生物被膜

生物被膜（共3篇）

生物被膜 篇1

近年来, 由细菌生物被膜引发感染的报道逐年增多, 而且严重威胁着人类的健康, 已成为临床治疗最棘手的问题之一, 也掀起了对其研究的热潮。目前, 针对医学和兽医学的各种检测方法都有所报道, 并已运用于实际。但是, 有些方法操作复杂, 敏感性和特异性差, 远远不能满足早期快速检测的需要。只有进行广泛深入研究, 才能得到客观、准确的检测结果, 真正为临床治疗生物膜引起的感染提供帮助。因此, 寻找简单、快速、可靠的检测方法已迫在眉睫。本文就细菌生物被膜的检测方法综述如下。

1 早期检测细菌生物被膜的方法

1.1 三磷酸腺苷 (ATP) 生物发光法

ATP生物发光法 (ATP biolumniesecnce test) 是一种间接、快速检测细菌生物被膜的方法, 大致做法是, 将细菌生物被膜从接触表面擦拭下来, 使用荧光仪对样本中的相关光单位 (relative light unit, RLU) 作统计, 检测ATP的总量[1]。这种检测方法具有便携、易操作、可提供实时检测结果等特点。萤火虫发光是在有氧条件下, 利用其体内的虫荧光素酶 (D-luciferin) 催化虫荧光素和ATP之间发生氧化反应形成氧化荧光素, 发出荧光;而细菌生物系统较微弱的发光与一般的生物发光稍有不同, 它是利用细菌细胞所产生的ATP与虫荧光素酶直接接触, 反映的是一种生物体的生命状态, 传递一定信息, 表达一定功能, 是一种“低水平的生物化学发光”。 由于虫荧光素酶对ATP的反应非常灵敏, 荧光强弱可以通过荧光仪计量, 然后通过相对荧光值和细菌细胞数的关系曲线, 可以大概确定样品中细菌细胞数, 又由于细菌细胞中的ATP含量与通过擦拭收集到的生物被膜的含量是相关的, 进而可以检测到细菌生物被膜。这种方法已被应用于食品生产和流通过程中的微生物快速监测和清洁度监测, 前景比较广阔。

1.2 高效液相色谱法

高效液相色谱 (HPLC) 法是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法, 其原理是被检样品经过加温处理, 尽量除去乙醇和二氧化碳, 调节pH值接近于中性, 过滤, 经反相色谱分离后, 按顺序离开色谱柱进入检测器, 产生的离子流信号经放大后, 在记录器上描绘出各组分的色谱峰, 根据保留时间和峰面积进行定性和定量。研究人员发现:磷脂是一种理想的生物标志物, 可通过研究磷脂组成揭示微生物含量、群落的组成和生理状况等信息;而且磷脂还是一种重要的生物活性物质及信息分子前体的贮备形式。由于细菌生物被膜中含有磷脂成分, 高效液相色谱法[4]是测定生物膜磷脂最有效的方法, 因此这种方法可以检测细菌生物被膜, 并且具有稳定性较好、精确度较高、检测限较低等优点, 但该方法也有缺陷, 分析时间长、对某些磷脂组分分离不完全, 因此不能进行定量分析。1994年, C.Passariello等[1]应用高效液相色谱法考察了绿脓假单胞菌细菌生物被膜受不同因素影响的情况, 对细菌生物被膜成分 (藻酸盐) 的含量进行了测定, 证明应用高效液相色谱法可对细菌生物被膜形成能力进行检测。

1.3 透射电镜、扫描电镜和激光共聚焦扫描显微镜法

应用透射电镜 (TEM) 和扫描电镜 (SEM) 都可以直接检测细菌生物被膜表层的形态学, 其细胞间的连结、纤维样多糖、细胞间质都清楚可辨[2]。而且应用扫描电镜还可以观察到细菌生物被膜内部的超微结构, 结果更准确、可靠, 被认为是检测细菌生物被膜形成能力的“金标准”, 但试验条件的要求比较高, 而且价格昂贵, 在临床实验室对生物膜形成能力进行评估时难以达到要求, 不宜做常规检测。

激光共聚焦扫描显微镜 (CSLM) 法[3]是近年来发展起来的一项新技术, 可以对透光样本进行分层扫描拍摄, 主要用于组织形态学研究, 也可对细菌生物被膜的立体结构进行形态学观察。

1.4 荧光素二乙酸酯法

荧光素二乙酸酯法 (nuoer seenidiacetate, FDA) 是一种间接检测细菌生物被膜的方法[3], 原理是利用活菌体的代谢能力, 细菌生物细胞中存在一种特异性酶 (aspecifioeterasees) , 可以降解荧光物质——荧光素二乙酸酯, 然后与菌液直接接触, 放出荧光素而发出绿光, 在一定波长处显示吸光度值, 使活菌数 (活力) 反映在光学特征上。该方法设备要求较低, 准确度较高。黄静[4]用荧光素二乙酸酯法检测沙门菌菌悬液时发现, 这种方法可以将溶液中的活菌数转变为菌体活力, 从而反映出细菌生物膜的致病性。此外还发现, 该方法测得的吸光度值与平板计数法测得的活菌值间存在较高的线性相关性。但该方法存在一定缺陷, 被测菌液的浓度必须达到1×105 cfu/mL以上, 而且在对细菌生物被膜进行检测时, 必须将细菌生物被膜从接触表面剥离下来才能检测。目前, 主要应用于饮用水管道里形成的细菌生物被膜的检测。

2 后来发展的检测细菌生物被膜的方法

2.1 传统方法

在检测细菌生物被膜的传统方法[5]中, 主要有平板擦拭法 (platingofswabbing) 、接触平板法 (eontaetplates) 和量计法 (dipstiekecthnnuie) 。一般来说, 这些方法比较经济也容易应用于实际。不过, 在平板擦拭法中, 需要利用海绵等类似物质来擦拭黏附在接触表面的细菌生物被膜。

2.2 银染法

目前, 银染法是被广泛采用的一种定性检测生物被膜形成能力的方法, 用来证明多糖、蛋白复合物和细菌生物被膜的共存, 样本需经AgNO3等溶液浸泡处理。这种检测方法可靠、特异、高效、省时、简便, 临床上可用于大量细菌生物被膜形成能力的鉴定[6]。银染法操作简单, 对设备要求较低, 在普通实验室就可以进行。受试菌经过一段时间就能在某些材料表面黏附形成一定大小的菌落, 然后逐渐扩大, 此时应用银染法即可分辨产多糖蛋白复合物的菌株。经过上述处理后, 若培养基呈灰黑色, 则可初步鉴定为细菌生物被膜。

2.3 结晶紫染色法

结晶紫染色法[7]是一种微孔板生物被膜表型检测的传统方法, 也叫胞外黏附基质的结晶紫染色法, 具有方便、可靠、特异、高效等特点, 可以进行半定量检测。但其操作过程较为复杂且耗时, 具体操作如下:将用肉汤培养基培养的细菌稀释, 取稀释后的菌液加入96 孔平底组织培养盘培养后, 吸干每孔菌液, 然后用固定液固定, 用结晶紫染色, 洗去未黏附的细菌, 晾干, 然后用酶标仪检测每孔的吸光度值。以阴性对照菌株平均吸光度值的3倍标准差为界定值, 如果被测菌株的吸光度值比界定值大, 则为生物膜形成株。李燕等[8]证明, 半定量黏附试验的特异性和灵敏度都为100%, 而且价格低, 适用于临床常规检查。

2.4 刚果红试验

刚果红试验[9]是细菌胞外多糖黏附素 (PIA) 染色法, 在生物膜形成过程中产生的胞外多糖黏附素可以与刚果红牢固结合, 如果菌落呈现红褐色、干燥并且出现结晶, 则检测结果为阳性, 是一种操作简便且快速的体外细菌生物膜形成的定性检测方法。

2.5 报告基因检测技术

报告基因 (reporter gene) 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因, 其编码序列与基因表达调控序列或其他目的基因融合形成嵌合基因进行表达, 其产物很容易被鉴定, 且具有一定的稳定性, 底物通过发出荧光显示相应的活动。根据报告基因检测技术[10]原理, 便可以了解细菌生物被膜的基因表达。该方法具有简单、迅速、灵敏, 并且容易进行定量, 便于样品的大量分析。D.G.Davies等[11]利用该技术, 分别检测了铜绿色假单胞菌的生物被膜状态和浮游菌状态藻酸盐启动子的活性。结果表明, 与浮游状态的细胞相比, 处于生物被膜状态的细胞, 其藻酸盐生物合成基因呈现增量表达。

2.6 玻璃管法

玻璃管法 (glass tube method) 是一种广泛运用于细菌生物被膜的初步定性检测方法, 具有简单、快捷等优点, 所需试剂和仪器等试验条件较低。达来宝力格等[12]用玻璃管法, 并结合微量板定量检测法, 对胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 体外形成生物被膜的能力进行了定性分析。结果表明, 胸膜肺炎放线杆菌在体外可以形成生物被膜。2009年, 有学者运用玻璃管法鉴定了从土壤和污水处理系统分离菌株的生物被膜形成能力。试验中由于一些主观误差, 对细菌生物被膜微观形态的观察不是很理想。这暗示此方法只能用于对细菌生物被膜形成能力的初步鉴定, 不太适合更为精准的深层研究。但是如果需要检测大批量的细菌是否具有生物被膜形成能力, 玻璃管法也不失为一个较好的选择。

3 近年来发展的检测细菌生物被膜的方法

3.1 PCR鉴定

PCR鉴定是近年来新发展起来的一种在细菌体外检测生物被膜形成能力的方法, 具有简便、快速、特异性高等特点。随着有关细菌生物被膜形成机制的深入研究, 有证据显示表皮葡萄球菌生物被膜形成与ica操纵子基因、细菌生物被膜的形成密切相关[13]。C.R.Arciola等[14]认为, PCR 法是检测ica基因非常有效的诊断技术, 可以大大提高细菌生物被膜诊断的阳性率。

3.2 肽核酸探针荧光原位杂交技术

肽核酸 (peptide nucleic acid, PNA) 探针荧光原位杂交技术是S.Malic等[15]发现一种检测慢性伤口感染的工具, 这种技术具有良好的杂交特异性和杂交动力特性。其原理是肽核酸具有与肽链骨架相似的结构, 并且携带有碱基, PNA分子主链的骨架是由2-氨基乙基-甘氨酸通过酰胺键连接组成, 核酸碱基是通过亚甲基羰基连接在碳原子上, 它能与DNA和RNA 特异性地结合制备PNA探针。PNA探针不带电荷, 具有极好的生物稳定性, 这有助于提高其特异性、亲和力及活动性, 典型的PNA探针荧光原位杂交技术一般包括3个步骤, 分别是固定、杂交和洗涤。在检测、鉴定细菌生物被膜形成能力的同时, 细菌还可以维持其原来固有的形态。如果与共聚焦显微镜 ( confocal laser scanning microscopy, CLSM ) 配合使用, PNA探针荧光原位杂交技术还能检测和鉴定慢性伤口感染生物膜中的细菌种类、立体结构及分布情况。这种技术与革兰染色或抗酸染色技术类似, 因此也被称之为快速诊断细菌生物被膜慢性感染性疾病的智能染色技术[16]。在低盐浓度下, PNA探针可以杂交, 并可大大提高细菌生物被膜检测的效率和灵敏度, 操作简单, 是一种准确、快速的检测技术, 适合于实验室检测。

4 展望

目前, 生物被膜研究多局限于形态结构和个别细菌的相关基因研究, 而对起关键作用的细胞间的信息传递研究还很有限, 报告基因在该领域的应用有望对细菌生物被膜相关基因及细菌间信息传递系统的研究带来突破性的进展[17]。

如何提高细菌生物被膜的检测水平, 建立快速、灵敏、准确、简便的检测方法, 研制出快速、标准、特异的检测商品试剂盒应用于生产, 也是今后研究的重要内容之一, 对预防由生物被膜细菌引起的传染病方面具有重要意义。

总之, 随着研究的不断深入和飞速发展, 用于细菌生物膜形成能力的检测方法的种类也越来越多, 这对临床上控制生物材料引起的医院感染有着举足轻重的作用, 但这些检测方法仍有许多缺陷, 因此检测细菌生物被膜方法的研究也尚需继续进行, 以期为进一步检测细菌生物被膜的形成能力建立全面的检测系统提供基础。

生物被膜 篇2

关键词：生物被膜,芽孢杆菌,应用

细菌生物被膜 (bacterial biofilm, BF) 是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的由细菌自身所分泌的含水聚合性基质所组成的结构性细菌群落。细菌生物被膜广泛存在于自然界环境中, 由于生物被膜中的细菌对抗菌素和其他化学杀菌剂有着比游离细菌强得多的抵抗力, 因此生物被膜形成常常是难治性医院感染的原因。

芽孢杆菌是与人类关系最为密切的细菌之一, 在工业、农业以及医疗卫生等领域都有着重要的应用价值。而几乎所有的芽孢杆菌都能生成生物被膜, 形成的这些生物被膜对于现实生活具有重要的意义, 称为有益的生物被膜。本文就枯草芽孢杆菌及相关菌种形成的有益生物被膜的应用情况进行综述。

1 有益菌生物被膜在生物防治中发挥重要作用

芽孢杆菌是土壤和植物微生态区系的优势生物种群, 具有很高的抗逆能力和抗菌防病作用。枯草芽孢杆菌能通过成功定植至植物根际、体表或体内, 同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长, 同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵, 从而达到生防的目的。近几年的研究表明, 生物被膜的存在模式对于生防菌发挥生防作用至关重要。

1945年Johnson等报道, 枯草芽孢杆菌能够产生抗菌物质。枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质大多为低分子抗菌肽, 其中包括能增强生物表面活性, 并且对于维持生物被膜空间结构至关重要的生物表面活性素 (surfactin) 以及一大类脂肽类化合物———伊枯草菌素 (Iturin) 。

1968年, Arima等首次发现枯草芽孢杆菌株产生的脂肽类表面活性剂, 呈晶状, 商品名为表面活性素。

1996年, Asaka和Shoda研究发现土壤中表面活性素的半衰期比伊枯草菌素A的半衰期更长, 这就决定了根系表面活性素的长期稳定作用。

2004年, Bais等报道, 野生型枯草芽孢杆菌菌株6051有抗假单胞杆菌菌株PV tomato DC3000的生物防治能力。研究结果表明, 在植物根系定植中, 枯草芽孢杆菌6051能形成稳定的、大量的生物被膜, 并且能够分泌通过共同作用来保护植物免受病原菌侵害的表面活性素。

2 有益菌生物被膜能抑制金属腐蚀

众所周知, 细菌的存在会腐蚀金属制品, 从而引起重大的经济损失。研究表明, 现实中利用微生物来抑制金属腐蚀是一种良好的策略。在近几年的研究中发现, 有益菌生物被膜能够控制金属腐蚀。

2002年, D.rnek等在电化学阻抗光谱的连续核反应堆的研究中发现, 经设计过的和天然的细菌生物被膜阴离子肽的分泌物会减少LB培养基中的铝2024的点腐蚀。与无菌控制腐蚀的方法相比, 在有生物被膜的存在时, 点腐蚀能发生戏剧性的概率减少。

此外, 硫酸盐还原菌能腐蚀铸铁、碳钢、不锈钢和一些合金。研究显示, 当短杆菌肽S产物-保护性的芽孢短杆菌18-3生物被膜在碳钢上形成时, 就能保护金属制品免受硫酸盐还原菌D.orientis和铁氧化细菌L.discophoraSP-6的同时侵害。这是因为短杆菌肽S产生的生物被膜能够阻止D.orientis和L discophoraSP-6在碳钢表面生长。

3 生物被膜作为生物膜生物反应器

生物膜法是利用附着生长于某些固体物表面的微生物进行有机污水处理的方法。在充氧的条件下, 微生物在固体填料表面聚附着形成生物被膜, 经过充氧的污水以一定的流速流过填料时, 生物被膜中的微生物吸收分解水中的有机物, 使污水得到净化。

2009年Hasar, H.研究发现, 氢基质-生物被膜反应器能应用于硝化盐水和废水的脱氮作用。将氢基质-生物被膜反应器与膜反应器综合使用, 呈现了显著的硝化作用和有机氧化作用。Hasar, H.研究了MBR/MBfR去除有机物和含氮化合物的效用, 结果表明MBR/MBfR成功从1000～4300gCOD/m3-d和200～230gN/m3-d的有机物和铵盐中去除了COD氧化物和氮化物。

4 展望

细菌生物被膜是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象, 它粘附在各种医疗器械及导管上而极难清除, 以至引发大量的医源性感染, 从而引起严重的临床问题。目前, 国内对于有害菌生物被膜的研究较多, 而对于有益菌生物被膜的形成及应用的研究极为罕见。开发和研究有益菌生物被膜在现代工业和农业生产中具有很好的应用前景。我国应加强对有益菌生物被膜在现代工农业生产的应用研究, 并对有益菌生物被膜在其他领域的应用进行进一步探索。

参考文献

[1]贾艳华、晁利刚, 等, 细菌生物被膜耐药机制及相关感染防治进展[J].河南畜牧兽医综合版.2008, 29 (8) :9-11.

[2]Bais, H.P., Fall, R., and Vivanco, J.M.:Biocontrol of Bacillus subtilisagainst infection of Arabidopsis roots by Pseudomonas syringae isfacilitated by biofilm formation and surfactin production.PlantPhysiol., 134, 307–319 (2004) .

[3]D.rnek, A.Jayaraman, B.Syrett, et al.Pitting corrosion inhibition ofaluminum 2024 by Bacillus biofilms secreting polyaspartate orγ-polyglutamate.Appl.Microbiology and Biotechnology, 2002, 58 (5) :651-657.

[4]Masaaki Morikawa.Beneficial Biofilm Formation by IndustrialBacteria Bacillus subtilis and Related Species.Appl.Bioscience andbioengineering, 2006, 101 (1) :1-8.

生物被膜 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年2月~2013年2月就诊的160例结节性甲状腺肿患者, 所有患者均经X线、B超、甲状腺功能等检查诊断确诊。160例患者随机分为被膜内组 (80例) 和被膜外组 (80例) 。被膜内组中男18例, 女62例, 年龄1~78 (50.63±11.92) 岁;单侧切除21例, 双侧切除59例。被膜外组中男19例, 女61例, 年龄14~75 (49.86±10.62) 岁;单侧切除19例, 双侧切除61例。两组患者资料在性别、年龄上无显著差异 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 治疗方法

1.2.1 被膜内组

在胸骨柄切迹上方两横指处做一横向切口, 分离舌骨下各肌群, 进入甲状腺被膜间隙, 钝性分离覆盖有被膜的甲状腺腺体[3]。紧靠在腺体上极内缘的部位将甲状腺上的动脉与甲状腺上的静脉前分支结扎并切断, 将覆盖于腺体上的假被膜分离, 分离、结扎并切断在甲状腺下动脉的第3级分支, 保留气管平面下1.5cm固有被膜, 将被膜内发生病变的甲状腺组织切除约80%~90%, 并将峡部切除, 保留腺体背面部分[4]。

1.2.2 被膜外组

使甲状腺前面暴露, 在紧贴于甲状腺的上极内缘情况下, 切断甲状腺的悬韧带, 同时将甲状腺上动脉内侧的分支结扎切断, 再将甲状腺上的动脉与后上的神经分离后结扎。在外侧紧贴真被膜, 将甲状腺腺体推向一侧, 结扎离断甲状腺中静脉主干, 暴露腺体后面的无血管区[5]。在真假被膜之间将疏松的结缔组织推向后下方, 同时将进入腺体的动脉结扎、切断, 同样切除病变的甲状腺组织约80%~90%。

1.3统计学方法

资料采用SPSS 15.0统计软件处理, 计量资料比较采用t检验, 计数资料采用χ2检验, P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者手术时间、术中出血量及平均住院时间的比较

两组患者行被膜内次全切除术和被膜外次全切除术后, 两组在手术时间、术中出血量及平均住院时间比较上, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

2.2 两组患者术后并发症的发生率比较

两组患者行被膜内次全切除术和被膜外次全切除术后, 被膜内组并发症发生率明显低于被膜外组, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。

3 讨论

结节性甲状腺肿是一种临床上常见甲状腺良性疾病, 发病率高, 多见于中年女性。是指由于体内甲状腺激素相对不足导致垂体TSH分泌增多, 伴有各种退性性变, 最终形成结节[6]。结节性甲状腺肿的发病机制与病因目前在临床上无法明确, 主要由遗传、放射、免疫、地理环境因素、致甲状腺肿因素、碘缺乏、化学物质刺激及内分泌变化等多方面综合刺激所导致[7]。目前治疗的方法主要是甲状腺制剂治疗和切除甲状腺结节治疗, 甲状腺次全切除术主要有两种:被膜内次全切除术和被膜内外次全切除术, 目的都是以完全切除病变的甲状腺组织, 并避免术后的并发症和复发[8]。

本研究将行被膜内和被膜外次全切除术治疗的结节性甲状腺肿患者进行对比分析, 结果显示被膜内组和被膜外组在手术时间、术中出血量及平均住院时间比较上, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 被膜内组术后并发症发生率为5.00%, 明显低于被膜外组的12.50%, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。分析原因为:被膜外次全切除术的操作主要在甲状腺真假被膜之间进行, 需要注意的方面多, 比如在结扎甲状腺上动脉时, 需与神经鉴别, 否则容易造成损伤, 而且在处理侧后面和下级时, 如果没移动腺体, 容易造成术后的低钙血症等[9]。因此, 被膜外次全切除术的过程对术者来说, 要求非常高, 同时术后并发症发生率也高。与被膜外次全切除术不同的是, 被膜内次全切除术是在甲状腺固有被膜内进行的, 其优点是避免对腺体背面、喉上神经、喉返神经的损伤, 因此降低了对术者的要求, 也降低了术后的并发症发生率。

综上所述, 甲状腺被膜内次全切除术是治疗结节性甲状腺肿的首选术式, 术后并发症的发生率明显低于甲状腺被膜外次全切除术, 值得临床推广使用。

摘要：选取2010年2月2013年2月在本院就诊的160例结节性甲状腺肿患者, 随机分为被膜内组和被膜外组各80例, 被膜内组行被膜内次全切除手术, 被膜外组行被膜外次全切除手术。着重观察两组患者的手术时间、术中出血量和平均住院时间, 比较两组术后并发症的发生率。被膜内组和被膜外组在手术时间、术中出血量及平均住院时间比较上, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 被膜内组术后并发症发生率为5.00%, 明显低于被膜外组的12.50%, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。甲状腺被膜内次全切除术是治疗结节性甲状腺肿的首选术式, 术后并发症的发生率明显低于甲状腺被膜外次全切除术, 值得临床推广使用。

关键词：结节性甲状腺肿,被膜内,被膜外,次全切除术

参考文献

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[6]付新宇.甲状腺次全切除手术后并发症的预防及护理[J].中外健康文摘, 2012, 9 (21) :310.

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