域内部发生氨基酸突变, 不同结构域之间的突变互不影响, 该途径突变最终导致新杀虫蛋白不断的产生。通过对结构域III的分析发现, 在不同Cry蛋白之间结构域III发生了交换, 而且发生交换的杀虫蛋白结构域III的氨基酸序列具有高度的相似性[2]。de Maagd等也推测结构域转换是Bt在自然界进化的一种机制, 而这种转换主要集中在结构域III上。研究者在参考了Bt在自然环境下的进化机制, 与生物技术等手段相结合对Bt进行有效改造, 得到了多种新型Bt基因, 所获得的新型Cry蛋白也具有良好的抗虫效果。为此, 主要对Bt的一些生态学研究进展和热点应用研究进展进行综述。
1 苏云金芽孢杆菌的生态位
关于Bt的生态学和生活方式的讨论现在依旧是研究者争论的话题, 一些研究认为Bt是土壤微生物, 从腐烂的有机物和根系分泌物中吸收营养, 随着植物的发芽和生长到达植物地上部分。还有一些研究认为, Bt是一种特殊的病原体, 可杀死宿主, 并在宿主尸体上寄生, 进而沉积到土壤中。实际上, 根据Bt的生存力和繁殖力, 其可以存在于不同的生态位, Bt应属于'copiotrophic'微生物。
1.1 土壤环境
一些研究者认为, Bt在土壤中是腐生的生活方式。然而, 一些研究者通过对昆虫尸体研究表明Bt是靠营养物质生存, 这一重要特征可保证Bt自身能在土壤中增殖。Dubois等[3]的研究表 ( (转转下下页页) ) ( (接接上上页页) ) 明, 营养阶段是Bt复杂生命周期的一部分, 其受到几个基因的激活和调控, 在宿主死亡后改变其新陈代谢。另一些研究表明了Bt也有腐生的生活方式, 例如可以在粪便和污水中生长。
1.2 内生植物环境
一般情况下, 内生菌与植物是互利共生的关系, 可以存活在植物组织内部, 但不引起生理损伤和植物形态的改变。在这种内生关系中, Bt从植物中吸取营养来维持生存, 而Bt通过产生毒素以保护植物免受昆虫的攻击和病害的出现。一些研究发现, Bt可在棉花、大豆等植物内生存, 同时可以产生Cry毒素[4]。同样的, Bt可以在豆科植物的根中存活, 导致了根瘤的生长。
1.3 水环境
对水中生存物种种类的研究相对较少, 但在这类研究中发现, Bt具有在水中生存的能力。Ichimatsu等从河流、小溪和池塘中分离出了多种Bt菌株, 其中有26.7%发现对双翅目具有杀虫活性。Konecka等人从林溪样品中分离出的Bt菌株对鳞翅目的活性是HD1菌株的24倍[5]。细菌在水环境中的生存能力受到其他生物、化学和物理因子的影响, 研究表明, Bt能在营养和氧气丰富的水环境中生存。由此可见, Bt也存在与水环境中。
2 Bt在害虫防治领域的应用性研究
2.1 Bt制剂的应用性研究
目前, Bt已发展成为国内外产量最大的微生物杀虫剂, 是商业开发最成功的微生物杀虫剂, 广泛应用于防治农林害虫。随着Bt制剂的使用, 出现了Bt毒力不强、杀虫谱窄、持效期短、害虫产生抗性等问题, 进而在Bt制剂的应用方式上进行研究, 解决了上述问题, 使Bt得到更好的应用。
2.1.1 Bt与其他生物杀虫剂混配
Bt与球孢白僵菌和植物源农药这两种友好型杀虫剂的混配使用也被广泛研究。例如, 李新社等利用苏云金芽孢杆菌与球孢白僵菌混配杀灭酒曲害虫黑菌虫, 害虫死亡率达93.33%。Murray从芸香科植物中分离出柠檬苦素与Bt混合, 将其饲喂马铃署甲虫时, 发现其与Bt相拮抗。这可能是由于芸香科植物能产生一种拒食素影响昆虫取食, 从而降低了杀虫剂的杀虫效果[6]。为此, 筛选与Bt混配的植物源杀虫剂时应评价植物源杀虫剂和Bt在作物中的兼容性, 选择能够与Bt起协同增效作用的植物源杀虫活性成分。
2.1.2 与害虫天敌混配
Wysoki的研究认为Bt对虫卵无毒性, 因此可以和卵寄生昆虫能够共生。Trumble等在施用Bt的西红柿田里释放赤眼蜂, 证实这种做法抗虫效果良好, 并且与施用化学杀虫剂相比更经济。用Bt与Prillus bioculatus联合治理田间的马铃署甲虫表明, 它们之间具有增效作用, 但是Bt对该天敌没有有害影响[6]。López R等的研究发现将Myiopharus doryphorae、寄生马铃薯甲虫或苞叶中的寄蝇长期处于Bt的至死中浓度中, 会降低他们的存活能力。因此Bt与天敌混合使用要考虑二者之间的相容性。
2.2 Bt基因的应用性研究
1981年美国的Schnepf等从HD-1菌株中克隆出第1个cry基因, 并在1985年公布了它的核酸序列, 1987年三个实验室同时从该菌株分离了相同杀鞘翅目昆虫的cry3A基因。在我国, 孙明等克隆了国内第一个cry基因, Bt毒蛋白基因国际命名委员会将其正式命名为cry1Ac10[6]。目前已经发现有700多个cry基因。
转Bt Cry基因植物:
随着Bt基因的应用, 面临着与Bt制剂同样的问题, 即害虫抗药性的问题。于是, 对多个Bt基因联合使用和新型Bt基因的研究与应用就成了的热点。
双Bt基因目前已经达到了预期的抗虫效果。李汉霞等通过有性杂交获得带有cry1Ac和cry1C双价的转基因青花菜, 抗虫性鉴定证明双价抗虫基因相互作用提高了青花菜的抗虫性。任亚超通过共转化法将双Bt基因同时转入烟草, 从整体抗虫性来看, 转基因各株系间的抗虫性存在显著差异。
多个Bt基因在植物中存在相互影响的问题, 随着新的Bt不断分离及其ICP杀虫谱的鉴定, 对杀虫能力强的Bt基因进行改造, 构建新型Bt基因, 转入植物即为单一Bt基因转入植物, 避免了多个基因之间相互影响。
3 展望
随着人类对健康和生态平衡的关注度的提高, Bt以对人体无害等优点, 取代化学农药被广泛应用在农业生产的各个领域。而且, 人们正在通过各个学科 (生物化学、基因工程、生物化学反应工程等) 的交叉渗透和综合应用, 不断扩宽Bt的开发领域。随着以基因工程为主导的现代生物技术的不断发展, 如何扩大杀虫谱、延长Bt有效期或作为生态因子保存在环境中持续发挥作用以及获得Bt蛋白能稳定高表达的转基因植株已经是国内外研究的热门领域。但随着Bt的研究与应用, 无论是改造后Bt菌株的毒力还是在转Bt基因植株中Bt的表达量均有所增强和提高, 其对所在生态环境的相互影响将成为新的研究方向。
参考文献
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苏云金杆菌悬浮剂 篇5
一、苏云金杆菌 (B.t) 的杀虫机制和杀虫范围
苏云金杆菌 (B.t) 制剂是胃毒剂, 进入昆虫消化道后, 伴孢晶体 (主要成分为蛋白质) 被昆虫碱性肠液破坏成较小单位的δ-内毒素, 使中肠停止蠕动、瘫痪, 中肠上皮细胞解离、停食, 芽孢则在肠中萌发, 经被破坏的肠壁进入血腔, 大量繁殖, 使害虫得败血症而死。目前已知苏云金杆菌有30多个变种, 某些变种营养体对数生长时期产生β—外毒素, 耐热, 是一种腺嘌呤核苷酸, 也起杀虫作用。苏云金杆菌杀虫谱广, 能防治上百种害虫, 对鳞翅目幼虫特别有效。目前苏云金杆菌 (B.t) 及其混配制剂已用于防治蔬菜、水稻、玉米、棉、果树、茶树和林区等害虫。如防治菜青虫、小菜蛾、稻苞虫、稻纵卷叶螟、玉米螟、棉铃虫、枣尽蠖、松毛虫、烟青虫、茶卷蛾、茶尺蠖等百种虫害, 是应用最广的微生物杀虫剂。中国50年代初曾从法国引进苏云金杆菌, 并进行防治玉米螟试验, 1959年又从捷克引进苏云金杆菌, 1961年从前苏联引进苏云金杆菌蜡螟变种青虫菌。与此同时, 四川省农科院植保所与农业部成都药械厂合作从事苏云金杆菌的研发工作, 至今全国已发展到80个厂家开发生产, 使用面积达近600万公顷。目前苏云金杆菌 (B.t) 的开发工作正在向改善工艺流程和提高产品质量方向发展, 同时继续寻找自然存在的B.t新菌系和利用分子生物学技术已确定的菌系基因形成转合的B.t菌系。近年来四川省农科院植保所植保技术工程公司与湖北康欣农药业有限公司 (湖北省农科院Bt研究开发中心) 合作推广应用苏云金杆菌 (B.t) 。
二、苏云金杆菌 (B.t) 杀虫效果好, 持效期较长, 并有后效作用
据上海市蔬菜技术推广站用生绿B.t粉剂 (16000国际单位/mg) , 亩用30g、50g和70g防治小菜蛾, 施药后7天的平均防效分别为74.4%、82.1%和90.3%;5%抑太保乳油用亩50ml, 防治小菜蛾, 施药后7天的平均防效为79.9%。武汉市蔬菜所亩用30g、50g和70g防治小菜蛾, 施药后7天的平均防效分别为86.5%、92.4%和95.5%, 与法国罗克福公司生产的Bt IS057A, 亩用50ml/亩的防效相当 (93.1%) 。《河北农业科学》1999年12月报导生绿 (苏云金杆菌B.t) 粉剂16000国际单位/ml, 防治美国白蛾, 稀释400倍液、800倍液和1200倍液, 施药后72小时 (3天) , 其平均防效分别为99.1%、100%和98.3%。
苏云金杆菌与其它杀虫剂混用后不仅能提高防治效果, 还能降低化学农药用量, 保护了天敌。1999年武汉市蔬菜所用2%苏齐 (B.t+阿维菌素) 可湿性粉剂, 防治小菜蛾田间药效试验。分别设1000倍液、2000倍液和3000倍液, 施药1天的平均防效分别为78.98%、69.4%和67.69%;施药后3天的平均防效分别为94.01%、93.41%和90.93%;施药后7天的平均防效分别为85.95%、84.72%和82.72%;施药后10天的平均防效分别为79.23%、75.45%和71.76%。海南省农科院植保所, 用2%苏齐 (B.t+阿维菌素) 防治小菜蛾田间药效试验, 分别设500倍液、1000倍液和2000倍液。施药后1天的平均防效分别为91.63%、85.86%和85.78%;施药后3天的平均防效分别为99.17%、96.45%和95.40%;施药后7天的平均防效分别为100%、98.19%和96.69%;施药后14天的平均防效分别为46.31%、40.49%和29.50%。2000年江西省农科院植保所用2.5%高氯苏WP《高效氯氰菊酯+苏云金杆菌 (B.t) 》防治小菜蛾田间药效试验, 分别设50g/亩、40g/亩和30g/亩。施药后1天的平均防效分别为83.1%、85.44%和67.7%;施药后3天的平均防效分别为88.57%、88.48%和73.14%;施药后7天的平均防效分别为89.46%、85.68%和75.22%。同年湖北省农科院植保所同样的剂量防治小菜蛾田间药效试验结果, 防效也相当好。施药7天的平均防效分别达92.42%、86.28%和81.84%。四川省棉竹市植保站用苏云金杆菌 (B.t) 乳剂 (1500ml/hm2) +杀虫双水剂 (500ml/hm2) 和苏云金杆菌 (B.t) 乳剂 (2250ml/hm2) +杀虫双水剂 (750ml/hm2) 防治水稻二化螟, 其防效分别为98.27%和93.15%;另外湖北省农科院植保所和江西省农科院植保所用10.8%毒 (毒死蜱) 苏 (苏云金杆菌 (B t) ) 可湿性粉剂进行防治斜纹夜蛾田间试验, 使用剂量为900g/hm2、750g/hm2和600g/hm2, 施药后7天其平均防效分别在97.58% (98.91%) 、94.57% (94.09%) 和89.75% (88.63%) 。
三、微生物杀虫剂——苏云金杆菌 (B.t) 应用前景广阔
苏云金杆菌 (B.t) 属生物农药范畴, 随着生物农药不断推广应用, 生物农药在虫害防治中的特点逐渐显现出来, 其主要表现为:
1. 对环境不会造成污染
由苏云金杆菌源于昆虫病原细菌的活体, 在环境中参与能量与物质循环, 在对作物施药后对水体、土壤、大气都不会产生污染, 也不会在作物中残留, 更不会产生生物富集等现象。
2. 对非靶标生物无杀伤力
由于生物农药是生物活体, 假如不考虑生态环境因素, 那么生物农药对非靶生物是几乎没有杀伤力的。加之苏云金杆菌 (B.t) 制剂是胃毒剂, 是通过害虫进食后而达到杀死害虫的目的。根据湖北省农科院植保所连续3年对棉田捕食性天敌的影响试验, 施药后48小时调查, 对捕食蜘蛛类、食虫蝽类、瓢虫类和草蛉等其它类天敌的影响, 施用苏云金杆菌 (B.t) 乳油比施药前天敌增加16.75%~23.07%, 而化防田的天敌却减少72.73%~82.97%。
3. 杀虫机制独特
而传统农药大多数都是神经毒剂, 因此在害虫综合治理中, 对抗性治理、协调治理中能发挥显著作用。而苏云金杆菌 (B.t) 所产生的内毒素作用于害虫中肠上的特异性受体, 可以称为消化毒剂, 所以能克服害虫的抗药性。根据福建农林大学植保系吴刚等人对苏云金杆菌预处理小菜蛾对有机磷和氨基甲酸杀虫剂的增效作用的研究结果表明:苏云金杆菌 (B.t) 预处理抗性小菜蛾幼虫后, 其对甲胺磷、水胺硫磷和克百威的敏感性分别为未处理的6.74、8.83和8.5倍, 即能克服抗化学农药药性。
4. 有明显的杀虫后效作用
根据《生物防治通报》资料, 分别用75mg/kg、50mg/kg、25mg/kg和10mg/kg饲喂棉铃虫3龄幼虫和成虫, 其结果是成虫寿命比饲喂5%糖水的减少5.4±0.63天~4.8±0.86天和4.3±0.1~2±0.32天;单雌产卵分别减少753±33.9粒、735±27.3粒、670±18.1粒和462±30.4粒;卵粒孵化率分别减少100%、67%±10.2%和51.98%, 苏云金杆菌 (B.t) 对棉铃虫成虫和幼虫的生长、发育、繁育都有明显的抑制作用。
四、使用苏云金杆菌 (B.t) 的注意事项
苏云金杆菌悬浮剂 篇6
Bt可湿性粉剂:Bt-HD,Bt-HB;由HZAU研制,WHKN公司生产。
苏云金杆菌是一种微生物源低毒杀虫剂,以胃毒作用为主。该菌可产生两大类毒素,即内毒素(伴孢晶体)和外毒素,使害虫停止取食,最后害虫因饥饿和死亡而外毒素作用缓慢,在蜕皮和变态时作用明显,这两个时期是RNA合成的高峰期,外毒素能抑制依赖于DNA的RNA聚合酶。
2 试验设计
2.1 试验处理
小区面积15m2左右,Bt-HD,Bt-HB做3次重复,CK做2次重复共8个小区,具体如下。
2.2 施药方法
播种前混肥翻耕:按照1 kg Bt加入5 kg米糠或麦麸的比例,混匀后撒到土壤表面,然后翻耕;在种苗出芽之后,用清水稀释后淋灌,每隔一周施用一次,共用3次。
2.3 栽培条件
选择跳甲常年发生较重的田块进行,该实验地共用种子约为400g;肥料共使用100斤,分三次使用,分别在出苗后早期、中期、中后期使用。此外根据土壤的干旱程度进行适当浇水。
期间在出苗初期(两片子叶)进行页面防治,用广东植物龙生物技术股份有限公司秒杀甲750倍喷雾进行防治共一次(防止迁入成虫的危害)。在中期、中后期用陶氏益农艾绿士1500倍喷雾进行小菜蛾防治共两次。
气象资料:11月份气温间于17℃至25℃,以晴天为主,无持续风向,微风;12月份气温间于10℃至18℃之间,天气寒冷,以小雨阴天为主,吹北风,微风。
3 结果
跳甲防效调查时间与方法:(1)第一次翻土取土壤分析计算细菌的数量,7天后再取土壤分析计算细菌数量,泥土经过105倍稀释后涂布在营养琼脂下培养,7天后再取的土壤中细菌的数量明显增加。(2)经过最后一轮的药后7天调查一次,每小区随机选取60株作物调查活成虫数;待菜心收割,每小区随机选取30株作物测量高度。
跳甲成虫防效与株高增长率
4 分析
从跳甲成虫防效来看,HB与化学药剂防效基本一致,防效可达七成以上。HD防效稍差。但由于整个生长期气温较低,所以成虫数量较少。从株高看药剂处理增长都比CK明显,其中HB处理增长相当且都比HD好。
5 讨论
对黄曲条跳甲的防效不但要重视成虫的防治,而且更应重视土壤幼虫、卵的防治,建议在播种前宜进行晒地、翻晒、轮作等措施降低幼虫、卵的基数,同时配合土壤处理,苗期成虫防治措施。更要特别注意的是蔬菜整个生长期迁入成虫的防治,特别是在多湿高温的天气更加要注重成虫的防治,从而全面系统降低跳甲种群数量。
研究发现BT处理的综合效果较为理想,Bt最好可以在大户大基地推广使用,一方面这样可以不用担心周边成虫迁入的危害,从而减少叶面的防治;另一方面BT的长期使用综合防治效果会更好,而且可以起到改良土壤的作用。
苏云金杆菌悬浮剂 篇7
介绍了对苏云金杆菌Bt02 的发酵条件优化研究, 通过单因素及正交试验提高了发酵活菌数, 为之后的应用研究做基础。
1材料与方法
1.1试验菌种
试验所用的苏云金杆菌菌株是从土壤样品中筛选分离所得, 命名为Bt02。
1.2 试验仪器
超净工作台 (苏净集团苏州安泰空气技术有限公司, SW-CJ-2F) 、涡旋振荡器 (澳门市其林贝尔仪器制造有限公司) 、摇床 (江苏太仓市实验设备厂, THZ-D) 和培养箱 (韶关市泰宏医疗器械有限公司, LRH-150B) 。
1.3 试验试剂
蛋白胨、玉米粉、酵母粉、豆饼粉、葡萄糖、麦芽糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉、脱脂豆粉、蔗糖、牛肉粉、氯化钠、KH2PO4、Fe SO4、Mn SO4、Zn SO4、Mg SO4、Ca CO3、Na OH、HCl、p H试纸。
1.4 培养基筛选
培养种子液选用的是LB培养基:蛋白胨1%, 氯化钠1%, 酵母粉0.5%, 灭菌前将p H值调节至7.5。
基础培养基:葡萄糖15 g/L、蛋白胨20 g/L、玉米粉15 g/L、氯化钠1 g/L、KH2PO42 g/L、Fe SO4·7H2O 0.02 g/L、Mn SO4·H2O0.02 g/L、Zn SO4·7H2O 0.02 g/L、Mg SO4·7H2O 0.3 g/L、Ca CO32 g/L。灭菌前将p H值调至7.5。
采用摇瓶培养的方式, 选用250 m L三角瓶, 加入50 m L液体培养基, 灭菌前将p H值调节至7.5, 灭菌冷却后按照2% 接种量 (1 m L) 接入对数期种子培养液, 30 ℃ , 180 r/min摇床振荡培养40 h测发酵液菌数。
1.4.1 碳源筛选。以基础培养基为本, 分别用15 g/L的麦芽糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉、蔗糖代替基础配方中的玉米粉配制培养基, 灭菌后接种, 按照之前的摇瓶培养条件发酵, 发酵结束后稀释涂布法计菌数[5,6]。
1.4.2 氮源筛选。以基础培养基为本, 分别用20 g/L的牛肉粉、豆饼粉、酵母粉、脱脂豆粉代替基础配方中的蛋白胨配制培养基, 灭菌后接种, 按照之前的摇瓶培养条件发酵, 发酵结束后稀释涂布法计菌数。
1.4.3 最适C/N比。以选出的碳源麦芽糊精和氮源脱脂豆粉作为试验因素, 每个因素设3 个水平。进一步优化发酵培养基中碳、氮源的用量。培养基的其他成分与基础培养基一致, 培养条件不变。发酵结束后稀释涂布法计数, 数据分析用软件SPSS17.0。
1.5 培养条件的优化
1.5.1 p H值。取1 m L对数期种子培养液接入50 m L灭菌前p H值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 的液体培养基中, 接种量4%, 180 r/min, 30 ℃培养40 h测菌数。
1.5.2 温度。取1 m L对数期种子培养液接入50 m L灭菌前p H值为8.0 的液体培养基中, 接种量4% , 温度分别为26、28、30、32、34、36 ℃培养, 180 r/min, 培养40 h测菌数。
1.5.3 转速。取1 m L对数期种子培养液接入50 m L灭菌前p H值为8.0 的液体培养基中, 接种量4%, 转速分别为140、160、180、200、220、240 r/min, 30 ℃培养40 h测菌数。
2 结果与分析
2.1 碳源对菌数的影响
选用4 种碳源作对比, 发酵结束后统计菌数的结果如图1 所示, 从结果中可看出麦芽糊精作碳源的菌数最高, 因此后续试验中选用麦芽糊精作为最佳碳源。
2.2 氮源对菌数的影响
选用4 种氮源作对比, 发酵结束后统计菌数的结果如图2 所示, 从结果中可看出脱脂豆粉为氮源的菌数最高, 因此后续试验中选用脱脂豆粉为最佳氮源。
2.3 C/N比对菌数的影响
利用SPSS17.0 设计正交试验, 设计方案与菌数结果如表1 所示。对试验结果进行方差分析, 结果如表2 所示。可以看出脱脂豆粉对Bt02 菌数的影响显著, 而麦芽糊精对菌数的影响并不显著。脱脂豆粉和麦芽糊精的最适浓度分别为20 g/L和15 g/L。
2.4 初始p H值变化对菌数的影响
不同初始p H值对菌数的影响, 结果见图3。随着p H值的增高菌数呈现先增加后降低的趋势, 当灭菌前p H值为8.0时, 菌数最高。
2.5 培养温度对菌数的影响
不同培养温度对菌数的影响, 结果见图4。随着温度的增高菌数呈现先增加后降低的趋势, 当培养温度为30 ℃时, 菌数最高。
2.6 培养转速对菌数的影响
不同转速对菌数的影响, 结果见图5。随着转速的增加菌数也呈现先增多后减少的趋势, 最适转速为200 r/min。
3 结论与讨论
本研究通过对苏云金杆菌Bt02 进行一系列的调整与优化发酵条件, 选用最佳碳源麦芽糊精、氮源脱脂豆粉培养, 灭菌前培养基p H值调至8.0, 发酵摇床转速200 r/min, 4% 接种量, 30 ℃ 发酵培养, 菌数提高到8×109cfu/m L。 相对于原配方的4.3×109cfu/m L, 提高了1.86 倍。
本研究通过对该菌的发酵优化大大提高了活菌数, 后期可将该菌的发酵产物与青岛明月蓝海生物科技有限公司五菌天王搭配使用, 开发新型抗韭蛆的生物肥料, 杀虫效果需要进一步验证, 且具体搭配比例也需进一步研究, 将为新型生物肥料的开发提供新的参考。
摘要：对苏云金杆菌Bt02进行发酵条件的优化研究, 通过碳源和氮源单因素试验及正交试验, 选出最佳碳、氮源及配比, 对p H值、发酵温度和转速进行了研究, 结果表明, 碳源选用麦芽糊精, 氮源选择脱脂豆粉, 初始p H值8.0, 温度30℃、转速为200 r/min为最佳发酵条件, 菌数提高到8×109cfu/m L。相对于原配方的4.3×109cfu/m L, 提高了1.86倍。
关键词：苏云金杆菌,Bt02,配方优化,正交试验
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苏云金杆菌悬浮剂 篇8
1. 生物农药发展概况
随着人类环境保护意识的增强, 高效低毒的生物农药已成为当今农药的发展方向。生物农药是指非人工合成, 具有杀虫、杀菌或抗病、除草能力的, 并可以制成具有农药功效和商品价值的生物制剂, 包括微生物源农药 (细菌、病毒、真菌及其次生代谢产物) 、植物源农药、动物源农药和抗病虫草害的转基因植物等。相对于常规的化学农药而言, 生物农药具有作用方式独特, 防治对象专一, 对天敌等有益生物安全, 用量小, 降解快, 对人、畜、环境风险性低, 适用于病、虫、草害综合防治等特点。1992年, 世界环境与发展大会曾明确指出, 到2000年要在全球范围内控制化学农药的销售和使用, 生物农药的用量达到60%, 然而, 目前生物农药在全球农药销售总量中仅占2%的市场份额, 与预期目标相差甚远。因此, 大力发展生物农药已经成为世界各国共同面临的重大任务。我国有关部门提出到2015年, 要求生物农药的使用占农药总量的30%~50%, 按此比例计算, 当前我国农药耗用量每年达120万t, 年需生物农药量至少在60万t以上。至2002年底, 包括转基因棉花, 我国生物农药年产量仅占到农药总产量的10%左右, 推广应用面积占到农药总应用面积的12%左右。可见发展生物农药已经成为我国急待解决的重大问题之一。目前, 我国正式注册的农药生产企业近2 000家, 品种约250种, 年产量近40万t, 总产量仅次于美国。其中, 化学农药占农药总量的90%以上, 生物农药所占比例不足10%, 我国农药品种结构老化, 高毒品种仍在继续使用, 集中表现为“3个70%”, 即杀虫剂约占农药总产量的70%, 有机磷农药约占杀虫剂的70%, 几个高毒老品种, 如, 甲胺磷、甲基对硫磷、敌敌畏等约占有机磷农药的70%, 这种现状已不能适应现代农业生产发展和环境保护的要求。
生物农药在我国发展有两个高潮, 即20世纪60年代-70年代和20世纪90年代以后。在前一个高潮阶段由于当时生物技术水平相对较低, 满足不了生物农药对工艺、贮藏和运输要求的条件, 除井冈霉素外, 未形成有影响的产品。进入20世纪90年代以后, 由于生物技术尤其是微生物技术的进步, 为生物农药的开发提供了便利, 形成了第二个高潮。据《农药登记公告》统计, 我国已商品化的生物农药产品主要有以下几类:苏云金杆菌、核型多角体病毒、阿维菌素和农用抗生素等。
不同种类的生物农药各有特点, 病毒类生物农药由于病毒无法离体培养, 生产中需要大量养殖昆虫, 从而使大规模生产受到限制;真菌类生物农药, 由于大量培养抗逆孢子技术没有突破, 致使产品的保存期和稳定性达不到农药登记的要求, 造成规模化生产存在一定的难度;植物源农药由于需要种植大量植物, 工业规模化生产受到土地、植被和生态保护等限制;动物源农药主要是被开发成仿生合成农药, 直接开发成生物农药难度很大;转基因植物, 由于安全性评价问题也影响其推广应用。以苏云金杆菌为代表的细菌类杀虫剂, 由于容易通过现代化发酵技术实现规模化生产, 产品便于运输、贮存和应用, 因而受到国内外研究者的关注和企业家的广泛重视。
2. 苏云金杆菌杀虫剂的研究现状
国际上已商品化的生物农药约30种, 以苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis, 简称Bt) 居主要地位, 已有产品为数百种, 约占整个生物农药市场的70%以上。1997年销售额达到9.84亿美元, 其中半数在美国。苏云金杆菌是一种革兰氏阳性细菌, 它在形成芽孢的同时能够产生一种或几种杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体, 晶体蛋白为其主要的杀虫活性成分。目前, 人们对Bt杀虫晶体蛋白的空间结构与功能、作用机理以及毒素与受体的结合模型进行了深入的研究, 在此基础上利用蛋白质工程和基因工程技术构建Bt工程菌, 增强Bt杀虫剂的毒力, 拓宽其杀虫谱, 进一步利用Bt基因及其他抗虫基因来转化植物, 以获得害虫难以产生抗性的转基因植物。
由于苏云金杆菌具有高特异性的杀虫活性和对人畜及非目标昆虫的安全性, 同时对环境没有不利影响, 因而得到了广泛的应用。然而由于Bt杀虫剂的杀虫谱较窄, 杀虫活性稳定性差以及残效期短, 从而限制了Bt杀虫剂更广泛的应用。近年来, 利用遗传工程技术构建Bt工程菌, 扩大杀虫谱, 提高杀虫效率, 以及将杀虫晶体蛋白基因转入农作物中以获得抗虫植物等方面, 都取得了很大的进展。
为了扩大Bt制剂的杀虫范围, 人们从自然界分离筛选新的Bt菌株, 通过分子生物学技术鉴定克隆出新的杀虫晶体蛋白基因。利用蛋白质工程技术对野生Bt菌株产生的晶体蛋白进行定点突变, 从而扩大Bt制剂的杀虫范围。