鼠胚培养

鼠胚培养（精选3篇）

鼠胚培养 篇1

体外神经细胞培养是神经科学研究重要的方法, 体外原代培养神经细胞的生长发育特征与体内非常相似, 具有取材容易、实验条件相对恒定、便于直接观察、检测指标及可有效排除诸多复杂因素干扰等优点, 日益成为神经科学研究中必不可少的实验材料及模型工具。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位, 进行神经元的体外原代培养, 是研究神经系统形态、结构、功能较为理想的方法之一。神经元的体外培养不仅可对体内神经元结构和功能进一步了解, 还能为中枢神经系统疾病的研究提供科学的治疗方案。本研究在以往各种方法的基础上对培养的各环节加以改进, 建立一种简单、较理想的胚鼠大脑皮层神经元原代培养方法, 为脑血管疾病、神经系统疾病的研究提供较理想的实验模型, 为其在中枢神经系统疾病中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由重庆医科大学实验动物中心提供, 由川北医学院实验动物中心代购, 实验动物饲养于我校动物实验中心。选取孕15~18d胎龄SD大鼠, 清洁级, 自由摄食和饮水, 室内温度在25℃左右, 相对湿度为60%~70%。

1.2 主要试剂

高糖DMEM/F12培养液 (美国Gibco公司) 、胎牛血清 (FBS) (美国HyClone公司) 、B27添加剂 (美国Invitrogen公司) 、Neurobasal-A培养液 (美国Gibco公司) 、多聚赖氨酸 (7万~15万) (美国Sigma公司) 、胰蛋白酶 (美国Sigma公司) 、SABC (链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物) 试剂盒 (武汉博士德生物工程公司) 、DAB显色试剂盒 (武汉博士德生物工程公司) 、多聚甲醛 (美国Sigma公司) 、兔抗NeuN (神经元核特异蛋白) (Millipor公司) 、0.2%TritonX-100 (中国天根生化科技有限公司) 、0.01M PBS液 (中杉公司) 。

1.3 细胞爬片的制备

将盖玻片放于玻璃培养皿中, 泡酸过夜后取出, 自来水下洗净酸, 再用去离子水洗净, 放入玻璃培养皿, 将装有盖玻片的玻璃培养皿一起放入消毒饭盒中高压锅消毒灭菌备用。

1.4 多聚赖氨酸包被培养板、盖玻片

6孔细胞培养板中每孔加入配制好的多聚赖氨酸 (0.1mg/ml) , 以能盖住孔底为限。拟行免疫细胞化学技术检测的标本, 需在培养板中预先置入1cm×1cm的玻璃盖片, 然后再涂多聚赖氨酸, 超净台放置20min后, 吸净培养板中的多聚赖氨酸, 加入适量10%FBS的DMEM/F12 (高糖) 培养液, 置于37℃、5%CO2细胞培养箱中备用, 临用前吸弃原培养液, PBS液清洗2次, 新鲜细胞培养基 (含10%FBS的高糖DMEM/F12培养液) 清洗1次即可使用。

1.5 神经元培养

取孕15~18dSD大鼠孕鼠, 颈椎脱臼处死, 碘伏消毒腹部皮肤, 75%酒精脱碘后, 剪刀腹部皮肤向两侧拉开, 用另一把剪刀打开腹壁暴露子宫, 取出含有胎鼠的子宫, 置于无菌消毒饭盒中。在超净台内小心剖开子宫, 打开羊膜囊取出胎鼠, 剪下胎鼠头部, 移入盛有冰PBS液的培养皿中。眼科镊剥离头颅皮肤、颅骨, 暴露出大小脑, 小心将全脑取出放入另一盛有冰PBS液的培养皿中, 漂洗。解剖显微镜下剥离脑膜, 直至剥离干净, 见不到含有血管的脑膜为主, 剥离出大脑皮质。将胎鼠皮层移入无菌小培养皿中, 用眼科剪剪成约为1mm3大小的小组织块。加入0.125%胰蛋白酶在37℃、含5%CO2细胞培养箱消化约30min后, 加入同等量含10%FBS的高糖DMEM/F12培养液 (完全培养基) 立即终止消化, 无菌玻璃吸管轻轻吹打分散后, 用200目钢网过滤。将过滤后所得单细胞悬液, 吸入无菌离心管中, 以800rpm的速度离心5min, 弃上清, 完全培养基重悬细胞, 玻璃吸管轻柔吹打。以密度为1×106个/ml混匀后接种于铺有多聚赖氨酸处理的盖玻片的6孔培养板中。置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内进行培养。于培养24h后, 全部细胞贴壁良好, 部分细胞周围开始出现突起, 培养液换为含2%B27的Neurobasal-A培养液, 抑制非神经元细胞的增殖。以后每3d换液1次, 每次更换一半新鲜培养液 (含2%B27的Neurobasal-A培养液) 。定时在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。6d用于实验研究, 在培养过程中4h及1d、2d、4d、6d用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况。

1.6 皮质神经元NeuN (神经元核特异蛋白) 免疫细胞化学鉴定

将铺有盖玻片6孔培养板中的培养液弃去, 每孔加入1ml4%多聚甲醛室温固定20min, 吸弃多聚甲醛, 每孔加入0.01M PBS液清洗细胞3次, 5min/次;0.2%TritonX-100室温下作用10min, 吸弃, 0.01M PBS液清洗细胞3次, 5min/次;3%过氧化氢浸泡10min;0.01M PBS液清洗细胞3次, 5min/次;5%BSA溶液封闭30min (37℃) ;吸去封闭液 (不洗) , 直接滴加一抗 (兔抗NeuN1∶100) 4℃孵育过夜, 阴性对照直接加PBS;0.01M PBS清洗细胞3次, 5min/次;滴加相应生物素化二抗37℃ (SABC试剂盒内, 为即用型) , 30min;0.01M PBS细胞3次, 5min/次;滴加辣根过氧化物酶标记抗生物素试剂 (SABC) 30min;0.01M PBS清洗细胞3次, 5min/次;取出各孔内盖玻片, DAB显色, 显微镜下控制, 显色效果满意后终止, 自来水冲洗5min;苏木素染色2min, 冲洗后, 盐酸酒精分化1s;70%乙醇, 30s×2次、80%乙醇30s×2次、95%乙醇30s×2次、无水乙醇分别脱水30s×2次;晾干中性树脂封片, 镜下观察并照相。胞浆、胞核出现棕色颗粒为阳性为神经元细胞。

2 结果

2.1 大鼠皮层神经细胞原代体外培养形态学观察

神经细胞刚分离时呈圆形, 细胞边缘光滑, 折光性强, 体积较小胞体透亮;种植4h后大部分神经细胞贴壁, 胞体圆而透明, 分布较均匀 (图1) ;细胞培养24h, 细胞全部均匀贴壁, 部分细胞变形呈多角形、伸出短小的突起, 大部分呈圆形, 胞体周围光晕明显;第2天细胞体积增大, 开始出现多极神经元, 周围突起增多、增粗并伸长, 但细胞间突起连接较少 (图2) ;第4天有部分细胞呈梭形、多角形, 细胞周围突起进一步增长、增粗, 出现相互连接, 形成较稀疏的神经网络 (图3) ;第6天细胞胞体饱满清晰, 边界清楚有明显的光晕, 有很强的折光性及立体感, 突起进一步增多、增长, 并有突起连接在一起, 相互间交错成网, 未见明显的胶质细胞 (图4) 。

2.2 大鼠皮层神经细胞免疫细胞化学鉴定

神经元特异核蛋白 (NeuN) 是神经元的特异性标志蛋白。将培养第6天的大鼠皮层神经细胞进行抗NeuN细胞免疫细胞化学检测, 显示胞核深染为强阳性、胞浆淡染为弱阳性 (图5) , 10×40倍视野下随机取10个视野, 计数阳性细胞的百分率, 鉴定神经元纯度为 (93.7±5.5) %。

3 讨论

原代培养的神经元由于在体外可以从事各种试验, 避免体内因素的影响, 现已广泛的用于神经系统的研究。目前关于神经元培养方法多种多样, 说法各不相同。要获得纯度高、生长状态良好的神经元取决于许多不同的影响因素, 包括适龄动物、组织分离的方法、培养基的选择及细胞接种的数量等因素[1]。本研究在以往各种方法的基础上对培养的各环节加以改进, 已获得高纯度、高质量的神经元, 结果显示:正常原代细胞接种后很快贴壁, 约30min开始贴壁, 4h时大部分细胞已贴壁, 24h时细胞贴壁良好, 部分细胞突起形成开始增长、增粗, 长至第6天时细胞胞体增大, 部分胞体为星形、梭形, 突起形成神经网络, 神经元特异核蛋白免疫细胞化学鉴定其纯度达90%以上。由于皮质神经元在体外生存能力较弱, 在其分离、培养的过程中, 需注意其中的关键环节: (1) 鼠龄是影响分离效果重要因素, 适龄胎鼠, 神经元的形态学分化和化学分化程度较低, 可以轻松的剥离脑膜及血管, 节约取材时间, 增加细胞体外存活能力[2], 因此本研究采用孕15~18d的胎鼠来分离皮质神经元; (2) 酶消化有利于分离组织间细胞, 本实验采用0.125%胰蛋白酶消化20~30min, 此浓度消化酶不易损伤细胞, 显微镜下观察, 易把握消化时间; (3) 吸管轻柔吹打分离细胞, 用力过猛将导致大量细胞膜破裂, 影响细胞的存活; (4) 刚接种时用含10%FBS的高糖DMEM/F12培养, 血清主要是促进神经元的贴壁生长; (5) 血清培养至2~3d时胶质细胞开始长出, 既往研究常规使用一定浓度的阿糖胞苷抑制非神经元细胞的生长, 但阿糖胞苷同时对神经元有毒性作用, 因此本实验于培养至24h全量换液, 换为含2%B27的Neurobasa-A培养液[3,4,5], 可抑制非神经细胞的生长[6,7], 从而提高神经元的纯度。结果显示:含2%B27的Neurobasal-A培养基抑制非神经细胞的生长, 从培养效果可以观察到, 细胞折光性好, 培养到24h换液后细胞仍生长良好, 紧密贴壁, 无悬浮细胞, 细胞周围开始伸出较长突起, 并相互连接形成神经网络, 胶质细胞数量较少, 通过免疫细胞化学方法鉴定获得纯度90%以上的神经元; (6) 神经元培养细胞接种密度也至关重要, 密度太低使神经元缺乏相互间的支持和营养也能导致培养的失败, 一般接种密度应在5×105~5×106个/ml[8]之间, 本实验采用1×106个/ml, 细胞密度适中, 生长状态良好。近年来, 离体培养的原代神经细胞越来越广泛应用于包括细胞功能及形态、神经发育、中枢退行性疾病、脑缺血等在内的多领域、多层次的研究[9,10,11,12], 所以本研究总结改进以往[13,14]皮层神经元原代培养方法为上述实验研究的顺利进行打下基础。

本研究应用孕15~18dSD大鼠胚鼠大脑皮层进行体外原代培养神经元, 在培养过程中, 初始使用含10%FBS的高糖DMEM/F12培养, 以促进神经元细胞快速贴壁生长, 而培养至24h, 大部分细胞已贴壁, 细胞周围形成突起。此时换液, 没有加用阿糖胞苷而是全量换液换为含B27的无血清神经元培养基维持培养细胞, 结果显示:细胞仍贴壁, 生长状态良好, 细胞周围突起增长、增粗, 部分连接形成神经网络, 通过免疫细胞化学鉴定纯度可达90%以上, 说明按这种方法进行神经元的分离和培养, 可以得到纯度较高、状态较好的神经元。

鼠胚培养 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

昆明种小白鼠，购自广西医科大学实验动物中心，体重为25～35 g，按照SPF级实验动物饲养标准条件饲养。

1.2 方法

1.2.1 鼠胚采集

选择4～6周龄雌鼠，于腹腔注射人绝经期尿促性腺激素(h MG)10 IU/只。46～48 h后注射人绒毛膜促性腺激素(h CG)10 IU/只。于注射h CG当晚合笼过夜。第二天将阴栓阳性者挑选出来。注射h CG后42～46 h用颈椎脱臼法处死阴栓阳性雌鼠，取出输卵管。在体视镜下划破输卵管壶腹部，收集其中的2-细胞期胚胎，并用含10%SPS的HTF冲洗3遍，再在培养液中冲洗1遍，选取优质胚胎继续培养。

1.2.2 体外培养

本实验采用微滴法培养。于培养前一天按不同的方案做好微滴，并覆盖矿物油，放入37℃，5%CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中过夜平衡，将收集的优质胚胎随机分成两组，A组于20μl培养液的微滴中培养，B组与50μl培养液的微滴中培养。胚胎在37℃、5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中持续培养96 h，每隔24 h观察鼠胚发育的情况并记录。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0分析软件对所得数据进行显著性检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

采用体内受精的方法获取2-细胞胚胎，在相同的培养条件下，A组分裂为4-细胞胚胎的分裂率为89.09%，B组分裂为4-细胞胚胎的分裂率为92.86%，两者比较差异无统计学意义(P>0.05);A组的囊胚形成率为83.64%，B组的囊胚形成率为81.63%，两者比较差异无统计学意义(P>0.05)，但A组的囊胚形成率比B的稍高(见表1)。

3 讨论

随着人类辅助生殖技术的不断发展，体外受精-胚胎移植技术现已成为治疗不育不孕的主要手段之一。人类辅助生殖技术包括卵母细胞的体外受精、胚胎的早期体外培养及胚胎移植等过程，这一系列过程要求有一个稳定的模拟母体内发育的体外培养环境及娴熟的技巧。在体外培养过程中，所有与卵子、精子、胚胎接触的耗材和试剂及环境，均有可能存在危害胚胎的因素[1]。活性氧是造成卵母细胞质量下降和胚胎发育不良的重要因素之一。胚胎培养液中的活性氧的来源可能来自胚胎的周围环境。它会引起早期胚胎发育停滞和延迟[3]。另外，由于开启培养箱引起培养箱内外气体交换，室内空气消毒后残留的臭氧也是培养液活性氧升高的主要原因之一。

本研究结果表明在体积为20μl与50μl的微滴中培养，2-细胞鼠胚的囊胚形成率差异无统计学意义(83.64%vs81.63%，P>0.05)。但在20μl的微滴中培养的2-细胞鼠胚发育到囊胚阶段的胚胎数比在50μl的多，这可能是由于在整个体外发育过程中胚胎在20μl微滴中受到外界的影响较小而造成。培养基可以吸收部分污染物，如果微滴的体积过大，其与外界环境的接触面就越大，则溶解于培养基中的有害物质就越多，胚胎受到的侵害面积就越大，从而影响胚胎的发育。而较小体积的液滴由于与外界的接触面小，降低了氧化损伤的风险[4]，其提供的培养环境相对于大液滴或者整个培养箱而言是一个小环境，因此可以把由大气候/环境发生改变而产生的有害因素通过小环境的微调作用而缓减，使培养胚胎受到的影响降到最低限度，很好地保护胚胎发育。综上所述，小鼠胚胎体外培养实验除了可以使新建立的辅助生殖实验室熟练IVF的基本操作技能外，还可以为建立一套比较完善的胚胎培养体系提供实验依据，是开展人类辅助生殖技术的基础。选择适量体积的微滴可以有效地降低外界因素对胚胎发育的影响，为胚胎体外培养提供一个稳定良好的微环境。

摘要：目的 比较鼠胚在不同的培养体系中的体外发育情况,探讨培养液的体积对体外培养的影响。方法 把收集的小鼠2-细胞胚胎分成两组,A组于20μl培养液的微滴中培养,B组与50μl培养液的微滴中培养,观察胚胎发育情况。结果 96h后A、B组的囊胚形成率分别为83.64%和81.63%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 适当体积的培养滴可促进胚胎的体外发育。

关键词：小鼠,胚胎,囊胚,体外培养

参考文献

[1]王利红,连方.两种2-细胞鼠胚体外培养方法比较.中国比较医学杂志,2009,19(11):67-69.

[2]Suzuki C,Yoshioka K,Sakatani M,et al.Glutamine and hypo-taurine improves intracellular oxidative status and in vitro develop-ment of porcine preimplantation embryos.Zygote,2007,15(4):317-324.

[3]Guenn P,Ei Mouatssim S,Menezo Y.Oxidative stress and protec-tion against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings.Hum Reprod Update,2001,7(2):175.

鼠胚培养 篇3

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

昆明白小鼠购自中山大学实验动物中心(合格证号:SCXK粤2011-0029)。雌鼠:65只,8~10周龄、体质量40~45 g;雄鼠:30只,10~12周龄、体质量50~55 g。

1.1.2 主要药品与试剂

孕马血清促性腺激素(PMSG)和绒毛膜促性腺激素素(HCG)购自杭州第二激素制药厂。精子梯度分离液(产品名称为:Sperm Grad)、洗精液(产品名称为:Sperm Rinse)为瑞典Vitrolife培养液系列。HEPES缓冲的人输卵管液(HTF)操作液、HTF培养液、卵裂培养液、囊胚培养液、血清蛋白替代品、胚胎培养矿物油等均为美国SAGE公司生产的Quinn’s系列产品。

1.1.3 主要仪器设备与耗材

IVF实验室VOC测定专用探头为丹麦Sparmed公司生产的Goossafe型号产品、Coda空气净化器、日本Nikon解剖显微镜、Olympus相差显微镜、Olympus倒置显微镜、日本Astec培养箱、美国Thermo 3111培养箱、丹麦Origio IVF Teach1800工作站、德国Labotect CO2浓度测定仪等。培养皿、试管、巴德氏吸管等耗材均为美国Falcon公司产品,一次性使用。

1.2 实验方法

1.2.1 VOC的测定

测定VOC的采样点需避开通风口,离墙壁距离大于0.5 m,高度在1.0~1.5 m,采样时关闭门窗,每5~8 m2为一个采样点,房间四周和中间位置都要采集到,记录每次采样数据。在IVF实验室建成后每个月测量1次VOC浓度,直至VOC浓度降至正常为止。测定时白天升温、清水擦洗墙壁和地面,夜间开启层流,第2天早上测定VOC浓度。

1.2.2 胚胎体外培养分组

按胚胎在培养环境中是否接触新装修培养室内空气分为实验组和对照组,实验组IVF的胚胎在单气培养箱内(培养箱型号为:Thermo 3111)培养,除6%的CO2外,胚胎接触的是培养室内空气(即开启层流24小时后含不同浓度VOC的空气);对照组的受精胚胎采用同样的单气培养箱,但此培养箱未放置于培养室内,而是在本楼层最外围的备用休息室内,无层流,但有多扇窗户与楼外空气流通,经多次测量室内VOC浓度与楼外相似。

1.2.3 VOC处理方法的效果比较

在开启层流的基础上装修完成后1周先测定VOC浓度,之后分别采用三种方法去除室内的VOC,包括活性炭表面吸附组、排风扇抽风组和空气净化器组,3组分别在3间培养室内进行,连续处理3个月后,持续测定记录1周的VOC浓度值,比较3组方法对VOC的处理效果。

1.2.4 小鼠促排卵和鼠卵获取

健康的雌性小鼠在下午的18点对其腹部消毒后腹腔内注射PMSG 10 U(0.1 ml),48小时后腹腔内注射HCG 10 U(0.1 ml),14小时后颈椎脱臼法处死雌鼠,打开腹部后找到并取出输卵管,用HTF 1023+10%血清蛋白替代品(SPS)洗涤去除血迹,然后将输卵管放入盛有2 ml HTF 1023+10%SPS的35 mm的培养皿中,用1 ml一次性注射器刺破输卵管膨大部,将切口处轻轻挤压,收集释放出的卵团及卵子,用HTF 1020+10%SPS洗涤3次后,转移到1 ml HTF 1020+10%SPS受精皿中,每个皿放15个卵子,放入37℃、6%CO2、饱和湿度的培养箱中等待受精。

1.2.5 小鼠精液的采集及处理

在IVF取卵日早上7:30颈椎脱臼法处死雄鼠,在无菌条件下取雄鼠附睾尾放入含2 ml HTF1023+10%SPS培养液的3001皿中,用无菌的1 ml一次性注射器刺破附睾尾,轻轻挤压出精子,制作精子悬液。采用密度梯度离心法处理精子悬液。

1.2.6 小鼠体外受精

采用集中受精法(3037皿,加矿物油覆盖),处理后的精子在显微镜下观察其活力及浓度,吸取精子悬液到含有卵子的培养液中,使终浓度为(1~2)×106/ml,放入37℃、6%CO2浓度和饱和湿度的培养箱中孵育受精。

1.2.7 原核胚及卵裂期胚胎的观察与培养

精卵培养16~18小时后,倒置显微镜下观察受精情况,24小时观察2-细胞胚胎,44小时观察4-细胞胚胎,68小时观察8-细胞胚胎,116小时观察囊胚的发育情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件录入数据建立数据库,定量数据采用均数±标准差描述,组间比较采用t检验,组间多重比较采用LSD法。定性数据采用百分比描述,均为双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验室装修完成后不同时段VOC浓度的比较

本研究在装修后第3个月测定的VOC浓度与对照的室外空气无明显差异,因此共收集了3次的测定情况,后续未再继续测量VOC浓度。装修后第1、2月实验组VOC浓度均高于对照组(P<0.05),第3个月实验组VOC浓度与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 不同VOC浓度鼠胚IVF胚胎发育的情况

装修后第1、2个月时,实验组的受精率、2-细胞率、卵裂率和囊胚率明显低于对照组(P<0.05)。装修后第3个月时,以上4项指标与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。装修后第1、2、3月时实验组的受精率、2-细胞率、卵裂率和囊胚率逐渐增加,两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

①ppb为十亿分率

2.3 不同VOC去除方法的比较

采用单纯活性炭表面吸附、空气净化器和排风扇抽风方法处理后VOC均低于处理前,差异有统计学意义(P<0.05);空气净化器VOC的去除率(60.15±2.18)%高于排风扇抽风(51.88±2.23)%和活性炭表面吸附(28.95±1.35)%,差异有统计学意义(t=35.34,P=0.00)。见表2。

3 讨论

根据世界卫生组织的定义,VOC是沸点在50℃~260℃、室温下饱和蒸汽压超过133.32 Pa的易挥发性物质,主要包括甲醛、烷类、芳烃类、酯类和其他等。新建的IVF实验室在建造过程中会不同程度地使用人造板材、地板胶和粘合剂等建筑材料,这些材料会产生不同程度的VOC;同时IVF实验室相对密闭,仪器设备集中放置,易致VOC在室内积聚。虽然IVF实验室的高效层流设备可以部分换气及过滤空气中的尘埃粒子,单纯的高效层流在正压的条件下不能有效去除室内VOC。

3.1 新建成的实验室VOC水平及其对鼠IVF胚胎发育的影响

尽管使用不锈钢板材及环保材料,我们发现IVF实验室建成后室内VOC浓度在第1、2个月时仍然显著高于室外环境中的VOC含量(P<0.05),虽然此浓度随着我们使用通风及活性炭过滤吸附等处理而逐渐降低,在实验室建成后一段时间内仍然高于正常环境值。本生殖中心的新建实验室在建成后3个月时室内VOC才降低至室外的数值。因此,在实验室建成后至正式运作之前,需要延长实验室空气环境处理的时间或加大处理的力度对在装修过程中产生的VOC进行去除。如增加室内空气净化器的数量,实验室彻底通风换气,层流系统中加装活性炭滤膜及增加更换滤膜的频率,升高实验室及仪器设备的温度增加VOC的释放等[2]。待实验室内VOC含量完全正常后方可投入运作。

为了分析不同浓度VOC对体外培养胚胎发育的影响,尤其是对胚胎形态、发育速度等临床IVF-ET中常规观察指标的影响,我们利用小鼠胚胎模型,比较了IVF实验室处于不同浓度的VOC环境下鼠胚体外发育的情况,为后续IVF实验室的正式运作和安全使用提供理论依据,以及为今后临床IVF中可能出现的培养环境中VOC升高提供警示指标(其他原因导致的VOC升高)。我们的结果发现,实验室刚建成时VOC浓度最高(384.00±5.16 ppb),在此时段的VOC环境中小鼠胚胎体外受精率、2-细胞率、卵裂率和囊胚率显著降低,明显低于对照组VOC浓度为199.00±2.58 ppb时的各项指标,表明高浓度的VOC严重影响小鼠的IVF与细胞卵裂,胚胎发育受阻。Hall等[3]在对人类胚胎体外培养发现,当培养环境VOC浓度为580 ppb时,胚胎发育成囊胚的比例明显下降,VOC浓度超过2100 ppb时,几乎无囊胚形成。Frutos等[4]在空气污染对受精的影响的研究中发现,污染的空气会造成受精率下降和流产率升高,认为空气质量不良会对受精和胚胎发育具有严重的影响。Nieuwenhuijsen等[5]研究发现,VOC和甲醛等污染的空气会使人类受精率下降。尽管我们24小时使用层流换气及空气过滤,以及室内空气净化器的内部空气过滤吸附,实验室内VOC水平在第2月时测定仍高于室外环境的对照组(P<0.05)。空气处理3月后VOC含量与室外环境VOC相当,为210.25±2.22 ppb。当VOC浓度逐渐降低时,其对应的体外受精率、胚胎卵裂率、囊胚形成率相应升高,3月后实验室VOC数值与环境空气无差异,其相应的小鼠形态与生长发育指标也与对照组无显著差异,提示培养环境空气中VOC浓度与小鼠胚胎体外发育之间存在一定的关系。但是,由于培养环境中空气VOC的变化是随时间而变化,在不同VOC浓度下进行的小鼠胚胎体外培养涉及不同时间、不同批次的小鼠胚胎,因而存在培养液、小鼠胚胎等其他影响因素,因此本实验只是观察性的研究,尚不能表明VOC浓度与小鼠胚胎发育之间存在严格的剂量依赖关系。

3.2 不同VOC去除方法对室内VOC处理效果的影响

新建IVF实验室在投入使用前,需要去除室内的VOC,IVF实验室最常采用的方法为活性炭吸附和通风换气。我们使用层流换气、单纯活性炭吸附、排风扇通风和空气净化器等方法去除VOC。这些方法均可以去除部分室内VOC,其中空气净化器的效果最好,去除率最高,其原因为其将室内含有VOC空气主动抽入机器,通过内置的活性炭和高锰酸钾和高效层流滤网过滤后排出洁净的空气,在这个过程中可以将大部分VOC吸附在活性炭内部微细的网孔表面,降低室内VOC浓度。Khoudja等[6]研究发现与本研究的结果一致。排风扇抽风是通过交换室内外空气来降低培养室内的VOC,由于IVF实验室设计相对比较密闭,门窗比较少,排风扇抽风无法达到排出室内大量VOC的目的,对VOC的去除效果不如空气净化器。单纯活性炭吸附是利用其内部的超细微孔被动吸附有限的周围环境中的VOC,吸附范围有限,不能主动抽吸过滤室内空气,所以对VOC的去除效果不如另外两种方法。因此,在封闭的IVF实验室空气净化器是降低VOC的最有效方法。Forman等[7]研究也发现空气净化器可以减少实验室VOC含量,从而提高空气质量。

新建IVF实验室内VOC浓度在一定时间段内高于周围环境,升高的VOC浓度影响小鼠精卵IVF、胚胎卵裂及囊胚形成,因此新建IVF实验室应在VOC含量完全正常后方可投入使用。通过降低空气中VOC含量,可以改善小鼠胚胎的体外发育。空气净化器较其他方法更能有效降低IVF实验室内VOC含量。

参考文献

[1]Worrilow KC,Huynh HT,Bower JB,et al.A retrospective analysis:seasonal decline in implantation rates(IR)and its correlation with increased levels of volatile organic compounds(VOC)[J].Fertil Steril,2002,78(Suppl 1):s39.

[2]Esteves SC,Bento FC.Implementation of air quality control in reproductive laboratories in full compliance with the Brazilian Cells and Germinative Tissue Directive[J].Reprod Biomed Online,2013,26(1):9-21.

[3]Hall J,Gilligan A,Schimmel T,et al.The origin,effects and control of air pollution in laboratories used for human embryo culture[J].HumReprod,1998,13(4):146-155.

[4]Frutos V,Gonzalez-Comadran M,Sola I,et al.Impact of air pollution on fertility:a systematic review[J].Gynecol Endocrinol,2015,31(1):7-13.

[5]Nieuwenhuijsen MJ,Basagana X,Dadvand P,et al.Air pollution and human fertility rates[J].Environ Int,2014,70(9):9-14.

[6]Khoudja RY,Xu Y,Li T,et al.Better IVF outcomes following improvements in laboratory air quality[J].J AssistReprod Genet,2013,30(1):69-76.