生长激素(GH)基因（精选4篇）
生长激素(GH)基因 篇1
生长激素(growth hormone,GH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白激素,是一种具有广泛生理功能的生长调节素。鱼类生长激素(fish growth hormone,fGH)是由鱼类脑垂体合成和分泌的一种分子质量约为22 ku的蛋白多肽,对鱼类的生长和发育具有重要作用。试验采用RT-PCR方法克隆黄河裸裂尻(Schizopygopsis pylzoui)GH基因cDNA,以进一步获得黄河裸裂尻GH基因序列,并将其连接到载体上,构建黄河裸裂尻GH基因表达质粒并在大肠杆菌中表达,获得融合蛋白,现报道如下。
1 材料
1.1 试验动物
黄河裸裂尻,由青海省渔业环境监测站提供,在青海大学分子生物学实验室水池短暂养殖。
1.2 试剂
RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、pMD19-T 载体、pQE30、JM109感受态细胞、E.coli RB791,均由TaKaRa公司生产。利用Primer Premier 5.0软件根据同属鱼类同源性比对结果设计引物,其他试剂购自索莱宝公司。
2 方法
2.1 黄河裸裂尻总RNA提取
按照谢保胜等[1]介绍的方法提取黄河裸裂尻总RNA,电泳分析RNA质量,利用分光光度计测定其含量,储存于液氮中。
2.2 引物设计
利用鱼类GH基因序列保守的特点,通过同源性比对设计引物:GH1 5′-TGAGGAAAGCCTGTTGC-3′,GH2 5′-TGACTAGCAATACATTAGCG-3′。
2.3 RT-PCR扩增
将总RNA溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)中,RNA终浓度为1 μg/μL。A液:取RNA样1 μL,加3.75 μL RNA-free水,Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 μL,10×PCR Buffer 1 μL,dNTP混合物(Mixture)1 μL,RNase抑制剂(Inhibitor)0.25 μL,AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL,MgCl2 2 μL,总体积为10 μL。指弹混匀,反应条件:30 ℃预变性10 min;50 ℃变性20 min,99 ℃退火5 min,5 ℃延伸5 min。 B液:取灭菌水28.75 μL,5 × PCR Buffer 10 μL,Ex Taq HS 0.25 μL,引物GH1 0.5 μL,GH2 0.5 μL。将A液与B液混合,总体积为50 μL,扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共 35 个循环。取PCR产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.4 黄河裸裂尻GH基因的克隆[2,3]
取PCR产物0.5 μL,pMD19-T载体1 μL,连接液1 μL,再加去离子水2.5 μL,总反应液为5 μL。加入SolutionⅠ 5 μL,16 ℃反应30 min;向总反应液(10 μL)中加入JM109感受态细胞100 μL。在冰内放置30 min,42 ℃加热45 s后再置冰内1 min;加入890 μL SOC培养基,37 ℃振荡培养60 min;在含有X-Gal、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨苄西林(Amp)的培养基上培养,计数蓝白斑。用无菌牙签随机蘸取15个菌落制成细菌悬浮液,扩增反应的总体积为50 μL:分别取上述细菌悬浮液2 μL,加入10× PCR Buffer 5 μL,dNTP Mixture 4 μL,M13 Forword 2 μL,AV-M 2 μL,Ex Taq HS 0.25 μL,ddH2O 34.75 μL,置于15个Eppendorf管中。扩增参数:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共35个循环;72 ℃延伸5 min。扩增后分别取样5 μL,用1%琼脂糖凝胶电泳检测。检测后,选取可行条带的原扩增液进行测序。
3 结果与分析
3.1 黄河裸裂尻总RNA电泳检测结果(见图1)
3.2 分光光度计测定OD值结果(见表1)
由表1可知:经检测,试验所提取的总RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.2范围内(通常纯RNA的OD260/OD280比值为1.8～2.0)。
3.3 黄河裸裂尻GH基因cDNA的RT-PCR扩增结果(见图2、图3)
M.DL-1 500 Marker;1,3.腮组织;2.脑组织。
3.4 序列分析
测序结果显示:黄河裸裂尻GH基因cDNA长度为508 bp,黄河裸裂尻GH基因编码的核苷酸序列与鲤鱼、鲫鱼、斑马鱼、鳇鱼、虹鳟鱼等相应的核苷酸序列同源性较高,见图4。
3.5 氨基酸序列比对(结果见图5)
3.6 同源性比较和系统分析
利用Mega4.1构件邻接(N-J)系统进化树[4,5],选择5种在进化上具有代表性的进行比较,采用默认参数进行构建,同时应用自举检验估计系统发育树各节点的自引导值(重复次数为1 000次)。黄河裸裂尻与鲤鱼、鲫鱼、虹鳟鱼、斑马鱼等淡水鲤科鱼类的同源性较高,见图6。
3.7 黄河裸裂尻GH基因在大肠杆菌中的表达
采用 BamHⅠ和HindⅢ 对黄河裸裂尻 GH基因cDNA与 pQE30载体进行双酶切,用T4 DNA连接酶连接后,获得重组质粒。再将重组质粒转入E.coli RB791中,在LB培养基中于37 ℃培养 12～15 h。蘸取上述大肠杆菌菌落,置于含 2 mL的 2×LB /Amp培养基的试管中,在37 ℃条件下振摇 4～5 h,加入IPTG使其终浓度为 1 mmol/L。诱导 2 h后收集菌液进行 SDS - PAGE蛋白质电泳检测,见图7。
由图7可知: 4号菌株经 IPTG诱导后,出现特异蛋白表达条带,蛋白分子质量约为 14.4 ku。
4 讨论
采用RT-PCR法和基因克隆研究黄河裸裂尻GH基因的cDNA序列,其长度为508 bp。与其他鱼类进行核苷酸序列和氨基酸序列比对发现:黄河裸裂尻与青海湖裸鲤、鲤鱼、斑马鱼的亲缘关系较近,氨基酸序列相似性分别为100%、98%、94%,尽管黄河裸裂尻与青海湖裸鲤所编码的氨基酸相似性为100%,但所测序列中编码氨基酸的基因序列有1个核苷酸位点不同,可能是不同种群间歧异性的具体表现。研究仅扩增出黄河裸裂尻GH基因的1个长度为508 bp的片段,并没有得到其全长序列,导致黄河裸裂尻与其他鱼种的同源性比对产生了一定差异。
研究采用生物信息学方法对黄河裸裂尻GH基因序列、编码蛋白的理化性质等进行分析,为今后研究GH蛋白的分离、纯化及对该蛋白生物活性分析提供可靠的技术保障,也对青海省开展的高原特有鱼种的人工驯化和养殖计划提供有力的技术保障。
参考文献
[1]谢保胜,藤原滋树.斑马鱼总RNA提取和纯化[J].生物学杂志,2007,24(6):67-69.
[2]谢保胜,段瑞君,藤原滋树.斑马鱼促性腺激素释放激素基因的克隆与表达[J].青海医学院学报,2009,30(1):9-13.
[3]谢保胜,段瑞君.斑马鱼促性腺激素释放激素及相关肽基因的克隆与序列分析[J].上海海洋大学学报,2009,18(3):263-267.
[4]刘滨,臧晓南,刘顺梅,等.大菱鲆生长激素基因cDNA的克隆、序列分析及分子系统研究[J].中国海洋大学学报,2008,38(5):726-732.
[5]江世贵,张殿昌.鲮生长激素基因cDNA的分子克隆和序列分析[J].中国水产科学,2003,10(2):10-14.
生长激素(GH)基因 篇2
高密度养殖是提高单位面积产量、实现更大经济效益的有效手段,但不可避免地影响养殖对象的生长速度和健康。而革胡子鲶(Clarias gariepinus)比其他养殖鱼类对高密度养殖的适应性强[11,12,13,14,15,16]。天津市德仁农业发展有限公司设施化养殖的革胡子鲶,在高密度下仍然能够快速生长(最高产量可达400 kg·m-3水体),推测与其内在的生长调控因子有关。文章通过分析不同养殖密度下革胡子鲶幼鱼的日增质量和垂体GH基因mRNA的表达水平,初步探讨革胡子鲶幼鱼在不同养殖密度下生长差异和生长差异的内在原因,以期为深入探究革胡子鲶的生长调节以及高密度养殖快速生长的机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验用鱼为天津市德仁农业发展有限公司从福建漳州购进约1.5 g的革胡子鲶饲养而成,选取大小规格相近的幼鱼为试验对象,平均体质量为10~12 g。
1.2 养殖试验
试验分组及饲养管理同DAI等[17]。即试验用革胡子鲶幼鱼取回后在天津农学院天津市水产生态及养殖重点实验室于水族箱(70 cm×50 cm×50cm)中暂养2周后,选取发育良好、体质健康的个体[平均体质量为(30.71±0.89)g]用于该试验。试验鱼随机分为35 kg·m-3、65 kg·m-3、95 kg·m-3和125 kg·m-34个密度组,每组3个重复,饲养于水族箱(70 cm×50 cm×50 cm)中,实际水体积为120 L。模拟天津市德仁农业发展有限公司水泥池饲养革胡子鲶幼鱼的实际养殖条件,每日10:00和18:00各换水一次,每次换水量为水体积的3/4;养殖水温保持在(27±1)℃。按体质量的2%每天8:00和16:00各投喂一次,所用饲料为天津市天祥水产有限公司生产的鲶鱼膨化配合饲料(粗蛋白35%、粗脂肪5%、粗纤维10%、灰分10%)。养殖试验为期60 d,试验期间水体积保持不变,每30 d取样一次。每天观察并记录鱼的摄食及死亡情况。
1.3 相关指标分析方法
1.3.1 革胡子鲶生长的测定
分别于第30和第60天各分析一次。分析时停饲24 h,并以200mg·L-1的MS-222麻醉,以水族箱为单位称量鱼体的总质量,同时计数鱼体数量,根据下列公式计算鱼的均质量和日增质量:
鱼的均质量=试验结束时每箱鱼总质量(g)/鱼的数量(尾)
日增质量=[试验结束时鱼的均质量(g·尾-1)-试验开始时鱼的均质量(g·尾-1)]/养殖天数
1.3.2 GH基因mRNA表达的半定量分析
养殖第30和第60天时,每个养殖密度各取经MS-222麻醉的鱼18尾(每个水族箱取鱼6尾),解剖取出垂体后立即放入液氮中,之后于-80℃保存备用。以β-肌动蛋白基因作为内参基因分析垂体GH基因mRNA的相对表达量。试验中以个体为单位,根据王晓梅等[18]报道的方法进行垂体总RNA的提取、c DNA第一条链的合成、GH基因ORF区段和β-肌动蛋白基因片段的扩增以及GH基因mR-NA相对表达量分析。
1.3.3 数据统计分析
试验数据以“平均值±标准差”(+SD)表示,数据采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),LSD法多重比较各组间数值的差异显著性(P<0.05)。
2 结果
2.1 生长分析
根据革胡子鲶在不同密度养殖30 d和60 d后体质量(表1)计算鱼体在0~30 d以及30~60 d 2个养殖期的日增质量。结果表明,试验期间随着养殖密度的增大出现日增质量降低的趋势(图1),统计分析结果显示,在0~30 d的养殖期间,35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组的日增质量差异不显著(P>0.05),95 kg·m-3和125 kg·m-3密度组的日增质量差异也不显著(P>0.05);但35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组的日增质量显著高于95 kg·m-3和125kg·m-3密度组(P<0.05);养殖30~60 d期间,35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组的日增质量显著高于125 kg·m-3密度组(P<0.05),而其余各密度组间的日增质量差异均不显著(P>0.05)。
表1 养殖密度对革胡子鲶体质量的影响Tab.1 Effect of stocking density on body weight of juvenile C.gariepinus
注:部分数据引自文献[17]。同一行肩标字母相同或无肩标字母者表示差异不显著(P>0.05),肩标字母不同者表示差异显著(P<0.05)Note:Some data in this table are taken from Reference[17].Values with the same letters or no letter within the same row are not significantly different(P>0.05);whereas those with different letters are significantly different(P<0.05).
同一线上肩标字母不同者为差异显著(P<0.05),肩标字母相同者为差异不显著(P>0.05)Values with different superscripts on the same lines are significantly different(P<0.05),while those with the same superscripts are not significantly different(P>0.05).
图1 不同养殖密度革胡子鲶日增质量Fig.1 Daily weight gain of C.gariepinus reared at different stocking densities
2.2 GH基因mRNA表达的半定量RT-PCR分析
2.2.1 总RNA分离结果
经1%琼脂糖凝胶电泳检测表明提取的革胡子鲶脑垂体总RNA完整性较好(图2显示了4个RNA样本的电泳结果)。用核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf公司出品,BioPhotometer型)测定出每个RNA样本光密度比(OD260/OD280)为1.80~2.00,表明总RNA纯度较好,RNA样本可以用于后续的试验。
2.2.2 PCR扩增产物电泳检测结果
图3-a和图3-b分别为养殖第30和第60天时革胡子鲶部分个体GH和β-actin基因片段扩增后的电泳检测结果。
图2 革胡子鲶4个个体脑垂体总RNA电泳结果Fig.2 Electrophoretic patterns of total RNA extracts from pituitary of four individuals of C.gariepinus
2.2.3 GH mRNA表达半定量PCR分析的数据统计
利用Gene Tools软件分析革胡子鲶个体GH(目标基因)和β-actin(内参基因)基因片段扩增后的电泳图谱,GH与β-actin基因片段扩增产物的信号强度比即为GH基因的相对表达量。
图4为养殖第30和第60天时不同养殖密度下革胡子鲶GH基因mRNA平均相对表达量的统计分析结果。养殖第30天时,各养殖密度间革胡子鲶GH基因mRNA相对表达量差异均不显著(P>0.05);养殖第60天时,革胡子鲶GH基因mRNA相对表达量在35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组间差异不显著(P>0.05),95 kg·m-3和125 kg·m-3密度组间差异也不显著(P>0.05),但35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组GH基因mRNA的相对表达量显著高于95 kg·m-3和125 kg·m-3密度组(P<0.05)。
3 讨论
鱼体的生长状况是水产养殖中备受关注的重要经济性状,而GH与鱼类的生长密切相关,在鱼类的个体生长及生长调节中起关键性作用。马细兰等[2]指出垂体GH基因在转录水平上反映GH的合成速度,是反映动物生长速度的有效指标,生长快速的鱼其垂体GH mRNA表达量高;并且应用半定量RT-PCR法分析得出尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)雄鱼垂体GH mRNA表达水平明显高于雌鱼,认为这可能是尼罗罗非鱼雄鱼生长快于雌鱼的主要内在原因之一。性成熟的金钱鱼(Scatophagus argus)雌鱼生长快于雄鱼,其生长差异与垂体GH mRNA的水平也呈显著的正相关[3]。同样,生长快速的雌性黄鲈(Perca flavescens)垂体GH mRNA水平显著高于雄鱼,并且在生长快速的春季显著高于秋季[4]。性成熟的鲤(Cyprinus carpio)垂体GH mR-NA表达也呈现出季节性的周期变化,生长较快的季节(水温18~20℃)垂体GH mRNA表达比生长相对较慢的季节(水温8~10℃)高3倍[6]。鲇形目鳠科的大鳍鳠(Mystus macropterus)脑垂体GH的含量分别在3月和8月出现峰值,与该鱼春季和秋季的快速生长一致[7]。该目鲇科的野生鲇(Silurus asotus)垂体GH的含量在3月和7月各出现一个高峰值,研究者认为这可能与野生鲇春季和产卵后生长加快有关;并且雌性鲇鱼垂体GH的周年含量显著高于雄鱼,与雌鱼生长速度显著快于雄鱼的现象相符合[5]。SHIN等[8]研究发现光的波长可影响观赏性鱼类———克氏双带锯齿盖鱼(Amphiprion clarkii)的生长速度和垂体GH mRNA水平、生长速率与垂体GH mRNA的水平呈正相关。李云等[9]研究显示饲料中添加一定量的半胱胺盐酸盐(1 mg·g-1饲料)可显著提高斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的体质量增长率和垂体GH的转录水平。马细兰等[10]发现促黄体素释放激素类似物(LHRH-A)可显著上调尼罗罗非鱼生长轴相关基因(GH、GHR和IGF)的表达,从而促进鱼类的生长。上述研究说明鱼体的生长速度与垂体GH基因的转录水平呈正相关。
泳道1~3、4~6、7~8和9~12分别为养殖密度35 kg·m-3、65 kg·m-3、95 kg·m-3和125 kg·m-3的各3个体GH和β-actin基因片段RCR产物电泳图,泳道M为DNA标准分子量(BBI公司)Lanes 1~3,4~6,7~8 and 9~12 are electrophoretic patterns of PCR products of GH andβ-actin gene fragments separately on three individuals at stocking densities of 35 kg·m-3,65 kg·m-3,95 kg·m-3and 125 kg·m-3,respectively;Lane M is DNA Marker(BBI Company)
图3 养殖第30天(a)和第60天时(b)革胡子鲶个体GH和β-actin基因片段PCR产物电泳图Fig.3 Electrophoretic patterns of PCR products of GH andβ-actin gene fragments of individuals on 30th(a)and 60thday nursing(b)
标有不同字母者为差异显著(P<0.05),无字母或字母相同者为差异不显著(P>0.05)Different letters above the bar indicate significant difference(P<0.05);while the same letters or no letter above the bar indicate no significant difference(P>0.05)
图4 不同养殖密度革胡子鲶GH基因mRNA的相对表达量Fig.4 Relative expression of GH mRNA in pituitary of C.gariepinus reared at different densities
由于脑垂体合成GH后经过血液运送至靶器官,再通过GHR和IGF的介导进而达到促进鱼体生长的作用,因此鱼类的生长速度并不能完全通过GH水平来体现,还与GHR和IGF的水平有关。如银大麻哈鱼(Oncorhynchus kisutch)在禁食3周后,比正常投喂组肝脏GHR mRNA水平低,提示长时间禁食可引起肝脏GHR基因表达的下降[19]。SAERA-VILA等[20]报道金鲷(Sparus aurata)肝脏和脂肪组织GHRⅠ基因表达最丰富,但禁食后可引起GHRⅠmRNA水平的下降。斑点叉尾(Ictalurus punctatus)在投喂外源皮质醇或者禁食4周后,与对照组相比,肝脏GHR mRNA的丰度以及血清中IGF的浓度均显著下降,且肝脏GHR mRNA的丰度和血清中IGF的浓度呈正相关;投喂外源皮质醇后鱼的生长显著下降,禁食组鱼的体质量减少[21]。华益民和林浩然[22]报道鲤饥饿32 d导致生长受阻,肝组织IGF-ⅠmRNA表达水平下降;再投喂后,其生长和肝组织IGF-ⅠmRNA丰度都逐渐恢复,表现出鲤的生长状况与肝组织IGF-ⅠmRNA水平的同步变化。尼罗罗非鱼饥饿28 d内血清GH含量反倒显著升高,而血清IGF含量和肝胰脏IGF mRNA表达丰度显著下降,饥饿后再投喂,第14天时血清GH含量显著升高,继续投喂7 d血清GH含量又表现出显著下降,但仍与饥饿第7天时的GH水平相当,而血清IGF含量和肝胰脏IGF mRNA表达丰度在第21天恢复投喂过程中显著升高,并恢复到饥饿前水平[23]。鲮(Cirrhinus molitorella)在投喂不同蛋白水平的饲料时,在8周的养殖期内其特定生长率与肝组织IGF mRNA的表达量呈极显著的正相关[24]。但强俊等[25]在分析温度和饲料蛋白水平对吉富品系尼罗罗非鱼幼鱼生长的影响时则发现血清GH水平与鱼的特定生长率相关性较低。黄国强等[26]研究也发现褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼在低温胁迫10 d导致的生长减缓能在恢复至最适生长温度的30 d内获得完全补偿生长,但血浆GH和IGF水平与生长率不存在明显的相关性。
该研究通过分析不同养殖密度下革胡子鲶幼鱼的生长以及垂体GH基因的表达,探讨养殖密度对二者的影响以及二者的相关性。该研究的数据统计分析结果显示,0~30 d养殖期内,35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组间的日增质量以及95 kg·m-3和125 kg·m-3密度组间的日增质量差异均不显著,但前2个密度组的日增质量显著高于后2个密度组(图1)。但养殖第30天时各密度组间GH基因mRNA的相对表达量并未受养殖密度的影响,即各密度组间的GH基因的相对表达量差异不显著(图4)。30~60 d养殖期内,35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组间的日增质量与95 kg·m-3密度组差异不显著,但显著高于125 kg·m-3密度组(图1)。而养殖第60天时,GH mRNA表达量的分析结果显示35kg·m-3和65 kg·m-3密度组显著高于95 kg·m-3和125 kg·m-3密度组(图4)。上述结果表明在该研究中革胡子鲶幼鱼的日增质量与垂体GH基因mRNA相对表达量不存在紧密的相关性。结合前人的研究结果,在该研究中笔者推测,仅就生长轴GH-GHR-IGF而言,革胡子鲶在较短的养殖时间内(30d),养殖密度增大时,由于空间不足、摄食不均等原因可能影响鱼体生存状态和营养水平,而导致GH下游的生长调控因子,如GHR和IGF的合成与分泌减少,最终使鱼体的日增质量降低。但是随着养殖时间的延长(60 d),养殖密度增大到一定程度时则会影响处于生长轴中心位置的因子———GH mRNA表达的下降,进而GH的合成与分泌减少,这可能成为影响鱼体生长速度的主要内在因素。对于GH-GHR-IGF这一生长轴在革胡子鲶生长中的调节作用以及三者的相互补偿关系仍需进一步深入探究。
摘要：革胡子鲶(Clarias gariepinus)幼鱼在35 kg·m-3、65 kg·m-3、95 kg·m-3和125 kg·m-3的密度下养殖60 d,第30和第60天时分析鱼的日增质量并应用半定量RT-PCR法分析垂体生长激素(GH)基因mRNA的相对表达量。0~30 d养殖期内,35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组间及95 kg·m-3和125 kg·m-3密度组间的鱼日增质量差异不显著,但前2个密度组的鱼日增质量显著高于后2个密度组;而养殖第30天时各养殖密度组间GH基因mRNA相对表达量差异均不显著。30~60 d养殖期内,35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组的日增质量显著高于125 kg·m-3密度组,但其余各密度组间差异不显著;养殖第60天时,35 kg·m-3和65 kg·m-3密度组GH基因mRNA相对表达量显著高于95 kg·m-3和125 kg·m-3密度组。结果表明革胡子鲶幼鱼的日增质量与垂体GH基因mRNA相对表达量不存在紧密的相关性。
生长激素(GH)基因 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织样品采集
试验采集北极狐脑垂体组织用于提取总RNA。采样后置于液氮中速冻, -80 ℃保存, 备用。
1.1.2 菌株、工具酶和试剂
菌株为大肠杆菌DH5α, 胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒, 购自北京天根生物工程公司;pMD18-T载体、rTaq聚合酶、限制性内切酶, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;Trizol Reagent, 购自Invitrogen公司;DEPC (焦碳酸二乙酯) , 购自美国Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取
取脑垂体组织放入坩埚, 倒入液氮进行充分研磨, 按Trizol Reagent说明书的方法提取总RNA。用DEPC水溶解所得到的总RNA, 紫外分光光度计测定RNA在260 nm和280 nm的OD值, 计算OD260/280值以测其纯度, 同时用1%的琼脂糖凝胶甲醛变性进行电泳分析, 然后将总RNA保存于-80 ℃冰箱, 备用。
1.2.2 反转录反应
在0.2 mL的PCR反应管中加入下列溶液或试剂:10×RT mixture 2.0 μL, dNTP mixture 2.0 μL, 总RNA (1.0 μg/μL) 1.0 μL, Quant Reverse Transcriptase 1.0 μL, Oligo-dT15或Random 2.0 μL, RNase-free水12 μL, 共20 μL。然后将上述溶液混匀置于37 ℃条件下1 h。
1.2.3 引物设计
在GenBank中没有检索到狐狸的GH基因CDS全序列, 根据狗 (AF069071) 的GH基因设计了1对引物, 用于扩增狐狸GH基因的CDS全序列。引物编号及序列如下:RGHf 5′-CAAAGCGCTCAGGGTCCT-3′, RGHr 5′-GAGGGGGTGACAGAGATGC -3′。
1.2.4 PCR扩增
反应体系为25 μL, 灭菌去离子水16.3 μL, 脑垂体组织的cDNA模板2.0 μL, 10×Buffer 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL, 10 pmol/ μL上、下游引物各1 μL, 0.5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL。
GH基因RGH引物PCR扩增的循环参数:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共35个循环;72 ℃ 10 min。
1.2.5 PCR产物的克隆、测序
取50 μL PCR产物经琼脂糖凝胶电泳, 把含有目的带的胶割下, 用小量胶回收试剂盒纯化回收。取回收产物4.5 μL加入到0.5 μL pMD18-T载体中, 然后加入Ligation Solution Ⅰ 5 μL混匀, 在16 ℃的水浴锅中连接1 h。将10 μL连接产物转化到200 μL的DH5α感受态宿主菌中, 取150 μL转化产物涂在含氨苄 (浓度100 μg/mL) 的LB平板上, 挑取经PCR鉴定后的5个阳性白色菌斑培养。用试剂盒抽提质粒, 经酶切鉴定后送上海博亚公司进行测序。
1.2.6 序列分析
使用DNAMAN生物软件对测序结果进行拼接, 参照狗的GH基因部分序列信息确定目的基因序列结构;序列同源性分析通过NCBI数据库上的Nucleotide Blast搜索软件完成;cDNA序列的ORF查找通过NCBI数据库上的ORF Finder完成;氨基酸翻译采用DNAMAN软件;氨基酸序列的相似性比较通过NCBI数据库上的Protein Blast搜索软件完成;使用SignalP 3.0 Server对蛋白进行信号肽分析;物种间分子系统进化树的构建由ClustalX 1.83和Mega 4.0生物软件完成;物种间遗传距离计算由Mega 4.0生物软件完成。
2 结果与分析
2.1 总RNA的分离
获得的北极狐脑垂体组织总RNA经紫外分光光度计测定, OD260/280比值均在1.8～2.0之间, 甲醛凝胶电泳可清晰见到18 S和28 S 2条核糖体RNA条带, 说明试验的脑垂体在保存和提取过程中无明显RNA降解, 总RNA是完整的。
2.2 RT-PCR扩增结果及克隆
根据狗 (AF069071) GH基因设计引物RGH, 扩增北极狐垂体组织的cDNA, 得到1条特异性扩增条带, 与预期扩增片段大小一致, 约为718 bp (见图1) , 经酶切鉴定得到两条条带, 一条与pMD18-T大小一致, 另一条与预期的GH片段大小相符 (见图2) , 最后进行序列测定。
1.PCR 产物;2.对照;M.DL -2 000 Marker。
1.酶切产物;M. DL -2 000 Marker。
2.3 序列分析
通过测序得到片段大小为718 bp的GH基因cDNA序列, 与预期大小一致。经NCBI数据库中Blast比对, 发现测得的序列与GenBank中其他哺乳动物的GH基因序列同源性非常高, 尤其与狗的同源性达到100%, 与猫和水貂的同源性为94%。试验结果表明克隆的序列是北极狐的GH基因序列, 该序列已登录于GenBank上, 登录号为EU159584。
北极狐GH基因核苷酸及编码的氨基酸序列ORF为651 bp, 编码216个氨基酸的前体蛋白。在成熟肽蛋白序列中有4个半胱氨酸, 根据已发表的人或猪的GH结构推知这4个半胱氨酸形成2个二硫键C78-C189和C206-C214。
2.4 相似性比较与进化树分析
将北极狐GH基因氨基酸序列与GenBank中已报道的部分哺乳动物相应序列对位排列比较可知, 北极狐GH与猪、狗、家猫和啮齿类动物GH的结构完全一致, 前体蛋白都由26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽组成, 而不同于191个氨基酸成熟肽的灵长类和27个氨基酸信号肽的偶蹄类。另外, 结合Blast比对北极狐与其他物种GH的氨基酸序列 (见表1) , 发现北极狐GH与哺乳类、禽类和两栖类的GH均具有较高的相似性。其中与同科动物狗的GH序列同源性达到了100%;与家猫的同源性达98.61%, 有3个氨基酸不同 (分别位于4位、26位和159位) 。通过同源性比较还发现, GH信号肽序列的同源性明显比其成熟肽低, 如北极狐GH信号肽序列与猫和猪对应序列分别有2个和3个氨基酸的差异。
在对北极狐、狗、羊、牛、猪、大熊猫等GH基因的氨基酸序列进行比对分析的基础上, 使用Mega 4.0生物软件采用非加权组平均法 (NJ法) 构建北极狐与其他物种间的分子系统进化树 (见图3) , 北极狐与狗归为一支。
3 讨论
根据已知的哺乳动物序列信息, 利用与狐狸亲缘关系最近的狗的GH基因序列, 设计引物进行PCR扩增, 成功克隆了北极狐GH基因的编码区DNA序列。在北极狐GH成熟肽蛋白序列中具有与其他动物同样的4个保守的半胱氨酸残基, 可形成2个二硫键, 这对维持生长激素的空间结构起着关键作用。
北极狐与哺乳动物、鸟类动物和两栖动物的氨基酸序列同源性最小为63% (非洲爪蟾) , 最大为100% (狗) 。Wallis O C发现, GH具有特殊的进化模式, 并非以恒定的速度进化, 它的进化是可变的[1]。哺乳动物GH分子进化极为缓慢, 猪GH序列被认为是哺乳亚纲动物GH的祖先, 其他哺乳动物如啮齿类的GH与祖先GH序列也高度保守。但灵长类和偶蹄类GH例外, 它们在特定时期曾发生了极其快速的进化, 因而与祖先GH序列差异较大。试验中北极狐GH序列与祖先猪GH成熟肽序列极为相似, 只有2个氨基酸的差异, 表明北极狐GH跟多数哺乳动物一样具有极缓慢的进化速度。GH的缓慢进化特性只限于成熟肽序列, 其信号肽序列并不具有相同的进化方式。研究还发现北极狐GH成熟肽在各物种间的同源性比对应的信号肽高, 这也验证了这一理论。
根据北极狐氨基酸序列与各物种进行的系统进化分析, 北极狐与狗归为一支。GH进化树与传统物种系统进化关系不一致, 进化距离由近至远依次为狗、猫、大熊猫、猪、大鼠、牛、羊、鸡、人、非洲爪蟾。在灵长类和啮齿类动物上与整个物种的进化史出现了偏差。Hedges S B曾指出具有相似生物学功能的基因, 进化驱动力也相似, 反映在进化关系上就应与整个物种的进化史保持一致[2]。但是如果系统发生树是基于一个基因的核酸或氨基酸序列所建立的, 特别是该基因在基因组中存在2个或更多的同样基因拷贝时, 基因树就会出现与物种树不一致的结果。
随着人类基因组计划的完成和动物基因组计划的深入展开, 利用其他哺乳动物研究中所取得的成果, 通过比较研究来加速某些相对落后的近缘种的科学研究已成为一种行之有效的捷径。北极狐作为珍贵的毛皮动物, 其养殖前景非常广阔, 对GH基因的编码区进行克隆测序, 希望能为以后对北极狐生产性能的相关研究提供有价值的参考。
参考文献
[1] WALLIS O C , WALLIS M. Molecular evolution of growth hormone (GH) in Cetartiodactyla: cloning and characterization of the gene encoding GH from a primitive ruminant, the Chevrotain (Tragulus javancius) [J]. Gen Comp Endocrinol, 2001, 123:62-72.
生长激素(GH)基因 篇4
1 POU1F1基因
垂体特异性转录因子 (PIT-1) 是POU结构域中几种同源 (异型) 蛋白之一, 目前已被正式命名为POU1F1[1]。该蛋白能够调控生长激素、催乳素和促甲状腺素的转录和表达, 对动物生长发育过程起重要的调节作用。目前已在多种动物上发现其多态性与生长性状相关。刘波、陈宏等在秦川牛及其杂种牛的四个群体中检测POU1F1的酶切多态性, 发现AB、BB基因型个体在胸围、十字部高指标上显著高于群体AA型个体 (P<0.05) , 可作为秦川牛体尺指标 (胸围、十字部高) 的候选基因之一[2]。庞瑾等在7个中国地方猪品种和3个国外猪品种中进行了POU1F1基因的多态性分析, 结果在7个地方品种中检测到第4外显子上有一个突变, 没有氨基酸变化;在3个国外品种中检测到1个Rsa I限制性内切酶的多态酶切位点[3]。由此看来, POU1F1基因标记的多态信息含量较高, 遗传变异较大, 分析POU1F1基因多态性进而探讨其对生长的调节作用, 对于提高猪的产肉性能具有重要的意义。
1.1 POU1F1的生物学功能
POU1F1蛋白是动物垂体前叶特异性表达的一种具有重要功能的转录因子[4], 该蛋白对垂体前叶胚胎发育以及生长激素 (GH) 、催乳素 (PRL) 和促甲状腺素亚β单位 (TSHβ) 基因的表达起决定性作用。在多种垂体激素缺乏而导致侏儒的鼠和人类中, 均可发现POU1F1基因活性的丧失。POU1F1在胚胎期率先表达, 提示POU1F1蛋白对于胚胎期垂体前叶细胞分化以及GH、PRL和TSH细胞的发育有重要作用。POU1F1基因突变可以导致垂体发育萎缩, 使GH、PRL和TSHβ分泌完全缺乏, 从而导致矮小现象出现。所以, POU1F1蛋白对于垂体细胞的形成和垂体细胞的增生具有重要作用。POU1F1蛋白与垂体中的PRL、GH、TSHβ基因及POU1F1自身的启动子结合, 调节这些基因的转录和表达, 进而对动物的生长发育、繁殖和免疫等起重要作用。
1.2 POU1F1基因的结构与定位
POU1F1基因是POU结构域基因家族的成员之一, 而POU结构域因子家族是一类转录调节因子, POU基因家族分成六大类, 不同类别的成员行使不同的功能。POU1F1蛋白有3个重要的结构域:N端转录激活区、POU特异区 (POU-SD) 和POU同源区 (POU-HD) [5]。POU1F1蛋白对于靶基因的转录激活作用依靠此N端转录激活区, 而POU-SD和POU-HD的主要功能是识别靶DNA的特异顺序并与之呈高亲和力的结合, 从而启动靶DNA的转录。猪POU1F1基因被发现定位于13号染色体上的q46区域[6], 已知其c DNA序列全长876 bp, 编码292个氨基酸, 包含6个外显子, 约含60个氨基酸。猪POU1F1基因序列与其他已知POU1F1序列的哺乳动物的同源性达95%, 氨基酸序列上的差别仅出现在氨基端区域, POU-SD与POU-HD区域则高度保守。
Yu T P等[7]以猪POU1F1基因c DNA片段为探针, 克隆了全长为2 695 bp的POU1F1基因组区域并进行测序, 随后Tuggle CK等、Nicolas、Chung等也对POU1F1基因组区域进行了克隆测序, 但他们所得的DNA序列彼此并不一致, 而且在POU-SD和POU-HD区域中均有差异。但据江苏省动物遗传育种重点实验室最近的研究验证, 发现Yu T P等的这段2695bp的POU1F1基因组序列是最具科学性和说服力的。
1.3 猪POU1F1基因的多态性研究
美国的Tuggle等早在1993年就开始了POU1F1基因多态性与猪生长及胴体性状的关系研究, 研究结果是在中国猪种梅山猪的POU1F1基因中发现了一个Bam HI多态基因座, BB基因型猪有相对较大的初生重及平均背膘厚, 但在美国猪种中并没有发现同样的多态基因座。为了进一步研究POU1F1的多态性与猪生长和胴体性状的关系, Yu T P等选用由梅山猪×杜洛克猪、梅山猪×汉普夏猪、梅山猪×长白猪、民猪×汉普夏猪和民猪×长白猪所组成的五个三代杂交资源家系, 运用PCR-RFLP方法检测Bam HI、Msp I、Rsa I 3种限制性内切酶的多态性, 分析与猪初生重、21日龄重、断奶重、平均日增重、背最长肌面积、肉色、大理石纹、硬度、背膘厚测量值等指标的相关性。结果发现, Msp I CC基因型的猪相对于DD基因型猪有较高的出生重 (CC型比DD型高0.12 kg) , 在几个背膘厚测量指标上, 也均高于DD基因型猪, 而CC基因型最初来自于中国猪种所具有的等位基因[8]。通过以上分析, 认为POU1F1与猪早期生长性状存在相关性, 是标记早期生长性状的最接近的基因。
为了具体研究猪POU1F1基因的酶切多态性与中国地方家系品种生长性能的相关性, 滕勇等采用PCR-RFLPs技术检测Msp I酶切位点多态性, 分析Msp I酶切突变位点不同基因型对“长杜枫姜”猪不同日龄段体重和日增重的影响。结果发现:Msp I DD基因型猪在45、70、180日龄重上均与CD基因型和CC基因型猪呈显著性差异;对于不同日龄段日增重, DD基因型猪也与CC基因型猪呈显著性差异[9]。可见POU1F1基因对猪的中期发育也起一定的作用。
结合以上研究, 我们认为POU1F1基因对猪的早中期发育均起一定的作用, 因此该基因可以作为数量性状的遗传标记。
1.4 POU1F1基因的研究前景
POU1F1基因的一个主要发展前景就是其在发育机制的早中期均起作用。据报道, 鸡胚发育到2 d时即已检测到POU1F1m RNA的表达, 牛POU1F1基因的转录激活贯穿于牛整个胚胎期的发育, 而且猪和鼠POU1F1基因的表达均与它们的早期发育存在着相关性。这些就为检测动物早期的表型性状及饲养价值评估提供了依据, 节省了遗传育种大批量生产的麻烦, 更好地为企业的产业化经营服务。
2 GH基因
生长激素 (GH) 是一种由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的单一肽链蛋白质类激素。在动物生长轴中, GH是调控动物生长发育和合成代谢的核心激素, 其作用机理复杂, 影响动物机体蛋白质、脂肪和糖的代谢, 与生长发育、繁殖等密切相关。
2.1 GH的生物学功能
生长激素的功能分为三类:代谢效应、增殖效应和分化效应[10]。它具有促进各组织器官发育, 增加体细胞大小与数量, 促进骨骼增长, 促进有丝分裂, 促进脂肪前体细胞成熟分化、骨髓T细胞前体发育以及造血细胞分化等作用。生长激素最普遍的作用是促进物质合成代谢。它可直接刺激葡萄糖进入肌肉细胞, 加速蛋白质合成, 增加肌肉重量和蛋白质沉积, 使能量由脂肪组织向其他组织转移。GH能提高氨基酸合成蛋白质的速度, 降低氨基酸的氧化分解;在GH作用下, 蛋白质周转代谢的总量减少, 合成量大于降解量, 从而提高蛋白质的沉积量。
GH通过降低机体内葡萄糖转化成脂肪酸的速度, 抑制脂肪酸合成酶m RNA的转录和乙酰Co A羧化酶 (CBX) 、脂肪合成酶的活性, 降低脂肪酸的合成酯化, 同时刺激脂肪的酶解作用, 从而减少脂肪的沉积, GH还可改变脂肪组织对胰岛素的效应, 拮抗胰岛素对脂肪合成的刺激作用。GH对糖代谢的影响比较复杂, 不直接参与糖代谢的调节, 但它可改变组织对糖代谢的敏感性。生长激素对糖代谢的影响表现为胰岛素样和抗胰岛素样效应。生长激素处理初期, 血糖降低, 此时葡萄糖的摄取和氧化加强, 生长激素表现出胰岛素样效应。但过一段时间后, 葡萄糖氧化减少, 血糖浓度显著升高, 同时胰岛素浓度也升高, 生长激素降低了靶组织对胰岛素的敏感性, 表现出抗胰岛素效应[11]。
2.2 GH基因的结构与定位
近二十年来, 国内外学者已经对猪GH基因结构做出了大量基础性工作。1983年Seeburg等成功克隆猪GH基因的c DNA, 但没有完整的5′端非编码区[12]。Vize等首先确定猪的GH基因序列[13]。贾锋等对猪GH基因的全序列进行了测定, 得出猪GH基因c DNA长度约为896 bp[14]。目前已知, 猪GH基因由5个外显子和4个内含子构成, 外显子大小分别为10bp、161bp、171bp、162bp和198 bp, 其中外显子1最小, 编码前导肽中的3个氨基酸, 外显子5最大。该基因4个内含子的大小分别为242 bp、210 bp、197 bp和278 bp, 其位置、大小与人、牛和鼠的生长激素基因类似;其核酸序列的组成、内含子的位置和长度、启动子、5′和3′端非转录区都有很高的保守性。
2.3 猪GH基因的多态性研究
Kirkpatrick等首先扩增出猪生长激素基因+48~+889位长约842 bp的片段。在17头无相关汉普夏和约克夏公猪中检测到GH基因5′端和第2内含子存在RFLP, 且5′端的等位基因频率存在品种间差异[15]。Kirkpatrick等又对24头无相关约克夏和19头远交个体的GH基因+206~+711位进行了PCR-RFLP检测, 发现Hae II在+308位呈多态性, Msp I在+577位呈多态性[16]。Larsen等用PCR-RFLP技术分析了丹麦4个猪种GH基因的-119~+486位片段, 发现Apa I于+299位, Cfo I于+330和+379位呈多态性[17]。方美英等采用PCR-RFLP方法检测6个猪种 (姜曲海猪、内江猪、杜洛克猪、桃源猪、香猪、民猪) 的GH基因第2外显子区的遗传变异[18]。他们所扩增的GH基因座位230 bp片段, 经用Hha I酶切, 产生了遗传多态性。在此片段上共存在2个Hha I酶切位点, 依次产生124 bp、49 bp和57 bp。两个酶切位点是由507处的C/T替换以及555~556处的G/A和C/A替换形成的。刘红林等对中国地方猪种生长激素基因Hha I酶切片段的多态性特征也进行了研究, 他们采用PCR-RFLP技术分析了8个中国地方猪种 (太湖猪、姜曲海猪、金华猪、皖浙花猪、内江猪、香猪、桃源猪、民猪) 和4个国外猪品种 (皮特兰猪、长白猪、大约克猪、杜洛克猪) , 结果表明, 在生长激素第2内含子和第2外显子区Hha I酶切等位片段的频率在猪种间存在显著差异, 其结果与方美英等人的研究结果一致[19]。
宋成义等 (2001) 利用PCR-RFLP技术分析了姜曲海猪GH基因+206~+711位共506 bp片段中的2处突变位点[20], 结果表明, Apa I酶切突变位点G4G4基因型个体的70日龄体重极显著高于G3G3/G3G4基因型个体 (P<0.01) ;G4G4基因型个体的0~70日龄日增重也极显著高于G3G3/G3G4基因型个体 (P<0.01) 。仲飞等以PCR方法扩增了GH基因的第1内含子, 经测序表明, 扩增的GH基因第1内含子的序列与Vize等在1987年发表的序列存在6个碱基的差异, 有高度的同源性, 同源性达97.5%, 说明GH基因第1内含子具有多态性[21]。俞沛初等采用PCR-RFLP技术对香猪、上海白猪、大约克夏猪的生长激素基因-119~+715区域共843 bp片段的扩增产物, 分别用Apa I、Dra I、Msp I 3种限制性内切酶检测酶切位点的多态性, 结果显示, 3个品种都产生了Apa I的酶切多态性, 经测序发现, 该酶切位点是由位于第1内含子的+295位处的酶切位点缺失所造成的, 导致切点缺失的原因是+295位上发生了G/A替换[22]。
所有这些都说明猪的生长激素 (GH) 基因座位表现出了广泛的多态性。综合以上研究, 可绘出部分GH基因中限制性多态位点图 (图1) 。
2.4 GH基因的研究前景
尽管国内外学者对GH研究较多, 但大部分研究集中在对GH的生产和应用效果方面, 如利用GH基因生产转基因猪和利用基因工程菌株来高效表达GH基因, 以及生长激素对猪生长性能、胴体性状和组成、肉质、营养代谢等的影响。而真正研究GH基因多态性与生产性能关系的还不太多。已有的这些研究大多数集中在对多态位点的寻找上, 其生物学意义还没有确定, 与生产性能的相关分析也比较肤浅, 尚不能在猪的育种和生产实践中应用。