乙型肝炎病毒X基因（共8篇）
乙型肝炎病毒X基因 篇1
摘要：目的 建立稳定表达乙型肝炎病毒X基因肝细胞株。方法 对含酶切位点Eco RⅠ、HindⅢ的X基因序列进行PCR扩增, 构建HBVx基因质粒 (pc DNA3.1 (+) -HBVx) , 利用转基因技术将X基因转入正常肝细胞构建稳定表达X基因的细胞株。结果 X基因亚克隆入pc DNA3.1 (+) , 有完整的X基因片段, 转入正常肝细胞获得稳定表达X基因的细胞株, 转染C57BL/6正常肝细胞有HBVx m RNA表达, 且C57BL/6/HBVx有HBV蛋白表达。结论 成功构建稳定表达乙型肝炎病毒X基因肝细胞株。
关键词：乙型肝炎病毒X基因,肝细胞,转基因细胞模型,真核表达载体
原发性肝癌 (HCC) 的发生与发展中, 乙型肝炎病毒 (HBV) 是一个重要的因素, 现阶段尚不明确其作用机制, 但是诸多的研究表明, 在HCC的发生发展中HBVx发挥着关键性的作用[1]。为更加深入研究HBVx在HCC中的作用, 并提供生物学模型基础, 本研究试图通过构建HBVx基因质粒 (pc DNA3.1 (+) -HBVx) , 利用转基因技术建立稳定表达乙型肝炎病毒X基因肝细胞株。
1 资料与方法
1.1 实验材料、仪器
1.1.1 实验材料
乙型肝炎病毒DNA阳性乙肝患者血清, 大肠杆菌DH5α, C57BL/6正常肝细胞、pc DNA3.1 (+) 质粒, 酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) 混合液, Eco RⅠ、HindⅢ、d NTP、DNA Maker (100bp) 、T4 DNA连接酶, 质粒DNA小量纯化试剂盒, RNA提取试剂盒, G418, DNA回收试剂盒等。实验所需试剂均从国内上海生工生物工程公司合成购买。
1.1.2 仪器设备
CO2细胞恒温培养箱 (英国Galaxy S) 、超净工作台 (苏州安泰空气技术有限公司) 、实时荧光定量PCR扩增仪 (德国Eppendorf公司) 、高速超离心机 (美国Beckman公司) 、双向电泳仪 (北京生化仪器厂) 、恒温水浴摇床 (天津奥特赛恩斯仪器有限公司) 、LKB测序系统 (Promega公司) 、凝胶成像系统 (Gel Doc1000, 美国Bio Rad公司) 等。
1.2 方法
1.2.1 (pc DNA3.1 (+) -HBVx) HBVx基因质粒构建 (1) 加入rireagent于采集的乙肝病毒DNA阳性患者血清中, 使其裂解, 然后加入抽提液 (酚∶氯仿∶异戊醇) , 完成抽提后, 于样本中加入无水乙醇, 进行HBV-DNA的纯化, 晾干。 (2) 根据Gen Bank所收录的完整HBV Xc DNA序列, 使用Primer Premier5.0进行带酶切位点引物的设计。HBV X全长基因长度为483 bp、β-actin扩增片段长度为304 bp。引物序列为:上游引物;下游引物。 (3) 提取HBs Ag (+) 肝癌组织总RNA。 (4) 采用PCR对X基因扩增, 加入限制性内切酶Eco RⅠ、HindⅢ的酶切位点。 (5) 将PCR产物与pc DNA3.1 (+) 质粒用限制性内切酶Eco RⅠ、HindⅢ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳, 回收基因片段与pc DNA3.1 (+) 质粒片段, 其长度分别约500 bp、5.4 kb, 然后通过T4 DNA连接酶连接, 构建 (pc DNA3.1 (+) -HBVx) 基因质粒。
1.2.2原代培养C57BL/6正常肝细胞。
1.2.3感受态细胞DH5+筛选 pc DNA3.1 (+) -HBVx转化大肠杆菌DH5α, 选取质粒来源于氨苄青霉素抗性克隆, 采用双酶切 (Eco RⅠ、HindⅢ酶切) , 酶切后进行琼脂糖凝胶电泳, 鉴定转化大肠杆菌DH5αDNA中有无目的基因, 并对阳性克隆DNA进行测序。
1.2.4肝细胞转染与筛选 将C57BL/6正常肝细胞2×106个接种在6孔板中, 24 h后采用脂质体Lipofectamine转染, 48 h后G418 500 mg/L筛选阳性克隆, 并设置对照, 筛选阳性克隆并对其再次培养, 采用250 mg/L G418进行筛选, 以获得转基因细胞株C57BL/6/HBVx, 可稳定表达HBVx。
1.2.5 C57BL/6/HBVx转基因肝细胞株鉴定 采用实时RT-PCR对HBV m RNA进行检测, 并采用Westem blot检测HBVx蛋白。
2 结果
2.1 pc DNA3.1 (+) -HBVx重组质粒鉴定
pc DNA3.1 (+) -HBVx重组质粒采用单酶切、双酶切 (Eco RⅠ、HindⅢ) , 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳, 最终获得了目的片段, 大小约500 bp, 结果证实, 目的基因HBVx已经成功克隆到质粒pc DNA3.1 (+) 中。经上海生工生物工程公司测序, pc DNA3.1 (+) -HBVx重组质粒的碱基序列与Gene Bank公布序列完全一致, 这表明HBVx基因为该克隆片段。
2.2 目的基因HBVx克隆
对PCR产物采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳, 500 bp位置可见特异性条带, 达到预计长度。对该特异性片段测序, 成功获得了该目的基因HBVx的全编码序列。
2.3 C57BL/6/HBVx的筛选与鉴定
通过G418筛选, 2周后, 经HBVx基因转染的C57BL/6肝细胞存在阳性克隆, 收集阳性克隆细胞总RNA, 进行RT-PCR扩增, 获得约500 bp HBVx基因片段;同时经Westem杂交检测C57BL/6/HBVx有HBVx蛋白表达。
3 讨论
原发性肝癌 (HCC) 在我国的发病率占到所有恶性肿瘤的第2位, 卫生部资料统计表明, 上世纪90年代以来我国肝癌死亡率已经上升到了20.4/10万, 每年新增肝癌患者超过13万例。当前治疗HCC的方法主要是采用外科切除, 也是疗效最好, 惟一可治愈的方法[2]。尽管肝癌近20年疗效有了显著的提高, 但复发转移十分严重, 对疗效的提高造成阻碍, 大肝癌根治性切除后5年复发率高达60%~70%, 小肝癌也达到了40%~50%[3], 因此寻找肝癌治疗新方法意义重大。
HCC的发病机制复杂, 诸多研究指出, HCC是多种因素、途径与基因参与的综合结果, 而HBV的慢性感染则是HCC发生发展的一个主要因素。X基因编码的X蛋白具有反式激活作用, 参与了基因的转录、细胞的周期、凋亡的调控, 对肿瘤细胞增殖具有刺激作用, 同时可减少肿瘤细胞的凋亡, 让癌基因被激活。诸多研究证实HBVx直接影响着HCC的发生发展[4]。相关研究表明[5], Hep G2细胞经x基因转染后, 绝大多数都是在S期、G0/M期, 这一点也表明x基因对肝癌细胞的增殖具有刺激作用, 并协同c-myc打乱了细胞增殖与凋亡的平衡, 导致细胞发生癌变。
本次研究中, 我们构建了HBVx基因质粒 (pc DNA3.1 (+) -HBVx) , 利用转基因技术将重组质粒携带的目的基因导入C57BL/6正常肝细胞, 筛选获得正常肝细胞株C57BL/6/HBVx, 含有目的基因HBVx, 并经实验证实有HBVx m RNA转录表达, 以及HBVx蛋白表达, 证实成功建立了稳定表达乙肝病毒X基因肝细胞株。本次结果为后续更加深入地研究HBVx在HCC中的作用提供生物学模型基础。
参考文献
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乙型肝炎病毒X基因 篇2
目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定.方法 利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到经同样酶切的.原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定.结果 所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加.纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解.纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应.结论 已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础.
作 者：杨华凤 潘明洁 吕敏 李越希 作者单位：杨华凤,吕敏(南京医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系,南京,210029)
潘明洁,李越希(南京军区军事医学研究所,南京,210002)
乙型肝炎病毒基因变异的探究 篇3
关键词：HBV (乙肝病毒) ,HBV DNA (乙肝病毒基因组) ,变异,耐药性
应用聚合酶链反应 (PCR) 及扩增产物直接测序等分子生物学技术的方法, 可以使人们从分子水平认识病毒及其变异成为可能。机体在感染乙肝病毒 (HBV) 后能够产生活跃的细胞免疫反应, 然而仍有许多HBV感染者不能清除病毒, 成为持续病毒携带者。可引起HBV持续性感染的原因很多, 其中主要原因之一是基因变异。
目前，以鉴定的HBV基因型有A-H 8种，通过对HBV全序列分析发现，在不同基因型之间S区段异质性最大，而型内S区段的异质性最小，在此基础上发展了一系列简单、准确的分型方法，推动了HBV基因型的流行病学及临床相关研究。
HBV基因组又称HBV DNA，由3200碱基对组成，为环状部分双股DNA，分为长的负链（L）和短的正链（S）两股。L链其核苷酸 (nt) 长度为3.2kb有4个开放读码区（S、C、P、X区），分别编码外膜蛋白、核心蛋白、X抗原和DNA多聚酶。它们都可以发生变异, 但发生的频率、类型和意义不同。归纳起来有:点突变 (替换) , 插入, 缺失, 重组, 重复, 重排。其中以点突变最常见, 其次为缺失和插入变异。HBV的变异是较普遍的现象, 可能与其聚合酶缺乏校正功能, 以及HBV承受宿主巨大的免疫压力有关, 变异多发生在具有重要功能的区段内, 可影响HBV的复制、表达及致病性。
目前研究发现，HBV与一般DNA病毒复制方法不同，是由DNA转录为RNA后再反转录为DNA才能复制，因此易发生变异。
一、乙型肝炎病毒S基因变异与临床
S区中有S基因，前S1和前S2基因，分别编码HBV的外衣壳蛋白（HBs Ag, Pre S1与Pre S2抗原，即前S1和前S2抗原）。
若此区基因的变异株 (a抗原) ，血清中虽有抗-HBs而无免疫保护作用，结果HBs Ag与抗-HBs可同时出现于血清中；有试验证明，S基因的突变体可干扰病毒颗粒的组装，导致HBV颗粒分泌下降；实验研究还发现，HBV基因组剪接S基因区产生的大分子蛋白变异体可导致肝细胞空泡化及肝细胞凋亡作用，与HBV感染导致肝细胞直接病变有关。由此可见，S基因的多处变异均可影响HBs Ag的抗原性，导致HBs Ag（-）HBV感染。
二、乙型肝炎病毒C基因变异与临床
C区中有C基因及前C基因，分别编码HBc Ag及HBe Ag。
前C基因含有起始密码子，当前C基因区发生突变时，在1896位的核苷酸鸟嘌呤被腺嘌呤所取代，结果TGG密码子被TAG终止密码子所代替。这时HBV仍有感染性，因此仍可表达HBc Ag而不能表达HBe Ag。在HBV携带者中，1896位核苷酸变异是最常见的变异，它可导致仍有HBV DNA复制，而血清中HBe Ag转换为抗-HBe，掩盖病情（如临床上常见的“大三阳”转变为“小三阳”），误导临床治疗。此外，前C区突变的HBV毒株可引起重症肝炎。
三、乙型肝炎病毒P基因变异与临床
P区最长，编码DNA多聚酶，具有逆转录酶活性。此酶既有以RNA为模板合成DNA的逆转录酶功能，又有催化合成DNA的多聚酶功能，故成为目前研究抑制病毒复制药物的靶子。
P基因变异主要见于长期应用拉米夫定和泛昔洛韦的患者，目前已发现的耐药株中P基因变异是多点位的，但相对集中于P基因酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸（YMDD）区域，不同的核苷类似物耐药株的变异位点不一致，拉米夫定耐药株的P基因变异多位于B区和C区，其中C区YMDD变异最为常见，而泛昔洛韦耐药株的P基因变异多位于B区，两者较少重叠，这对于设计使用不同的核苷类似物有重要的指导意义。核苷类似物需服药一年以上，因此HBV对核苷类似物的耐药是不可避免的，目前体内外实验均证明耐药性的产生与P基因变异有关。随着抗HBV核苷类似物的临床应用，正确认识核苷类似物耐药性，这些问题已成为临床医师关注的焦点。
变异是生物适应环境生存的重要方式，在HBV感染的过程中自然发生或在治疗的诱导下产生变异，变异株影响着抗原的表达，可逃避疫苗免疫，还可引起耐药，改变发病机制和病理过程，HBV基因的变异应引起临床在诊断、治疗、预防、预后等方面的足够重视。
参考文献
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乙型肝炎病毒X基因 篇4
乙型肝炎病毒(hepatitis virus,HBV)的慢性感染是导致肝细胞癌(HCC)发生的主要原因之一,而HBV相关的HCC排名十大癌症之一[1]。目前,全世界HBV慢性感染患者有两亿人,因此,HBV对人类的健康仍然是严重的威胁。尽管HBV相关肝癌的致病机理仍然不清楚,但有证据表明,HBX蛋白在 HCC 的发生和发展过程中有重要的作用[2]。
乙型肝炎病毒含4个编码病毒蛋白的开放读码框(ORF),其中X基因ORF编码HBV X蛋白(HBX),HBX蛋白是一种多功能的调节因子,它直接或间接地通过与宿主蛋白的相互作用参与调节转录、信号传导、细胞周期、蛋白降解、细胞凋亡和遗传稳定[3,4]。目前研究认为HBV中的最小标码阅读框HBX基因具有反式激活功能,在病毒的感染、宿主细胞的凋亡、肝癌的发生以及病毒与宿主细胞相互作用的过程中都起到十分重要的作用[1,5]。本研究主要通过表达、纯化HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的关系奠定一定的实验基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
E.coli BL21,JM109,DH5α由本实验室保存,乙肝病毒由第四军医大学微生物教研室提供。pMD18T购自大连TAKARA公司。
1.2 试剂
蛋白胨和酵母提取物购自Oxoid公司;氨苄青霉素和卡那霉素购自Sigma公司; Amylose Resin购自NEB公司;离子交换树脂购自Bio-Rad公司;质粒抽提试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Omega公司;透析袋购自Minipore公司;Taq DNA聚合酶,T4 DNA连接酶,限制性内切酶及DL2000、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)均购自大连TAKARA公司。质粒小量抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自BBI公司。IMAC纯化试剂盒购自Novagen公司。
1.3 含HBX基因重组质粒的构建、表达、纯化及筛选
1.3.1 HBX基因组DNA的提取
裂解液煮沸提取DNA,曲100 μL血清加50 μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,15 mmol/L NaCl,0.5%SDS,pH8.0),沸水煮沸30 min,12 000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20 ℃ 保存备用。
1.3.2 HBX重组质粒的构建
以获得的HBV基因组为模板,用Expand High Fidelity PCR System扩增HBV的全基因组,PCR产物用 1.0%的琼脂糖电泳后胶回收,用TOPO XL PCR Cloning 试剂盒构建pCR-XL-TOPO-HBV质粒(P1:5‘-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA-3’;P2: 5-CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3)。以pCR-XL-TOPO-HBV质粒为模板,用Expand High Fidelity PCR System扩增HBX基因,引物设计引物,HBX F:5’-TCGAAGCTTATGGCTGCTAGGCTGTGCTGC-3’含Hind III酶切位点 (下横线),HBX R:5’- TGAGAATTCCCCAAGCTTTTAGGCAGAGGTGAA￣A￣A￣A￣G￣ -3’含EcoR I酶切位点(下横线)。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃50 s,55 ℃50 s,72 ℃1 min,共30个循环,72 ℃延伸3 min。将PCR产物与pMD18-T载体连接,标记为pMD18-HBX。Hind III、EcoR I双酶切鉴定,将筛选出的阳性克隆双向测序(由北京奥科生物技术有限公司完成测序)。Hind III、EcoR I双酶切pMD18-HBX及pProExHTa空载体,凝胶回收HBX目的片段及pProExHTa酶切载体,利用T4 DNA连接酶连接并转化到E.coli BL21,阳性克隆接种于5 mL含100 mg·L-1 氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养液,37 ℃振荡培养过夜,将过夜培养物以1:100的比例转接与100 mL新鲜的LB培养基,37 ℃振荡培养2 h,待细菌密度达到A600=0.6 ～0.8时,加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol·L-1,37 ℃诱导4 h,12 000 r·min-1离心5 min收获菌体,重悬于100 μL 1×SDS加样缓冲液中,煮沸使菌体蛋白变性,离心后取上清12 μL进行12 %的SDS-PAGE,观察HBX蛋白的表达量。
1.3.3 表达产物HBX的纯化
将pProExHTa-HBX重组质粒IPTG诱导,收集诱导的菌体并用PBS洗涤2次,而后Native Binding buffer,12 000 r/min,5 min弃上清。沉淀用1×wash buffer连续洗3次,根据菌体重量按Novagen试剂盒溶解包涵体液体,并与菌体充分反应后12 000 r/min离心5 min,上清透析12 h。后取IMAC介质2 mL 500 g/min离心5 min弃上清,Binding buffer洗涤3次加入样品,结合孵育(1—2) h。离心弃上清,用0.5 mL的Elution buffer 洗洗3次,收集洗脱液。
1.3.4 表达产物HBX的鉴定
将纯化的表达产物HBX,利用Western blot 鉴定其生物学活性,HBX表达产物12%SDS-凝胶电泳后,100 V恒压电转1 h,转至硝酸纤维素膜上后用丽春红染色,观察电转是否成功,而后蒸馏水洗涤至无色,10%脱脂奶粉封闭过夜,按1:1 000稀释一抗,二抗用2.5%封闭液稀释与膜孵育1 h。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG,显色并观察结果。
2 结果
2.1 HBX基因的克隆及序列分析
应用所设计的引物进行PCR扩增,从HBV基因组DNA中获得特异性的DNA片段,其大小与文献报道相符,约为465 bp(见图1),将扩增的片段连接入pMD18-T载体,送由北京奥科生物技术有限公司进行DNA测序,测序结果与GenBank数据库所收录的HBX基因的CDS序列一致。
1—核酸Maker DL2000,2—HBX基因PCR产物,3—EcoR I、Hind III双酶切p MD18-HBX重组质粒,4—EcoR I,Hind III双酶切p ProE xHTa-HBX重组质粒
2.2 重组质粒的构建及鉴定
经过EcoR、Hind III双酶切含有目的片段的pMD18-HBX,证实有465 bp的片段插入载体,重组的pProExHTa-HBX表达载体也证实插入了465 bp的目的DNA片段(见图1)。
2.3 重组菌的诱导表达及产物鉴定
将重组子pProExHTa-HBX转化E.coli BL21,37 ℃培养过夜,IPTG诱导表达,对重组子产物进行12%的SDS-PAGE分析,与重组子未诱导菌比较,诱导菌在17 kDa附近有表达条带(见图2)。Western blot结果证明表达蛋白可与HBX mAb特异结合,表明其有一定的生物学活性,同时与病人血清反应也具有相应的生物学活性(见图3)。
2.4 表达蛋白的纯化
成功纯化了HBX蛋白,大小为17 kDa(见图2)。
1—低分子量蛋白Maker,2—BL21中未诱导的重组表达载体pProExHTa-HBX,3、4、5—诱导重组表达载体,6—纯化的HBX蛋白产物
1—蛋白Marker,2—空质粒pProExHTa的阴性对照,3—纯化产物与HBX mA b的特异性结合带,4—纯化产物与HBV病人血清特异性反应条带
3 讨论
近年来,研究发现乙型肝炎病毒X蛋白与乙肝和肝癌的发生与发展有密切关系。HBX蛋白在细胞核内参与乙型肝炎发生相关的转录过程,在细胞质内参与细胞乙型肝炎发生的信号转导[6]。在细胞核内主要参与调控NF-КB、AP-1、CREB和基础转录元件TATA结合蛋白等一系列转录因子的活性,从而参与多种基因转录效应[7]。它既可以反式激活HBV增强子及核心启动子、S基因启动子、SV40 增强子及早期启动子等,还可以激活哺乳类IL-1β和IL-6 重复序列(LTR)及人类免疫缺陷性病毒Ⅰ型(HIV-1)的启动子[8]等。在细胞质内HBV X 蛋白与细胞转导因子ERK、p38、MAPK、Src、Jskl、PI-3k、PSMA1、PS、MA7、TL2 等相互作用,参与细胞的信号转导。如HBV X 蛋白能够与p53 在胞浆内结合,破坏了p53 的负调控,抑制p53 的转录和介导凋亡的活性。
根据最新研究推测,HBX蛋白可能通过3个方面的效应导致肝癌的形成[9]:其一,HBX蛋白可能通过反式激活细胞内与生长、增殖相关的基因,影响DNA的正常复制和转录过程;另一方面,HBV X 蛋白与细胞内的信号转导因子相互作用,促进细胞增殖,并增强细胞的抗凋亡能力;此外,体外实验表明,HBX蛋白还能上调端粒酶活性,这可能是HBV诱发肝癌的另一机制。HBV X 蛋白还能促进肝癌组织血管内皮生长因子的表达。
HBX蛋白至今没有晶体结构,这与HBX的表达有至关重要的作用,已有的研究表明HBX蛋白无论是在大肠杆菌中表达还是在杆状病毒中表达,均会以包涵体形式存在,然后通过变性复性来纯化HBX蛋白。这种表达纯化HBX的方法对HBX蛋白结构有很大的影响,为了能表达出可溶性的HBX蛋白。本研究通过扩增HBX基因,筛选了pET 32a、pQE30 和pProExHTa三个不同的表达载体,结果发现,在pProExHTa表达载体中能可溶性表达的含量相对较高,为进一步开展HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定实验基础。
摘要：克隆乙肝病毒X基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。用PCR方法从结乙肝病毒基因组扩增出HBX基因片段,克隆至pMD18-T载体中。序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pProExHTa并在大肠杆菌BL21中表达。表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆了HBX基因,并对其在E.coli中进行了表达。SDS-PAGE及Western blot分析表明表达产物正确。通过IMAC纯化系统获得17 kD纯化蛋白,与文献报道相符。结果成功获得了纯化的HBX蛋白,为进一步研究HBX蛋白与宿主蛋白之间的相互作用奠定基础。
关键词：乙肝病毒,HBX,表达,纯化
参考文献
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乙型肝炎病毒X基因 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
搜集本院2011年1月-2012年12月的300例患者的HBV-DNA阳性血清。肝细胞癌30例, 肝硬化44例, 慢性乙肝感染者120例, 没有症状的病毒携带者106例。受调查患者中, 年龄19~69岁, 平均36.5岁, 男224例, 女76例。诊断标准符合2000年修订的《病毒性肝炎治疗方案》。
1.2 研究方法
1.2.1 HBV基因型的鉴定
(1) 核酸的提取:取血清50μL, 加入50μL裂解液, 100℃保温10 min, 13 000 r/min离心5 min, 上清即为HBV-DNA。 (2) DNA的扩增:采用套式P进化树的构建并分析基因型。DNA的扩增:采用套式PCR法对病毒S基因进行扩增。外侧引物:5′-CCT CC T GCTGGTGGCTCCAGT-TC-3′ (nt22~77) , 5′-GGCGGCAAACCCCAAAAGA CCC-3′ (nt 1004~1025) ;内侧引物:5′-CTAG GACCCCT-GCTCGTGTTACA-3′ (nt181~203) , 5′-A T TACATATC-CCATGAA GTTAAG-3′ (nt 870~892) 。扩增条件:94℃5 min, 94℃30 s, 55℃30 s, 72℃60 s共35个循环, 72℃5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后, 送上海生物工程有限公司进行测序。 (3) 基因型鉴定:应用Mega软件中NJ法进行系统进化树的构建并分析基因型。
1.2.2 HBV-DNA HBeAg的测定
根据说明书进行。
1.3 统计学处理
采用SPSS 10.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示, 比较采用t检验, 计数资料采用字2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HBV基因型的分散情况
300份血清中180份为B型, 占总数的60%;120份为C型, 占总数的40%。
2.2 HBV基因型和年龄及性别的关系
在女性HBV感染者里面, B型的比例是65.5%, C型的比例是34.5%;在男性感染者里面, B型的比例是59.0%, C型的比例是41%。在这些男女受访患者中, HBV的基因型分散情况差异无统计学意义 (P>0.05) 。C型患者的年龄 (35.2±11.4) 岁明显大于B型患者的 (29.5±9.8) 岁, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.3 HBV基因型在不同类型的感染者中的分布情况
在不同类型的感染者中, HBV基因型的分散情况的不同有统计学意义 (P<0.05) 。C基因型在无症状病毒携带者的比例是31.2%, 在慢性乙肝患者中比例为30.2%, 明显低于肝癌患者58.6%和肝硬化患者的60.0%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。可是在CHB和ASC两组病例中, B基因型和C基因型的构成比比较差异无统计学意义, HLC和HCC两组之间B基因型和C基因型的构成比差异也没有统计学意义。
2.4 HBV基因型与HBeAg的相关性
C基因型HBeAg阳性率71.7% (86/120) 明显高于B基因型HBeAg阳性率55.6% (100/180) , 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.5 HBV的基因型和HBV-DNA含量之间的关系
B基因型血清的HBV-DNA含量 (5.62±0.92) log值明显低于C基因型患者的 (5.98±0.76) log值, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
HBV基因型分布有一定的地域性, 北美、欧洲还有非洲的一些国家都有A基因型的分布, 主要在亚洲地区分布的基因型是B、C, 分布最广的基因型是D, 它主要流行于北美、中东、印度和地中海地区。非洲撒哈拉地区分布最广的是E基因, 欧洲和中北美的一些地区还分布着G基因;墨西哥和中美的一些国家还发现了H基因型。我国南方以B基因型为主, 北方以C基因型为主, 由南向北C基因型逐渐增多, 而B基因型逐渐减少。此次调查笔者用S基因直接测序法分析300名乙肝病毒感染者的HBV基因型, 调查结果表明, 太原地区B型HBV感染者的比例为 (60.2%) 剩下的为C型基因感染者。在这次调查研究过程中, 未发现其他基因型的基因。
在分析不同类型的HBV感染者基因型之后发现, ASC和CHB患者C基因型的比例明显低于HCC和HLC的患者 (P<0.05) ;HCL和HCC两组之间均以C型为主, 它们之间的BC基因型差异没有统计学意义。而在ASC和CHB中, 基因型均以B型为主, B、C型差异也没有统计学意义。这和文献里报道的C基因型较B基因型更容易进一步发展成为肝癌和肝硬化的结论相符。
此次研究表明, B基因型HBeAg阳性率明显比C基因型低 (P<0.05) , 这个结果和国内外其他学者专家的结论一致。其原因可能是B基因型易转换成HBeAg, 而C基因型则不易发生转换。研究结果表明B基因型患者血清的HBV-DNA含量明显低于C基因型患者 (P<0.05) , 这个导致C基因型患者不容易发生e系统的转换, 因为它的病毒复制非常活跃。
所以, HBV基因型的分布状况与临床医学病情有着密不可分的关系。C基因型患者的病毒水平较顽固, HBeAg血症持续的时间比较长, 不易发生与HBeAb的转换, 且平均年龄明显高于B基因型, 这就导致了C基因型患者更容易转化发展成肝癌和肝硬化。
摘要：目的:对乙型肝炎病毒 (HBV) 在人体内的分散情况进行调查, 然后讨论它和感染临床表型是否有关系。方法:对PCR进行测序, 测序之前先对其进行扩增, 然后分析300例乙肝病毒感染者的HBV基因型, 对HBV的基因型和临床表型之间的关系用t检验法和字2检验法分析。结果:在300例的病毒感染者中, 含有B基因型的患者180例, 占60%, 含有C基因型的患者120例, 占40%。B基因型患者年龄 (29.5±9.8) 岁明显高于C基因型患者 (35.2±11.4) 岁, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;在这些男女受访患者中, HBV的基因型分散情况差异无统计学意义 (P>0.05) 。C基因型在无症状病毒携带者的比例是31.2%, 在慢性乙肝患者中比例为30.2%, 明显低于肝癌患者的58.6%和肝硬化患者的60.0%, 差异均有统计学意义 (P<0.05) ;B基因型HBeAg阳性率55.6%明显低于C基因型的71.7%, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;B基因型患者血清的HBV-DNA含量 (5.62±0.92) log值明显低于C基因型患者的 (5.98±0.76) log值, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论:临床患者的身体状况和HBV的基因型有着密不可分的关系。从患者的年纪、HBeAg阳性比例和病毒水平来看, C基因型患者明显比B基因型多, 因此C基因型患者的病情很可能进一步转为肝硬化, 甚至是肝癌。
关键词：乙型肝炎病毒,临床表型,基因型
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乙型肝炎病毒X基因 篇6
基因启动子Cp G岛甲基化代表一种重要的表观遗传学机制,往往涉及人类的致癌过程。研究资料显示,肝脏组织中一些传统的抑癌基因和调节基因启动子异常甲基化可以作为HCC生物标志物[3]。癌症患者血清DNA来源于凋亡细胞、坏死细胞或肿瘤细胞等,并携带各种DNA改变,包括DNA整合、突变以及甲基化等标志,并且发现血清DNA的改变和相应的肿瘤组织中的改变高度一致[4,5]。该研究结果表明,血清DNA中基因启动子甲基化有可能作为HCC的无创诊断指标。
本研究通过文献发掘纳入6个常参与消化道致癌的基因(BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9)作为候选靶标。通过Methy Light方法来测定其在HCC、慢性乙肝后肝硬化(cirrhosis of liver,LC)、慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)及健康人群中的甲基化状态,寻找能从CHB和LC患者中有效筛选HCC的指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2011年1月-2014年12月在金华市中医医院就诊的患者263例,包括98例HCC(HCC组),75例LC(LC组)及90例CHB患者(CHB组)。HCC诊断依据B超、计算机断层扫描(computed tomogra-phy,CT)及血清AFP检查结果,并最终由组织学确诊。LC诊断依据B超、CT检查患者伴有门脉高压和脾大;CHB诊断依据《慢性乙型肝炎防治指南》(2010版)[6]。所有患者血清HBV表面抗原(hepatitissB surface antigen,HBs Ag)阳性,排除其他类型的肝脏疾病(自身免疫性肝炎、酒精性肝病、Wilson病和其他类型的病毒性肝炎等)及其他重大疾病。80例健康者(对照组)来自杭州市第一人民医院体检中心。各组年龄和性别配对。所有研究对象签署经杭州市第一人民医院伦理委员会批准的知情同意书。
1.2 血清DNA提取及亚硫酸盐处理
抽取患者接受治疗前及健康体检者空腹静脉血5 ml,置含促凝剂的真空采血管内,室温条件下2 000 g离心10 min,小心吸取2 ml血清至Eppendorf管内,12 000 g离心5min,吸取血清至新的Eppendorf管内,置入-80℃冰箱冷冻保存备用。血清DNA分离和纯化采用磁珠法试剂盒(北京金麦格公司)。采用Epi Tect Bisulfite试剂盒(德国Qiagen Hilden公司)对提取的DNA进行亚硫酸钠处理并纯化,最终获得20μl处理后DNA置于-80℃冰箱冷冻保存备用。上述操作均按试剂盒说明书进行。
1.3 阳性对照品制备
取1μg从正常胎儿脐带血中提取的DNA,加入10 u SssⅠ甲基化转移酶(美国NEB公司),160μmol/L SAM和缓冲液于20μl体系中反应37℃、15 min,65℃、10 min,再按照DNA亚硫酸盐修饰的方法加以处理和纯化,产物置入-80℃冰箱冷冻保存备用。
1.4 Methy Light方法检测基因启动子甲基化
Methy Light方法是一种建立在Taq Man探针法实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,RT-PCR)上的甲基化定量分析技术,通过一对甲基化特异性扩增引物和一条覆盖若干Cp G二核苷酸的水解探针,来对目的基因进行甲基化状态分析[7]。本实验以ACTB为内参基因,来校正样品间在模板量上的差异。引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成(见表1)。反应体系包括2×PCR Buffer10μl、200μmol/L d NTPs、0.3μmol/L正反向引物、0.1μmol/L探针、3.5 mmol/L Mg Cl2、0.5 u Taq酶、修饰后DNA 1.0μl,加水至20μl(PCR试剂购自日本Toyobo公司)。使用ABI PrismR7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)在96孔板上进行扩增,反应条件为:95℃预变性3 min,95℃变性15 s,58℃退火1 min,共45个循环。各基因启动子甲基化程度用甲基化比值(percentage of methylated reference,PMR)表示,PMR的计算参照参考文献[7],以PMR>4为阳性。
1.5 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用t检验。多组间比较用单因素方差分析(One-way,ANOVA),两两比较用t检验,计数资料以百分比或率表示,用χ2检验,诊断效能用受试者工作特征曲线(receiver operatinggcharacteristic curve,ROC)曲线下面积(area under theecurve,AUC)表示,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 临床资料
共纳入343例研究对象的临床资料。4组患者的血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、血清白蛋白(serum albumin,ALB)、总胆红素(total biliru-bin,TBIL)、血小板计数(Platelets,PLT)、AFP水平比较,经ANOVA检验,差异有统计学意义(F=34.571、5.068、62.327、4.617和233.482;P=0.000、0.028、0.000、0.003和0.000)。其中HCC、LC及CHB组患者的ALT、TBIL、AFP水平与对照组比较,经t检验,差异有统计学意义(ALT:t=29.645、42.095和30.105,P=0.000;TBIL:t=52.502、70.328和34.206,P=0.000;AFP:t=254.778、111.592和98.263,P=0.000),HCC、LC及CHB组患者的ALT、TBIL、AFP水平均高于对照组;HCC、LC及CHB组患者的ALB、PLT水平与对照组比较,经t检验,差异有统计学意义(ALB:t=7.542、6.523和4.271,P=0.007、0.012和0.041;PLT:t=4.963、21.355和4.337,P=0.027、0.000和0.039),HCC、LC及CHB组患者的ALB、PLT水平低于对照组。
2.2 血清各基因启动子甲基化阳性率
HCC、LC、CHB组及对照组BVES、APC、RASSF1A、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因启动子甲基化血清检测阳性率见表2。HCC组患者甲基化阳性率从高到低分别为:RASSF1A(52.04%)、APC(36.73%)、BVES(29.59%)、HOXA9(20.41%)、GSTP1(17.35%)和TIMP3(11.22%),其中APC甲基化阳性完全与RASSF1A重叠。RASSF1A基因启动子甲基化在LC患者血清中经常被检出(13.33%),甚至在健康人群中还有低比率阳性(3.75%)。其余5个基因在LC患者中呈现低比率阳性(2.67%~5.33%),而在健康人群中未检出。见表2。
例(%)
注:χ12、P1值:HCC组与LC组比较;χ22、P2值:HCC组与CHB组比较
2.3 血清各基因启动子甲基化对HCC的诊断效能
血清RASSF1A甲基化从慢性HBV感染患者中鉴别HCC的敏感性为0.520,高于其余6个诊断指标;BVES、APC、TIMP3、GSTP1及HOXA9甲基化的敏感性均不及AFP(≥20 ng/L),而血清各基因甲基化指标特异性均优于AFP(≥20 ng/L);从慢性HBV感染患者中诊断HCC的效能排在前3位的指标分别是血清RASSF1A甲基化(AUC=0.718)、血清APC甲基化(AUC=0.650)及AFP(≥20 ng/L)(AUC=0.609)。见表3。
2.4 血清基因启动子甲基化联合使用对HCC的诊断效能
从慢性HBV感染者中(CHB+LC)鉴别HCC,血清RASSF1A、BVES、APC、TIMP3、GSTP1和HOXA9基因启动子甲基化联合使用的敏感性、特异性及AUC分别为0.806,0.855和0.845;血清各基因启动子甲基化联合AFP(≥20 ng/L)的敏感性提高至0.878,特异性降至0.763,AUC为0.852,见附图。
A:RASSF1A+APC+BVES+TIMP3+GSTP1+HOXA9联合使用的ROC曲线(HCC vs CHB+LC);B:RASSF1A+APC+BVES+TIMP3+GSTP1+HOXA9+AFP联合使用的ROC曲线(HCC vs CHB+LC)
3 讨论
在HBV高流行区域,基本形成从慢性肝炎到LC,甚至最终至HCC的肝脏疾病谱,且大多数HCC的发生伴随在LC的基础上[8]。因此,对慢性HBV感染人群进行定期、规律的HCC筛查,有助于HCC的及时诊治,提高患者生存期。
本研究选取常参与消化道肿瘤,特别是HCC发生的6个肿瘤相关基因(BVES,APC,RASSF1A,TIMP3,GSTP1及HOXA9)[9,10,11,12]。该基因涉及多种细胞功能或信号系统,如细胞黏附、侵袭、转移(BVES、APC和RASSF1A)、凋亡、血管生成(TIMP3),解毒(GSTP1)以及细胞分化(HOXA9)。经Methy Light法检测,HCC患者血清RASSF1A甲基化阳性率最高,为52.04%(51/98),其次是APC为36.73%(36/98),而且APC阳性完全与RASSF1A阳性重叠。值得注意的是,两者在LC及CHB均有低比率阳性;该结果表明,RASSF1A、APC甲基化可能是HCC发生、发展过程中较为普遍的一种表观遗传学改变,并且可能还是一个早期事件。
通过各指标从慢性HBV感染患者中鉴别HCC的敏感性和特异性分析,6个肿瘤相关基因中只有RASSF1A甲基化的敏感性高于AFP(0.520 vs0.480),而特异性均高于AFP;从诊断效能看RASSF1A(AUC=0.718)、APC(AUC=0.650)和BVES(AUC=0.636)均好于AFP(AUC=0.609)。通过6个基因的联合使用,可明显提高HCC的诊断敏感性、特异性和效能,分别为0.806、0.855和0.845,如果再联合AFP,尽管诊断敏感性提高至0.878,但特异性明显降至0.763。
乙型肝炎病毒X基因 篇7
关键词：天祝,藏族,乙型肝炎基因型,临床特点
乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球公共卫生问题。目前全球大约有4亿HBV感染者，几乎1/3的人曾感染过HBV，在发展中国家尤为突出，仅中国就有1.5亿人感染HBV，其中2 000万人为慢性乙肝患者，每年因此导致大约50万人死亡。肝细胞癌（HC）在癌症死亡率中已跃升为第4位，而HBV感染为其主要病因，根据HBV全基因组序列异质性≥8%或S基因序列异质性≥4%，将HBV分为A-H 8种基因型[1]。不同民族HBV基因型分布不同，不同HBV基因型感染者的临床表现也有差别。本研究旨在了解天祝藏族HBV感染者基因型及与肝脏疾病的关系。
1 材料和方法
1.1 标本来源
选取我院2010—2013年武威籍天祝藏族门诊或住院患者（患者间无门诊和住院重合计数现象），共500例，应用特异性引物聚合酶链反应法（PCR）进行血清HBV-DNA定量检测。选取HBV-DNA大于103copies/ul者，共208例，应用特异性引物聚合酶链反应法进行血清基因分型检测。208例患者中乙型肝炎病毒携带者（ASC)57例，慢性乙型肝炎（CHB)73例，乙型肝炎后肝硬化（LC)42例和原发性肝癌（HCC)36例。其中男性112例，女性96例，年龄15～70岁，平均（41.00±3.70）岁，排除其他肝炎病毒导致肝脏病变疾病。诊断均符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》。
1.2 仪器和试剂
HBV-DNA测定使用ABI公司的DE-7500荧光定量PCR仪；HBV基因测定使用美国PE公司生产的基因扩增仪PE9600型。试剂、引物及探针均由上海科华生物工程股份有限公司提供。按试剂说明书进行操作。
1.3 统计处理
使用SPSS14.0软件进行χ2检验,P<0.05为有显著性差异。
2 结果
在208例藏族阳性HBV中，检出C型102例（49.04%),B型87例（41.83%),B、C两型所占比例无显著性差异（P>0.05),B+C混合型3例（1.44%），主要分布于ASC、CHB组中；D型16例（7.69%），主要分布于LC、HCC组中（见表1）。
3 讨论
(1）不同地区人群感染HBV的基因型构成存在差异[2]。基因型A、D主要分布在美国和欧洲，基因型B、C主要分布在东亚及东南亚，E型多分布在非洲，F型多分布在南美洲，G型仅在法国和美国有单个病例报道，这种地域分布反映了HBV感染史中发生变异的特点。国内学者研究显示[3,4]：我国HBV基因型南方以B型为主，北方以C型为主。本研究显示：天祝藏族HBV基因型以B、C型为主，D型相对多见，表明天祝藏族人群HBV基因型分布及其优势基因型与国内其他地方人群比较，有一定的特殊性，可能与地域和民族有关。
(2）本研究还显示，随着HBV携带者（ASC）、慢性乙型肝炎（CHB）、乙型肝炎后肝硬化（LC）和肝癌（HCC）疾病程度的加重，C、D基因型的分布逐渐增加，B基因型的分布逐渐下降。表明C、D基因型具有较强的致病能力，易引起较严重的肝损伤，发展为肝硬化和肝癌的可能性更大，预后较差。
(3)Zumbika[5]研究发现，B+C混合型基因感染在重度慢性乙型肝炎和肝硬化中占有相当大的比例，认为混合型基因感染可能和严重的肝脏疾病相关。本研究检测到的B+C混合型基因感染都在无症状携带者、慢性肝炎患者中，表明同型基因型在不同地域致病能力不同。
综上所述,天祝藏族乙型肝炎病毒优势基因型为C型和B型，D型相对多见，C、D型与较严重的肝脏损伤有关。B+C混合型感染与严重的肝脏损伤是否相关，有待进一步随访研究。
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乙型肝炎病毒X基因 篇8
乙型肝炎病毒 (HBV) 简称乙肝病毒, 是一种dsDNA病毒, 属于嗜肝DNA病毒科, 能够引发乙型病毒性肝炎疾病。乙肝病毒的感染可能引起爆发性肝炎、慢性肝炎, 慢性迁延性肝炎、重症肝炎及乙肝病毒表面抗原 (HBsAg) 无症状携带者等, 而慢性肝炎久治不愈容易引发肝硬化和导致肝癌。我国是乙肝的高发区, 60%的人群被HBV感染过, 10%的人群为乙肝表面抗原阳性携带者, 每年约有25万人死于乙肝相关性肝硬化或肝癌[1~3]。
随着分子生物学技术的发展, HBV病毒基因致病性与致癌性的关系受到了人们广泛的关注, 尤其是x基因。HBV的x基因功能重叠明显, 编码的蛋白特点明确, x的反式激活范围宽, 而这种特征与乙肝病毒致癌性密切相关[4]。HBV基因组包含PreS/S、PreC/C、Pol以及x4个开放阅读框架。其中开放阅读框架最小的是x, 它所表达的氨基酸分子具有多种功能, 其中C末端靶向动细胞凋亡并具有反式激活能力, 而N末端抗细胞凋亡能力能够在一个很广的范围内对细胞功能进行调节, 从而导致肝细胞肝癌 (HCC) [5]。对HBV其他几个开放阅读框架做大量的研究发现乙肝表面抗原基因所表达的蛋白能够使机体产生自我保护的抗体, 它的变异也会导致接种疫苗的失败, 但是针对x基因的变异情况以及在治病中的作用还有待进一步研究[6]。本实验对x基因部分区段进行了巢式PCR扩增, 对扩增序列进行测序分析, 并对变异情况进行了初步的分析。
1 对象与方法
1.1 研究对象
血浆标本共90个, 这些标本来自2012年3月~2013年9月在本院传染科住院的慢性乙肝患者以及感染HBV的无偿献血者。采用EDTA抗凝技术, 采集当天的样本血液600μL, 于-40℃下冰冻保存。通过我系和传染科的联合, 对这些采样患者进行了肝穿刺活检和愈后随访, 90例患者中有64例是本地患者, 26例是周边省市的患者;90例患者中, 有51例男性乙型肝炎患者, 39例女性乙型肝炎患者, 其中年龄最大的为64岁, 最小的8岁, 平均年龄在32~33岁之间。90例乙型肝炎患者中, 除了定期到我院进行就诊的乙型肝炎患者之外, 其他的乙型肝炎患者都要保持与医院的联系, 及时了解乙型肝炎患者的相关情况, 并对反映的情况进行记录。患者在入院的时候均没有饮酒的历史, 也没有其他类型的肝炎病毒感染。
1.2 主要试剂和仪器设备
主要试剂:2×PCR Master Mix (上海生工生物工程公司) ;
主要设备:紫外分析仪 (北京六一WD-9403C) 、稳压稳流电泳仪 (北京六一DYY-8B) 、高速离心机 (德国SIGMA公司H-3) 、PCR仪 (ABI 9700) 以及无菌超净工作台。
1.3 HBVx基因部分区段变异的检测
1.3.1 提取组织中HBV DNA
裂解液煮沸法提取HBV中DNA, 裂解液配制参照文献[7] (10 mmol·L-1 Tris-HCl, 1 mmol·L-1 EDTA, 15 mmol·L-1 NaCl, 0.5%SDS, pH8.0) 。将10μL裂解液加入到50μL血清中, 摇匀, 对其煮沸10min, 在5 000rpm下离心5min, 取上清液备用。
1.3.2 巢式PCR扩增HBVx基因片段
对所提的DNA样品进行巢氏PCR, 扩增x基因部分片段, 目的扩增产物为306bp;所有引物均由上海生物工程公司合成, 引物序列如下:
外引物:上游A:5′-CGGTCTGGAGCGAAA-CTTATC-3′ (nt1306-1326)
下游B:5′-GCTTGGAG-GCTTGAACAG-TAG-3′ (nt1877-1857)
内引物:上游C:5′-GCACCTCTCTT-TACGCGGTCTC-3′ (nt1526-1547)
下游D:5′-GAGGGGAAAAAGT-TGCATG-GTG-3′ (nt1831-1810)
1.3.3 x基因扩增体系和参数
1扩增体系
第一轮:PCR Master Mix (2×) 12.5μL, 引物A、B 10μmol·L-1各0.4μL, DNA模板5μL, 总反应体系25μL。第2轮模板采用第1轮扩增产物5μL, 引物C、D (10μmol·L-1) 各0.4μL, 总反应体系25μL。
(2) 扩增参数
第一轮:在95℃下预变性5 min, 94℃变性30s, 54℃退火30s, 72℃延伸45s, 经过38个循环后, 在72℃延伸2min。第二轮:在95℃预变性5min, 94℃变性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸30s, 经过38个循环后, 72℃延伸2 min。对第二轮的反应产物用浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳实验, 然后对分子量大小符合预期的PCR产物进行测序。
1.3.4 变异分析以及测序
经PCR反应所得x基因扩增产物交由上海生物工程公司北京测序部进行纯化处理, 并对其进行双向测序。采用DNAstar软件中的SeqMan软件对测序的结果进行核对拼接, 用EditSeq软件的通用密码子, 将碱基序列转换成蛋白质, 然后采用C1usta1W软件对序列进行排列, 对相关的变异位点进行统计。
2 实验结果
2.1 x基因扩增和序列测定
经过琼脂糖凝脉电泳, 血清HBV x基因扩增产物见图1, 与Marker对比可知HBV X基因检测方法是可行的。
在300~400bp之间获得预期位置的阳性条带 (位于巢氏PCR扩增x基因上) , 共扩增出42份x基因预期片段, 其中28份成功测序 (分型成功的总样品数68例) 。将测序结果翻译成相应的蛋白序列并进行比对, 结果表明, 样品的氨基酸序列发生了变化 (图2) 。
测序结果表明, 氨基酸读码框架的改变主要是由于DNA上的一些位点发生了变化, 主要包括碱基缺失变异、碱基介入及碱基丢失。碱基缺失变异:在1576位点的有I、J、M;在1583以及1593位点的L;1613位点的M。碱基介入:a中98位氨基酸 (此处出现氨基酸终止密码子是因为碱基A在1614~1615区间进入导致) 、Z中133位氨基酸 (此处出现氨基酸终止密码子是因为碱基A和C在1729~1730区间进入导致) 、X中128位氨基酸 (此处出现氨基酸终止密码子是因为碱基T在1742~1733以及1760~1761区间进入导致) 均出现终止密码子。碱基丢失:W中129位氨基酸 (此处出现氨基酸终止密码子是因为1753位上的碱基缺失) 、S中134位氨基酸 (此处出现氨基酸终止密码子是因为1768位上以及1769位上的碱基缺失) 、N中144位氨基酸、b中123位氨基酸 (此处出现氨基酸终止密码子是因为1704位上的碱基缺失) 以及Y中1760~1766位之间发生5个碱基的丢失均导致终止密码子的出现。
2.2 x基因表达氨基酸与致病相关性
将与疾病相关的位点与已经查阅到的文献中的报道进行比较, 统计本次实验所测定的X基因表达的氨基酸与致病相关的特殊位点, 详细见表1。从表1中可以得出X基因表达的氨基酸与致病性密切相关, 101位的P、130位的M、127位的T以及C末端部分氨基酸缺失变异均会引发细胞增殖加快, 导致肝部病症的产生。各个样品的基本信息见表2[12], 在参加这次实验的8位患者之中, 其中慢性肝炎有4例, 但都未表达HBeAg, 剩下3例没有相应症状的携带者都可以表达HBeAg。
3 讨论
据有关资料显示, 全球大概有20亿左右的的人口感染了乙型肝炎病毒[13], 其中约有3.5亿人口为慢性感染, 而我国约有1.7亿左右的患者, 占全球比例的一半, 面对如此严峻的形式, 我国对乙型肝炎的基础研究和临床资料研究一直都是我国医疗及科研的重点。
近年来x基因在病毒复制和乙型肝炎病毒疾病进程中所起的作用越来越明显, 本文实验主要是采用巢氏PCR方法对乙型肝炎患者血清中的部分X基因片段先扩增再测序, 最后译成氨基酸, 实验发现X蛋白的C末端存在着不同程度的变异, 针对这种变异状况, 采用对比分析数据统计的方式, 进行分类汇总, 并得出了相应的结果。由于实验中对样品的采集比较有限, 所以对这些因为变异所导致的结果无法作出详细的介绍和分析。在一些关于X蛋白变异位点的参考文献中, 对比X蛋白中的变异位点在感染病毒中所起的作用, 研究发现其中有20个样品的x基因变异都与肝细胞癌有关[14], 在此之中有个特殊年龄较小的患者, 突变点位于1762点, 对于1762位的这种单向变异并且具有中间化阶段的双突变特性, 很少在文献中被提及, 具有尚未发现的重要意义。在一般情况下ntl762T/1764A突变是可以同时发生的, 在改变调节序列的空间结构中会产生新的转录因子结合点。另一方面, 病毒对免疫产生抵抗的另一个原因便是T细胞表位发生的微小变化, 这种微变是由于ntl762T/1764A变异产生的。在此实验中, 发生这种变异情况的例子有7例, 其中慢性肝炎有4例, 但都未表达HBeAg, 剩下3例没有相应症状的携带者都可以表达HBeAg。本实验中, 8例存在一种被称之为C末端缺失变异的情况, 即在C末端产生一定数量的氨基酸缺失。在这次实验的8位患者之中, 慢性肝炎患者有1例, 其他的7位患者都是没有相关症状的携带者, 年龄在18岁到65岁之间, 平均年龄为32岁, 关于研究X蛋白的C末段缺失, 近年来有大量的文献对其进行了报道, 这些报道对于本文的研究有着十分重要的意义。在这些文献研究[15,16]中值得注意的是在HCC细胞中, 科学家们常看到干细胞基因组中HBC的X基因末端出现了缺失。在此我们可以猜测X蛋白的C末端缺失与HCC细胞的关系是十分密切的, 虽然X基因能在几乎所有的HBV感染者肝细胞中检测到, 但发生癌细胞转化的患者却很少, 经研究表明[17,18]C末端缺失的X蛋白会导致肝细胞的恶性增生, 而不是全长的X蛋白。
通过本次实验, 我们发现了在x基因中几例插入和缺失变异会导致X蛋白整体读码框架的变化, 其主要表现为X蛋白的反式激活能力丢失, 这种丢失会造成C末端靶动凋亡与N末端抗凋亡能力的平衡被改变甚至破坏。
摘要：本文对乙肝病毒感染者中X基因部分区段及其编码的氨基酸变异情况进行了分析。采用巢氏PCR扩增X基因部分区段, 对有特异性条带的扩增产物进行序列测定, 测序结果用相关软件进行处理, 翻译成蛋白质后与文献中已经公布的和疾病相关的变异位点进行比对并进行统计。在90份样本中, 扩增出X基因的占42份, 与此同时, 测序成功的为28份。翻译为氨基酸之后, 在X蛋白的C端存在着不同程度的变异, 导致X蛋白整个读码框架的改变, 主要表现为X蛋白的反式激活能力丢失, 这种丢失会造成C末端靶动凋亡与N末端抗凋亡能力的平衡被改变甚至被破坏。