地衣芽胞杆菌

2024-05-15

地衣芽胞杆菌（精选3篇）

地衣芽胞杆菌篇1

肝硬变、重型及慢性病毒性肝炎等肝病患者多伴有肠源性内毒素血症(intestinalendotoxemia,IETM),其可加重肝损害及促发各种并发症的发生和发展,严重影响肝病患者的预后。本研究对地衣芽胞杆菌活菌制剂在肝病患者肠源性内毒素血症中的治疗作用进行了临床观察分析。

1 资料和方法

1.1 病例选择

所有入选45例患者均为我院2008年5月—2010年6月住院治疗肝病伴有IETM患者。分成Ⅰ、Ⅱ2组,Ⅰ组(观察组)28例,其中男20例,女8例;平均年龄(55.7±9.4)岁;合并腹水6例,合并自发性细菌性腹膜炎2例,合并肝性脑病2例。Ⅱ组(对照组)17例,其中男12例,女5例;平均年龄(57.6±7.4)岁;合并腹水3例,合并自发性细菌性腹膜炎1例,合并肝性脑病1例。诊断标准参照2000年9月西安会议制定的标准。2组患者在一般资料上差异无统计学意义。

1.2 治疗方法

对照组给予保肝、补充白蛋白及对症治疗;观察组在对照组的基础上加用地衣芽胞杆菌活菌制剂(东北制药集团公司沈阳第一制药厂生产,批准文号:国药准字S10950019),500mg,3次/d,疗程为3周。治疗过程中不使用抗生素、乳果糖,或进行清洁灌肠操作等影响内毒素水平的疗法。

1.3 检测项目

所有病人均于入院时抽静脉血检测血清内毒素,使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后,1 000×g离心10min,将血清和红细胞迅速小心地分离。所选45例患者的血清内毒素水平均升高,是内毒素血症者。2组患者于治疗后3周再次抽血检测血清内毒素水平。测定方法采用酶联免疫吸附试验,试剂盒购自上海信然生物技术有限公司,严格按说明书进行操作,洗板时一定要洗净,标准曲线一定要做好,单位用pg/ml表示。

1.4 统计学处理

2组患者治疗前后血清内毒素含量水平的分析采用SPSS 10.0统计软件处理,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2 组患者治疗前血清内毒素含量水平差异无统计学意义,2组患者治疗后血清内毒素含量水平差异有统计学意义(t=3.61,P<0.05)。

见表1。

注:与治疗前比较,aP<0.05。

3 讨论

内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的一种脂多糖,细菌裂解或黏附在其他细胞上时脂多糖被释放出来。过量的内毒素会引起内毒素血症,给机体带来严重的危害,甚至发生内毒素性休克和多器官功能障碍综合征[1]。内毒素对肝细胞有直接毒性作用,可损伤肝窦血管内皮,促进肝内微血栓形成,导致门脉高压症。直接及间接引起的肝外并发症:肾功能损害,可表现为肾前性氮质血症、肝肾综合征;胃黏膜病变,可致胃黏膜水肿、糜烂及出血;DIC;肺损害,Ⅰ期表现为呼吸性碱中毒,Ⅱ期肺动脉压增高,Ⅲ期形成充血性肺不张及可致肺动脉压升高。

循环血中可检测出内毒素,称之为内毒素血症。内毒素血症可以出现在多系统的多种疾病中,通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等,病死率极高。直接或间接损害肝脏,引起糖代谢紊乱及酶学、蛋白代谢的改变。

人肠腔内聚集大量革兰阴性细菌,细菌繁殖期间常脱去外膜片段,死亡后细胞壁崩解,因而肠道内存在大量内毒素。当肠黏膜吸收的内毒素因某些病理原因进入血循环而被检出时称为IETM。血浆中IETM主要来源于肠道内毒素的吸收,因此IETM是病人死亡的主要原因。

肝病时肝脏对内毒素的清除功能减退,大量内毒素在肝脏未经解毒溢入体循环;门体系统功能障碍,出现门体分流,来自肠道的内毒素绕过肝脏,未经灭活解毒,涌入体循环,均易发生IETM。IETM主要是加重肝损害和使部分患者促发肝功衰竭及肝外并发症的发生。

重型肝炎患者的70%～100%、病毒性肝炎患者的35%～65%、肝硬变患者可高达79%,均可引起IETM,由此可见,肝损伤时容易形成IETM,而IETM形成后,进入肝脏的内毒素又可引起肝细胞的一系列损伤反应,使肝损伤不断加重,最后导致肝功能衰竭[2]。另外,IETM对肾功能有损害作用;可诱发上消化道出血,诱发或加重肝性脑病。血清IETM可导致微血栓形成,引发DIC[3]。本研究对45例肝病存在明显IETM患者进行了地衣芽胞杆菌活菌制剂干预治疗。结果显示,治疗组与对照组比较,血清内毒素水平明显下降,差异有统计学意义,与张美华等[4]报道的微生态制剂有改善IETM作用的结论一致。另外,地衣芽胞杆菌活菌制剂有改善肝硬化患者顽固性腹泻的作用。乳果糖治疗IETM虽然有效,但有导泻作用,对于腹泻患者不适合用。临床和实验资料证明,地衣芽胞杆菌活菌制剂疗法具有高效、低毒、后续效应强和患者依从性好等优点,有望成为乳果糖的替代药物,特别用于乳果糖不能耐受的患者。

总之,IETM对肝病患者有严重的影响,是造成患者肝功能受损、病情恶化的重要因素。积极清除内毒素血症对于改善病情预后意义重大。目前临床有效的治疗手段不多。地衣芽胞杆菌活菌制剂是地衣芽孢杆菌无毒菌株活菌制剂,可调节肠道菌群,扶持厌氧菌生长,减少有害菌比例,从而减少肠腔内毒素的产生。从而降低了IETM的发病率,降低了对肝脏的损害及改善了肝脏功能,其确切的疗效,尚须扩大样本进一步研究。

参考文献

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[3]吴其恺.肝衰竭肝源性内毒血症的研究进展[J].传染病信息,2009,22(5):318.

[4]张美华,贾林.肝性脑病患者肠道微生态改变及微生态治疗[J].世界华人消化杂志,2004,12(9):2159-2161.

蜡样芽胞杆菌实验室诊断技术进展篇2

1 细菌培养法

培养法是实验室检测B.cereus的常规方法。标本经胰酪胨大豆多粘菌素肉汤在30 ℃温箱中培养18～24 h增菌后,转种选择性培养基中,于30 ℃温箱中培养24～48 h,观察菌落形态,挑选可疑菌作生化鉴定。目前常用的选择性培养基有甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYPA)和华晨蜡样芽胞杆菌显色培养基(brilliance bacillus cereus agar,BBCA),后者价格高,故MYPA常被选用,但一些具有高背景菌群的食物样本,常出现扰菌落,针对这种情况,Chon等[5]对MYPA进行改进,他们在MYPA里添加甲氧苄啶,同时用未加甲氧苄啶的MYPA,对具有高背景菌群的食物样本如红辣椒粉、发酵黄豆酱、蔬菜沙拉、萝卜等进行对比检测,由于甲氧苄啶可以抑制植物区系分化的可疑菌落,因此,可提高MYPA的选择性。BBCA是最近开发的显色培养基,对蜡样芽胞杆菌具有良好的选择性。Jeong等[6]以法国生物梅里埃鉴定系统为金标准,采用BBCA对B.cereus进行分离鉴定,两者具有很好的一致性,BBCA更简便易行。Hendriksen等[7]对MYPA和BBCA进行评价试验后认为,两者都有各自的优点和局限性,局限性主要表现在有少数苏云金芽孢杆菌菌株在MYPA上没有表现出卵磷脂酶的活力,在评估的324株菌株中,有5株在BBCA上不生长。常规培养法不需要贵重设备,一般实验室都可以开展,但操作复杂、耗时、特异性和敏感性不高。

2 免疫学方法

免疫学方法主要是检测B.cereus的特征性蛋白。研究发现蜡样芽孢杆菌有3种相对分子质量约为28.5×103、26.5×103和20.0×103的特征性蛋白,而苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌则没有此特征性蛋白,为免疫学检测B.cereus奠定了基础。免疫学检测B.cereus的方法主要有荧光免疫技术、酶免疫技术、发射免疫技术、免疫乳胶凝集试验、反向被动乳胶凝集试验、反向间接凝血试验。目前,常用的方法有酶联免疫吸咐试验(ELISA)和免疫层析法。Chen等[8]将抗B.cereus 28.5×103的抗体结合在微量滴定板上,洗涤后,用辣根过氧化物酶标记的抗体作为二次抗体,通过抗原-抗体反应显示信号,建立检测B.cereus 28.5×103的抗原的ELISA法。对38株B.cereus和127株非B.cereus(包括79株芽孢杆菌)进行测试,结果该法的敏感性和特异性分别为100%和88.2%。Kuwabara等[9]将B.cereus的特异抗体先固定于硝酸纤维素膜的一端,以胶体金标记其多抗,建立检测呕吐型B.cereus的胶体金免疫层析条带,可在30 min内完成,最低检测浓度为108 CFU/ml,并且与其他芽胞杆菌无交叉反应。免疫胶体金技术具有快速简便、特异、敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点。

3 聚合酶链反应

聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的新方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复的热循环构成:即在高温(95 ℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为2条单链DNA模板;而后在低温(37～55 ℃)情况下,2条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72 ℃)下,以引物3′端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5′端向3′端方向延伸,合成DNA新链。目前,对B.cereus的全基因组测序已经完成,其高度保守基因区域分布C组bcr7～18[10]。根据B.cereus特异性基因片段中的开放阅读框架部分序列设计引物,可进行PCR检测。PCR方法常用的有常规PCR、随机扩增多态性-PCR(RAPD-PCR)、限制性片段长度多态性-PCR、多重PCR、和实时荧光定量PCR等。Kim等[11]选取产催吐毒素B.cereus的CER基因作引物,并用B.cereus的其他基因(EM1、RE234、CES、Ces3R、CESR2等)作对比,建立常规PCR,对160株B.cereus,其中40株为产催吐毒素型同时进行检测,结果CER引物准确率最高(97.5%),其敏感性和特异性分别为100%和96.7%。常规PCR扩增后需做凝胶电泳鉴定,比较繁琐,同时扩增产物极易受到污染造成假阳性。Kuwana等[12]制备8个寡核苷酸引物,建立菌株的DNA多态性模式,对16株蜡状芽孢杆菌组的菌株进行RAPD-PCR,结果能准确、有效地鉴别这些菌。Jensen等[13]采用聚合酶链反应-限制性片段长度(PCR-RFLP)技术鉴定蜡样芽胞杆菌群,他们以gyrB作为靶基因进行扩增,扩增产物为362 bp片段,对12株B.cereus、25株苏云金芽胞杆菌、25株蕈状芽孢杆菌和2株炭疽芽孢杆菌进行扩增,随后用Sau3A1消化产物,经电泳谱带鉴别,结果除蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌无法区分开来外,其他菌株都能鉴别出来。由于该法扩增后需要对产物进行消化,增加了操作的复杂性,临床上应用不多。Park等[14]用B.cereus的gyrB和groEL基因作诊断标记,建立多重PCR,并检测不同种类的食品作为评价。结果groEL扩增产物中,所有的B.cereus试验株均得到400 bp的DNA片段,gyrB基因得到475 bp,他们观察来自29个其他致病菌的DNA片段,没有出现非特异性扩增。多重PCR是一种操作简单、快速、有效的方法。实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用对荧光信号积累的实时检测来监测整个反应过程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。Oliwa-Stasiak等[15]设计2套引物(BCFomp2/BCRomp2和BpmF/BpmR2)和3个TaqMan探针(MOTB-FAM-1,MOTB-FAM-2,和BPM-FAM-1),建立量化的鉴定炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和韦氏芽孢杆菌的实时PCR方法。该法的敏感性为1010到1个基因的拷贝/20 μl,他们对该方法进行测试,没有出现非特异性扩增。与常规PCR相比,实时PCR做到了定量分析并采用完全封闭的检测系统,有效解决了PCR污染问题,特异性更强,自动化程度高。

4 展望

上述方法是临床上检测B.cereus的常用方法。经过多年的优化提高,细菌培养发展得比较成熟,因其所需设备要求不高,已成为基层最常用的方法,但操作复杂、费时,不能做到早期诊断。免疫学方法因其灵敏性和特异性尚不理想,目前还不为临床广泛接受。PCR虽然快速,敏感性和特异性高,但检测费用高也限制其在基层实验室广泛应用,同时PCR所需的特异性基因,大部分与其他芽胞杆菌具有一定的同源性,特异性还不理想。随着对靶基因研究的不断深入和更特异性靶基因的发现以及实时荧光定量PCR的不断完善,PCR技术在B.cereus诊断上将具有良好的应用前景。

摘要：蜡样芽胞杆菌广泛分布于自然界及食品中,并可在其中生长繁殖,引起人类食物中毒。引起的食物中毒有两型,一类由不耐热肠毒素引起的腹泻型,临床表现为腹痛、腹泻和里急后重,与产气荚膜梭菌引起的食物中毒相似;另一类由耐热肠毒素引起的呕吐型,临床表现为恶心、呕吐,似葡萄球菌食物中毒。临床上不容易区别,须通过实验室检测确证,蜡样芽胞杆菌分离培养及鉴定耗时,操作繁琐。近年来出现的新型免疫学方法和聚合酶链反应具有较高的敏感性和特异性,作者将蜡样芽胞杆菌实验室诊断检测技术进展进行综述。

地衣芽胞杆菌篇3

本研究通过对此株产纤维素酶的地衣芽孢杆菌ws-6进行研究,初步优化和探索了其产酶条件,为此株细菌在饲料中的进一步应用建立基础,也为进一步改造、构建更适合生产纤维素酶的工程菌株奠定了理论和试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

菌株来源于从新疆乌苏本地多年青贮窖中分离筛选到的地衣芽抱杆菌(Bacillus Licheniformis)ws-6菌株,现保存于中国普通微生物保藏管理中心:编号CGMCC No.1991。

1.1.2 试剂

蛋白胨、酵母膏、琼脂等购自北京奥博星生物技术有限责任公司,葡萄糖、蔗糖、NaCl、NaOH、MgSO4·7H2O等购自天津市天新精细化工开发中心,盐酸、乙醇购自中国医药集团上海化学试剂公司,羧甲基纤维素钠购自Sigma公司,其余试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

E360K离心机(德国Eppendof);紫外分光光度仪UV-2550(日本岛津自动化设备有限公司),MLS-3020高压蒸汽灭菌锅(新德医疗器械有限公司);DK-8D电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);pHs-3C酸度计(上海雷磁仪器厂);AEL-160岛津电子天平(日本岛津自动化设备有限公司);摇床ZHWY-100D(上海智城仪器制造有限公司)。

1.1.4 培养基

(1)斜面保存培养基

蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,水1 000mL,琼脂粉15g,pH 6.5,1×105 Pa灭菌25min。

(2)种子培养基

蛋白胨10g,氯化钠10g,酵母粉5g,水1 000mL,pH 6.5,1×105 Pa灭菌25min。

(3)基础产酶培养基

蛋白胨10g,酵母膏10g,CMC-Na 10g,NaCl 5g,KH2PO4 1g,蒸馏水1 000mL,调pH至6.5,1×105 Pa灭菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将分离保存的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)ws-6菌株转接到斜面培养基,37℃培养24h,备用。

1.2.2 种子液的制备

取一环活化的菌种,接入装液量为50mL种子培养基的250mL三角瓶中,37℃、200r/min培养18h。

1.2.3 发酵培养

取1mL种子液,接入盛有50mL基础产酶培养基的250mL三角瓶中(接种量为2%,V/V),置37℃摇床中振荡培养,转速200r/min。

1.2.4 粗酶液制备

取发酵液1mL,5 000r/min离心10min,取上清液即为粗酶液。

1.2.5 羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定

参照NY/T 912-2004测定饲料添加剂纤维素酶活力。

酶活定义:在温度50℃、pH 6.0条件下,每分钟由底物降解释放1μmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。

2 结果和分析

2.1 ws-6菌株发酵产酶条件优化

2.1.1 初始pH和培养温度对产酶的影响

在基础产酶培养基的基础上,以2mol/L的盐酸或3mol/L氢氧化钠调节培养基初始pH 4.0～8.0,培养24 h后测定酶活。结果(图1)显示,初始pH 5.5～7.5有利于ws-6菌株产酶,酶活在初始pH 6.5时最高,这说明中偏酸性环境有利于菌株产酶。在25℃～50℃范围内恒温振荡培养,结果(图2)35℃～40℃的培养温度有利于菌株产酶。

2.1.2 装液量对产酶的影响

在250mL的三角瓶中分别装入10mL、20mL、30mL、40mL、50mL和60mL培养基,接种后培养24h时取样测定酶活力。装液量对菌株产酶水平的影响表明,当培养基装液量由10mL增加到30mL时,产酶能力增加,但继续提高装液量则使菌体产酶水平下降。这说明菌株产酶水平与菌体生长并不完全一致,并非菌体生长量越大产酶水平越高。溶氧水平对菌株产酶具明显得影响,结果如图3,在装液量为30mL时表现较高的产酶活性。

2.2 ws-6菌株发酵产酶培养基优化

2.2.1 不同碳、氮源对产酶的影响

在上述培养条件下,以基础产酶培养基为基础改用不同碳源:1%葡萄糖、1%蔗糖、1%羧甲基纤维素钠、0.5%葡萄糖+0.5%羧甲基纤维素钠、0.5%蔗糖+0.5%羧甲基纤维素钠,考查不同碳源对ws-6菌株产酶的影响。结果见图4,葡萄糖最有利于产酶,0.5%葡萄糖和0.5%羧甲基纤维素钠产酶水平远高于前述碳源;在基础产酶培养基的基础上采用不同氮源(添加量1%),结果如图5,最佳氮源为酵母膏。

2.2.2 金属离子对酶活性的影响

在产酶培养基中分别加入0.05%的Mn2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Ca2+、Na+、K+不同金属离子,接种后培养24h时取样测定酶活力,结果如图6所示。金属离子Na+、K+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+对菌株ws-6产酶有促进作用,而Fe2+、Ca2+对菌株ws-6产酶没有显著影响,Cu2+则抑制菌株产酶。

2.2.3 产酶培养基正交优化实验设计

培养基中各组分之间有一定的内在关系,在单因素实验的基础上,采用正交实验以寻求培养基中各组分的最佳配比。由表2可知,极差分析可知,RC>RB>RA>RD,在实验条件下优化水平的最佳组合为A3B1C3D2。即地衣芽孢杆菌ws-6菌株的最佳培养基配方为葡萄糖1.5%、羧甲基纤维素钠0.5%、酵母膏1.5%、KH2PO4 0.1%。

2.2.4 优化后酶活性变化

在最佳碳、氮源、最适pH和发酵温度条件下,30 mL最优发酵培养液中接入2%的种子菌液,地衣芽孢杆菌ws-6菌株酶活性动态变化如图7所示。在培养12h后可检测到纤维素酶活性,产酶高峰发生在第48h,达3.45U/mL,此后8h产酶水平急剧下降。

3 讨论

3.1 对ws-6产纤维素酶条件进行了优化,发现初始pH值和培养温度是影响ws-6菌株发酵产酶水平的重要因素,发酵产酶最适初始pH值为6.5,最适培养温度为37℃。发酵中的溶氧水平对产酶有显著影响,250mL三角瓶中以装30mL培养基为宜;同时酶的活性受金属离子的影响,金属离子Na+、K+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+对菌株ws-6产酶有促进作用,而Fe2+、Ca2+对菌株ws-6产酶没有显著影响,Cu2+则抑制菌株酶活性。

3.2 采用正交实验设计分析对地衣芽孢杆菌ws-6菌株产酶培养基进行优化,确定ws-6菌株产酶培养基组分为(g/L):葡萄糖15g、羧甲基纤维素钠5g、酵母膏15g、KH2PO4 0.5g、NaCl 5g,同时发现纤维素酶的产生与菌体生长部分藕联,菌体生长量在24h达到最大,而ws-6菌株产酶水平在48h时达到最高,酶活性达到3.45U/mL,比出发菌酶活性提高约1.4倍。

3.3 由细菌所产生的纤维素酶一般为中性或偏碱性[12],ws-6菌株所产纤维素酶具有一定的耐酸性,且在弱酸性条件下活性相对较高,所以在青、黄贮饲料制作中对于提高纤维素分解率以及饲料的利用率都具有较高的应用价值。

摘要：目的:通过优化该菌产酶条件,以期在饲料中的进一步应用建立基础。方法:纤维素酶活性用还原糖法测定,产酶条件采用单因素筛选与正交优化方法相结合。结果:培养基初始pH6.5、培养温度37℃、接种量2%2、50 mL三角瓶装液量30 mL、葡萄糖1.5%、羧甲基纤维素钠0.5%、酵母膏1.5%、KH2PO40.05%、NaCl 0.5%,培养48h后酶活性达到最高3.45U/mL;金属离子K+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Na+对产酶有激活作用,Cu2+则抑制酶活性。结论:酶活性比出发菌提高约1.4倍,对饲料制作中提高纤维降解具有一定的实用价值。

关键词：地衣芽孢杆菌,纤维素酶,优化

参考文献

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