组织灌注（精选8篇）
组织灌注 篇1
摘要：目的 超声动态评估组织灌注技术用于评价糖尿病患者肾脏皮质血流灌注的效果。方法 选择2013年3月—2015年9月期间该院收治的60例2型糖尿病患者作为观察组研究对象。按照其肾小球的过滤情况进行分组:A组20例(正常),B组40例(下降),另选择30名正常者作为对照组研究对象。该组患例采用彩超仪器,并使用Pixel Flux软件对图像进行进一步的分析与研究。结果 观察组A组与对照组相比较,平均灌注强度、平均血流速度均差异有统计学意义(P<0.05),但是组织阻力指数差异无统计学意义(P>0.05);观察组B组与对照与患者相互比较,平均灌注强度、平均血流速度、组织阻力指数的统计学差异P均小于0.05差异有统计学意义。结论 超声动态评估组织灌注技术可以更加准确的评价ROI内的血流参数指标,因此糖尿病患者接受超声动态检查可以明确其肾脏功能情况,这对于治疗方案的尽早确定以及患者的生活质量水平的改善均具有重要的意义。
关键词：超声动态评估,组织灌注技术,糖尿病患者
近年来,随着人们生活习惯和饮食结构的不断变化,我国糖尿病的发病人数有逐年上升的趋势。糖尿病可能会引发多种并发疾病,其中最为严重的并发症就是糖尿病肾脏病变,为提高该疾病的临床治疗效率,改善糖尿病肾病患者的生存质量水平。该院对超声动态评估组织灌注技术(dynamic sonographic tissue perfusion measurement,DTPM)改善糖尿病患者肾脏皮质血流灌注的具体效果进行了全面的研究,希望能够为今后的临床治疗提供科学的指导依据,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
首选选择2013年3月—2015年9月期间该院收治的60例2型糖尿病患者作为观察组研究对象。按照其肾小球的过滤(glomerular fitration rate,GFR)情况进行分组:A组(正常),GRT≥90,共20例,包括男性12例、女性8例,平均年龄为(44.6±6.7)岁;B组(下降),GFR处于30~60之间,共40例,包括男性23例、女性17例。该组患者均符合糖尿病肾病的临床诊断标准,为保证结果准确性,该组研究排除了其它原因所导致的肾脏功能病变、身体其他重大器官存在病变、妊娠及哺乳期妇女。
另外选择30名正常者作为对照组研究对象,其中包括男性18名、女性12名,平均年龄为(45.6±7.8)岁。该组入选对象不存在肾功能异常的情况,各项检查的生化检验结果均为正常。与观察组患者的年龄、性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05),可行比较。
1.2 方法
该组研究采用北京东方迈润医疗器械有限公司提供的GE VOLUSON E10彩超仪器,并使用Pixel Flux软件对图像进行进一步的分析与研究。首先将仪器与心电图连接,之后需使患者保持侧卧位,并分别进行肾脏检查,检查过程中的相关操纵均需要严格按照相关的指示完成操作,确保得到的图像清晰准确。图像完成储存之后需要使用Pixel Flux软件对图像进行分析和处理,通过自动追踪患者的心动周期变化,进一步得到患者的平均灌注强度、平均血流速度、组织阻力指数。
1.3 统计方法
研究行SPSS 19.0完成数据分析,采用均数±平均数(±s)表示研究中所得到的相关数据,采用t值进行检验,若得到P<0.05,则可认为差异有统计学意义。
2 结果
观察组A组与对照组相比较,平均灌注强度、平均血流速度均差异有统计学意义(P<0.05),但是组织阻力指数差异无统计学意义(P>0.05);观察组B组与对照与患者相互比较,平均灌注强度、平均血流速度、组织阻力指数的统计学差异P均小于0.05。差异有统计学意义。具体情况见表1。
3 讨论
目前,临床中关于糖尿病肾病的具体发病机制和原因尚未完全明确,一般认为其发病原因与以下几方面因素相关:(1)遗传因素;(2)高血压;(3)肾脏血流动力学异常;(4)血糖升高所导致的代谢异常;(5)血管活性物质代谢异常[1]。
相关研究证明,肾脏血流动力学指标异常所导致糖尿病肾病在临床中具有较高的发病率,其主要表现为患者的肾小球高灌注和高滤过,肾血流量和肾小球滤过率(GFR)升高,并且如果在此期间患者的蛋白摄入含量有所升高,那么这些指标升高的情况将会比正常状态下更加显著[2,3]。
因此在该组研究过程中,重点将不同组别参数的指标情况作为评价的重要标准。超声动态评估组织灌注技术的主要特点在于其可以对于ROI(肾皮质区域)内的各项血流动力指标据悉宁定量的评价。在进行检查的过程中,可以将患者的各项指标情况通过色彩加以表示,并通过关注参数以及相关的曲线图进一步反映患者的审批制血流关注情况。从最终的检查结果中可以发现,患者的各项血流参数指标水平与其肾小球过滤率存在着密切的关系,观察组A组患者的肾小球过滤率与常人基本无异,可以看到该组患者与对照组患者的组织阻力指数存在着较为明显的差异。而观察组B组患者的肾小球过滤率明显低于正常者,因此其各项受检指标情况均与对照组患者存在着明显的差异,P<0.05。这一结果显示,超声动态评估组织灌注技术可以对于患者ROI内的血流参数指标的评估水平较为准确,在临床中可以为相关的医疗研究人员提供更加科学、充分的治疗指导依据。
4 结语
综上所述,超声动态评估组织灌注技术可以更加准确的评价ROI内的血流参数指标,因此糖尿病患者接受超声动态检查可以明确其肾脏功能情况,这对于治疗方案的尽早确定以及患者的生活质量水平的改善均具有重要的意义。因此建议在临床检查过程中广泛的应用这项技术。
参考文献
[1]李敏州,高彦彬,马鸣飞,等.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(22):344-348.
[2]王文娟,郭燕,王丽琴,等.正常人肾脏磁共振扩散张量成像及可重复性[J].中国医学影像技术,2012,28(11):2064-2067.
[3]冯强,马智军,伍建林,等.健康成年人肾脏不同部位的DTI研究[J].中国医学计算机成像杂志,2013,19(3):231-234.
组织灌注 篇2
钻孔桩水下混凝土灌注
事故预防处理措施
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中铁一局京沪高铁土建二标项目经理部
五工区
二OO八年五月十日
德禹特大桥DK344～DK359段桩基工程采用钻孔灌注桩，共计3838根。钻孔灌注桩数量大，桩身长，施工质量的优劣直接关系到桩基工程质量，关系到整个工程的质量。现对其施工作以下要点分析： 1.钻孔桩混凝土灌注操作技术 1.1.首批砼灌注
砼灌注量与泥浆至砼面高度、砼面至孔底高度、泥浆的密度、导管内径及桩孔直径有关。
孔径越大，首批灌注的砼量越多，由于砼量大，搅拌时间长，因此可能出现离析现象，首批砼在下落过程中，由于和易性变差，受的阻力变大，常出现导管中堵满砼，甚至漏斗内还有部分砼，此时应加大设备的起重能力，以便迅速向漏斗加砼，然后再稍拉导管，这样能使砼顺利下滑至孔底，下灌后，继续向漏斗加入砼，进行后续灌注。1.2.后续砼灌注
后续砼灌注中，当出现非连续性灌注时，漏斗中的砼下落后，应当牵动导管，并观察孔口返浆情况，直至孔口不再返浆，再向漏斗中加入砼，牵动导管的作用如下：
1.2.1．有利于后续砼的顺利下落，否则砼在导管中存留时间稍长，其流动性能变差，与导管间磨擦阻力随之增强，造成水泥浆缓缓流坠，而骨料都滞留在导管中，使砼与管壁摩擦阻力增强，灌注砼下 落困难，导致断桩，同时，由于粗骨料间有大量空隙，后续砼加入后形成的高压气囊，会挤破管节间的密封胶垫而导致漏水，有时还会形成蜂窝状砼，严重影响成桩质量。
1.2.2．牵动导管增强砼向周边扩散，加强桩身与周边地层的有效结合，增大桩体摩擦阻力，同时加大砼与钢筋笼的结合力，从而提高桩基承载力。1.3后期砼的灌注
在砼灌注后期，由于孔内压力较小，往往上部砼不如下部密实，这时应稍提漏斗增大落差，以提高其密实度。1.4.砼灌注速度
再控制砼初凝时间的同时，必须合理地加快灌注速度，这对提高砼的灌注质量十分重要，因此应做好灌注前的各项准备工作，以及灌注过程中各道工序的密切配合工作
2.钻孔灌注桩易发事故的预防及处理 2.1 导管进水的主要原因
a.首批混凝土量不足或导管悬空过大,致使首批混凝土不能埋住导管,泥水从导管底口进入。
b.灌注中提升导管过猛过高或测深错误,导致导管底口脱离混凝土顶面,底口涌入泥水。
c.导管脱落,泥水从上口涌入。
d.导管接头不严密,螺栓不紧或法兰变形;胶垫被高压气冲破焊缝开裂;导管掉落引起的导管被高压气和混凝土撕裂。
出现以上事故要查明原因,以便采取相应的技术措施。灌注前应认真测量孔深和导管长度,准确计算料斗,导管容量及首批混凝土量并严格控制导管悬空。导管悬空一般控制在0.2m～0.4m范围内并根据孔径大小、孔深、导管粗细、料斗大小、沉淀多少和孔底采用相应值。一般孔径越大,孔深越深,导管越粗,沉淀越少,平孔底要采用低值,反之可悬空大些。
首批混凝土下去后应立即测量导管内外混凝土深,根据导管深度计算导管埋深。如果导管没有埋住,导管已进水,应立即提出导管,将散落孔底的混凝土与泥水混合物用空气吸泥机或抓斗清出。没有以上设备的可迅速提出钢筋笼，二次下钻清孔。
灌注中,导管要严格控制埋深在2m～6 m范围内,注意不要拔脱导管,并准确测量混凝土面上升高度,随时与实灌混凝土量理论上升高度验证。计算时应结合地质资料考虑必要的充盈量及扩孔缩径等因素。
导管是灌注成败的关键因素,因此,灌前要认真检查导管吊绳是否牢固,连接是否坚实可靠,同时上卸导管工人应加强责任心,严格操作,清净法兰盘上的泥水,混凝土等杂物,拧紧螺栓。法兰变形,垫子破损,螺丝已损伤的坚决换掉。导管在使用前和使用一段时间后,要做一做承压和水密实验,千万不可大意。导管底口可以在环外缘焊一根φ8mm～10mm圆钢予以加强加固,防止底口外翻。
因导管脱落造成的自上口进水的事故处理比较简单。出现此类事故后可先行打捞起导管,用水泵将管内泥水抽干,然后边注入清水清洗导管内壁边抽边洗至洗净抽干。此时管内混凝土面上口仍会 留有少量泥水。接下来将导管上提,导管埋深控制在0.5m左右,测量管内混凝土深度。计算并注入适量新的混凝土(以能充分排出泥浆为宜),继续灌注。当新的混凝土将泥水充分排出后,再将导管向下插入0.5m左右,继续灌注至终结。第二次插入时导管底口以上的混凝土应视作浮浆,以后的导管埋深要超过此时导管埋深的1m以上,并且这些浮浆要在灌注终结时预留出来,以便凿除。
2.2 卡管产生的主要原因 a.初灌时隔水塞(栓)卡管。
b.混凝土原因卡管。如混凝土塌落度过小、和易性差、离析、拌合不均匀,粗骨料过于集中及混凝土中夹有大块砖石、卵石、水泥结块、混凝土块等原因,都可能造成卡管。
c.导管原因卡管。如导管漏水造成管内混凝土在自重作用下泌水离析,形成混凝土堵塞。
d.机械故障或其它原因造成中止混凝土灌注时间过长时,管内混凝土会离析,和易性变差、管内底部混凝土会泌水形成堵塞。
e.其它原因造成的卡管。如导管坠落使导管底口内翻,减小了内径,会积存混凝土,使混凝土流动不畅,极易造成卡管。
卡管事故处理时一般都比较困难,因此要注意预防避免卡管。导管用前用后冲洗干净,清除附着于内壁上的混凝土,整平导管凹陷,使管内平滑流畅。另外灌前要注意检修机械设备,使其保持良好的工作状态并准备必要的备用机械设备。拌制混凝土应达到要求,料物注意不要挟带大块固体。同时要加强组织的协调性,尽量使混凝土灌注保持其连续性、快速性,减少中断时间。因故中断时可间隔 10min左右,上下小幅提动并转动导管、使管内混凝土间断性下行,也可减少卡管机会。轻度卡管可采用长杆冲捣或用卷扬机快速上下提动导管,使管通畅。但较重卡管时,以上办法往往不能奏效,反而会因振动加快粗骨料下沉,加快混凝土离析,加重卡管。出现这种后果后,只有提出导管,清理后再作处理。处理办法可参照前面介绍的二次灌注等办法。
2.3 埋管
导管不能从混凝土中提出,我们称之为埋管。造成埋管的主要原因有导管埋深过大,灌注时间过长、混凝土已初凝,塌孔严重等原因。埋管轻则损坏导管,重则毁桩。其危害不亚于卡管。因此灌注时间尽量不要太长,导管埋深要严格控制在2m～6m范围内。千万不要以为翻浆还很好就不会埋管而使其埋深过大。实践表明,多数埋管都是因为这样大意而造成的。
一旦发生埋管,可先卸掉料斗,用卷扬机或吊车直接吊拉导管。吊拉时应全力、小幅、间隔、快速提动导管,不可猛提硬拉,待导管活动开后再提卸。一般经过这样折腾后的导管尤其是法兰变形严重,应检修并做水密实验,合格后再用。
2.4 塌孔、缩径
塌孔的判断主要应依据实测灌注混凝土量计算混凝土面上升高度与实测值的差值。如果差值突然变大即混凝土上升速度突变,在正常翻浆情况下,应疑为塌孔。轻度塌孔要以继续灌注,重度塌孔宜填实重钻。
缩径主要同地质情况有关。例如砂层或富水层,如果停钻到灌 注时间间隔太长,孔内泥浆会在自重作用(静水压)下失水,水向砂层渗透,泥则附着于孔壁越积越厚,从而加厚了泥壁,减小了孔径;又如处于地下水位线以上的粘土层会吸夺泥浆中的水份,加厚泥壁的同时自身膨胀,也会减小孔径;再如砂土层钻进过快,钻头尺寸不够也是缩径的一个原因。以上这些原因在下钢筋笼前先下一个同孔一样粗细的孔规,预先检测一下都能够发现并予以纠正,另外再把停钻到灌注控制在4h以内,这样就不会造成缩径的后果了。
2.5 短桩头
出现短桩头主要原因是灌注临近终了时误测所致。因此灌注结束前,由于浆渣过稠,要加重测锤,增多施测点。测量时轻轻上下提动测锤。使之渐渐深入,直至提出后测锤粘有混凝土浆为止,即可测量准确。同样,灌注过程中。也应如此测量,同时凭着测量时对测绳的感觉也能区别泥浆、砂浆和混凝土。泥浆滑腻,砂浆沙松,混凝土有石子的碰撞且较难测入,这些感觉只有有一定经验的人才能感觉到。当然桩顶设计较浅的,也可以插入木杆或钢筋,持提出后观察所粘水泥浆测量,更直观。
一般短桩头短少混凝土高度不是很大,可以凿除桩头后补足或结合上部施工。
2.6 断桩、夹泥、夹心
造成断桩、夹泥、夹心的原因很复杂,而大多数原因又不易发觉,只有经过检测后才能发现。其主要原因有：
a.以上各种事故引起的必然或次生结果。
b.灌注时间过长,首批混凝土已初凝,流动性降低,续混凝土 灌冲破首批混凝土面上升,致使两层混凝土中间夹有泥浆渣土。
c.清孔不彻底或提钻时粘连在钻头上的泥石块掉落孔内。当首批混凝土巨大冲击力将这些渣块托起到一定高度时,由于混凝土面的不均匀上升或托浮力减小,使这些渣块留裹在混凝土内造成夹泥。灌注中局部塌孔也会造成夹泥。
d.灌注时间过长,初凝混凝土粘在导管外壁,并随着终结时导管的提出而提出,使桩顶部出现竖向空洞或夹泥。
e.质量不合格混凝土灌入造成断桩。如偶有一盘严重离析的混凝土灌入或洗刷拌合机的水灌入会在桩内形成一层相对均匀的粗料隔离层。
f.导管提脱或导管埋深较小底口己到浮浆层,造成续灌混凝土同已灌混凝土连接不良,强度降低或断桩。
g.大幅上提导管后又落下,泥浆容易随导管挟带进入混凝土后留在混凝土内形成夹心。断桩、夹泥、夹心这些事故只有在成桩检测后才能发现,这就要求我们要采取相应技术措施,预防和避免此类事故的发生。如灌前认真检测增多放测点,尽量减少孔内沉淀物;灌注中通力合作,尽量缩短灌注时间;严格混凝土拌制,不合格混凝土严禁灌入;避免导管大幅提落;提卸导管时小幅振动,减少混凝土的带出,尤其是结束前提管更应如此。
2.7 钢筋笼上浮
钢筋笼随着混凝土灌入而上升的现象我们称之为钢筋笼上浮。这种现象多是因为混凝土上升托浮所致、多发生在笼底离孔底有一段距离,笼重量较轻,桩径小于1.2m,尤其是1m以内的灌注桩。桩 径1.2m以上的较少见．当混凝土埋住钢筋笼一定深度,导管底口又在笼底以下时,导管底口以上混凝土会随着继灌混凝土整体上升,并对钢筋笼施以向上的摩擦托浮力,这个力不断加大,在克服笼体自重力及笼同孔壁磨擦力后就会使笼子上升。因此,当发现笼子上浮时应当提卸导管,尽量减小导管埋深,使其底口高于笼底,减小托浮力．采取以上措施后,笼子就会停止上浮．另外,导管也能挂住笼子上升．如果轻提导管,笼子随着导管上提而上升,且上升幅度一致,则属于这种情况．此时,只要轻轻转动导管,笼子一般会自行落入,反之,笼子上升与提动导管无关,而是随着续灌混凝土而上升,则是混凝土托浮所致,应提卸导管,提卸导管后还上升的,应结合上部加压的办法,同时放慢灌注速度,减少每盘混凝土数量。采取以上措施后,一般笼子都会停止上浮。
钢筋笼已经上升,且上升幅度不大,在采取以上措施后,在笼顶施压,笼子会慢慢沉下;发现较晚或上升幅度较大的,则很难使其再恢复到初始状态。因此,笼顶位置高的,应同上部灌注设备焊牢;笼顶位置较深的应在笼顶焊一钢筋并露出浆面,以便随时观察。
组织灌注 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择50只健康的小白鼠 (由我院动物实验基地提供) , 将其分为两组:缺血损伤组25只, 雄性16只, 雌性9只, 平均体重为20.3g;葛根素组25只, 雄性17只, 雌性8只。将所有小白鼠进行笼养, 提供一个可以自由吃食喝水的环境。各组实验白鼠在性别、年龄和体重等方面无较大差异, 具有可比性。
1.2 方法
(1) 首先将所有的小白鼠腹部用专用夹夹住, 持续将近10min, 将缺血损伤组的小白鼠强制注射入30mg的生理盐水, 而葛根素组注射入同等容量的葛根素注射液, 然后静置, 进行相关数据收集。
(2) 缺血损伤模型的制作。将所有的小白鼠在模型制作前一天禁止饮食, 但提供足够的饮水。第2天, 将专用的麻醉剂从耳的边缘部位注入。待完全麻醉后, 用普鲁卡试剂进行开腹, 暴露小白鼠的腹部主动脉, 用动脉夹将其夹住20min, 再将其开放, 同时注入一定量的肝素。实验的时候要保持白鼠体温的维持[2]。
(3) 血浆MDA含量以及血浆SOD活性的测定。将所有小白鼠在刚开始和再灌注持续1h后分别采血2～4mL, 将所有血样进行标记整理, 最后在血验室里, 采用硫代巴比妥试剂测定白鼠血浆中的MDA含量, 采用黄嘌呤氧化酶试剂测定血浆中的SOD活性, 最后进行统计与分析。
1.3 统计学分析
本研究采用了SPSS13.0统计软件包进行统计分析, 采用χ2检验计数资料, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
表1为实验过程中测得的各个平均值, 我们可以从中看出葛根素对缺血损伤起一定的保护作用。
3 讨论
由以上实验我们可以得知, 葛根素对组织缺血再灌注损伤有着许多的保护作用, 以下为各种保护作用产生的机制。
3.1缺血组织无复流现象的减少
当组织缺血时, 会发生一种在相关组织血液复流, 但缺血处却没有能够被充分灌注的现象, 当缺血状态长时间保持, 就会产生我们所称的缺血组织损伤。
其发生的原因主要是血管内的内皮细胞由于突然的膨胀产生了管腔过于狭窄和血小板的过多聚集产生了血管内的阻塞。随之, 再灌注时血液被阻塞, 不能完全填充缺血组织, 无复流现象就随之发生。葛根素的摄入会对逆转丙二醛以及血栓素的产生有一定的作用, 同时葛根素降低了患者血液内的粘稠度, 内皮细胞的损伤也大大减小。葛根素也能对冠状动脉有所扩张, 给内皮细胞提供更多的氧气, 减轻了缺血组织的损伤。通过以上方法, 葛根素对过度氧化的脂质的内皮细胞产生了保护作用[3]。
3.2自由基的清除
当组织缺血时, 将会通过一系列的作用 (神经递质的释放, 相应受体的接受与作用, 细胞内部钙含量的超标, 各级酶系统被逐步激活) 导致自由基的大量形成。由于自由基对神经元膜性结构产生攻击, 使得相应膜的脂质被过度氧化, 从而造成神经细胞的损伤。葛根素的摄入能够提高血浆内MDA和SOD活性, 使得超氧化物作用酶的产生受到抑制, 过氧反应产生减少, 从而有效地清除了自由基。
3.3作用于钙离子通道
我们通过对白鼠钙离子通道的研究发现, 葛根素能够抑制白鼠L型钙离子电流的形成, 并形成阶段性依赖, 而L型钙通道电压的曲线则逐渐上移。由此我们分析出葛根素能够较为有效地减少突触神经上所附带的钙元素, 更对神经元内的凋亡细胞的减少起到一定的抑制作用。这二者的作用关系互为相关[4]。
综上所述, 葛根素对于组织缺血再灌注损伤有很强的保护作用, 值得我们继续研究和探讨。
摘要：目的:通过对照组比较, 探讨使用葛根素在组织缺血再灌注损伤保护中的机制。方法:将50只小白鼠分为两组进行对照治疗, 缺血损伤组25只、葛根素组25只, 将各组白鼠经过相应的处理措施, 测量出每只白鼠的血浆MDA值和血浆SOD活性。结果:缺血损伤组白鼠平均血浆MDA值开始为110μmol/L, 1h后为150μmol/L, 平均血浆SOD活性开始为350×103 NU/L, 1h后为280×103 NU/L;葛根素组白鼠平均血浆MDA值开始为100μmol/L, 1h后为120μmol/L, 平均血浆SOD活性开始为366×103 NU/L, 1h后为340×103 NU/L。结论:葛根素对组织缺血再灌注损伤起一定的保护作用。
关键词：葛根素,组织缺血,再灌注损伤,保护机制
参考文献
[1]张小花, 张兰.葛根素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].安徽医药, 2007, 11 (8) :688-689.
[2]桑韩飞, 张英民, 徐礼鲜, 等.葛根素对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J].第四军医大学学报, 2001, 22 (5) :414-417.
[3]孙鹏, 刘金龙.葛根素对组织缺血再灌注损伤保护机制的研究进展[J].现代中西医结合杂志, 2006, 15 (3) :405-407.
组织灌注 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂及设备
雄性Wistar大鼠48只, 体重250 g～350 g, 购于山西医科大学生理实验室。将其分为假手术组 (sham) 、缺血再灌注组 (IR组, 分为6 h、24 h、48 h、72 h、7 d亚组) 。CD40L、MMP-3抗体:北京博奥森生物技术有限公司;SABC染色试剂盒、DAB显示试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司。BI-2000医学图像分析系统软件 (成都泰盟科技有限公司) 。
1.2 动物模型制作方法
参照Zealonga的改良线栓法制备大鼠大脑中动脉栓死模型 (MCAO) 。基本步骤:大鼠于术前夜禁食;称重后, 用10%水合氯醛 (4 mL/kg) 腹腔麻醉;备皮, 消毒并于颈部行25 mm纵向切口, 分离右侧颈总动脉 (CCA) 、颈内动脉 (ICA) 及颈外动脉 (ECA) ;结扎ECA与CCA;于ECA与ICA分叉下方剪一切口, 将一预先处理过的渔线插入CCA, 经ICA入颅直到有轻微阻力感为止, 插入深度为 (20.0±0.5) mm, 实现大脑中动脉阻塞。结扎入口处, 渔线外留1 cm, 消毒, 全层缝合伤口。2 h后提拉线头至CCA, 实现对缺血脑组织再灌注, 造模完成。
1.3 取材和指标的检测
大鼠脑再灌注后, 用10%水合氯醛麻醉, 开胸暴露心脏, 经升主动脉插管剪开左心耳, 用生理盐水250 mL快速冲洗, 取脑, 切右侧半脑在4%多聚甲醛中固定6 h。用免疫组化检测脑组织CD40L、MMP-3。每只大鼠各个指标做一张切片, 每张随机取5个视野, 计算CD40L、MMP-3的阳性细胞数并进行光密度值测定。取平均值作为统计参数。
1.4 神经功能评分
用Longa神经功能评分法评分。0分:无神经功能缺损症状;1分:轻微神经功能缺损, 不能完全伸展左侧前爪;2分:中度局灶性神经功能缺损, 向左侧转圈;3分:重度局灶性神经功能缺损, 向左侧倾倒;4分:不能自发行走或意识丧失。1分～3分为有效模型。
1.5 脑组织含水量测定
用干湿重法。取脑后在电子天平上称得其湿重, 然后取左侧半脑即刻置于烤箱, 100 ℃恒温烘烤24 h至恒重, 称干重并计算含水量。脑含水量= (湿重-干重×2) / 湿重×100%。
1.6 统计学处理
数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 再灌注后CD4OL的表达
再灌注6 h已有CD40L的表达, 24 h、48 h阳性细胞数和光密度值达到高峰, 72 h后开始降低, 7 d仍有表达, 达到一比较稳定低值。详见表1。
2.2 再灌注后MMP-3的表达
再灌注6 h已有MMP-3的表达, 24 h, 48 h阳性细胞数与光密度值达到高峰。详见表2。
2.3 再灌注后神经功能评分 (见表3)
2.4 再灌注后脑含水量 (见表4)
3 讨 论
CD40属于TNF-γ受体家族, 主要表达于单核细胞、内皮细胞和小胶质细胞也能表达[2]。CD40L是TNF超家族成员, 主要表达于活化的CD4+T细胞, 巨噬细胞、小胶质细胞也能表达[3]。目前CD40/CD40L参与脑缺血再灌注损伤的研究大多源自动物实验。Ishikawa等[3]发现敲除CD40或CD40L基因的小鼠MCAO模型, 其大脑的梗死体积较对照组减少30%～40%, 表明在脑缺血再灌注损伤过程中CD40/CD40L信号系统起重要作用。近年来研究的有关卒中患者的CD40L主要是血清sCD40L, 其中95% 由血小板分泌而非来自脑组织, 且血清sCD40L在体外不能诱导内皮细胞炎症反应, 而重组的sCD40L却能;可知sCD40L在脑缺血病理生理过程中的作用并不肯定。MMP-3为锌离子依赖性内肽酶, 已证实MMP-3单倍体可以预测脑卒中[4], 而最近研究发现MMP-3和MMP-9可能会导致血管源性脑水肿[5]。显然以上研究的CD40L和MMP-3都来源于血清且作用机制并不十分明确, 而脑组织中的CD40L 和MMP-3目前还研究尚少。
本实验中发现缺血再灌注6 h后脑组织有CD40L与MMP-3的表达, 24 h～48 h阳性细胞数与CD40L和MMP-3的表达强度均达高峰, 72 h后开始下降, 7 d仍有较低表达, 与脑含水量、神经功能评分变化特点基本一致。证实脑组织中CD40L、MMP-3与脑缺血再灌注损伤密切相关, 可能为以下机制:缺血再灌注后脑组织CD40L表达增高, 诱导MMP-3分泌, MMP-3可以通过降解各型蛋白及胶原来参与血脑屏障的损伤;MMP-3还可激活MMP-9, 共同参与血脑屏障的损伤。白细胞通过受损的血脑屏障渗入脑组织, 并分泌相关炎性介质促进炎症, 加重脑水肿, 造成缺血脑组织的损伤。然而CD40L的作用并不局限于此, 其信号通路可以通过诱导细胞因子、黏附分子、趋化因子等参与脑缺血再灌注损伤。
综合分析CD40L在脑缺血再灌注损伤的炎症级联反应中处在上游, 如果能及时有效的阻断CD40/CD40L通路, 将能极大减少再灌注损伤。如何能找到特效的通路阻滞剂仍是今后研究的重点。
参考文献
[1]Mach F, Schonbeck U, Fabunmi RP, et al.Tlymphocytes induce endothelial cell matrix metalloproteinase expression by a CD40L dependent mechanismi mplications for tubule formation[J].AmJ Pathol, 1999, 154:229-238.
[2]Geldart T, Illidge T.Anti-CD40monoclonal antibody[J].LeukLymphoma, 2005, 46:1105-1113.
[3]Ishikawa M, Vowinkel T, Stokes KY, et al.CD40/CD40ligand sig-naling in mouse cerebral microvasculature after focal ischemia/reperfusion[J].Circulation, 2005, 111:1690-1696.
[4]Kaplan RC, Smith NL.Matrix metalloproteinase-3 (MMP3) and MMP9genes and risk of myocardial infarction, ischemic stroke, and hemorrhagic stroke[J].Atherosclerosis, 2008, 201 (1) :130-137.
组织灌注 篇5
关键词：抵当丸,脑出血,脑血流,脑灌注
脑出血 (ICH) 是中风病中发病率、致残率、致死率较高的一种, 中风病急性期总的病机为本虚标实, 风、火、痰、瘀内结, 并由此导致气血逆乱, 脉络破损, 血溢脑脉外而发, 所谓离经之血即为瘀血。因此, 瘀血阻窍是卒中的主要矛盾。治疗上活血化瘀、促进血肿的吸收就成为重要的治疗原则[1]。近年来的临床和实验研究均发现脑出血后血肿周围组织存在缺血, 为活血化瘀法治疗脑出血提供了理论基础。但对于血肿周围组织缺血持续的时间、缺血在组织损伤中的作用及其干预方法尚存争议。CT灌注成像因其能直观准确地显示血肿周围组织的血流灌注状态, 从而成为目前脑实质出血血肿周围组织脑血流研究较为理想的方法[2]。本研究应用CT灌注成像技术动态评估脑出血后血肿周围组织血流灌注的变化及抵当丸的干预作用, 以期为脑出血的临床救治提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组
成年健康雄性Wistar大鼠50只 (山东大学实验动物中心提供) , 体重400 g～500 g;应用随机数字表将大鼠分为10组。对照组、假手术组各5只;脑出血Ⅰ组和脑出血Ⅱ组 (治疗组) 各20只, 分为12 h、24 h、72 h、7 d时相点亚组, 每亚组5只。
1.2 模型制备
采用自体血尾状核注入法制备大鼠脑出血模型, 在室温22 ℃及恒定湿度条件下, 大鼠术前12 h禁食, 4 h禁水, 轻柔抓取动物, 腹腔注射10%水合氯醛 (4 mL/kg) 麻醉动物。参照Rosenberg等[3]方法。假手术组注射同体积的生理盐水, 其余步骤均同脑出血Ⅰ组和Ⅱ组。神经功能评分按Bederson评分法[4]评分。
1.3 干预治疗
抵当丸 (组方为水蛭6 g, 虻虫6 g, 大黄9 g, 桃仁9 g) 配置为浓度为0.08 g/L的药液, 即每升药液含生药0.08 g。脑出血Ⅱ组给予抵当丸3 mL, 每日两次灌胃;脑出血Ⅰ组给予生理盐水3 mL, 每日两次灌胃, 对照组、假手术组不予干预。
1.4 CT灌注成像检查
术后在各时相点行颅脑灌注CT检查, 扫描采用GE Lightspeed螺旋CT扫描机, 视野 (FOV) 9.6 cm×9.6 cm, 矩阵512×512, 曝光条件为120 kV和100 mA。对比剂采用300 mg I/mL碘海醇, 注射量为2 mL, 注射流率为0.5 mL/s。数据经CT灌注软件处理后获得局部脑血流量 (regional cerebral blood flow, rCBF) 、局部脑血容量 (regional cerebral blood volume, rCBV) 等参数。参数测量采用人工手绘方法设置感兴趣区, 参数测量时在每个区不同位置分别放置4个感兴趣区, 测出每个感兴趣区的rCBF、rCBV和MTT值。
1.5 标本采集
大鼠行灌注CT检查后迅速开胸暴露心脏, 从左心室插管至升主动脉根部, 先以100 mL生理盐水快速灌注, 之后用 4%多聚甲醛200 mL灌注至动物四肢变硬。注毕立即取脑观察大体标本的形态变化, 随后将脑放入4%多聚甲醛溶液内固定, 石蜡包埋、切片、HE染色。
1.6 统计学处理
用SPSS 16.0医学统计学软件处理, 统计结果以均数±标准差
2 结 果
2.1 血肿形成情况
CT平扫显示注血后血肿呈高密度, 位于右侧尾状核。组织切片显示20只大鼠脑内血肿形成良好, 呈圆形或椭圆形, 位于右侧尾状核;2只大鼠可见少量血液流至右侧硬脑膜下腔。
2.2 CT灌注影像表现
在CBV、CBF可见血肿周围不同程度低灌注, 自血肿边缘向外依次为深蓝色→淡蓝色→青绿色的靶样改变, 越靠近血肿边缘, 脑组织灌注越低。MTT可见血肿周围普遍延长, 呈现为红色区域;对照组、假手术组大鼠两侧脑组织灌注对称, 无明显异常改变。
2.3 CT灌注参数变化
脑出血Ⅰ组和Ⅱ组的rCBF、rCBV明显低于正常对照组和假手术组 (P<0.05) , MTT高于正常对照组和假手术组 (P<0.05) 。详见表1。
2.4 Bederson评分
脑出血Ⅰ组和Ⅱ组Bederson评分在各时相点均显著高于正常对照组 (P<0.05) ;脑出血Ⅱ组与脑出血Ⅰ组比较, 其Bederson评分除注血7d显著低于脑出血Ⅰ组外 (P<0.05) , 其余各时相点无统计学意义 (P>0.05) 。详见表2。
3 讨 论
3.1 脑出血后血肿周围组织血流灌注的变化
脑出血发生后, 血肿周围组织局部脑血流经历了一个动态、多时相的变化过程。本研究显示, 脑出血Ⅰ组rCBV、rCBF在注血后各时相点均降低, MTT也明显延长, 其中注血后12 h和72 h出现两个低谷, 以12 h最低, 其发生机制与血肿的占位效应及血凝块回缩有关, 而注血后24 h出现一个血流回升的高峰, 则与早期脑血流下降引发的快速脑血流自动调节机制有关, 随着时间的进展逐渐加剧的凝血酶触发的凝血级链反应、红细胞代谢产物的毒性及炎症反应中中性粒细胞在血管壁及其周围的浸润黏附、释放各种炎症因子[5,6], 在加重脑损伤的同时阻塞微循环, 导致脑血流再次降低, 在72 h出现第二个低谷。上述脑血流的变化规律与文献[7,8,9]的研究结果基本一致, 提示脑出血后血肿周围组织存在不同程度的持续低灌注状态。
3.2 抵当丸对脑出血后血肿周围组织血流灌注的影响
脑出血在祖国医学中属于中风病范畴, 脑出血急性期属中医之血证, 为脑中“蓄血”。 根据中医“祛瘀生新”“血行风自灭”的理论, 瘀血不去, 则新血不生、出血不止故当应用活血化瘀之法[10]。抵当丸是《伤寒论》中用于治疗下焦蓄血症的代表方剂, 所谓下焦蓄血, 实指热瘀互结病位较深, 病重势急, 攻逐不可平缓, 故治当选用活血峻品以破血逐瘀。
抵当丸应用活血破瘀的血肉有情之品水蛭、虻虫, 破血逐瘀的桃仁, 以及清热解毒、荡涤六腑、活血化瘀的大黄组方。以功擅破血逐瘀, 药力峻猛之水蛭、虻虫为主要药物。水蛭咸苦性平, 入肝经, 主逐恶血瘀血, 具有破瘀血而不伤新血, 专入血分而不伤气分的特点。虻虫微苦微寒, 亦入肝经而专破瘀血。二药一飞一潜, 相须为用, 则破血逐瘀之功尤强。再辅以活血消瘀的桃仁、大黄活中寓下, 因势利导, 既能泻无形之血热, 又能除有形之瘀滞, 使邪有出路。诸药合用起到破血逐瘀的作用。
现代药理研究提示:水蛭主要成分水蛭素可以抗凝、抗血栓, 降低凝血酶活性;虻虫有抗凝血酶的作用, 并且可以抑制血小板的聚集, 减少血中纤维蛋白的含量, 抑制血液浓、黏、凝、聚的状态[11];桃仁一方面有抗凝血作用和弱的溶血作用, 另一方面可以改善血流动力学, 增加脑血流量, 防止脑缺血, 桃仁中含有的苦杏仁甙能提高脑中能量代谢的细胞氧化酶的活性, 从而增加脑缺血状态下的能量代谢[12];大黄中含有蒽醌类衍生物、鞣质、游离酸和钙等物质, 具有止血、降低血管通透性、拮抗钙离子、清除自由基等作用[13]。
抵当丸具有改善脑出血后血液循环、止血和促进血肿吸收, 减轻脑水肿的作用。本研究显示脑出血Ⅱ组各时相点rCBF、rCBV均显著高于脑出血Ⅰ组, 其Bederson评分在治疗后7 d显著低于脑出血Ⅰ组, 提示抵当丸可明显提高脑出血后血肿周围组织的血流灌注、在一定程度上促进神经功能恢复。
组织灌注 篇6
1 材料与方法
1.1 试剂和器械
BD动脉留置针 (货号:REF682245, 规格型号:20 G、1.10 mm×45 mm、49 m L/min) , 见图1, 4%多聚甲醛新鲜配置 (天津市光复精细化工研究所) , 0.9%复方氯化钠注射液 (500 m L/4.5 g、宁夏启元药业) , 10%水合氯醛 (成都金山化学试剂有限公司) , 三通 (舒尔康、批号:120225) 、止血钳、组织剪、眼科剪、小动脉夹、皮镊、输液管 (2副) 等。
1.2 实验动物
选取体重450~500 g, 健康雄性18个月龄SD大鼠24只[购于宁夏医科大学动物实验中心, 清洁级, 合格证号:SCXK (宁) 2011-0001], 常规条件下饲养, 自由饮水, 普通饮食。
1.3 实验方法
将灌注所用的0.9%复方氯化钠注射液加热至37℃[3]、新鲜配置4%多聚甲醛滤去杂质[3]、输液管 (两副输液管用三通连接好) 、手术器械等物品准备就绪后, 放置盛有上述0.9%复方氯化钠和4%多聚甲醛的输液瓶距离操作台1.5 m高的位置[4]。雄性SD大鼠经10%水合氯醛 (0.4 m L/100 mg) 麻醉, 待大鼠反正反射消失后, 将其仰卧位于实验台上, 固定头部和四肢, 暴露胸部, 沿胸骨中线自剑突向上依次剪开皮肤和胸骨, 充分暴露胸腔, 显露心脏和主动脉弓, 迅速用皮镊提起左侧肺, 可见其下位于大鼠脊柱左侧的胸主动脉 (胸主动脉右侧为食管) [5], 以小动脉夹夹闭胸主动脉。并迅速用眼科剪剪开心包, 用动脉留置针在心尖波动最明显处进针, 进入约0.5 cm时, 右手往外退针芯, 同时左手持针翼将套管自左侧心室推送至升主动脉直至套管针尾部, 此时, 关闭套管针尾端的开关, 防止血液外溢, 连接输液管, 剪破右心耳, 打开套管尾端和输液管开关, 灌注0.9%复方氯化钠注射液, 先快后慢, 待自右心耳流出液体颜色清亮, 此时旋转三通开关, 由快及慢灌注4%多聚甲醛, 待大鼠颈部及上肢僵硬, 说明灌注固定成功[6]。随后断头取脑, 之后将脑组织置于4%多聚甲醛固定4℃保存[7]。
1.4 观察指标
(1) 观察并记录灌注后大鼠组织的色泽、质感及是否含有血丝。 (2) 观察并记录实验中所用的0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛的量、灌注插管时间、总灌注时间。灌注插管时间是指从针进入心尖开始至插管成功所用时间, 总灌注时间是从针进入心尖开始至灌注固定成功所用时间。 (3) 观察并记录灌注过程中大鼠颈部、胡须、四肢和尾巴是否抽搐。 (4) 观察并记录灌注过程中是否发生肺循环灌注。发生肺循环途径灌注的现象时鼻腔中会有灌流液流出[8]。 (5) 观察并记录在灌注插管过程中损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管脱出等不良事件的发生率。
2 结果
灌注后大鼠脑组织呈乳白色, 质地较硬, 且未含血丝 (图2) 。实验中所用的0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛的量分别为 (107±9.2) m L、 (175±17.3) m L, 灌注插管时间和总灌注时间分别为 (10±1.8) s、 (41±4.1) min。灌注过程中大鼠颈部、胡须、上肢明显抽搐, 下肢及尾巴未抽搐。灌注过程中均未发现大鼠鼻腔中有灌流液流出, 故未发生肺循环灌注。灌注插管过程中未出现损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管脱出等不良事件。
3 讨论
免疫组化等病理学实验研究中需对组织进行定性、定位或定量研究。因此, 在组织切片之前, 需对组织进行灌注固定, 因为固定好的组织能抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性, 防止自溶;抑制组织中细菌的繁殖, 防止组织腐败, 使细胞的蛋白质、脂肪、糖等各种成分凝固成不溶性物质, 以防止物质扩散, 维持原有组织的形态结构[9]。大鼠在体脑灌注过程中, 通过大鼠天然的循环系统直接进行灌注固定, 固定液可快速、均匀地分布到脑组织各个部位, 所以脑组织标本制备多采用此法[10,11]。
灌注固定主要坚持两个原则:一要尽量保持活体的状态;二要尽量行动迅速从而避免动物长时间处于痛苦和濒死状态, 引起病理假象, 从而干扰科研结果[12]。目前, 据文献[12]报道, 小动物灌注多采用经心脏灌注方法, 而经颈总动脉因操作难度大, 费时而逐渐被淘汰。脑组织灌注过程中为节省灌注液, 依研究报道有夹闭腹主动脉、胸主动脉等[5], 但夹闭腹主动脉需进行开腹, 增加操作难度, 延长灌注总时间, 降低实验效率。灌注针是保证整个灌注过程的必要条件, 因此, 灌注针的选择对整个灌注过程尤为重要。有研究报道灌注针可用静脉输液器针[8]、自制灌流针[5,13,14]和普通针头[14]等, 这些灌注针虽可进行灌注, 但都有各自弊端。如静脉输液器针和普通针头因针尖锋利, 在插管过程中可刺破心脏及心室, 且易脱出, 使灌注失败或发生肺循环灌注。而自制的灌流针[5,13], 一般因针尖钝圆, 不易刺入心脏, 需借助眼科剪[12], 又因心脏跳动, 增加眼科剪的操作难度, 在心尖处剪的口可能过大或过小, 也可能剪破心脏, 影响灌注固定效果, 而通过剪口, 插入灌注针, 动作要轻慢[5], 从而延长灌注时间甚至导致灌注失败。陈浩宇等[14]自制的灌注针因塑料前端成针尖状, 在灌注插管时可损伤血管及心腔, 并可能引起肺循环灌注。
因此, 笔者采用动脉留置针夹闭胸主动脉经心脏灌注的方法, 可避免上述弊端, 且依据许晓泉等[15]研究, 在灌注开始时加热至37℃的0.9%复方氯化钠注射液的速度要快, 能更好地排出脑组织内的血流, 灌注新鲜配置滤去杂质的4%多聚甲醛时速度需放慢, 让多聚甲醛在脑组织内停留更长的时间, 以便有效固定。本实验结果表明:灌注过程中大鼠颈部、胡须、上肢明显抽搐, 下肢及尾巴未抽搐, 说明完全夹闭胸主动脉, 可节省灌注液;另外, 灌注过程中未发生肺循环灌注, 保证了体循环灌注的效果, 进而灌注后大鼠脑组织呈乳白色, 未见血丝, 且质地较硬;灌注插管时间仅用了 (10±1.8) s, 可见操作简单且节约时间;灌注插管过程中未出现损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管针脱出等不良事件, 保证了灌注过程顺利进行, 且可节约实验成本。
本研究的创新点:采用动脉留置针为灌注针, 在整个灌注过程中, 发现采用动脉留置针具有以下优势: (1) 进针易:动脉留置针芯针尖锋利, 心尖处进针容易, 进针约0.5 cm时退出针芯, 将套管从左心室顺利推送至升主动脉, 可节约灌注插管时间; (2) 出血少:动脉留置针套管的外径较针芯大[16], 可完全占据心尖穿刺点, 减少出血; (3) 损伤小:在退出针芯推送套管过程中, 由于套管顶端钝圆, 可避免损伤心腔及升主动脉; (4) 推送顺:动脉留置针套管原料采用聚四氟乙烯, 管壁硬度适宜、光滑, 可顺利推送至升主动脉; (5) 明插管:在动脉套管推送过程中, 可看到套管进入升主动脉的全过程, 确保插管成功, 同时可避免肺循环灌注的发生; (6) 易固定:套管尾端两侧有针翼, 较其他灌注针容易固定; (7) 难脱出:动脉套管长度45 mm, 插管成果后, 套管很难脱出, 有利于灌注的顺利进行; (8) 速度可:动脉留置针套管管腔直径1.10 mm, 流量49 m L/min, 可保证灌注速度, 强化灌注效果, 节约灌注时间和灌注液。
综上所述, 本实验操作简单, 灌注插管迅速、损伤小, 可避免肺循环灌注, 总个灌注过程省时、省液, 且灌注固定效果好, 值得推广应用。
摘要：目的:拟寻求一种更好的大鼠体脑组织灌注方法以提高灌注固定效果。方法:健康雄性SD大鼠经10%水合氯醛进行麻醉, 暴露心脏和主动脉弓, 以小动脉夹夹闭胸主动脉, 用动脉留置针在大鼠心尖波动最明显处进针, 进入约0.5 cm时, 边退出针芯, 边将套管自左侧心室推送至升主动脉直至套管针尾部, 并关闭套管针尾端的开关, 防止血液外溢, 连接输液管, 剪破右心耳, 依次从心脏灌注0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛固定脑组织。结果:脑组织灌注所需的灌注液减少, 灌注插管时间及总灌注时间均缩短, 且灌注后脑组织更硬、色泽更白。结论:采用此种灌注方法后, 其灌注固定效果明显提高, 且操作过程简单易行, 值得推广。
组织灌注 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
脂联素ELISA试剂盒 (美国Invitrogen公司 货号KRP0041) , 脂联素免疫组化试剂盒 (英国abcam公司 货号ab62551) , 二步法IHC检测试剂 (北京中杉金桥公司货号:PV-6000-G) , SABC免疫组化试剂盒/DAB显色试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司) , 内皮素-1 (ET-1, Merck公司 货号05-23-3800-0.1MG) 。
1.2 动物与分组
封闭群纯种SPF级Sprague-Dawley (SD) 雄性大鼠30只, 体重180 g±20 g, 自然光线, 自由饮水, 自由摄食条件下适应性喂养7 d。分别称重标记, 采用随机法分为A组 (正常对照组) 、B组 (缺血再灌注组) , 每组15只。
1.3 动物模型制备
参考顾国军等[2]方法, B组复制缺血再灌注大鼠模型。俯卧位固定于脑立体定向仪上, 以保温床垫维持肛温在 (37.5±0.5) ℃, 在颅顶沿正中线做一长约1.5 cm的切口, 暴露颅骨, 以前囟为标志, 向前0.9 mm, 向左旁开5.2 mm, 向下8.7 mm植入ET-1导管。将ET-1 (60 pmol/μL) 以0.6 μL/min的速率注射到MCA附近, 留针5 min, 缓慢拔针, 退针后缝合头皮。术口局部施以消毒酒精抗感染。
1.4 标本处理及观察指标
1.4.1 血浆脂联素检测
每组大鼠于复制模型前后随机抽取10只, 依次用10%水合氯醛腹腔注射麻醉 (300 mg/kg, 必要时补充注射) 后, 经眼眶采血, 接取5 mL至分离胶管中, 4 ℃, 3 000 r/min离心10 min, 取上层血清, 采用酶联免疫吸附试验 (ELISA法) 进行检测, 操作过程中严格按照试剂盒说明进行。
1.4.2 颈动脉脂联素检测
每组大鼠于复制模型前后随机抽取3只, 分别经水合氯醛麻醉, 迅速剥离颈总动脉, 用止血钳把周围肌肉组织和神经组织剥离后穿双线, 远心端结扎, 近心端用动脉夹阻断血流, 剪下颈总动脉, 纵向切开后, 于生理盐水中冲洗, 放入4%多聚甲醛中, 固定6 h～8 h, 石蜡包埋。做3 μm厚连续切片, 进行免疫组织化学染色。
脂联素免疫组织化学检测: 常规脱蜡至水, 抗原修复, 封闭内源性过氧化物酶。 苏木素复染后, 自来水返蓝。 脱水, 透明, 中性树胶封片, 显微镜下观察。设置阴性对照, 采用PBS代替一抗、二抗及SABC, 结果为阴性。
1.5 统计学处理
采用SPSS13.0软件。计量资料以均数±标准差
2 结果
2.1 两组大鼠血浆脂联素水平变化
缺血再灌注造模后, 血浆脂联素水平较造模前降低, 有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。
2.2 两组大鼠颈动脉脂联素的表达
免疫组化图片背景为紫蓝色, 脂联素阳性表达在血管壁, 呈棕褐色。血管壁纤维和内皮细胞着色。免疫组化结果显示:造模后血管壁脂联素的阳性表达强度 (2+) 弱于造模前 (3+) 。
3 讨论
脂联素是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子, 由Scherer等[3]于1995年首先从鼠的脂肪细胞分离出来, 1999年Arita等[4]将其命名为脂联素。近年来研究发现, 脂联素不仅与肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病密切相关, 还在动脉粥样硬化过程中起着重要的调控作用。与心脑血管病等多种疾病密切相关。
低脂联素水平参与脑梗死的发病过程, 与颈动脉粥样硬化有一定关系, 尤其与不稳定斑块形成密切相关。本实验结果表明, 急性缺血再灌注大鼠造模后血浆脂联素水平和颈动脉内膜脂联素表达均低于造模前 (P<0.05) 。脂联素可能通过以下几个方面预防缺血性脑卒中的发生:抑制单核细胞黏附血管内皮细胞;抑制血管平滑肌增殖迁移[5];抑制巨噬细胞向泡沫细胞的转化[6];增加脂肪酸氧化, 降低三酰甘油、游离脂肪酸含量[7], 改善脂肪代谢, 发挥抗动脉粥样硬化作用。因此, 脂联素有可能成为脑梗死的风险预测因子, 为防治缺血性脑卒中提供理论依据, 针对血浆脂联素水平降低的治疗可能有助于降低脑梗死的预防和治疗。
参考文献
[1]李志.针刺对急性脑梗死合并血脂异常患者血脂水平的影响[J].中医药学刊, 2006, 24 (4) :744.
[2]顾国军, 黄振兴, 陶凯忠, 等.HBO-1对内皮素-1诱导的大鼠局灶性脑缺血模型的疗效观察[J].第二军医大学学报, 2006, 27 (10) :1134-1137.
[3]Scherer PE, Williams S, Fogliano M, et al.A novel serum protein similar to Clq, produce dexclusively in adipocytes[J].J Biol Chem, l995, 270 (45) :26746-26749.
[4]Arita Y, Kihara S, Ouchi N, et al.Paradoxical decrease of an adi-pose specific protein radiponectin, in obesity[J].Biochem Biophys Res Commun, 1999, 257 (1) :79-83.
[5]Arita Y, Kiahara S, Ouchi N, et al.Adipocyte-derived plasma pro-tein adponectin acts as a platelet-derived growth factor-BB binding protein and regulates growth factor-induced common postreceptor signal in vascular smooth muscle cell[J].Circulation, 2008, 105 (24) :2893-2898.
[6]Yokota T, Oritani K, Tckahashi I, et al.A diponeetin, a new mem-ber of the family of soluble defense collagens, negatively regulates the growth of myelomonocytic progenitors and the functions of macrophages[J].Blood, 2007, 96 (5) :1723-1732.
组织灌注 篇8
本实验采用改良线栓法[3]建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型, 观察活血开窍法对脑损伤的保护作用及对脑组织谷氨酸 (Glu) 、天门冬氨酸 (Asp) 含量的影响, 以期探讨其治疗缺血性脑血管病的可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
清洁级Wistar雄性大鼠, 体重280 g～350 g, 鼠龄4个月。由广西医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号:SCXK桂2003-0003, 使用许可证号:SYXK桂2003-0005。
1.2 主要试剂和药品
醒脑通脉胶囊由广西中医学院第一附属医院制剂室制备, 按一定比例制成胶囊, 每克含生药15 g;尼莫地平由山东新华制药股份有限公司提供 (国药准字H10910080, 产品批号0507132) , 每片20 mg;戊巴比妥钠:中国医药 (集团) 上海化学试剂公司, 批号:F20020915, SCRC69020180。氨基酸标准品、其他试剂皆为国产分析纯试剂, 由广西分析测试研究中心 (中国实验室国家认可委员会认可实验室) 有机化学分析室提供。
1.3 主要实验仪器
AR2140型电子分析天平, 上海奥豪斯生产;5804R冷冻高速离心机, 德国Centrifuge;L-8800 全自动氨基酸分析仪, 日本日立公司。手术器械:手术刀、手术剪、眼科剪、眼科镊、手术镊、止血钳、持针钳、动脉夹、三棱缝针、医用丝线 (黑色0号, 上海浦东金环医疗用品有限公司, 批号:12E081) 、3-3.5号日本DUEL进口渔线。
1.4 方法
1.4.1 模型的制备及分组、给药
25只大鼠随机分为5组, 每组5只, 即正常组、脑缺血再灌注组、尼莫地平阳性对照组、醒脑通脉组 (大小剂量共2组) , 其中除了正常组以外均制作成脑缺血2 h再灌注48 h的模型。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞的局灶性脑缺血再灌注模型。正常组不造模;其余4组分别用2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉, 麻醉大鼠仰卧固定, 颈部正中切口, 钝性分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉, 仔细分离避免损伤迷走神经, 并结扎颈总动脉、颈外动脉。在颈总动脉分叉处剪一小口, 以尼龙线从颈总动脉分叉处插入, 进入颈内动脉, 当线栓进入约1.8 cm, 有阻力时表明线栓已达大脑中动脉起始端, 并阻断大脑中动脉起始端及所有侧支血流循环, 导致大脑中动脉局灶缺血, 分别栓塞2 h后, 轻轻回拉插线至颈总动脉切口处, 制成再灌注模型, 术后动物苏醒后即行神经功能缺失体征评分以评定模型成功与否。神经功能缺失体征评分:采用Longa等[4]的方法在术后进行5级制评分。评分标准:1级 (0分) 无神经缺损体征;2级 (1分) 不能充分屈曲对侧前爪;3级 (2分) 向麻痹侧转;4级 (3分) 向麻痹侧倾倒;5级 (4分) 不能自发行走, 意识丧失。2级 (1分) ～4级 (3分) 为成功模型, 计入实验动物数。醒脑通脉胶囊治疗组用蒸馏水把醒脑通脉胶囊备制成混悬液, 按每次250 mg/kg (低剂量组) , 1 000 mg/kg (高剂量组) 给药, 分别在造模前给药2 d, 每日1次, 在脑缺血2 h再灌注48 h后灌胃1次, 脑缺血再灌注模型组给予生理盐水灌胃, 阳性对照组给予尼莫地平灌胃, 按每次2 mg/kg给药, 给药时间同醒脑通脉胶囊治疗组。在脑缺血2 h再灌注48 h后灌胃1次后, 约1 h处死大鼠, 取脑检测。
1.4.2 检测方法
将大鼠断头取脑, 去掉嗅球、小脑及低位脑干, 快速取右侧大脑半球额顶叶皮层大脑组织约0.3 g, 加200 μL PBS在冰台上磨成匀浆, 吸出匀浆液, 在18 000 r/min、4 ℃条件下离心20 min, 取上清液加磺基水杨酸1∶1沉淀, 用孔径0.45 μm水系滤膜过滤, 取25 μL过滤后上清液直接上机检测氨基酸含量 (高效液相色谱法) 。
1.5 统计学处理
采用SPSS13.0版软件进行处理。计量资料以均数±标准差
2 结 果
与正常组大鼠比较, 模型组大鼠脑组织中Glu、Asp含量显著升高 (P<0.01) ;与模型组大鼠比较, 醒脑通脉大、小剂量组脑组织中Glu、Asp含量显著降低;与尼莫地平组比较, 醒脑通脉大剂量组脑组织中Glu、Asp含量显著降低 (P<0.05或P<0.01) 。说明醒脑通脉大、小剂量组均可降低脑组织中Glu、Asp的含量, 且具有量效关系。详见表1。
3 讨 论
脑缺血损伤级联反应分为4个阶段, 即兴奋性毒性、梗死灶周围去极化、炎症和细胞程序性死亡, 在缺血后不同的时间分别出现, 各阶段互有重叠并非孤立存在[5]。兴奋性毒性是指因兴奋性氨基酸受体激活引起的神经元细胞死亡[6]。级联反应都以兴奋性毒性开始, 兴奋性毒性也可能是所有下游事件的触发者, 可被看做是最重要的一个。由于其发生的时间极短 (数分钟至数小时) , 治疗比较困难。脑缺血时, 缺血神经元大量释放的EAA尤其是Glu对神经元的损伤起关键作用。由于EAA使神经元持续去极化, 增加了神经元内Glu等的大量释放, 又因脑缺血后三磷腺苷 (ATP) 降解, 依赖能量而重吸收Glu的机制衰竭, 影响Glu摄取功能, 甚至出现Glu向细胞外液转移, 如此恶性循环, 突触间隙持续高浓度的Glu就引起兴奋性神经毒性[7]。故拮抗EAA兴奋性毒性, 包括抑制其过度释放, 促进其再摄取, 以及抑制其受体活性, 对脑缺血损伤具有防治作用。
有些活血开窍中药能影响级联反应中的某一阶段, 同时还改善血液循环。马丽焱等[8]报告葛根总黄酮、三七总皂苷、氧化苦参碱、小檗碱可增加脑局部血流量。对培养的神经细胞, 三七总皂苷能拮抗谷氨酸介导的兴奋性毒性。三七总皂甙直接保护脑细胞、改善组织血液循环是其作用的基础。醒脑通脉胶囊为活血开窍剂, 功用活血化瘀祛痰, 醒脑开窍通络。三七及其主要成分具有收缩血管, 促进凝血作用;能抑制血小板聚集, 降低血液黏度, 具有活血作用;能减轻局部脑缺血后脑水肿, 缩小梗死范围, 因而具有抗脑缺血作用;现代药理研究表明石菖蒲可以有效抑制脑缺血再灌注后脑中Glu、Asp及γ一氨基丁酸 (GABA) 含量的异常升高, 从而减轻上述物质在脑缺血-再灌注时对神经元的损害, 进而起到脑保护的作用[9]。
本研究表明, 缺血2 h再灌注48 h后, 脑组织Glu和Asp含量明显增加, 表明EAA的兴奋毒性参与了脑缺血后早期细胞损伤和迟发性神经损伤的发生过程。在本研究中, 活血开窍法之醒脑通脉胶囊治疗组与缺血再灌注模型对照组比较, 醒脑通脉胶囊能明显降低脑组织Glu和Asp含量, 与缺血再灌注模型对照组比较差异有统计学意义 (P<0.01) , 且具有量效关系。以上结果说明, 活血开窍法可对抗缺血性脑损伤, 防止再灌注时EAA的升高。提示活血开窍法抗缺血性脑损伤的作用机制可能与其对抗脑缺血再灌注后EAA的升高有关。
参考文献
[1]赵刚, 李树清.兴奋性氨基酸毒性与缺血性脑损伤[J].国外医学:脑血管疾病分册, 2004, 12 (6) :426.
[2]刘泰.自拟醒脑通脉胶囊治疗急性脑血栓的研究[J].临床荟萃, 2000, 15 (19) :867.868.
[3]罗勇, 董为伟.Wistar大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究[J].重庆医科大学学报, 2002, 27 (1) :124.
[4]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversible middle cere.bral artery:Occlusion without cranietomyin rats[J].Stroke, 1989, 20 (1) :84.91.
[5]廖维靖, Frank W, Ulrich D.脑缺血损伤的病理生理机制.损伤级联反应[J].国外医学:脑血管疾病分册, 1998, 6 (4) :197.202.
[6]Beal MF.Mechanisms of excitotoxicity in neurologic diseases[J].FASEB J, 1992, 6 (15) :3338.3344.
[7]陈维洲, 芮耀诚.脑血管疾病基础与临床研究[M].济南:山东科技出版社, 1993:12.25.
[8]马丽焱, 肖培根, 郭宝林, 等.几种中药成分对脑组织的保护作用[J].中国中药杂志, 1999, 24 (4) :238.239.