肾脏灌注

肾脏灌注（通用4篇）

肾脏灌注 篇1

灌注是血流通过毛细血管网将携带的氧和营养物质输送给组织细胞的重要功能。利用影像学技术进行灌注成像可测量局部组织的血液灌注, 了解其血流动力学及功能变化, 对临床诊断和治疗均有重要参考价值[1]。

1 肾脏CT灌注成像的理论基础

CT灌注成像的理论基础为核医学的放射性示踪剂稀释原理和中心容积定律 (central volume principle) 即BF=BV/MTT[2] (BF:blood flow血流量, BV:blood volume血容量, MTT:mean transit time对比剂平均通过时间) 。Miles等认为[3,4], 碘对比剂经静脉注入后具有与放射性示踪剂相同的药物动力学特性, 因此放射性核素的示踪原理可用于动态CT的研究。Hamberg等[5]认为使用等渗性碘对比剂的动态CT扫描基本能满足使用示踪剂观察组织灌注的条件。

CT灌注成像的方法是在静脉团注碘对比剂后对选定层面进行同层动态CT扫描, 以获得该层面内每一像素的时间-密度曲线 (time-density curve, TDC) , 该曲线反映了碘对比剂在该器官中浓度的变化, 间接反映了组织器官灌注量的变化。根据该曲线利用不同的数学模型计算出BF, BV, MTT, TTP (time to peak对比剂峰值时间) , PS (capillary permeability surface area product表面通透性) 等灌注参数, 对参数进行图像重建得到直观的伪彩色功能图, 以此来评价组织器官的灌注状态。

肾脏体积较大, 血管丰富, 血流量大, 血供不像肝脏那样复杂, 而且是实质性对称性脏器, 受呼吸运动影响较小, 很适合CT灌注成像。

2 肾脏CT灌注成像方法

2.1 扫描方法

先行常规肾脏平扫。然后选定灌注扫描的层面, 通常选择病灶最大的层面。灌注扫描模式为同层连续动态扫描, MSCT为固定多层连续动态扫描。于注射碘对比剂延迟5 s后每隔1 s扫描一次, 共扫描50 s。扫描过程中要求患者屏气, 即身体保持静止状态。对比剂注入方式选择经肘前静脉团注对比剂, 总剂量不应少于50 m L, 碘浓度多采用300 g/L。采用不同的数学模型进行灌注研究, 其对比剂注射速率不同, 非去卷积模型方法的对比剂注射速率需达到10 m L/s, 甚至20 m L/s, 而去卷积模型方法的对比剂注射速率可降至3~5 m L/s。

2.2 图像后处理

使用Perfusion CT或Functional CT专用软件, 不同的CT机型附带的灌注成像软件功能有所不同, 对所得图像进行后处理。感兴趣区 (ROI) 的选择很重要, 所以要仔细划定ROI, 既要避开血管, 又要与组织器官的周边部分有一定的距离以减少部分容积效应的影响;另外ROI面积要大以减少光子噪声, 一般要求50 mm2左右或2~6个像素。对所得图像进行后处理, 可进行阈值定义, 去除周围骨、脂肪等组织的影响, 可选择-200~120 HU。分析所有动态图像, 得到BF, BV, MTT, TTP, PS等灌注参数及直观的伪彩色功能图。在灌注图上可分别测量ROI血流量和达到峰值的时间等, 同时进行定量、半定量和数据统计分析等。

2.3 肾脏CT灌注参数的测定

根据TDC利用不同的数学模型可以计算出BF, BV, MTT, TTP, PS等灌注参数。各项灌注参数的意义是, BF指在单位时间内流经一定量组织血管结构的血流量 (m L/min/mL) ;BV指存在于一定量组织血管结构内的血容量 (m L/g) ;MTT是指血液流经血管结构 (包括动脉、毛细血管、静脉窦、静脉) 时, 所经过的路径不同, 其通过时间也不同, 因此用平均通过时间表示, 主要反映对比剂通过毛细血管的时间 (s) ;TTP指TDC上从对比剂开始出现到对比剂达峰值的时间 (s) 。PS是对比剂由毛细血管内皮进入细胞间隙的单向传输速率即表面通透性。

3 肾脏MS CT灌注成像研究的现状

3.1 正常肾脏MSCT灌注成像的研究

正常肾脏的TDC具有一陡直的上升段, 波峰高。研究[6]表明, 正常人两侧肾脏皮质或髓质的BF, BV, MTT, PS及TTP无显著性差异, 双侧具有可比性;但同侧肾脏皮质的BF, BV, PS及TTP数值明显高于髓质 (P<0.05) , 而MTT变化不明显;因为肾皮质大部分由肾小球组成, 血管分布密集, 血流丰富, 而肾髓质主要由肾小管组成, 血管分布较少所致。

3.2 肾脏占位性病变MSCT灌注成像的研究

3.2.1 肾细胞癌 (RCC) 与正常肾脏MSCT灌注成像的比较

多项研究[7,8,9]均表明肾细胞癌的BF, BV, PS值明显低于正常肾皮质, 差异有统计学意义。但MTT的测定结果有分歧, 叶慧等[8]研究发现肾细胞癌的MTT值小于正常肾皮质, 作者推测系肿瘤内新生血管杂乱无章及存在大量动-静脉短路所致。而赵金坤等[9]研究发现肾细胞癌的MTT值高于正常肾皮质, 作者推测原因可能为正常肾皮质内毛细血管丰富, 排列有序, 走行规则, 血液流动如常, 而肾细胞癌的肿瘤血管虽然丰富, 但排列紊乱、迂曲。

3.2.2 CT灌注成像鉴别诊断的价值

叶慧等[8]研究发现肾盂癌的BF, BV和PS值明显低于肾细胞癌, 两者之间差异有极显著性意义 (P<0.01) , 但两者之间的MTT值差异无显著性意义 (P>0.05) 。任方远等[10]研究发现肾细胞癌的血流量、血容量、无血管血流量 (flow without vessels) 及组织强化峰值 (peak enhancement) 高于或大于良性肾肿瘤, 而灌注起始时间小于良性肾脏肿瘤, 且均有统计学意义。

3.2.3 CT灌注成像在确定肾细胞癌分级、分期的价值

研究发现多数肿瘤的微血管密度 (MVD) 与肿瘤的分级、转移、复发及预后相关, 认为它们是反映恶性肿瘤生物学行为的重要指标。一般将肿瘤的MVD作为肿瘤血管生成的标志。肿瘤血管的结构和功能状况与肿瘤组织BF, BV及MTT值密切相关, 而这恰恰是CT灌注成像反映肿瘤血管生成活性的基础[11]。

赵金坤等[9]研究发现, 肾细胞癌CT灌注的BF值和BV值与其MVD计数呈正相关, 而MTT值与其MVD计数呈负相关。可能的原因是在不考虑血液流率的情况下, 单位体积内微血管数量越多, 其血流量亦越大。同样, MVD越大, 单位体积内血管成分与非血管成分的比重越大, 因而单位体积内BV必然相应较高;此外, 肿瘤血管内皮间隙大, 基底膜不完整、血管壁薄且缺乏平滑肌, 导致对比剂在CT灌注成像期间发生外渗, 肿瘤血管越多, 滞留在间质中的血液越多, 此亦是MVD越大单位体积内BV越大的原因。肾细胞癌的MVD计数与MTT值呈负相关, 即MVD计数越高MTT值越短, 这是因为随着MVD的增高, RCC单位体积内肿瘤血管随之增多, 其内直接通路 (动静脉短路) 亦增多, 导致MTT缩短。

孙建男等[7]研究发现, 经病理证实PS值较高的部位即是肿瘤恶性程度较高的区域, 故认为BF和PS值对RCC的评价较有意义, 能准确反映肿瘤血管的生成情况和血流动力学变化特征。叶慧等[8]认为高级别与低级别的RCC相比, 其灌注值升高, 在高级别 (Ⅲ级) RCC中, MTT明显低于正常肾皮质, 推测系肿瘤内新生血管杂乱无章及存在大量动-静脉短路所致。此外, 许楠等[12]研究报道, RCC早期肿瘤最高密度点表面通透性较中晚期肿瘤高, 早期肿瘤最高密度点平均通过时间较中晚期肿瘤短。作者认为早期肿瘤内新生血管具有异常的内皮细胞、壁细胞和基底膜, 内皮细胞排列紊乱形态不规则, 细胞间连接不紧密, 甚至局部开放, 基底膜也不完整, 因此肿瘤新生血管早期渗透性显著增高。肿瘤后期产生大量新生血管, 这些血管迂曲蜿蜒, 分支不规则, 分布不均, 高灌注区与低灌注区交错分布, 这些异常的分布分支方式削弱了肿瘤灌注速度和其通透性。

3.3 CT灌注成像在缺血性肾病的诊断价值

正常肾脏灌注的TDC具有一波峰较高的陡直上升段, 双侧肾脏的TDC基本相似, 双侧肾脏皮质或髓质灌注相近, 达峰时间和强化峰值对称而且相似, 标准差小。而缺血性肾病的TDC初始上升时间向后推移, 上升段明显平缓, 波峰出现延迟, 波峰高度明显降低。

肾皮质血流灌注量的测定是判断肾脏血流的直接指标。在很多病理生理情况下, 肾皮质和肾髓质的血流都会出现重新分布。CT灌注成像对慢性肾小球肾炎、肾动脉硬化、糖尿病肾病的研究也有很大空间。

4 CT灌注成像的新进展

随着MSCT及灌注软件的不断升级, 灌注扫描的范围不断扩大。既往单层螺旋CT只能进行单层面的灌注扫描, 而64层螺旋CT灌注扫描的范围可扩大到40 mm, 覆盖范围扩大;GE公司推出的VCT XT采用容积穿梭模式, 使灌注扫描的覆盖范围达到80 mm;此外, 在不影响灌注分析结果可靠性的前提下, 容积穿梭模式通过增加扫描间隔时间至3 s (以往为0.5 s或1 s) , 使同样扫描范围的放射剂量只有原来的1/3[13]。

肾脏灌注 篇2

关键词：超声动态评估,组织灌注技术,糖尿病患者

近年来,随着人们生活习惯和饮食结构的不断变化,我国糖尿病的发病人数有逐年上升的趋势。糖尿病可能会引发多种并发疾病,其中最为严重的并发症就是糖尿病肾脏病变,为提高该疾病的临床治疗效率,改善糖尿病肾病患者的生存质量水平。该院对超声动态评估组织灌注技术(dynamic sonographic tissue perfusion measurement,DTPM)改善糖尿病患者肾脏皮质血流灌注的具体效果进行了全面的研究,希望能够为今后的临床治疗提供科学的指导依据,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

首选选择2013年3月—2015年9月期间该院收治的60例2型糖尿病患者作为观察组研究对象。按照其肾小球的过滤(glomerular fitration rate,GFR)情况进行分组:A组(正常),GRT≥90,共20例,包括男性12例、女性8例,平均年龄为(44.6±6.7)岁;B组(下降),GFR处于30~60之间,共40例,包括男性23例、女性17例。该组患者均符合糖尿病肾病的临床诊断标准,为保证结果准确性,该组研究排除了其它原因所导致的肾脏功能病变、身体其他重大器官存在病变、妊娠及哺乳期妇女。

另外选择30名正常者作为对照组研究对象,其中包括男性18名、女性12名,平均年龄为(45.6±7.8)岁。该组入选对象不存在肾功能异常的情况,各项检查的生化检验结果均为正常。与观察组患者的年龄、性别构成比较差异无统计学意义(P>0.05),可行比较。

1.2 方法

该组研究采用北京东方迈润医疗器械有限公司提供的GE VOLUSON E10彩超仪器,并使用Pixel Flux软件对图像进行进一步的分析与研究。首先将仪器与心电图连接,之后需使患者保持侧卧位,并分别进行肾脏检查,检查过程中的相关操纵均需要严格按照相关的指示完成操作,确保得到的图像清晰准确。图像完成储存之后需要使用Pixel Flux软件对图像进行分析和处理,通过自动追踪患者的心动周期变化,进一步得到患者的平均灌注强度、平均血流速度、组织阻力指数。

1.3 统计方法

研究行SPSS 19.0完成数据分析,采用均数±平均数(±s)表示研究中所得到的相关数据,采用t值进行检验,若得到P<0.05,则可认为差异有统计学意义。

2 结果

观察组A组与对照组相比较,平均灌注强度、平均血流速度均差异有统计学意义(P<0.05),但是组织阻力指数差异无统计学意义(P>0.05);观察组B组与对照与患者相互比较,平均灌注强度、平均血流速度、组织阻力指数的统计学差异P均小于0.05。差异有统计学意义。具体情况见表1。

3 讨论

目前,临床中关于糖尿病肾病的具体发病机制和原因尚未完全明确,一般认为其发病原因与以下几方面因素相关:(1)遗传因素;(2)高血压;(3)肾脏血流动力学异常;(4)血糖升高所导致的代谢异常;(5)血管活性物质代谢异常[1]。

相关研究证明,肾脏血流动力学指标异常所导致糖尿病肾病在临床中具有较高的发病率,其主要表现为患者的肾小球高灌注和高滤过,肾血流量和肾小球滤过率(GFR)升高,并且如果在此期间患者的蛋白摄入含量有所升高,那么这些指标升高的情况将会比正常状态下更加显著[2,3]。

因此在该组研究过程中,重点将不同组别参数的指标情况作为评价的重要标准。超声动态评估组织灌注技术的主要特点在于其可以对于ROI(肾皮质区域)内的各项血流动力指标据悉宁定量的评价。在进行检查的过程中,可以将患者的各项指标情况通过色彩加以表示,并通过关注参数以及相关的曲线图进一步反映患者的审批制血流关注情况。从最终的检查结果中可以发现,患者的各项血流参数指标水平与其肾小球过滤率存在着密切的关系,观察组A组患者的肾小球过滤率与常人基本无异,可以看到该组患者与对照组患者的组织阻力指数存在着较为明显的差异。而观察组B组患者的肾小球过滤率明显低于正常者,因此其各项受检指标情况均与对照组患者存在着明显的差异,P<0.05。这一结果显示,超声动态评估组织灌注技术可以对于患者ROI内的血流参数指标的评估水平较为准确,在临床中可以为相关的医疗研究人员提供更加科学、充分的治疗指导依据。

4 结语

综上所述,超声动态评估组织灌注技术可以更加准确的评价ROI内的血流参数指标,因此糖尿病患者接受超声动态检查可以明确其肾脏功能情况,这对于治疗方案的尽早确定以及患者的生活质量水平的改善均具有重要的意义。因此建议在临床检查过程中广泛的应用这项技术。

参考文献

[1]李敏州,高彦彬,马鸣飞,等.糖尿病肾病发病机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(22):344-348.

[2]王文娟,郭燕,王丽琴,等.正常人肾脏磁共振扩散张量成像及可重复性[J].中国医学影像技术,2012,28(11):2064-2067.

肾脏灌注 篇3

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

8~12周健康雄性SD大鼠32只, 体质量200~250 g (湖南斯莱克景达实验动物有限公司) , 异氟醚 (Minrad Inc, 美国) , 诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS) 试剂盒、考马斯亮兰试剂盒 (南京建成生物医学工程研究所) , 麻醉机及异氟醚挥发罐 (Dr覿ger Fabius, 德国) , 分光光度计 (上海光学仪器厂) , 呼末气体监测仪 (Datex-ohmeda, 芬兰) , 血气分析仪 (GEM Premier 3000, 美国)

1.2 模型制备

参照文献报道的方法制备大鼠肾缺血再灌注损伤的模型[7]。实验动物麻醉深度达到手术要求后, 将实验动物固定于手术台暖光灯下, 常规备皮、消毒铺单, 术中测肛温, 保持体温维持在36~37℃左右。上述操作成功后, 用盐水纱布覆盖切口, 腹部正中切口进入腹腔, 小心分离出双侧肾蒂, 切除右侧肾, 用无损伤微动脉夹夹闭左侧肾蒂45 min后恢复灌注, 并观察肾脏颜色变化, 确定血流5 min之内恢复, 再灌注3 h后关闭腹腔, 操作过程中注意保护左侧输尿管。逐层缝合腹壁, 待其自然苏醒后置于相对清洁、恒温环境中, 标准饲料喂养, 自由饮水。24 h后处死大鼠, 心脏取血, 3 500 r/min离心后取上清液于-20℃冰箱中保存待测, 打开腹腔留取肾组织标本, 将肾脏标本沿正中线分割成左右两部分, 一部分标本取材后放入10%福尔马林溶液中浸泡送检, 另一部分用滤纸吸干表面血渍后于-70℃冰箱中保存待测。所有标本的取材均取自不同大鼠的相同部位以便结果更具有可比性。

1.3 动物选择及分组

8~12周健康雄性SD大鼠32只, 随机分为4组, 每组8只。A组 (假手术组) :戊巴比妥那麻醉后开腹, 只切除右肾, 左肾不处理, 45 min后关腹, 放置3 h, 饲养24 h后取标本。B组 (异氟醚组) :在1.0MAC (浓度为1.2%) 的异氟醚麻醉下开腹, 只切除右肾, 左肾不处理, 45 min后关腹, 术后持续吸入相同浓度的异氟醚3 h, 饲养24 h后取标本。C组 (缺血再灌注组) :戊巴比妥那麻醉后开腹, 接受右肾切除术, 阻断左肾动脉45 min, 开放肾动脉后关腹, 再灌注3 h, 饲养24 h后取标本。D组 (异氟醚缺血再灌注组) :在1.0MAC的异氟醚麻醉下开腹, 接受右肾切除术, 阻断左肾动脉45 min, 开放肾动脉后关腹, 缺血和再灌注期间继续吸入相同浓度的异氟醚3 h, 饲养24 h后取标本。

1.4 检测指标及实验标本的采集

1.4.1 血气分析检测

所有实验动物均于缺血前和再灌注开始后抽取股动脉血做血气分析, 观察动脉血二氧化碳分压 (Pa CO2) 的变化, 作为呼吸功能的参考依据。

1.4.2 血浆肌酐 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量检测

试验结束并继续存活24 h后, 所有大鼠均心脏抽取静脉血5 m L, 3 000 r/min离心10 min后取上清液于-20℃保存。全自动生化分析仪测定血浆肌酐 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量。

1.4.3 肾组织中i NOS活性检测

取左肾下极组织0.2 g, 做肾组织匀浆, 按试剂盒说明操作并测定。计算方法如下:

(U/mgprot) ;U/mgprot为酶活力单位每毫克蛋白肾组织蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。计算方法如下:

1.4.4 肾组织的病理学检查

将实验动物处死以后, 取出的肾脏标本沿正中线分割成左右两部分, 其中一部分标本取材后放入10%的福尔马林溶液中固定, 送病理科做病理组织切片, 观察光镜下的肾组织病理变化。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 多组均数比较用单因素方差分析, 组间比较采用t检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血气分析结果

术中分别在缺血前和再灌注开始后两个时间点抽取股动脉血做血气分析测量动脉血Pa CO2值, B、C、D组与A组比较差异无统计学意义, P>0.05, 见表1。

注:覮B、C和D组与A组比较差异无统计学意义, P>0.05

2.2 血浆肌酐 (Cr) 、尿素氮 (BUN) 含量变化

2.2.1 血浆肌酐结果

C、D组分别与A组比较, 血浆肌酐含量升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;D组与C组比较, D组血浆肌酐值较C组值降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

2.2.2 血浆尿素氮结果

C、D组分别与A组比较, 血浆肌酐含量升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;D组与C组比较, D组血浆尿素氮值较C组值降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

2.3 肾组织i NOS活性

肾组织i NOS活性结果:C、D组分别与A组比较, 肾组织i NOS活性升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;D组与C组比较, D组i NOS活性较C组降低, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

注:1) 与A组比较, P<0.05;2) D组与C组相比, P<0.05

2.5 肾组织形态学改变

肾组织形态学改变 (HE染色) :A、B两组肾小管排列整齐, 肾间质无充血、水肿及炎性细胞浸润, 肾组织未见明显的病理学改变;C组肾小管上皮细胞呈空泡变形和坏死, 大量肾小管上皮细胞肿胀, 肾小管内可见蛋白管型及脱落坏死的细胞, 肾间质充血、水肿, 局灶炎性细胞浸润;D组肾小管细胞水肿, 仅少部分肾小管上皮细胞坏死脱落, 病理改变明显轻于C组。见附图。

A:假手术组;B:异氟醚组;C:缺血再灌注组;D:异氟醚醚缺血再灌注组

3 讨论

在实验过程中术中分别在缺血前和再灌注开始后两个时间点抽取股动脉血做血气分析测量动脉血Pa CO2值, 结果发现四组都在正常值之内且无明显差异, 表明实验中所有的大鼠都没有发生二氧化碳蓄积, 说明术中实验动物的呼吸也未受到麻醉药的明显影响, 且国外有研究发现异氟醚在动物缺血再灌注损伤模型中对动物的呼吸也不会造成明显的影响[8]。本实验结果显示缺血再灌注组 (C组) 大鼠的血浆肌酐 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量较假手术组 (A组) 明显升高, 且肾组病理切片显示缺血再灌注组 (C组) 的肾组织损伤明显, 提示模型制备成功。异氟醚缺血再灌注组 (D组) 大鼠血浆 (Cr) 和尿素氮 (BUN) 含量较缺血再灌注组 (C组) 明显降低, 病理结果显示肾脏组织的损伤D组轻于C组, 提示异氟醚对大鼠肾脏缺血再灌注损伤有一定的保护作用。

NO作为一种信号分子, 具有广泛生物活性, 参与肾脏血流动力学调节, 与肾脏缺血再灌注损伤关系密切。NO在一氧化氮合酶 (NOS) 的作用下, 以左旋精氨酸、分子氧为底物合成, 来源于不同NOS的NO会起到不同的生理和病理作用[9]。NOS分为原生型 (c NOS) 和诱生型 (i NOS) , c NOS根据存在的部位分为神经型 (n NOS) 和内皮型 (e NOS) , 其中n NOS主要分布在神经系统, 在肾脏中分布较少, 肾脏内以e NOS为主, 主要分布在肾小管上皮细胞以及血管内皮, 参与调节肾血流及肾小管功能等, i NOS主要来源于组织的巨噬细胞, 参与介导巨噬细胞的细胞毒作用, 在肾脏中与肾血管内皮损伤、肾小管功能障碍有密切关系, 肾脏缺血再灌注损伤后, i NOS表达增强, i NOS来源的NO增多, 毒性作用显现, NO可与活性氧自由基反应生成具有细胞毒性的过氧亚硝酸离子 (ONOO-) , 过氧亚硝酸离子可引起细胞膜过氧化, 抑制蛋白质功能, 破坏核酸及染色体, 对组织细胞造成伤害[10], 且有研究发现, 在肾脏缺血再灌注损伤实验中, 当抑制i NOS活性时, 可以减轻肾脏的缺血再灌注损伤[2,3,11,12]。

异氟醚是一种常用的吸入麻醉药, 其缺血再灌注损伤的保护作用在心[13,14,15,16]、脑[17,18,19]、肝[20]、肠[21,22]等器官实验中均有证实, 有研究发现异氟醚与i NOS活性有密切的关系, 当用巨噬细胞或肺组织试验时, 异氟醚可以抑制巨噬细胞表达i NOS, 减少NO的产生, 提高组织的生存能力[23,24,25], 本研究同样发现, 即当肾脏发生缺血再灌注损伤时, 肾脏组织的i NOS活性会升高, 而经异氟醚处理后, 肾脏组织的i NOS活性降低, 血肌酐和尿素氮含量、肾组织病理切片都证实肾脏损伤的会减轻, 说明异氟醚可以通过抑制i NOS活性来减轻肾脏的缺血再灌注损伤。

肾脏灌注 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠24只,体重220～280 g,由武汉大学医学院实验动物中心提供,随机分为3组,假手术组(n=8)、缺血再灌注组(n=8)、姜黄素组(n=8)。NF-κB、β-actin(内参)单克隆抗体购自Santa Cruz公司。姜黄素购自武汉中西仪器大全公司,含量大于90%。

1.2 实验模型的制备

假手术组:行2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(45 mg/kg),500 U肝素钠腹腔注射,游离双侧肾脏,切除右肾,缝合腹壁。缺血再灌注组:实验过程与假手术组相同,但在右肾切除、左肾游离后进行左肾缺血,左肾动、静脉用血管钳夹闭45 min然后恢复灌流。姜黄素组:于左肾动脉夹闭前30 min尾静脉注射姜黄素注射液(20 mg/kg),余同缺血再灌注组。

1.3 标本采集与处理

分别于组织再灌注24 h后静脉采血2 m L检测肾功能指标血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平。后处死各组大鼠,留取左肾组织标本,一部分速置-80℃冰箱中保存待测,另一部分用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋后制备切片。

1.4 观察指标

1.4.1 Cr、BUN浓度

将血液标本注入试管中,常温3000 r/min、离心10 min后,用全自动生化分析仪(奥林巴斯公司Au2700)测定血清Cr、BUN浓度。

1.4.2 组织学检查

固定的肾组织制备石蜡切片后,行HE染色,后在奥林巴斯400倍光镜下观察肾组织的病理改变。1.4.3 Western blotting检测NF-κB表达从液氮罐中取出保存后的肾组织,二辛可宁酸(BCA)法检测蛋白浓度,取40μg上样,用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,电转到硝酸纤维素膜(NC)膜上,使用5%的脱脂牛奶封闭2 h,后加入NF-κB单克隆抗体,按1∶1000稀释,4℃摇床过夜。之后与辣根过氧化物酶结合的二抗结合,按1∶2000稀释,室温孵育1 h,TBST洗涤后,增强化学发光法(ECL)法显色后照相。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析,计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析,比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Cr和BUN水平比较

与假手术组比较,缺血再灌注组和姜黄素组的肾功能指标Cr和BUN明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。姜黄素组的Cr和BUN水平与缺血再灌注组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

2.2 肾组织病理学改变

假手术组:光镜下见肾小管上皮细胞无明显改变,间质无明显充血水肿,也无炎性细胞浸润。缺血再灌注组:光镜下可见肾小管上皮细胞明显变性坏死,管腔扩张,管腔内有脱落坏死细胞。姜黄素组:光镜下可见部分近曲小管细胞轻度水肿样变性,偶见管型。各组肾组织病理学改变见图2。

2.3 肾组织中NF-κB蛋白变化

Western blotting结果显示,缺血再灌注组和姜黄素组的NF-κB水平明显高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05)。姜黄素组的NF-κB表达水平与缺血再灌注组比较显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

3 讨论

Sen和Baltimore于1986年从B淋巴细胞核提抽物中检测到一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异结合的核蛋白因子,称为NF-κB[3]。此后,研究者发现NF-κB是一类广泛存在于真核细胞中的核转录因子,许多基因的启动子和增强子上都有NF-κB的结合位点,在机体的免疫反应、炎性反应和细胞增长调控上都发挥一定的作用[4]。正常情况下,NF-κB能与I-κB(核因子κB抑制蛋白)以无活性的二聚体形式存在于许多组织的细胞质中[5],I-κB通过抑制NF-κB进入细胞核而发挥作用。NF-κB在肾脏IRI中发挥着重要作用,其在氧自由基、自介素、缺血等刺激下而激活[6,7],通过一系列细胞信号转导途径活化,活化的NF-κB从胞质转移入细胞核,与相应基因的κB位点结合从而发挥作用[8]。

肾脏IRI是众多复杂机制相互作用的结果,常发生于肾脏移植、保留肾单位手术(NSS)、肾积水、肾动脉狭窄、栓塞性疾病、主动脉搭桥手术、意外或医源性损伤等中,与促炎因子释放、中性粒细胞浸润和氧自由基产生等有关[9]。姜黄素是从姜黄根茎中提取的一种酚类色素,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理学作用,能够直接或间接的保护机体细胞免受有害因素的损害,维持细胞正常的新陈代谢和生理功能,从而实现保护作用。由于其活性广泛,安全有效,因此极具临床开发前景。近来的国内外研究发现姜黄素对心肌、脑、肾等脏器的IRI均有保护作用[10,11,12],但缺乏对其分子保护机制的深入探讨。为探究姜黄素对肾脏IRI的保护机制,本研究构建了大鼠肾脏IRI模型,观察姜黄素对肾脏IRI的作用,并用Western blotting检测NF-κB的表达。结果表明,在大鼠缺血再灌注前,给予姜黄素治疗,再灌注24 h后,姜黄素组肾功能(Cr和BUN)的水平与缺血再灌注组相比有明显改善,差异有统计学意义,说明姜黄素对肾脏IRI有保护作用。组织病理学检查也显示,缺血再灌注组的肾小管上皮细胞明显变性坏死,管腔扩张,管腔内有脱落坏死细胞,刷状缘脱落明显,间质内有充血水肿及炎性细胞浸润,而姜黄素组的细胞损伤明显轻于缺血再灌注组。Western Blotting结果显示,缺血再灌注组和姜黄素组的NF-κB水平明显高于假手术组,与缺血再灌注组比较,姜黄素组的NF-κB表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。