糖尿病大鼠肾病

糖尿病大鼠肾病（精选10篇）

糖尿病大鼠肾病 篇1

糖尿病肾病是糖尿病人群重要代表性的并发症之一, 现已成为终末期肾脏病的第二原因, 仅次于各种肾小球肾炎, 发病率呈上升势头。由于代谢功能失调呈现变化多样性, 所以终末期肾脏病甚至比其他肾脏疾病治疗更加困难。糖尿病肾病的发病机制受多种因素影响, 氧化应激的作用尤显突出, 因为糖尿病肾病时氧化应激的存在, 导致肾脏组织中抗氧化酶裂解氧化, 所以抗氧化能力明显降低。白藜芦醇一种具有天然生物学活性物质的抗氧化剂, 其毒副作用较低, 既往有研究表明可改善糖尿病肾病大鼠的氧化损伤并提高抗氧化酶的活性, 抑制损伤因子的活性[1~3], 白藜芦醇可能通过影响氧化应激/NF-k B通路改善糖尿病视网膜病变发展[4]。本试验研究白藜芦醇通过多种机制改善糖尿病大鼠体内高血糖、肌酐、尿素氮产生保护治疗效应, 并探讨其通过干预影响糖尿病肾病氧化应激反应而起到对肾脏保护效果。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验选用2月龄, 体重 (160±20) g, Wistar大鼠60只, 均为雄性大鼠 (购自长春亿斯动物实验中心) 。适应性喂养1周后, 随机进行分组;Ⅰ正常对照组;Ⅱ糖尿病模型组;Ⅲ白藜芦醇治疗组, 每组20只。各组大鼠饲养环境一致, 饮用水为自来水、饲料和垫料均已消毒。肾病组模型与白藜芦醇组模型禁食后一次性腹腔注射stz (溶于新鲜配制的0.1mol/L的柠檬酸缓冲液, p H4.5) 60mg/mg。静脉采血测空腹血糖并测尿蛋白值, 确定判断肾病模型建立达到成功。

1.2 实验方法

1.2.1肾病模型建立后适应性喂养7d, 白藜芦醇治疗组肾病糖尿病模型进行灌胃干预100mg/kg·d, 其他两组灌胃等量生理盐水。分别在4w、8w、12w采血检测血肌酐尿素氮, 并分别于4w、8w、12w末各取24h尿样标本测尿蛋白含量。

1.2.2用化学比色对照法测MDA, T-SOD, GSH-PX, 取12w末各模型组4只动物标本, 麻醉状态下行肾脏切除术, 制作肾皮质组织匀浆清夜。

1.2.3 HE染色肾脏组织病理观察, 模型组各随机选4只动物, 按4w、8w、12w末以50mg/kg苯巴比妥麻醉切除肾脏术, 以观察各模型组肾小球系膜细胞, 血管以及肾小球基底膜厚度和细胞外基质蓄积情况。

1.2.4 PAS检测观察肾脏组织糖原类物质。

1.2.5免疫组织化学分析法镜下观察AFP、P53表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0正版软件, 变量数据采取 (±s) 并使用单因素访查分析统计法, 两组之间比较选t检验, 以P<0.05为显著性统计学意义。

2 结果

见表1~3, 图1~3。

*与Ⅰ组比较, P<0.05, #与Ⅱ组比较, P<0.05。

*与Ⅰ组比较, P<0.05, #与Ⅱ组比较, P<0.05。

*与Ⅰ组比较, P<0.05, #与Ⅱ组比较, P<0.05。

3 讨论

白藜芦醇, 又称芪三芬, 存在于葡萄、桑椹、花生、虎杖等植物和果实中的多酚化合物, 葡萄中含量最高, 是一种天然抗氧化剂并具有生物学活性。实验已证明白藜芦醇对超氧阴离子有强烈抑制作用, 具有羟自由基清除活性和抑制氧化剂的活性, 目前研究表明, 白藜芦醇可抑制氧化应激对糖尿病肾病肾脏起保护作用, 但其作用机制没有较权威的深入研究。现有研究结果显示白藜芦醇通过保护膜脂从而保护细胞膜而起作用, 增强机体抗氧化能力, 且其抗氧化效果强于维生素E等微量元素, 优点是副作用很小。白藜芦醇同时又抗炎、抗氧化、抗癌、调血脂, 治疗心肌缺血等作用。本实验研究通过建立糖尿病肾病大鼠模型, 观察肾功能和氧化应激个指标变化, 对白藜芦醇减轻糖尿病肾病损伤作用进行探讨[5,6]。

糖尿病肾病是糖尿病病人最重要的合并症之一。随着生活水平提高、膳食习惯改变在中国发病率呈上升趋势, 目前已成为终末期肾脏病的第二位原因, 仅次于各种肾小球肾炎。由于存在复杂多变的代谢功能紊乱, 发展到终末期肾脏病往往比其他肾脏疾病治疗恢复更加棘手。因此及时防治对于延缓糖尿病肾病的意义巨大。遗传因素、血流动力学异常、代谢异常、高血压、活性物质代谢异常都是糖尿病肾病的发病诱因。糖尿病肾病发病可通过肾小球滤过率改变, 蛋白尿出现, 持续蛋白尿, 终末期肾衰改变等不同临床体征表现。临床治疗依据开展不同病期针对性治疗, 控制血糖血压、终末期肾脏替代治疗、器官移植[7]。

氧化应激损伤导致肾脏血流动力学异常改变, 表现为肾小球高灌注、高滤过、血流量、GFR升高, 诱发肾组织局部糖代谢紊乱、非酶糖基化、多元醇通路激活、已糖胺通路代谢异常GBM增厚;细胞外基质蓄积, 出现肾小球结节样病变和微血管玻璃样改变, 并发生肾小球滤过膜蛋白屏障功能严重损害。氧化应激直接导致肾脏组织内的不饱和脂肪酸收到ROS攻击, 产生丙二醛导致肾脏细胞膜的各项生理平衡严重破坏, 生物膜通透性增加, 血浆蛋白成分大量透过内皮细胞产生沉淀物, 蓄积肾小球基底膜, 并使其增厚;红细胞膜过氧化反应, 降低膜的流动性, 提高对内皮细胞黏附作用;脏成肾组织细胞线粒体DNA破坏。间接损伤发生于肾小球系膜细胞, 如转录因子NF-k B和AP-1发生磷酸化后被活化, 启动不同种细胞因子转录 (内皮素-1、肿瘤坏死因子-a、单核细胞趋化蛋白-1) [8]。

通过本实验可以看到, 糖尿病肾脏模型组MDA值高于正常对照组, 白藜芦醇治疗组低于糖尿病肾脏模型组, 糖尿病肾病模型组T-SOD、GSH-px低于对照正常组, 白藜芦醇治疗组高于糖尿病肾病模型组。糖尿病肾病大鼠模型组存在明显的氧化应激损伤, 白藜芦醇用药组, MDA含量降低, T-SOD活力、GSH-px活力上升, 明显改善了应激损伤。

白藜芦醇治疗糖尿病肾病大鼠模型, 与未治疗组相比, 其氧化应激指标明显改观, 提高T-SOD、GSH-px活性, 抑制MDA含量, 对肾脏氧自由基代谢起到了积极有效的调节作用, 通过镜下观察细胞外基质糖原成分显著下降, 达到改善肾内血流动力学、减少蛋白尿排出、抑制系膜细胞、成纤维细胞、巨噬细胞活性;改善滤过膜通透性使内生肌酐清除率下降等作用保护肾脏功能。观察模型组4w、8w、12w病理组织HE染色下肾小球单位改变, 对照组肾小球单位均无特异性改变, 肾小球单位完整, 境界清楚。肾病模型组4w开始出现肾小球改变, 镜下表现为毛细血管基底膜增厚, 系膜细胞增生, 简直细胞体积增大, 呈弥漫性系膜增生性改变, 到8w、12w镜下改变更加明显符合糖尿病肾病病理学特点, 较典型改变时可出现出现细动脉玻璃样变及食酸性空泡样变。观察模型组4w、8w、12w大鼠肾脏病理组织PAS法染色下肾小球单位及糖原沉积性改变, 如镜下所示对照组肾小球单位均无特异性改变, 肾小球单位完整, 境界清楚。很少有免疫球蛋白的沉积。肾病模型组4w开始镜下出现毛细血管基底膜增厚伴随连续的颗粒状沉积分布PAS反应阳性, 系膜区呈边界清楚的颗粒状沉积, 但沉积物强度较弱, 系膜增宽 (+) , 细胞中度增生, 到8w末时肾脏病理组织镜下沉积物强度明显增高累及小于80%呈阶段性分布, 到12w末时呈连续性弥漫性分布颗粒沉积面积大于80%。系膜细胞增生和系膜区糖原符合物的沉积也较突出, 毛细血管团位于肾小囊内但血管腔变窄, 间质细胞体积增大。治疗组组织镜下改变, 4w毛细血管基底膜增厚出现非连续性颗粒状沉积分布, 从8w镜下改变开始到12w镜下所见, 基底膜增厚不明显, 颗粒状沉积信号较弱可视为阴性表达。白藜芦醇干预情况显示, 改善了肾小球基底膜的滤过作用, 糖原沉积减少, 达到了积极良好的干预效果。

由上可见, 白藜芦醇本试验中糖尿病肾病大鼠模型起到了有效的干预修复效果, 血清生化指标、肾功均得到积极改善, 通过对氧化应激反应过程中MDA含量降低, T-SOD、GSH-px活力得到提高, 免疫组化VPF表达情况改善了肾小球血管滤过功能, 综合各方面实验结果证实, 白藜芦醇通过有效抑制氧化应激而达到了保护肾脏功能的功效, 而对糖尿病肾病联合多效配伍干预治疗也成为未来探索方向。

摘要：目的:研究白藜芦醇对实验用糖尿病肾病大鼠氧化应激指标及血管通透性因子VPF表达的影响。方法:雄性Wistar大鼠, 随机分为正常对照组Ⅰ、糖尿病肾病模型组Ⅱ、白藜芦醇治疗组Ⅲ。Ⅱ组与Ⅲ组动物制备糖尿病肾病模型成功。Ⅲ组进行白藜芦醇灌胃干预, 100mg/kg·d, 其他两组灌胃等量生理盐水。分别在4w、8w、12w, 常规检测尿蛋白含量, 并检测血糖、血肌酐和尿素氮。在4w、8w、12w取肾脏标本制病理切片, 用PAS法制片观察糖原沉积, 用免疫组化法标记VPF表达。在12w末用化学比色对照法检测氧化应激指标MDA, T-SOD, GSH-PX的表达情况情况。结果:Ⅱ组大鼠血糖、血肌酐、尿素氮和尿蛋白明显升高 (P<0.05) 。Ⅱ组肾脏病理组织VPF表达阳性度高于Ⅰ组, Ⅲ组低于Ⅱ组表达;Ⅱ组大鼠血糖、血肌酐、尿素氮和尿蛋白明显升高;Ⅱ组肾脏病理组织VPF表达阳性度高于Ⅰ组, 而Ⅲ组又低于Ⅱ组表达;氧化应激各项指标通过对照比较, Ⅲ组与Ⅱ组比较MDH降低, T-SOD、GSH-px均升高。结论:白藜芦醇有效降低了糖尿病肾病大鼠血糖、肌酐、尿蛋白等生化指标, 并有有效改善了MDH、T-SOD、GSH-px等氧化应激指标, 降低了血管通透性因子VPF的表达, 起到了肾脏修复作用。

关键词：糖尿病肾病,氧化应激,血管通透性因子

参考文献

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糖尿病肾病护理 篇2

83例，其中并发肾脏病变者 24 例。 通过对DN病人采取以下几方面的护理措施，对延缓了DN的发生取得了一定效果。

1临床资料

1.1一般资料：糖尿病诊断符合WHO标准，患者24小时尿蛋白排泄在30~300mg，所有患者无急、慢性肾炎、尿路感染、发热、酮症酸中毒及近期应用肾毒性药物史。本組24例，男10例，女14例；年龄7~72岁，平均年龄53岁；病程最短2个月，最长15年，平均4.6年；高度水肿3例，中度水肿8例，低蛋白血症 2例，血压高者6例。

1.2结果：本组24例，治愈5例，好16转例，无效3例。

2护理对策

2.1一般护理:(1)注意环境清洁，空气流通，保持被服清洁，减少感染机会。(2)轻病人注意劳逸结合，无高血压，水肿不明显，无肾功能损害，蛋白不多的患者可适当参加体育锻炼以增强体质，预防感染；对水肿明显，血压较高病人或肾功能不全的患者，强调卧床休息到水肿消退。 　(3) 监测体重，每日2次，每次在固定时间穿着相同衣服测量。 (4)加强皮肤护理。因患者免疫机能低下，水肿时循环障碍易用发生损伤和感染，特别是伴有周围神经病变时，更要保持皮肤干洁、勤换衣服、翻身、避免皮肤擦伤，防止褥疮及坏疽的发生(5) 每天记录24小时出入量，水的摄入量应控制在前一日尿量加500ml为宜。

　 2．2饮食护理:(1)教会病人及其家属根据标准体重、热量标准来计算饮食中的蛋白质、脂肪和碳水化合物的含量，并教会病人如何分配三餐食物，及合理安排膳食。(2) 提供优质高蛋白饮食，如牛奶、鸡蛋、鱼类，肾功能不全时要控制植物蛋白的摄入。(3) 限制钠的摄入，每日膳食中钠应低于3g，氮质血症期限蛋白摄入<0.5g。少尿时应控制钾的摄入，保证全面营养。 　

2.3病情观察:(1) 做好血钾、尿糖、尿酮体的监测及记录，以防止高渗性昏迷及酮症酸中毒的发生。(2)

糖尿病大鼠肾病 篇3

1 实验材料

1.1 实验动物

8周龄健康雄性SD大鼠60只,体重180～220g,由浙江中医药大学动物中心提供。

1.2 实验药物

肾消方主要由黄芪、人参、桂枝、升麻、桃仁、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、地龙等组成,水煎浓缩至2g/ml,4℃保存。厄贝沙坦片(安博维):杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司。

2 方法

2.1 模型制备及分组给药

选用健康SD大鼠68只,雌雄各半,随机分为假手术组8只和60只手术组。手术组大鼠腹腔麻醉状态下行左肾切除术,术后1周尾静脉注射链脲佐菌素(35mg/kg),FBG≥16.65mmol/L认定为模型成功。造模大鼠随机分为模型组(20只):纯净水灌胃,肾消方组(20只):肾消方20g/kg·d-1灌胃,厄贝沙坦组(20只):安博维6mg/kg·d-1灌胃。假手术组大鼠在腹腔麻醉状态下,打开腹腔,剥离肾脏脂肪包膜,关闭腹腔,缝合切口,术后1周尾静脉注射生理盐水0.5ml,等量纯净水灌胃。实验共进行16周。

2.2 观察指标与方法

2.2.1 一般指标 各组大鼠分别于造模后和实验结束后置于代谢笼准确收集大鼠24小时尿量,目内眦取血;采用焦榈酚红-钼酸盐显色法测定24小时尿蛋白定量;全自动生化分析仪测定血糖、血脂、血尿素氮、肌酐。第16周末对右肾进行原位灌洗后处死大鼠。

2.2.2 p22phox蛋白含量测定 Western Blot印迹分析。

2.2.3 肾皮质Cu,Zn-SOD活性测定 化学比色法。

2.3 统计方法

数据以undefined表示,采用SPSS11.0统计软件,组间比较应用one-way ANOVA分析。

3 结果

3.1 各组大鼠一般指标检测结果

见表1～2。

与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05(下同)

3.2 各组大鼠肾脏NADPH氧化酶亚单位p22phox蛋白表达检测

模型及各用药组肾脏p22phox蛋白表达显著高于假手术组。治疗各组大鼠肾脏p22phox蛋白表达显著降低,见图1。

3.3 各组大鼠肾皮质Cu,Zu-SOD活性比较

见表3。

与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01

4 讨论

肾消方为临床治疗糖尿病肾病的有效方剂,本文实验结果提示肾消方可降低DN大鼠血糖,降低尿素氮和24小时尿蛋白含量。

糖尿病肾病的典型病理改变是结节性肾小球硬化,在这个过程中,氧化应激损伤起着主要作用,高糖诱导ROS增多,仍然通过PKC激活NADPH氧化酶,正反馈产生ROS,后者通过激活MAPK和JAK/STAT信号转导促进MCP-1、TGF-β1、PAI-1等炎症因子过度表达,从而促进细胞外基质的增加和肾小管间质纤维化[1,2]。肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均表达NADPH氧化酶,NADPH氧化酶是ROS另一个重要来源。NADPH氧化酶主要由4种亚单位组成,即p22phox、gp91phox、p47phox和p67phox,在肾脏系膜细胞,已确定含有p22phox、p47phox和p67phox,是否含有gp91phox亚单位尚不确定。正常情况下在细胞内可低水平表达,但在病理情况下显著增加。国外其他学者的研究结果显示,DM大鼠肾脏NADPH氧化酶活性和NADPH氧化酶亚单位(p22phox)水平升高[3],氧化应激水平升高,作用于肾脏可引起肾组织损伤。本实验结果显示DN大鼠肾脏抗氧化酶Cu,Zn-SOD水平明显低下,在糖尿病肾病大鼠肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞均见NADPH氧化酶表达增高,而肾消方能显著降低DN大鼠肾脏p22phox蛋白表达,减少蛋白尿,提高肾组织Cu,Zn-SOD活性,提示肾消方能显著降低DN大鼠肾脏氧化应激水平,减轻氧化应激对肾组织的损伤,产生肾脏保护作用。

参考文献

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[2] Francesco P.Pathogenetic mechanisms of diabetic nehropathy.J Am Soc Nephrol,2005,16:30.

糖尿病肾病食疗方 篇4

一、冬瓜瘦肉汤

原料：冬瓜400克，猪瘦肉150克，菠菜50克，盐、姜、葱适量。

制法：冬瓜去皮洗净切小块。菠菜洗净切段。猪瘦肉洗净切丝，与姜、葱放锅内加油略炒，加适量水烧开，投入冬瓜、菠菜烧滚，加盐调味即成。

功用：此汤有养血祛湿消肿之功，适用于糖尿病肾病。

二、银鱼炒肉丝

原料：银鱼干25克，猪瘦肉100克，韭黄50克，鲜生姜、淀粉适量。

制法：银鱼干水发洗净，入油锅内炸香捞起；猪瘦肉切丝用淀粉拌匀，备用；油锅内下生姜丝爆炒，再下肉丝炒至将熟时，加入韭黄炒至熟，最后下银鱼干炒匀即可。

功用：适用于糖尿病肾病伴下肢浮肿者。

三、香菇豆腐汤

原料：豆腐2块，香菇30－50克，食盐、胡椒粉、葱少许，蒜泥豆瓣酱1汤匙。

制法：豆腐洗净，切块，放入油锅内，炸至金黄色变酥时捞起，滤去油分。锅内放油烧热，爆香蒜泥豆瓣酱，加入适量清水，煮开，放入冬菇，再煮片刻，至汤浓。最后加入脆豆腐及适量盐及胡椒粉调味，盛起，撒上葱花，趁热食用。

功用：此汤有降糖益肾之功，适用于糖尿病肾病初起者。

四、豆角炒牛肉

原料：牛肉150克，青豆角250克，大白菜100克，油、盐、姜、葱、蒜各适量。

制法：青豆角放锅内加油炒至大半熟铲起。牛肉切粗丝。油锅内爆炒姜、葱、蒜，再下牛肉丝炒至将熟时，加入青豆角、大白菜炒匀至熟透。

功用：适用于糖尿病肾病。

五、木耳鲜藕滑肉片

原料：猪瘦肉200克，木耳25克，藕100克，姜、葱、酱油、糖、麻油各适量。

制法：将藕去皮洗净，切成细丝。瘦肉切丝，放入酱油1茶匙拌匀略腌。木耳浸水洗净，切丝待用。锅内放油烧热爆炒姜、葱，入肉丝炒熟，再放木耳及藕丝炒匀即可食用。

功用：适用于糖尿病肾病。

六、海带冬瓜汤

原料，海带200克，紫菜50克，冬瓜250克，无花果20克。

制法：冬瓜去皮洗净切成小方块。海带用水浸发，洗去咸味。无花果洗净。锅内放适量水，入冬瓜、海带、无花果，慢火煲熟，下紫菜滚片刻即成。

功用：适用于糖尿病肾病浮肿明显者。

七、玉米须粥

原料：新鲜玉米须100克，小米50克，精盐少许。

制法：先将玉米须洗净，加水适量，煎汁去渣，加入小米煮粥，粥将熟时，调入精盐，再煮1－2分钟即可。

功用：适用于糖尿病肾病久治不愈者。

八、肉丝炒南瓜

原料：南瓜300克，猪瘦肉150克，盐、葱、蒜、麻油各适量。

制法：猪瘦肉切丝用调料拌匀，南瓜切块，锅内放麻油爆炒南瓜，下葱、蒜爆香，下肉丝炒熟即成。

糖尿病大鼠肾病 篇5

1材料

SD雄性大鼠60只, 体重160～180g, 鼠龄2～3月, 购自首都医科大学实验动物科学部。加味消渴康 (由生黄芪、山萸肉、生薏仁、水蛭、葛根、丹参、决明子组成) :购自北京祥威药业公司;氯沙坦:购自杭州默沙东制药有限公司, 生产批号:100438。链脲佐菌素 (STZ) :美国Sigma公司;兔抗MMP-9多克隆抗体:美国abcam公司;兔抗TIMP-1多克隆抗体:美国abcam公司。

2方法

2.1 动物模型制备及分组

本实验采用单侧肾切除加腹腔注射链脲佐菌素的方法制作DN大鼠模型, 血糖浓度≥16.7 mmol/L, 尿糖定性>+++, 确定DN造模成功[2]。将造模成功的大鼠随机分为正常组、模型组、氯沙坦组 (5.2mg/kg·d-1) 、加味消渴康小剂量组 (13.125g/kg·d-1) 、加味消渴康中剂量组 (26.25g/kg·d-1) 、加味消渴康大剂量组 (52.5g/kg) , 另取大鼠8只作正常对照, 每日1次, 连续灌胃12周, 正常组及模型组每日灌服等量蒸馏水。

2.2 标本采集和观察指标检测

各组大鼠于给药后第6周末和第12周末进行眶下静脉取血, 运用全自动生化分析仪测定血生化水平。于第12周末进行肾脏取材, 肾组织常规制片, 运用免疫组化法测定肾组织MMP-9和TIMP-1的蛋白表达, 400倍镜下随机选择10个视野, 并用图文处理系统进行分析。

2.3 统计学处理

采用SPSS13.0 for Windows进行统计处理, 计量数据采用均数±标准差undefined表示, 组间比较采用单因素方差分析法和LSD检验。

3实验结果

3.1 各组大鼠肌酐 (SCr) 、尿素氮 (BUN) 水平比较 见表1。

与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较◆P<0.05, ◆◆P<0.01;与氯沙坦组比较▲P<0.05;与加小组比较★P<0.05, ★★P<0.01

3.2 各组大鼠肾组织MMP-9、TIMP-1表达的测定 结果见表2。

MMP-9表达主要位于肾小管及肾小管间质。正常组显色最重;模型组显色最轻。氯沙坦组、中药三剂量组与模型组比显色稍重。TIMP-1表达主要位于肾小管及肾小管间质。正常组显色最轻;模型组显色最重;氯沙坦组、中药三剂量组与模型组比较显色稍浅。积分光密度值比较见表2。

与正常组比较*P<0.05;**P<0.01;与模型组比较◆◆P<0.01

4讨论

近年来的研究表明, MMPs/TIMPs系统在糖尿病肾病ECM的异常积聚方面起了重要的作用。MMPs是多种类型胶原蛋白、明胶、纤连蛋白等的水解酶[1]。TIMPs是MMPs的特异性抑制因子, 它们能够形成MMP-TIMP复合体, 从而阻断MMPs与底物结合, 因此TIMPs过度表达可以抑制MMPs对ECM的降解作用;二者的相互作用影响着ECM的代谢平衡[2]。

加味消渴康由生黄芪、山萸肉、生薏仁、水蛭、葛根、丹参、决明子组成。生黄芪、山萸肉为君药, 能够益气养阴、培补肾元, 扶助正气而使湿浊不生;生薏仁、葛根为臣药, 祛除湿浊且养阴生津;决明子、丹参、水蛭共为佐使药, 既能活血祛瘀, 又能使湿浊从大便排出, 使邪有出路。全方针对糖尿病气阴两虚, 肾元亏虚, 痰瘀互结的病机, 具有益气养阴、补益肾元、祛瘀化痰的功效。现代药理研究亦证实:黄芪、生薏米能降低血糖[3];山萸肉能够降低尿素氮;葛根、决明子、丹参、水蛭能够改善肾脏微循环[4,5,6,7]。

本实验结果表明, 加味消渴康能够降低DN大鼠SCr及BUN, 并能调节MMP-9和TIMP-1的表达, 推测加味消渴康可能是通过作用于MMP-9/TIMP-1系统来调节ECM的代谢, 从而对DN大鼠起到治疗作用, 其具体机理有待于进一步研究。

参考文献

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糖尿病大鼠肾病 篇6

关键词：健脾滋肾开郁散结,中医药,糖尿病肾病,肾组织病理学,大鼠

糖尿病肾病 (diabetic nephropathy, DN) 是糖尿病最常见的严重慢性微血管并发症之一, 根据美国疾病控制中心统计资料显示, DN患者占糖尿病总人数的67%以上。国内报道:DN占糖尿病总人数的20.0%~23.4%, 近年来随着患者寿命的延长, 其发病率呈增高趋势, 最新报道已达32.8%。DN是导致慢性肾功能不全的常见原因, 在终末期肾病患者中约1/3是由DN引起的, 已成为糖尿病患者的主要死因[1]。其主要病理改变为肾小球肥大, 基底膜增厚, 肾小球及小管细胞外基质积聚, 最终出现肾脏纤维化[2,3]。临床研究表明, 中医药在对本病的早期预防, 延缓其病程进展方面日益显现出独特的优势[4]。笔者根据《内经》“二阳结谓之消”等相关理论结合多年临床实践, 运用健脾滋肾开郁散结法治疗DN取得了满意的疗效。本研究旨在探讨健脾滋肾开郁散结中药干预治疗对DN大鼠肾脏损伤的保护作用, 为该法防治DN的临床应用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

雄性SD大鼠40只, SPF级, 体重 (200±20) g, 北京大学 (医学部) 实验动物中心提供[许可证号SCXK (京) 2011-0012]。

1.2 药品与试剂

1.2.1 药物

健脾滋肾开郁散结中药由黄芪30 g、山药18 g、玄参12 g、沙苑子12 g、茯苓10 g、苍术6 g、花粉12 g、怀牛膝15 g、生石膏18 g、西洋参10 g、绿豆衣10 g、薏苡仁12 g、三七5 g组成。全部药物按传统方法水煎过滤, 浓缩至每毫升含生药1.8 g的溶液, 置于4℃冰箱备用。盐酸苯那普利 (北京诺华制药有限公司, 批号X2062) , 格列喹酮 (北京万辉双鹤药业有限责任公司, 批号1131247) 。

1.2.2 试剂

链脲佐菌素 (STZ, Sigma公司, 批号080412) 。

1.3 主要仪器

GT-1640型京都血糖仪及血糖仪试纸 (日本京都) , 7170全自动生化分析仪 (日本日立) , Olympus BX51光学显微镜 (日本奥林巴斯) , 大鼠代谢笼 (杰伟福北京分公司) 等。

1.4 方法

1.4.1 模型建立与分组

SD大鼠适应性喂养1周后, 按体重随机分出10只, 作为正常对照组, 常规饲养 (饲料由河北北方学院动物室提供) 。其余35只大鼠给予高糖高脂饲料 (猪油10%, 蔗糖20%, 胆固醇2.5%, 胆酸钠1%, 常规饲料66.5%) 饲养4周后, 禁食12 h, 一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg (临用前用0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲液配制) 。72 h后尾静脉测定随机血糖, 连续3 d随机血糖16.7 mmol/L以上的大鼠视为造模成功。正常对照组, 以等量生理盐水腹腔注射。将成模的30只大鼠, 随机分为模型组、健脾滋肾开郁散结中药组 (简称中药组) 、盐酸苯那普利加格列喹酮组 (简称西药组) , 每组10只。中药组以健脾滋肾开郁散结中药煎液[14.2 g/ (kg·d) ]灌胃, 西药组以盐酸苯那普利[蒸馏水溶解15 mg/ (kg·d) ]及格列喹酮[蒸馏水溶解10 mg/ (kg·d) ]混悬液灌胃。正常对照组和模型组按体重换算等体积的生理盐水灌胃。连续给药12周。在实验过程中由于高糖死亡而不能完成血糖测定的大鼠不列入统计。

1.4.2 标本收集与观察指标

实验期间每周末记录大鼠体重, 观察大鼠的一般状态。实验的每4周末尾静脉取血, 血糖仪及血糖试纸测定各组大鼠的血糖;实验第12周末结束前1 d, 代谢笼收集24 h尿液, 测定24 h尿蛋白定量;12周末处死大鼠, 心脏取血, 全血离心, 取血清, 测定尿素氮 (BUN) 、血清肌酐 (Scr) 、三酰甘油 (TG) 、总胆固醇 (TC) 、血清白蛋白 (Alb) 的含量。

1.4.3 肾组织病理形态学观察

实验结束后取左肾福尔马林固定, 石蜡包埋, 切片4μm, 用于苏木精-伊红 (HE) 和过碘酸希夫 (PAS) 染色, 观察肾组织病理学变化。

1.5 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件对所得数据进行统计分析, 计量资料采用均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, 两两比较采用LSD-t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般情况

实验过程中正常对照组大鼠精神状态良好, 反应灵敏, 动作敏捷, 毛色光泽, 正常饮食, 体重稳定增加;模型组大鼠精神萎靡, 反应迟钝, 活动减少, 毛色黯淡无泽, 明显消瘦, 体重呈下降趋势, 并出现多饮、多食、多尿的症状;中药组、西药组与模型组比较, 上述症状体征得到明显改善。治疗前后各组大鼠体重变化见表1。

2.2 各组大鼠血糖和24 h尿蛋白定量比较

与正常对照组比较, 模型组血糖持续升高, 24 h尿蛋白定量明显升高 (P<0.01) ;中药组与西药组大鼠血糖逐渐降低, 到8、12周末时即明显低于模型组 (P<0.05或P<0.01) , 24 h尿蛋白定量明显降低 (P<0.01) ;中药组与西药组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

注:与正常对照组比较, *P<0.01;与模型组比较, △P<0.05

注:与正常对照组比较, *P<0.01;与模型组比较, △P<0.05, △△P<0.01

2.3 各组大鼠血清尿素氮、肌酐、胆固醇、三酰甘油、白蛋白的比较

模型组BUN、Scr明显高于正常对照组 (P<0.01) , 中药组和西药组BUN、Scr较模型组显著降低 (P<0.05或P<0.01) , 中药组与西药组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。模型组血清TC和TG明显高于正常对照组 (P<0.01) , 中药组和西药组较模型组明显降低 (P<0.01或P<0.05) , 中药组与西药组之间比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。模型组血清Alb较正常对照组显著降低 (P<0.01) ;中药组较模型组显著升高 (P<0.05) ;西药组与模型组、中药组TG、Alb比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。见表3。

注:与正常对照组比较, *P<0.01;与模型组比较, △P<0.05, △△P<0.01

2.4 各组大鼠肾组织病理改变

光镜下可见, 正常对照组肾脏组织结构清晰, 肾小球结构完整, 未见肾小球肥大, 肾小球毛细血管基底膜、系膜、基质未见明显异常改变 (图1) ;模型组可见肾小球肥大, 囊腔间隙变宽, 肾小球系膜基质增多, 部分肾小球系膜细胞增生, 毛细血管腔变窄, 肾小管上皮细胞水肿, 可见空泡变性, 肾间质可见炎症细胞浸润 (图2) ;中药组和西药组也均有不同程度病理改变, 但与模型组比较病理改变程度减轻, 肾小球系膜基质减少, 系膜细胞增生不明显, 间质少见炎症细胞浸润 (图3~4) 。

3 讨论

由于糖尿病发病率增高, DN已经成为我国终末期肾病并进入肾替代治疗的第二位病因, 且有日益增高的趋势。DN严重影响患者健康, 导致巨大社会、卫生经济负担, 如何更好地防治DN和延缓其进展是不能回避的重大课题。中医药在DN的治疗中积累了丰富的经验, 尤其在早期的防治上有显著优势[5]。

DN属中医“消渴”、“浮肿”等范畴。近代多数学者认为本病病位主要涉及肺、脾、肾三脏, 尤以肾脏为主, 病机为本虚标实, 主要以气阴两虚为本, 痰湿、瘀血阻滞为标, 故气阴两虚及血瘀是DN的基本病机, 对于DN的治疗, 历来以滋阴、清热、生津为纲[6]。由于本病患者久病多有气短神疲、不耐劳累、虚胖无力或日渐消瘦等表现, 是脾气虚弱、精血无源之故, 而日久必及于肾。本课题组根据《内经》“二阳结谓之消”, 以及藏象学的有关理论, 结合多年的临床实践, 认为本病的病位主要在于脾肾二脏, 脾肾亏虚、中焦气结为基本病机, 由于脾胃失和, 中焦气机阻滞, 上下水火失于通达, 日久致脾气虚弱, 精血无源;本病阴虚燥热, 日久损耗津液, 必汲肾精, 终致脾肾亏虚。治当健脾益气、滋肾养阴、开郁散结, 在临床治疗DN和多种慢性肾病中取得了较为满意的临床疗效。方中以黄芪、西洋参、茯苓健脾益气为君;山药、玄参、沙苑子、牛膝滋养肾阴为臣;黄芪与山药相互配合, 益气健脾, 张介宾在《类经·藏象》中指出:“黄芪能助脾气上升, 还其散精达肺之归, 淮山药补脾固肾, 以止小便频数。”生石膏、花粉甘寒折热, 润燥生津止渴;绿豆衣、薏苡仁既能除肠胃所蕴热毒, 又能清凉止渴;苍术味辛苦性温, 辛开苦降, 促使中焦气机通达, 升降协调;与玄参为伍一燥一润, 一阳一阴, 一脾一肾, 既能滋肾养阴, 又可制苍术辛燥之嫌;诸药合用, 共奏健脾滋肾、水升火降、上下通达、开郁散结之功, 使脾肾功能得以渐复。

现代药理研究发现, 黄芪有较好的降尿蛋白、降糖、降压和扩张血管作用[7], 并能通过明显降低糖尿病大鼠血糖、糖化血红蛋白, 抑制肾脏肥大, 减少微量白蛋白排出, 抑制肿瘤坏死因子α (TNF-α) 的表达, 减慢肾小球基底膜增厚[8]。黄芪及其单体有增强机体免疫功能、保肝、抗衰老、抗应激、抗菌、降压、降糖和利尿护肾等作用。在护肾方面, 黄芪单体除对肾小管损伤有一定的保护作用外, 对DN肾小球损伤亦有良好的保护作用。许多研究结果表明, 黄芪有益于糖尿病和DN早、中期的控制, 可以明显延缓DN的进展[9,10,11]。山药多糖具有降血糖、非特异性免疫功能[12]。薏苡仁能改善高糖高脂诱导氧化应激反应, 通过抗氧化作用保护β细胞免遭自由基风热损伤和抑制血清脂质过氧化物反应, 改善糖尿病的免疫功能。薏苡仁中所含的多酚化合物既有降血脂作用, 又有通过激活Nrf2/ARE以来的细胞保护基因, 对抗氧化应激性细胞损伤的作用[13]。绿豆皮水提液中含有的抗氧化物质如黄酮、皂苷、鞣质等经机体吸收, 通过清除ROS或提高抗氧化酶的活性, 提高机体的抗氧化能力[14]。

糖尿病早期于影像学上无明显改变, 随着病情的进展可出现肾脏的增大, 早期病理解剖可发现肾脏细胞的增生和肥大, 并且这种病理改变很大可能是相继发生。在DN早期主要是肾脏体积增大, 肾小球明显增大, 肾小囊变窄, 部分肾小球基底膜增厚, 系膜细胞增生, 肾小管上皮细胞气球样变性[15,16,17]。这与本研究模型组和治疗组病理切片结果显示一致。病理形态学能直接客观地反映出疾病的病理损害情况, 是研究疾病对组织损伤规律的重要指标, 也是评价药物疗效的重要指标[18,19]。

本实验中大鼠经高脂高糖饮食饲养4周后, STZ按30 mg/kg一次性腹腔注射给药, 72 h后尾静脉取血测血糖, 大鼠血糖显著升高, 93%的大鼠血糖>16.7 mmol/L, 其中有3只大鼠由于高血糖致死亡剔除实验。在12周的干预治疗过程中, 模型组大鼠体重持续明显下降, 并出现多饮、多食、多尿的糖尿病症状, 提示糖尿病模型复制成功。实验结束后通过生化检查及病理形态学检查发现模型组大鼠血糖、BUN、Scr、24 h尿蛋白水平均显著高于正常对照组 (P<0.01) , 光镜下可见模型组肾脏组织明显病理改变, 肾功能损伤程度严重, 提示已并发DN, 本实验模型成功建立。

本实验研究发现, 健脾滋肾开郁散结中药干预治疗后可有效改善DN大鼠的一般状况, 显著降低DN大鼠血糖及24 h尿蛋白含量, 并不同程度地降低了血清BUN、Scr、TG、TC水平, 说明健脾滋肾开郁散结中药对DN降低血糖的同时, 对早期DN大鼠肾功能的损伤具有干预作用。病理观察发现中药组大鼠肾小球基底膜增厚减轻, 系膜细胞增生程度明显改善, 肾小球和肾小管及间质的纤维组织减少, 提示健脾滋肾开郁散结中药可有效减轻肾小球系膜基质增生, 抑制肾组织纤维化, 从而改善肾组织形态学病变程度。

糖尿病大鼠肾病 篇7

1 实验材料

1.1 实验动物及药物

雄性Wistar大鼠, 70只, 体重 (220±20) g, 由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。动物许可证号:SCXK- (吉) 2007-0003。虫草益肾颗粒剂:由黑龙江中医药大学药学院协助制备;福辛普利 (蒙诺) :10mg/片, 中美上海施贵宝制药有限公司生产。

1.2 主要试剂及仪器

链脲佐菌素:美国Sigma公司;PMSF:美国Sigma公司;硝酸纤维素膜:美国Pall公司;牛血清白蛋白:美国Promega公司;预染蛋白marker:英国Biolabs公司;单克隆小鼠抗WT1抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG:美国Santa Cruz公司;BCA蛋白定量试剂盒:美国Pierce公司;血糖仪和试纸:美国强生公司;光学显微镜:日本Olympus公司;组织匀浆机:德国Heidolph公司;GS-800图像分析系统:美国Bio Rad公司。

2 实验方法

2.1 动物模型的制备及实验分组

大鼠70只, 适应性饲养1周后, 随机分为正常对照组 (10只) 和DN组 (60只) 。除正常对照组, 其余所有大鼠均行戊巴比妥钠腹腔麻醉 (30mg/kg) 后行右肾切除术, 术后2周腹腔单次注射链脲佐菌素 (STZ, 65mg/kg, 溶于0.1mol/L枸橼酸缓冲液中, pH值4.5) ;正常对照组注射相当体积的枸橼酸缓冲液。48～72小时后尾尖取血, 血糖仪测定血糖, 同时用尿糖试纸测定尿糖。以空腹血糖≥16.7mmol/L、尿糖 (+++) 以上为模型成模标准[6]。本实验4周后测24小时尿蛋白定量在30mg以上者, 表示DN模型成功。将DN组大鼠随机分为模型对照组、虫草益肾低剂量组、虫草益肾高剂量组、福辛普利组, 每组15只。

2.2 给药方法

正常对照组与模型对照组给予0.9%氯化钠注射液灌胃, 虫草益肾低剂量组予虫草益肾颗粒0.486g/kg灌胃, 虫草益肾高剂量组予虫草益肾颗粒0.972g/kg灌胃, 福辛普利组予福辛普利0.9mg/kg灌胃, 每天给药1次, 给药8周。实验过程中, 模型对照组死亡1只, 福辛普利组死亡2只, 低剂量组死亡3只, 高剂量组死亡2只。

2.3 观察指标及检测

2.3.1 24小时尿蛋白定量 考马斯亮蓝法测定24小时尿蛋白定量。

2.3.2 血生化指标测定 眼眶静脉丛采血, 分离血清, 留取标本后-20℃保存。空腹血糖 (FBG) :采用葡萄糖氧化酶法;尿素氮 (BUN) 、肌酐 (SCr) :采用脲酶UV法;胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、低密度脂蛋白 (LDL) :采用Synchron CX-7全自动生化分析仪测定。

2.3.3 肾脏组织标本采集与处理 第8周末大鼠腹主动脉采血后, 灌注4℃预冷生理盐水180 ml左右, 同时开放大静脉反复灌洗肾脏至其外观发白, 迅速取出左肾, 剥离肾包膜, 肾组织自肾门处切成两部分, 一部分用4%多聚甲醛固定2小时, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 石蜡包埋, 切片厚度4μm, 裱于用防脱片剂 (Poly-L-Lysine) 处理过的干净载玻片上, 置60℃恒温箱中烤片12小时后置4℃冰箱中保存, 以备HE染色应用;另一部分肾组织迅速投入液氮中冻藏, 供分子生物学检测。

2.3.4 肾组织WT1表达测定 Western blot分析。

2.3.5 大鼠肾组织nephrin表达的检测 RT-PCR。

2.4 统计学处理

计量资料以undefined表示, 采用单因素方差分析, 多个样本均数两两之间比较用q检验, 均采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。

3 实验结果

3.1 各组大鼠24小时尿蛋白、BUN、SCr、血糖、血脂的变化

结果见表1。

与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较#P<0.05, ##P<0.01;与低剂量组比较ΔP<0.05;与福辛普利组比较○P<0.05 (下同)

3.2 各组大鼠肾组织病理形态学变化

正常对照组肾脏呈蚕豆样, 形态规整, 颜色正常, 质地坚实, 无肿大, 切面皮质呈正常红褐色, 髓质颜色浅红, 皮、髓质分界清楚。模型对照组肾脏增大, 质地坚实, 切面皮质变薄, 皮髓质界限不清楚。虫草益肾高剂量组及褔辛普利组肾脏体积稍有增大, 肾组织外观呈正常红褐色与少量灰白色物相间分布, 切面可见皮质变薄, 皮、髓质界线尚清。光镜观察:模型对照组HE染色以肾小球直径增大、肿胀, 体积增大, 系膜基质增多, 毛细血管扩张充血为突出表现。正常对照组大鼠肾小球大小结构正常, 无系膜细胞及系膜基质增生, 肾小球基底膜无增厚。虫草益肾胶囊组, 肾小球毛细血管袢开放较好, 系膜细胞和系膜基质轻微增生, 肾小球系膜区轻度节段性增宽, 少量炎症细胞浸润, 部分小管上皮开始修复。小数肾小管扩张, 上皮细胞水肿减轻, 糖原空泡减少, 其改变以虫草益肾胶囊高剂量组为明显。福辛普利组病理改变和虫草益肾胶囊组相近。

3.3 各组大鼠肾组织WT1表达的测定

见表2。

3.4 各组大鼠肾组织Nephrin mRNA的表达

见图1。

A.正常组 B.肾高剂量组 C.福辛普利组 D.模型组 E.低剂量组

模型组表达最多, 虫草益肾低剂量与高剂量组表达减少与福辛普利组相当。

4 讨论

糖尿病肾病是糖尿病微血管病变的主要表现, 是临床中导致慢性肾功能衰竭和糖尿病病人死亡的主要原因之一。近年来有关中药治疗糖尿病肾病的研究越来越多, 并证实某些中药有一定的肾脏保护作用。该病中医辨证多属肾元亏虚、痰瘀互结、络脉瘀阻, 以健脾益肾、活血化瘀、芳化湿浊为治则。虫草益肾颗粒剂由发酵虫草菌粉、黄芪、制大黄、猫须草、水蛭、草豆蔻六味药物组成。以虫草为君药, 黄芪为臣药, 二药合用能健脾、补肺、益肾, 以补脏腑之虚损, 使肺得宣肃, 脾复健运, 肾主开合, 水道能调, 气旺血行, 从根源上减少痰、瘀的生成;大黄味苦, 性寒, 擅泻热毒、破积滞、行瘀血。黄芪与大黄一补一泄, 一升一降, 各司其职, 共为臣药;猫须草别名肾茶, 甘淡微苦, 性凉, 清热祛湿、排石利尿为佐使药;水蛭苦咸, 入血分, 破血逐瘀;草豆蔻芳香温燥, 入脾胃经, 燥湿化浊、温中止呕、行气消胀, 为佐使药。

本研究结果表明虫草益肾颗粒剂可以降低DN大鼠24h小时尿蛋白量, 降低血脂、BUN、SCr, 其降血糖作用较弱, 能减轻糖尿病肾病大鼠肾小球和肾间质硬化性损害, 证实确具保护肾功能作用。

研究证明足细胞损伤在糖尿病肾病的发生、发展过程中起重要作用[1]。足细胞可发生肥大、变性、进而从GBM上脱落、丢失, 致使硬化肾小球的GBM广泛裸露[2], 从而促进DN的发展。

近年来已认识到足细胞裂孔隔膜上的蛋白分子nephrin、WT1、podocin、CD2AP等是肾小球滤过屏障选择性功能的关键。其中nephrin是裂孔隔膜的主要成分, 其基因和/或蛋白表达异常在蛋白尿的发生机制中有重要作用。Nephrin是特异性表达于肾小球足细胞的一种跨膜蛋白, 定位于肾小球足突细胞裂隙隔膜, 属于细胞黏附分子中的免疫球蛋白 (Ig) 超家族成员。动物实验发现DN早期nephrin mRNA表达增加, 尿中出现nephrin蛋白, 后期nephrin mRNA表达逐渐下降, 由此推测DN早期nephrin mRNA表达[4]增加是对从尿中nephrin蛋白丢失的代偿性变化。本实验结果显示DN大鼠肾脏nephrin的表达减少, 应用虫草益肾颗粒后其表达增加, 以高剂量组为明显, 和福辛普利组比较无差异。

WT1是一个位于11号染色体短臂1区3带的抑癌基因, 其主要功能是通过识别、结合特异的靶基因以调节其转录, 在肾脏和泌尿生殖器官发育过程中发挥重要作用。何伟春等[5]通过对阿霉素肾病大鼠模型中WT1表达的研究, 证实了WT1的表达与蛋白尿之间具有相关性, 它可能参与了蛋白尿的发生发展。WT1定位表达在足细胞核, 它是足细胞特异性标志之一。它的突变可以引起以肾病及泌尿生殖器官异常为特征的一组疾病。

本实验研究结果显示随着蛋白尿的增加, WT1的表达反而增加, 经虫草益肾颗粒剂治疗后WT1表达减少, 由此提示nephrin、WT1的变化与蛋白尿的程度有关, 改变nephrin、WT1在肾小球中的表达, 可对DN患者实施更早期的治疗以延缓DN的发展。

参考文献

[1]张丽萍.足细胞和糖尿病及其肾病.国外医学.内分泌学分册, 2005, 25 (2) :121.

[2]Janssen U, Riley SG, Vassiliadou A, et al.Hypersion superimposed on type II diabetes in Goto Kakizaki rats induces progressive ne-phropathy.Kidney Int, 2003, 63:2162.

[3]Forbes JM, Bonnet F, Russo IM, et al.Modulation of nephrin in the diabetic kidney;associaton with systemic hypertension and in-creasing albuminuria.J Hypertens, 2002, 20:985.

[4]赵向娅, 冯晓蓓, 王朝晖, 等.尿足细胞及其相关分子在肾小球疾病中的表达.中国中西医结合肾病杂志, 2009, 10 (6) :489.

糖尿病大鼠肾病 篇8

关键词：糖尿病肾病,鹿茸方,转化生长因子-β1

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)病人常见的并发症之一,是导致终末期肾衰竭(ESRD)的重要原因。据美国DM协会统计,DN已经成为ESRD的主要原因。因此寻找防治DN的有效药物已成为全球DM界所共同关注的重点课题之一。鹿茸方能降低链脲菌素(STZ)DN模型大鼠的尿微量白蛋白排泄率(UAER),调节一氧化氮和内皮素代谢,下调DN大鼠肾脏醛糖还原酶(AR)mRNA的表达。同时既往运用基因芯片对DN模型大鼠肾组织部分基因表达筛选的研究结果表明,DN模型大鼠肾皮质转化生长因子-β1(TGF-β1) mRNA表达明显上调,提示与DN的发生发展有着一定的关系。本课题在鹿茸方既往研究基础上,运用链脲菌素诱导的DN大鼠模型结合鹿茸方的干预治疗,来观察鹿茸方对肾皮质TGF-β1 mRNA表达的影响,在分子水平上探讨鹿茸方防治DN的可能疗效机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar 大鼠45只(由中国科学院上海实验动物中心提供),体重180 g~200 g。

1.2 实验药物 鹿茸方(由菟丝子、鹿角片、肉苁蓉、生地黄、补骨脂、怀牛膝、益母草、黄芪组成水煎后浓缩为药液)每毫升相当于3 g生药,水飞蓟宾片(益肝灵片)由上海复星朝晖药业有限公司提供,每片38.5 mg。

1.3 试剂及仪器 TRIzol试剂(GIBco BRL公司);PCR Marker DL2000 Marker(Takara 公司);链脲菌素(Sigma公司);大鼠TGF-β1酶联免疫检测试剂盒(上海华涛生物技术有限公司提供)。高速低温离心机;-80 ℃冰箱;紫外分光光度计UV1240;DYNEX OPSYS MR 酶标仪;PTC 200 DNA扩增仪;雅培全自动生化分析仪;电泳仪; 凝胶成像系统;引物序列:TGF-beta1上游引物P1 5' CAATTCCTGGCGTTACCTTG3',下游引物P2 5'TTCTCTGTGGAGCTGAAGCA3',产物长度345bp,Beta-actin上游引物P1 5' GGCATCCTGACCCTGAAGTA 3',下游引物P2 5' AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG3', 产物长度614bp。RT-PCR检测所检测的基因及内参照β-actin引物序列由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.4 实验方法

1.4.1 DN造模及分组 健康雄性Wistar 大鼠45只,取出40只大鼠腹腔注射STZ(45 mg/kg,溶解在0.1 mol/L灭菌枸橼酸钠缓冲液中,pH4.0),另外5只仅注射等量的上述灭菌枸橼酸钠缓冲液。4周后用金属代谢笼收集大鼠24 h尿液,测定UAER,以24 h(30~300) mg者视为DN造模成功。

将造模成功的33只大鼠随机分为模型组(9只)、鹿茸方小剂量治疗组(8只)、鹿茸方中剂量治疗组(8只)、水飞蓟宾治疗组(8只)。另取5只为正常对照组,仅注射上述灭菌枸橼酸钠缓冲液。

1.4.2 给药方法 正常对照组和模型组给予生理盐水灌胃,每日每次2 mL,鹿茸方小剂量组和中剂量组分别为成人(按体重60 kg计算)剂量的10倍[相当于生药25 g/(kg·d)]、20倍[相当于生药50 g/(kg·d)]用药,给予鹿茸方水煎浓缩剂灌胃,水飞蓟宾组给予水飞蓟宾38.5 mg/(kg·d)灌胃,1次/日。上述处理用药8周。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 UAER测定 由曙光医院检验科生化室协助测定,采用美国雅培ABBOTT- AREOSET全自动生化分析仪测定,试剂为原装试剂。

1.5.2 TGF-β1含量测定 用大鼠TGF-β1酶联免疫检测试剂盒,ELISA法,然后用双缩脲法测定肾皮质组织蛋白质含量进行标化。

1.5.3 肾脏皮质TGF-β1 mRNA表达测定 ①总RNA的提取。将肾皮质组织,放入Eppendorf管中剪碎,加入TRIzol试剂1 mL,匀浆后加入200 μL氯仿,颠倒混匀后剧烈手摇,15 ℃~30 ℃下放置(2~3)min,4 ℃ 1 2000 r/min离心15 min,取上清约600 μL,加入500 μL异丙醇,常温下放置10 min,4 ℃,12 000 r/min离心10 min,弃上清,RNA沉淀中加入1 mLDEPC水配制的75%乙醇,混匀后,4 ℃,7 500 r/min离心5 min,弃上清,待试管完全干燥后加入DEPC水30 μL。取含有RNA液1 μL加100 μL DEPC水稀释,用紫外分光光度计定量OD260/OD280,此值在1.8~2.0,提示得到了纯净的总RNA。②RT-PCR反应。20 μL反转录体系包括:DEPC ddH2O 5 μL,总RNA 3 μg,100 pmol随机六聚体引物 1 μL,然后加双蒸水至11 μL,65 ℃ 10 min,孵育 5 min,然后置于冰上顺序加入:5×反转录酶缓冲液 4 μL,10 mmo/L dNTP 1 μL ,100 mmol/L DTT 2μL ,M-MLV 1μL ,RNasin 1 μL,37 ℃,60 min,-20 ℃保存。扩增结束后在2 % 琼脂糖凝胶上进行电泳,电泳缓冲液1×TAE,(30~45) min后在紫外灯下观察结果并拍照保存。测定其光密度或密度扫描仪对特异性条带进行扫描。

1.6 统计学处理 采用SPSS 11.0软件统计方法。计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,组间比较用单因素方差分析的,P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠UAER比较

模型组及3个治疗组UAER较正常对照组显著升高(P<0.05);3个治疗组24 h尿量、24 h UAER较模型组显著降低(P<0.05);水飞蓟宾治疗组较鹿茸方小剂量组、鹿茸方中剂量组显著为高(P<0.05);鹿茸方小剂量组和中剂量组间比较无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

2.2 各组大鼠肾皮质TGF-β1

mRNA和蛋白表达的比较 模型组TGF-β1 m RNA及蛋白表达较正常对照组显著升高(P<0.05),3个治疗组虽仍高于正常对照组,但无统计学意义(P>0.05);3个治疗组TGF-β1 mRNA及蛋白表达较模型组显著下调(P<0.05);3个治疗组间比较,鹿茸方小剂量组恢复降低较明显,但无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

2.3 各组大鼠肾皮质TGF-β1 mRNA表达电泳图谱(见图1)

注:a为正常对照组,b为模型组,c为鹿茸方小剂量组,d为鹿茸方中剂量组,e为水飞蓟宾治疗组。

3 讨 论

回顾性研究显示,伴持续性微量白蛋白尿约80%的1型DM病人和约20%的2型DM病人10年之内发展至临床DN[1]。Almdal 等[2]观察发现伴微量白蛋白尿(30 mg/d<UAER<300 mg/d)的病人在5年内有18.6%发展至临床DN(UAER≥300 mg),无尿微量白蛋白尿的病人仅有1.8%发展至临床DN[2]。DN从第Ⅲ期开始出现典型的糖尿病性肾小球硬化症,其基本病理改变是肾小球毛细血管基膜增厚和系膜区的扩张。肾小球细胞外基质(ECM)积聚是引起肾小球系膜区扩张、基膜增厚和导致肾小球硬化的主要病理基础。肾小球ECM的合成增加和(或)降解减少,打破原有的平衡,引起ECM更新转换失去平衡,导致ECM的过度积聚,进而进展为肾小球硬化[3]。在调节ECM代谢的细胞因子中,与ECM关系最密切的是TGF-β1。在DM病人和实验性DM动物肾脏、血液和尿中TGF-β1水平升高,暴露于高浓度葡萄糖的肾系膜细胞TGF-β1的表达也增加[4];TGF-β1加入培养系膜细胞可产生类似于DN基质成分的改变;TGF-β1对基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)表达的影响方式与DN时十分类似[5];DN肾脏系膜细胞TGF-β1合成增加基本已成定论,并认为DM早期的肾小球肥大是TGF-β1所介导的[6]。TGF-β1主要分布在肾小管上皮细胞和肾小球,主要通过自分泌和旁分泌机制发挥其多功能的调节作用,其调控机制可能发生在基因转录及翻译后水平,其他多种因素也可通过TGF-β1这个中心环节促进DN的发生发展,因此将TGF-β1作为防治糖尿病性肾小球硬化的一个治疗靶标,对于减轻和延缓DN的进展意义重大。

DM属中医“消渴”范畴。渴而饮水不能多,但腿肿,脚先瘦小,阴痿弱,数小便者,此是肾消病也[7]。DN病属“肾消”范畴,消病日久,精微下渗,脏真既亏,阴损及阳,水中无火,气不化水,因虚致瘀,瘀化为水,泛滥横溢而为诸症[8]。谨守病机,治宗陈言《三因极一病证方论》鹿茸方以治,该方补肾益气,滋阴温阳,疏瘀泄浊[9]。鹿角片、补骨脂、肉苁蓉温肾壮阳;生地、菟丝子滋肾填精;黄芪益气补元,升举清阳;益母草疏瘀泄浊,活血利水;怀牛膝引诸药直达下焦以为佐使。合而成方,滋化源补阴阳以复开阖,司其属令条达以致和平。鹿茸丸复方治疗DN病人,能显著降低早期DN病人UAER[10,11]。鹿茸丸复方能降低链尿菌素DM模型大鼠24 h UAER、β2微球蛋白(β2-MG),调节一氧化氮、内皮素代谢[12]。降低DM模型大鼠红细胞山梨醇,肾脏皮、髓质山梨醇,以及下调模型大鼠肾脏皮质、下调髓质AR基因高表达,提示鹿茸丸复方亦可能通过影响DN多元醇代谢达到治疗效果[13]。

启动预防糖尿病肾病措施 篇9

糖尿病肾病主要表现有哪些

蛋白尿：临床糖尿病肾病早期唯一的表现为蛋白尿，开始为间歇性，逐步发展为持续性。早期微量白蛋白尿，普通尿常规化验不出来。一旦尿常规发现尿蛋白，此时糖尿病肾病已到中期。早期可用放免法测白蛋白排泄率，如结果在20～200微克／分钟，说明已是糖尿病肾病早期阶段。

夜尿增多：如夜间排尿次数或尿量增多，说明肾脏可能受损。

水肿：早期可不出现水肿，或仅早晨眼睑水肿。出现全身水肿时病情已到晚期。

高血压：血压增高既是糖尿病肾病早期征兆，又是糖尿病肾病加重的重要因素。

贫血：是合并肾脏损害的常见表现。

肾功能衰竭：不同病人有很大变化，有的尿蛋白不多，但很快发展成肾病综合征，肾功能恶化成尿毒症。

视网膜病变：糖尿病肾病严重时几乎100％合并视网膜病变。可致视力下降甚至失明。

心衰、心梗、周围神经炎：是糖尿病肾病时常见的合并症。

如何早期发现糖尿病肾病

糖尿病肾病是一个不断进展的过程，一般可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V5期。Ⅰ～Ⅱ期无临床症状，Ⅲ期叫隐性肾病期或微量白蛋白尿期，属早期糖尿病肾病。

Ⅳ期又叫临床糖尿病肾病期，尿常规蛋白阳性是进入此期的标志。特点是尿糖、血压升高，但蛋白排泄率并不见少。随蛋白尿发生出现水肿。

V期是糖尿病肾病的终末期或肾功能衰竭期(尿毒症)。氮质血症是本期的开始，当肾小球滤过率小于40毫升／分钟时，血肌酐和尿素氦明显增高，血肌酐大于20毫克分升。此期血压显著增高、严重水肿、贫血、食欲差、恶心、呕吐，常致病人死亡。

尿蛋白增加是糖尿病早期肾病的临床特征之一，也是主要诊断依据。糖尿病人应定期查尿微量白蛋白，如果在3个月内连续检查2～3次，平均值达到20～200微克／分钟或尿微量白蛋白达到30～300毫克／24小时，排除其他可能原因，即可诊断早期糖尿病肾病。

预防比治疗更重要

由于糖尿病肾病的不可逆性和治疗的困难，所以预防糖尿病肾病有更积极的意义。预防的主要措施是：

控制血糖：严格控制血糖达标，是降低糖尿病肾病的关键。可惜的是，目前我国2型糖尿病血糖控制达标率不足30％。应强调的是，对饮食治疗、口服降糖药控制不好或已有肾功能不全的患者，一定要及时采用胰岛素治疗。

控制高血压：高血压是糖尿病肾病重要促发因素，严重高血压出现是。肾脏损伤加剧的先兆，降压治疗对本病十分重要，所以要求特别严格。凡蛋白尿≤500毫克／天以上者，血压应控制在130／80毫米汞柱以内；凡蛋白尿≥500毫克／天者，血压应控制在125／75毫米汞柱。

限制蛋白摄入：目前主张糖尿病肾病早期就应限制蛋白质摄入，以每天30～50克蛋白为宜，而且应该选用优质动物蛋白，最好是“白色蛋白”，如鸡肉、鸡蛋、牛奶、鱼类。不宜选用植物蛋白，因其生物利用率低，反而会加重肾脏负担。

避免泌尿系统感染：反复发作的泌尿系感染可加重糖尿病肾病，遇有感染应及时治疗。

避免使用对肾脏有损害的药物：如庆大霉素、链霉素等，慎用止痛药，避免血管、肾脏造影。

糖尿病大鼠肾病 篇10

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠40只, 周龄5~7周, 体重180~200 g, 购自Damool Science。

1.2 实验药品

冬虫夏草粉, 由杭州中美华东制药有限公司提供;链脲佐菌素, 购于Sigma公司;SOD试剂盒、GPX试剂盒、MDA试剂盒购于Cayman Chemical公司;ROS试剂盒购于e Bioscience公司;westernblotting检测试剂:兔抗Klotho抗体, 购于Abcam公司;山羊抗兔Ig G-HRP二抗, 购于美国Santa Cruz公司;实时PCR检测试剂盒:TRIzol试剂和RNase-free Dnase试剂盒购于Invitrogen公司。

1.3 造模方法与动物分组

SD大鼠给予溶解于柠檬酸盐缓冲液链脲佐菌素 (60 mg/kg) 一次性腹腔内注射建立糖尿病肾病大鼠模型, 对照组给予相同计量的柠檬酸盐缓冲液一次性腹腔内注射。将确诊为DN的大鼠 (血糖>300 mg/d L进入本实验) 随机分为两组, 非DN大鼠 (对照) 也随机分为两组, 即:对照组, 给予饮用水2 m L/只灌胃;冬虫夏草组, 给冬虫夏草粉5 g/ (kg·d) 灌胃, 灌胃前以饮用水2 m L配制成悬液制剂;DN模型组, DN大鼠予饮用水2 m L/只灌胃;DN+冬虫夏草组, DN大鼠予冬虫夏草粉5 g/kg/d灌胃;实验周期为24周。

1.4 标本采集

实验第24周分别收集血液及24 h尿标本行尿蛋白、尿白蛋白肌酐比及肾功能检测, 检查方法参照笔者已发表的文献[5]。分离肾皮质并根据试剂盒说明检测氧化及抗氧化指标, 之后将右肾皮质组织以胶原酶消化及percoll密度梯度离心分离肾小管, 用于western-blotting及RT-PCR检测, 具体方法如文献[6]所述。

1.5 western-blotting检测

分离的肾小管组织以RIRA裂解液裂解及提取蛋白, BCA法检测蛋白浓度。样品转移到硝化纤维膜上, 封闭1 h后, 用Klotho一抗在4度过夜, 加入酶标的山羊抗兔Ig G-HRP二抗作用1 h, 加入显影剂显色并用X光曝光。条带以Bandscan 4.0软件进行分析。

1.6 RT-PCR检测

用TRIzol试剂提取肾小管组织RNA, 第一条c DNA通过RNA逆转录酶反转录获得。应用ABI Prism 7900HT系列扩增系统进行扩增。每个反应进行3次, 平均值除以β-actin的数值后获得每个数值, 以正常对照组为1进行比较。Klotho引物:5′-CGT GAA TGA GGC TCT GAA AGC-3′ (forward) 和5′-GAGCGGTCACTAAGCGAATACG-3′ (reverse) ;β-actin引物:5’CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3’ (forward) 和5’-TGGTACGACCAGAGGCATACAG-3’ (reverse) 。

1.7 统计学处理

采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析, 组间比较采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA) , 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬虫夏草对大鼠肾功能的影响

DN模型组大鼠与对照组相比, 血肌酐、24 h尿蛋白、尿素氮、尿白蛋白肌酐比明显增高 (P<0.001) , 肌酐清除率明显下降 (P<0.01) ;冬虫夏草干预后24 h尿蛋白、尿素氮、尿白蛋白肌酐比、血肌酐均明显下降 (P<0.05) , 肌酐清除率明显减少 (P<0.05) , 见图1。

##P<0.01;###P<0.001, 与对照组比较;*与DN组比较, P<0.05

2.2 冬虫夏草对氧化应激及抗氧化应激指标的影响

DN模型组大鼠与对照组相比, 肾组织ROS和MDA水平均明显增加 (P<0.01) , 而SOD及GPx水平明显降低 (P<0.05) ;冬虫夏草干预后ROS和MDA水平均明显降低 (P<0.05) , SOD及GPx水平均明显增加 (P<0.05) , 见图2。

#P<0.05;##P<0.01;###P<0.001, 与对照组比较;*与DN组比较, P<0.05

2.3 冬虫夏草对Klotho m RNA及蛋白表达水平的影响

DN模型组大鼠与对照组相比, 肾组织Klotho m RNA和蛋白表达水平均降低 (P<0.05) ;冬虫夏草干预后Klotho m RNA (P<0.05) 及蛋白表达水平 (P<0.01) 均增加, 见图3。

*P<0.05, #P<0.05, 与对照组比较;**与DN组比较, P<0.01

3 讨论

DN是糖尿病重要的微血管慢性并发症之一, 也是导致终末期肾功能衰竭的主要原因。DN在全球范围内呈上升趋势。因此, 对DN早发现早治疗, 探寻有效地阻止DN进程的药物仍是肾病工作者的重要任务。有研究证实, 氧化应激增强、活性氧簇 (ROS) 产生增多在DN的发生发展中发挥了重要作用[7]。近年大量研究表明, 作为衰老相关性疾病DM的主要并发症之一, DN其实也是典型的衰老相关性疾病[1,2]。冬虫夏草是我国传统中药的瑰宝, 具有良好的肾保护作用, 但其很多的作用机制尚待进一步明确。有研究表明, 冬虫夏草可通过降低DN动物模型肾脏中Ⅳ型胶原水平等抑制肾组织纤维化, 减轻肾脏病理损伤, 从而在早期DN治疗中发挥重要作用[8,9,10]。细胞衰老是器官功能乃至整个机体功能衰退的主要表现, 肾脏细胞也不例外。有研究表明, 冬虫夏草菌丝体能促进机体体液免疫功能、增强机体抵抗力以及改善机体功能, 从而有助于延缓衰老[11]。

Klotho是新发现的与人类衰老密切相关的基因, 主要表达于肾脏和大脑脉络膜中, 尤以肾小管上皮细胞表达最为明显[12]。随着研究的深入, 有研究表明, Klotho可以发挥很多生物学功能, 如抗氧化、抗凋亡、抗衰老以及对抗组织纤维化作用[13,14,15,16]。动物实验证实, 升高血浆中可溶性Klotho水平可逆转衰老的过程, 并通过降低氧化应激反应发挥对心肾和其他组织的保护作用[13,14,15,16]。基于上述发现, 本研究通过DM大鼠模型在长期喂食冬虫夏草后, 观测其在肾小管间质作用。笔者发现, 在冬虫夏草的干预下, DN大鼠肾功能较前有所改善。除此之外, ROS及MDA水平降低, SOD和GPx水平升高, 提示冬虫夏草可通过拮抗氧化应激而发挥抗氧化作用, 从而减轻肾小管损伤。与此同时, 肾小管Klotho表达增加, 提示冬虫夏草很可能通过上调衰老相关基因Klotho的表达, 延缓肾小管的凋亡。由此, 本研究提示, 冬虫夏草可通过抗氧化及抗衰老减轻肾小管损伤, 从而延缓DN进展。

摘要：目的:观察冬虫夏草对糖尿病 (DM) 大鼠肾小管损伤的影响, 基于抗氧化及抗衰老探讨冬虫夏草延缓糖尿病肾病进展的作用机制。方法:链脲佐菌素 (STZ) 诱导糖尿病肾病 (DN) 大鼠模型, 与非DN大鼠一起随机分为四组:对照组、冬虫夏草组、DN组、DN+冬虫夏草组。饲养24周后检测肾脏GPx、SOD、MDA、ROS及Klotho mRNA蛋白表达水平, 并检测血肌酐 (Scr) 、尿素氮 (BUN) 、24 h尿白蛋白、尿白蛋白肌酐比 (UACR) 、肌酐清除率 (Ccr) 。结果:DN组大鼠肾功能明显降低, 肾脏氧化应激水平增加, 肾小管Klotho mRNA及蛋白表达下降。经冬虫夏草治疗后肾功能明显改善;ROS和MDA水平降低, SOD及GPx水平增加;肾小管Klotho表达上调。结论:冬虫夏草可延缓DN进展, 其机制可能与其在肾小管间质发挥的抗氧化及抗衰老作用有关。