人源抗体（精选4篇）
人源抗体 篇1
摘要：目的 应用噬菌体展示技术,构建天然人源抗肺癌噬菌体抗体组合文库,筛选能与肺癌细胞特异结合的抗体。方法 用RNA提取试剂盒提取淋巴细胞RNA,以Oligo DT为引物反转录合成cDNA,以半套式PCR扩增轻链和重链可变区抗体基因并重组到原核表达载体中,通过噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,形成噬菌体抗体组合文库。结果 电泳显示扩增的mRNA有清晰的28s、18s和5.8s的条带,600700bp片段者为重组克隆;噬菌体展示抗体库大小在108107之间;优化电转化条件,最终得到库容为1.2×108cfu,双链重组率为41%的抗体库。结论 成功构建人源抗肺癌噬菌体展示文库,为下一步筛选具有肺癌细胞特异亲和力的人源性单克隆抗体奠定了基础。
关键词：噬菌体展示,肺癌,抗体
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,也是危害人类健康与生命最大的恶性肿瘤,其重要性与日剧增。据世界卫生组织2000年报告:1997年全世界死于肺癌人数占恶性肿瘤死亡的19%,居恶性肿瘤死因的第一位。目前,肺癌的五年存活率不到15%,其主要原因之一是临床确诊的肺癌患者往往已经处于病程中晚期或发生了癌细胞的远端转移,因此,实现早期诊断、早期治疗是治疗肺癌的首选策略。在血清学检验中,由于肺癌肿瘤标志物其敏感性和特异性仍不十分令人满意[1],肿瘤标志物在肺癌早期诊断中的应用价值受限。目前常用的Cyfra21-1、NSE等,对肺癌的特异性均不理想。
近年来,人类肿瘤学研究发现肿瘤患者血清中也存在有各种类型的抗细胞自身抗原的抗体。目前肿瘤研究中自身抗体作为肿瘤早期诊断的标志物也已成为肿瘤早期诊断领域的研究热点,倍受重视[2]。
噬菌体展示抗体库技术被誉为抗体技术的第三次革命,本文通过噬菌体展示技术,构建天然人源噬菌体组合文库,从而可以从文库筛选到对肺癌细胞具有特异性亲和力的单抗,进一步解决肺癌早期诊断的问题。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌XL1-BLUE、VCSM13和噬菌粒pcomb3H由广州医学院分子生物学实验室保存,限制性内切酶、T4DNA连接酶均购自New England Biolabs公司,抗体扩增引物由上海生工生物工程公司合成,反转录试剂盒为美国GIBCO BRL公司产品,重组噬菌体鉴定试剂盒购自Amersham phamacia公司。
1.2 方法
(1)m RNA的来源和抗体片段c DNA的合成:分别抽取12例肺鳞癌患者、10例肺腺癌患者及8例小细胞肺癌患者外周血5m L。按总RNA提取试剂盒提取肺癌患者外周血淋巴细胞的总RNA,以Oligo DT为引物用反转录试剂盒合成c DNA。(2)噬菌体抗体库的构建:按照Barbas[3]所报道的方法进行。从淋巴细胞群中抽取RNA,以免疫球蛋白信号肽序列引物和家族特异性免疫球蛋白可变区基因作为引物,进行半套式PCR扩增人抗肺癌的轻链和重链可变区抗体基因,重组到原核表达载体中,并通过噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把单克隆抗体的Fab段表达在噬菌体表面,形成噬菌体抗体组合文库。
2 结果
2.1 m RNA的提取
通过提取总RNA来获得m RNA,结果如图1,m RNA的提取质量通过电泳来进行鉴定,可以看到清晰的28s、18s和5.8s的条带。
注:下划线处为酶切位点
2.2 半套式PCR扩增
分别采用肺癌患者c DNA为模板,用前导肽引物与3′端引物配对进行第一次PCR扩增,见表1。
2.3
取上述制备的PCR产物为模板进行第二次PCR反应,见表2。
2.4 噬菌体抗体库的构建和库容的测定
随机从文库中各抽取24个克隆PCR扩增插入片断,通过电泳结果鉴定扩增出600~700bp片段者为重组克隆。噬菌体展示抗体库大小在108~107之间,并通过优化电转化条件来增加库容量,最终得到了库容为1.2×108cfu,双链重组率为41%的抗体库。
3 讨论
19世纪70年代德国学者Kohler和英国学者Milstein利用细胞融合技术首次成功地制备了杂交瘤抗体[4],这一技术是生物技术发展的一个里程碑。然而,由于异源蛋白易引起人抗小鼠抗体反应而影响人体内应有的疗效,因此人们开始了人杂交瘤技术的研究。但这项技术至今未获真正的突破。
抗体库特别是噬菌体表面展示技术的创建,被誉为又一次革命性进展。这项技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体,不经细胞,甚至不经免疫,制备针对任何抗原的单克隆抗体,为人单抗的制备提供了一条非常有效的办法。这一技术将表型和基因型联系在一起,将抗体识别可抗原的能力和噬菌体扩增的能力结合在一起,是一项极为高效的表达、筛选体系,在生物技术领域极具应用前景。
本文利用噬菌体展示文库技术,从肺癌患者血液中获取抗体基因,来制备具有诊断价值的人源单克隆抗体。抗体库的多样性(不同抗体基因的数目)和抗体库的大小(每个抗体基因的数量)是影响发现稀有抗体和高亲和力的抗体的概率的重要因素。如何保证天然抗体库中所有的表位都有机会被筛选是发现高亲和力抗肺癌单抗的关键。为了构建的抗体库能尽量反映体内的实际情况。要保证抗体的所有组分都能用PCR的方法扩增出来,以使得绝大多数抗原都能从抗体库筛选出相应的抗体,PCR引物的设计是至关重要的。引物的设计需按抗体可变区基因上下游DNA碱基的序列来进行,这需要了解尽量多的抗体基因序列。总的来说,所报导的引物设计可大致分为两类,一是前导肽序列引物或前导肽序列简并引物,利用该类引物已从人的杂交瘤和外周血细胞中扩增出VH基因;另一种是可变区基因5’末端互补引物。在本实验中,我们采用了半套式PCR法。先用Larrick等前导简并引物扩增出c DNA的可变区基因,加大模板量,其PCR产物再用Kang等的引物扩增,这样扩增率达到87%。这样的话,这种嵌套式PCR可以增加PCR产物的多样性,多少弥补由于转化效率不高而降低抗体库多样性的不足。
注:下划线处为酶切位点
其次,要使任何抗原都能从抗体库筛选出相应的抗体,就得保证抗体库中的抗体片段有足够的多样性,影响这一有效表位多样性的主要因素除了设计优良的PCR引物外还有细菌的转化效率。由于细菌转化率的原因,限制了噬菌体抗体库的容量,要构建有足够库容量的抗体库,常成为噬菌体抗体库的技术难点。要提高细菌的转化率,目前所用的转化方法首选的是电穿孔法,其转化效率高达1010个转化子/μg DNA。但如果在培养基中加入抗生素,其转化效率显著降低[5]。在制备电转化感受态细胞时,要加入氨苄青霉素或四环素,这两种抗生素正是对抗体库载体和大肠杆菌宿主进行抗性筛选时所需要的,因此就降低了电转化的转化效率。为了避免大肠杆菌性纤毛的丢失问题,我们采用了在过夜培养的时候,将四环素的浓度提高一倍,即20µg/m L,但在第二天以1∶100的比例接菌培养时,不加抗生素的方法。培养时间不能过长,一般以3~4小时细菌处于对数生长中期为适,否则老化的细胞太多,影响转化率的提高。
制备高质量的电转化细胞,优化电转化参数,能够提高转化效率,增加库容量。电转化参数包括电场强度、电脉冲的长度和DNA浓度。电压更高或电脉冲更长,转化效率会有所提高,但由于细胞生存率的降低,转化效率的提高将被抵消。一般来说,在各种文献的报道中,电转化参数的设置为:电压2.5KV,电容25µFD,电阻200~400Ω。但在本实验中,我们发现电压设为2KV和电阻设为200Ω时比电压为2.5KV和电阻为800或400Ω时,转化率更高。
本研究成功构建了人源抗肺癌噬菌体展示文库,为下一步筛选和鉴定具有肺癌细胞特异亲和力的人源性单克隆抗体奠定了基础。
参考文献
[1]廖美琳,赵家美,杨新法.肺癌[M].北京:中国医药科技出版社,2003.
[2]刘卫红,李志,王鹏,等.肿瘤相关抗原抗体联合检测在肺癌早期诊断中的价值评价[J].中国卫生检验杂志,2006,16(12):1412-1414.
[3]Barbas CF,Kang AS,Lemer RA,et al.Assembly of combinatorialantibody libraries on phage surfaces:the gene III site[J].Proc NatlAcad Sci USA,1991,88(18):7978-7982.
[4]Kohler G,Milstein C.Continuous culture of fused cells secretingantibody of predefined specificity[J].Nature,1975,256(5517):495-497.
[5]Steele C,Zhang S,Shillitoe EJ.Effect of different antibiotics onefficiency of transformation of bacteria by electroporation[J].BioTechniques,1994,17(2):360-365.
人源抗体 篇2
狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患急性传染病, 病死率极高, 发病后进展速度快, 至多10天内死亡, 死亡率几乎为100%。每年约有50 000人和数以百万计的野生动物死于狂犬病。
该病存在于60多个国家, 其中东南亚发病率尤高。中国的发病率为0.4/10万~1.58/10万, 死亡人数在法定传染病中已跃居第2位。狂犬病毒基因组全长约12kb, 具有5个结构基因, 其中由G基因编码的糖蛋白, 是病毒与宿主细胞结合的配体, 介导了病毒与靶细胞的结合及病毒在神经系统中的分布, 不但与病毒的毒力、致命性相关, 而且是病毒的主要保护性抗原, 能刺激机体产生中和抗体, 抵抗病毒的感染。
联合应用抗狂犬病毒免疫球蛋白和狂犬病疫苗是狂犬病三级暴露预防的主要措施。
目前临床使用的抗狂犬病毒免疫球蛋白, 主要来自狂犬病疫苗免疫人或马的抗狂犬病毒血清, 抗体的产量受到限制且存在一定的安全隐患。基因工程抗体技术的完善与发展, 为制备具备高亲和力的治疗性人源抗体提供新途径。人源抗体由于具有较低的免疫原性和较好的组织穿透性, 使其能够更好地应用于疾病的临床治疗。
这篇研究发表在最新一期《中国药理学报》, 由南京军区军事医学研究所朱进研究员、南京医科大学管晓虹教授、冯振卿教授、研究生李琛及其研究小组完成, 为国家“863”资助项目。
本研究是人源抗狂犬病毒治疗性中和抗体研究中的一部分, 研究小组从人源免疫型抗狂犬病毒抗体库中筛选出的一株针对狂犬病毒糖蛋白的单链抗体, 克隆出可变区基因, 运用重叠延伸拼接的方法, 分别制备Fd及L链, 再进一步拼接成Fab基因, 构建Fab表达载体, 从而实现Fab的可溶性表达。
研究通过间接ELISA与竞争ELISA、免疫共沉淀结合质谱分析及荧光抗体病毒中和实验 (FAVN) 分析抗体的免疫学特性。建立狂犬病昆明种鼠 (KM鼠) 模型, 在个体水平比较分析Fab抗体、疫苗和人免疫球蛋白等对小鼠暴露后的预防和保护作用。
人源抗体 篇3
噬菌体抗体库技术是将编码抗体的基因插入噬菌体编码外壳蛋白的基因中,使抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ或基因Ⅷ连接,抗体就会和外壳蛋白融合,以单链抗体(ScFv)或Fab的形式在噬菌体表面表达,从而被特异性抗原筛选出来[1,2,3,4]。噬菌体抗体库技术绕过了复杂的杂交瘤技术,将杂交瘤的无限传代变成了基因的无限传代,在生产人源化抗体及对鼠源性单克隆抗体的人源化改造上有明显的优越性。研究采用噬菌体抗体库这一生物学技术构建抗乙肝病毒噬菌体展示单链抗体库,以期为今后乙型肝炎的预防、诊断和治疗奠定基础。
1 材料
总RNA抽提试剂盒,购自上海华舜生物工程有限公司;100 bp DNA Ladder Marker, Sigma公司产品;DNA 纯化试剂盒,Promega 公司产品; SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶,购自宝生物工程(大连)有限公司;M13K07、pCANTAB5E、辅助噬菌体M13K07、E.coli TG1、HRP /抗M13 单克隆抗体、HRP/抗M13噬菌体单克隆抗体,Amersham Biosciences公司产品;乙肝病毒表面抗原(批号为99052),购自上海荣盛生物有限公司;其他试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 VH 和VL 基因的PCR 扩增
提取患者外周淋巴细胞中的总RNA, 用Oligo(dT)引物通过逆转录酶反转录合成cDNA。
2.2 人源抗体VH 和VL 基因的PCR 扩增
引用参考文献[5]中报道的引物, 上游引物为VH1af 5′-ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3′, VH2af 5′-ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG-3′,VH3af 5′-ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′,VH4af 5′-ACTGCGG-CCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG-3′,VH5af 5′-ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG-3′,VH6af 5′ -ACTGCGG-CCCAGCCGGCCCAGGTACAGCTGCAGGAGTCAGG-3′,ScFvf 5′-ATCGACGCTACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGGT-3′, 下画线部分为SfiⅠ酶切位点。下游引物为Jκ1r 5′-GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3′, Jκ2r 5′-GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3′, Jκ3r 5′-GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3′, Jκ4r 5′-GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3′, scFvr1 5′-ACGGCTGCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTT-3′; Jλ1r 5′-GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3′, Jλ2r 5′-GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3′,Jλ3r 5′-GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAAAACGGTGAGCTGGGT-CCC-3′, ScFvr2 5′-ACGGCTGCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTA-3′, 下画线部分为NotⅠ酶切位点。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
以合成的cDNA 为模板,PCR扩增VH 和VL 基因。VL基因的PCR 反应条件:95 ℃ 10 min;94 ℃ 60 s,66 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;最后72 ℃ 10 min。VH基因的退火温度为65 ℃,其他反应条件同VL基因。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,切胶回收目的基因片段。
2.3 ScFv基因的构建
通过SOE-PCR方法将VH 和VL 基因拼接成ScFv 基因。 取纯化的VH 和VL 基因片段经 94 ℃ 40 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min,10个循环后加含有酶切位点的引物;94 ℃ 30 s,66 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共35 个循环。取PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。
2.4 单链抗体克隆载体的构建
纯化的ScFv 经SfiⅠ和NotⅠ酶切后,与同样经酶切的载体pCANTABE按照3∶1的比例混合,用T4 DNA连接酶连接并转化感受态E.coli TG1;涂于2×YT-AG培养平板(含100 mg/L 氨苄西林),于30 ℃培养过夜;加入适量的2 ×YT 培养基刮下细菌, 取部分菌液用2 ×YT-AG培养基稀释至OD600值为0.3,于37 ℃振床培养1 h;加入1×1012 cfu 辅助噬菌体M13K07,继续振床培养1 h, 离心,取沉淀;用含100 mg/L 氨苄西林和50 mg/L 卡那霉素的2×YT-AK培养基重悬后,于37 ℃摇动14～16 h,离心取上清液;加入200 g/L PEG-8000 和2.5 mol/L NaCl 沉淀噬菌体,于4 ℃、10 000 r/min 离心15 min;用2 mL 0.02 mol/L PBS(pH值为7.2)重悬沉淀, 重悬沉淀即为噬菌体ScFv库。
2.5 抗体库的扩增、重组率测定和酶切鉴定
取适量抗体库接种在20 mL 2×YT-ATK培养基中振摇培养至OD600值为0.68;加入辅助噬菌体M13K07于37 ℃静置60 min,离心取沉淀重悬于20 mL 2×YT-ATK培养基中培养过夜;离心取上清液用PEG/ NaCl 进行沉淀,再离心取沉淀用适量的 PBS重悬,然后离心得上清液即为噬菌体抗体库,检测库容。用SB 培养液对所制备的噬菌体抗体库进行10 倍系列稀释,分别加入E.coli TG1在室温条件下感染,涂于SOBAG 平板过夜培养,次日计数噬菌落形成单位(cfu),计算噬菌体抗体库的库容,4 ℃保存,备用。
从SOBAG平板上随机挑取12个单菌落进行PCR 扩增,并用琼脂糖凝胶电泳检测ScFv的重组情况;提取单菌落的质粒,用SfiⅠ、NotⅠ进行双酶切,采用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱。
2.6 抗体库的多样性分析
随机挑取抗体库共12个单克隆,PCR 扩增ScFv基因片段,电泳回收后用BstNⅠ酶切,采用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱。
2.7 噬菌体ScFv 库的富集筛选
参照参考文献[6]进行噬菌体ScFv 库的富集筛选。用0.03 mol/ L PBS(pH值为7.2)稀释的乙肝病毒表面抗原包被96孔酶标板, 每孔60 mL,于4 ℃过夜;次日, 用30 g/L BSA-PBS 于37 ℃温箱孵育封闭1 h;弃封闭液,每孔中加入70 μL 噬菌体抗体库,37 ℃孵育2 h;弃去孔中未结合的噬菌体,用PBST 洗液洗涤10～20次;最后再用去离子水洗2遍, 每孔中加入50 μL 甘氨酸-盐酸洗脱缓冲液(pH值为2.2), 室温孵育10 min;加入 2 mol/L Tris 3～5 μL,使溶液的pH值在7.2 左右, 以中和洗脱下来的噬菌体溶液;立即向洗脱的噬菌体中加入2 mL 新鲜制备的OD600值为1.0 的E.coli TG1,室温孵育20 min;向上述菌液中加入10 mL SB-A(SB 培养基, 含 20 mg/L氨苄西林),立即取10 μL菌液涂于含氨苄西林的SOBAG(100 mg/ L)平板上, 以滴定洗脱下来的噬菌体计算产出的克隆数。其余部分转入三角烧瓶中,于37 ℃振荡培养1 h;依次加入100 mL SB-A(SB 培养基, 含50 mg/ L 氨苄西林, 于37 ℃培养1 h)、1×1012 cfu 的辅助噬菌体M13K07及卡那霉素70 mg/L (37 ℃培养14～16 h)。同上制备噬菌体上清液, 如此再反复富集4 轮。
2.8 ScFv的特异性鉴定
将第5轮筛选后洗脱的噬菌体感染E.coli TG1涂于SOBAG平板,培养过夜;随机挑选细菌菌落,接种于4 mL含氨苄西林和四环素的SOBAG中,37 ℃振荡培养过夜;从中取200 μL加至4 mL 含同样量抗生素的SOBAG中,37 ℃振荡培养2 h;加入40 μL M13K07培养2 h;再加入卡那霉素至70 μg /mL,30 ℃振荡培养过夜;次日离心收集上清液,即为单克隆噬菌体抗体,4 ℃保存。将待检噬菌体抗体与等量1% BSA 混合,室温孵育20 min,加至经乙肝病毒表面抗原包被和BSA封闭的ELISA平板中,于37 ℃温育2 h;用PBST洗涤4 次、PBS 洗涤2 次后,以HRP 标记的M13 噬菌体单克隆抗体进行结合反应,TMB 显色。
3 结果
3.1 抗体可变区的RT-PCR结果
以提取的RNA为模板逆转录合成cDNA第一链后,再以cDNA为模板进行PCR反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区。取产物经琼脂糖凝胶电泳检测,分别在300～400 bp之间出现条带,见图1。
M.100 bp DNA Ladder Marker; 1.VH片段;2.VL片段。
3.2 SOE-RCR结果
采用SOE-PCR方法将抗体轻链、重链可变区基因组装成ScFv片段,经1.0%琼脂糖凝胶电泳证实,组装后的ScFv基因在700～800 bp之间出现条带,见图2。
M.100 bp DNA Ladder Marker; 1.ScFv基因。
3.3 抗体库的库容、重组率测定及酶切鉴定结果
构建的初级抗体库经(库容= 涂板后生长出的菌落数目/涂板菌液量×涂板菌液稀释的倍数)计算,库容量为3.6×106。随机挑取20个菌落,经PCR鉴定表明,重组率为(15/20)80%, 故次级库的库容量为2.7×106。提取PCR鉴定为阳性的克隆质粒进行双酶切鉴定,结果在770 bp处出现清晰亮带,见图3。
1.双酶切产物;M.100 bp DNA Ladder Marker。
3.4 抗体库的多样性分析结果
随机挑取12个单菌落,经PCR 扩增ScFv 基因片段,电泳回收后以BstNⅠ酶切,经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析显示,抗体库中抗体分子的多样性良好,见图4。
1～12.随机挑选的单个菌落;M.DL-2 000 Marker。
3.5 噬菌体抗体库筛选的结果
对抗乙肝病毒抗原噬菌体抗体库进行5 轮“吸附—洗脱—扩增”的筛选,可知随着洗涤次数的增加,噬菌体抗体的收获率增加,经过5轮筛选增加约145倍,表明噬菌体抗体库得到富集,结果见表1。
3.6 ScFv的特异性鉴定结果
从第5 轮筛选得到的菌落中随机挑选20个菌落,制备噬菌体抗体,用ELISA方法检测,其中18个菌落对重组蛋白呈阳性反应。
4 讨论
HBV感染可引起肝炎,全世界HBsAg阳性者约3.5亿人,每年约有80万人死于HBV感染的相关性疾病,占所有疾病死亡原因的第9位。我国是HBV感染的高发区,约有1.2亿HBV携带者。HBV感染给患者及其家庭造成巨大的经济负担。目前,还没有一种理想的治疗乙肝的理想药物。无可置疑,进行乙肝防治研究具有非常重要的意义。
ScFv是一种新型的基因工程抗体, 它将VH可变区和VL可变区通过一段短肽连接起来,具有相对分子质量低、穿透力强、血中半衰期短、抗原结合特异性强、异原性低、容易操作、能在原核细胞中表达、易于大量生产等优点,并且可以用化学耦联或基因工程方法构建成与其他靶分子连接的融合蛋白,有利于药物、毒素、放射性同位素导向治疗,这些小分子抗体在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗、新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用[7,8,9,10,11],已经被广泛应用于医疗和生物技术领域[12]。
人源抗体 篇4
关键词：哺乳动物细胞表面展示,全长抗体库,人源抗体,稳定展示
当前,基因工程抗体药物在全球范围内得到了广泛应用[1,2,3,4],在治疗心血管疾病、自身免疫疾病及肿瘤等领域发挥了重要作用。抗体库技术和抗体展示技术是应用于抗体药物制备的常用基础技术[5,6]。但传统的抗体库和抗体筛选技术仅能筛选Fab或scFv等小分子抗体,无法进行全长抗体的直接筛选。近几年出现的哺乳动物细胞表面展示技术[7,8,9]可用于全长抗体的筛选,已得到越来越多的重视。本课题组在前期研究中已经成功构建了可直接表达全长抗体的哺乳动物细胞表达载体pDGB4[7];在本研究中,我们以来自于HIV患者外周血淋巴细胞的RNA为模板,用RT-PCR扩增抗体基因,插入载体pDGB4构建了一个可在哺乳动物细胞表面展示全长抗体的基因库,并建立了可稳定表达全长抗体的哺乳动物细胞库,为筛选获得特异性抗HIV抗体奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司,质粒DNA中提试剂盒购自Invitrogen公司,逆转录(RT)酶、RT试剂盒和Taq DNA聚合酶购自Promega公司,DNA凝胶纯化回收试剂盒购自AXYGEN公司,限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas Life Sciences公司。大肠杆菌TOPO-10由本实验室保存。细胞转染试剂由香港Dgen公司提供。含有Flp-in定点整合位点的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)细胞(FCHO细胞)和可表达Flp-in定点整合催化酶的载体pOG44购自Invitrogen公司。荧光标记的抗体购自BD Pharmingen公司。细胞培养用Hanm's-F12和血清购自Hyclon公司。潮霉素B溶液(Hygromycin B)购自展晨生物技术有限公司。
1.2 载体
哺乳动物细胞表达载体pDGB4由本课题组构建[7],其结构如图1所示。其中抗体重链基因表达结构包括CMV启动子、带有PDGFR跨膜序列(TM)的人抗体全长IgG1重链基因(HC-TM);抗体轻链基因表达结构包括CMV启动子、人抗体全长IgG1 Kappa型轻链基因(LC)。当同时使用BsmBI和SfiI对载体进行双酶切时,可用于插入抗体重链可变区基因和抗体轻链全长基因,构建可直接表达全长抗体的基因库。
1.3 方法
(1)总RNA的提取:HIV感染者为安徽既往献血员,未接受过抗病毒治疗,经中国疾控中心伦理委员会批准和患者知情同意后,于静脉采血,EDTA抗凝,并采用密度梯度离心法分离HIV患者的外周血淋巴细胞。按RNA提取试剂盒说明书提供的方法从外周血淋巴细胞中提取总RNA,用Nano Drop微量核酸蛋白定量仪测定总RNA的浓度。(2)抗体重链基因的PCR扩增:以约20ng总RNA为模板,用RT试剂盒逆转录合成抗体基因的cDNA第一链;RT产物直接用于cDNA的扩增。将课题组前期设计合成的26对重链引物分别按照所对应的抗体亚型的数量进行混合,获得三组重链引物(PH1、PH2、PH3)。PCR反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性30sec,55℃退火30s,72℃延伸1min,重复循环35次;最后以72℃延伸7min。用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物并测定其浓度,按实验需要可取少量电泳回收的PCR产物作为模板,按相同的PCR条件,再进行一次PCR扩增,以增加所获得的抗体基因的量。(3)构建全长抗体基因库:用BsmBI对载体pDGB4和扩增到的抗体重链基因分别进行酶切,随后按照本课题组前期建立的方法[10],用1%或2%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。载体片段和重链基因片段按1∶1的比例混合,在16℃条件下连接过夜;然后取1μL连接产物,在电脉冲为25μF、电压为2.5kV、电阻为200Ω条件下,电击转化感受态大肠杆菌TOPO-10。将转化后的细菌涂于含有氨苄青霉素的LB平皿,37℃培养过夜,根据生长出的细菌克隆数量计算抗体库的库容量。收集平皿上所有的菌落,即为全长抗体基因库。(4)构建可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库:在T-75细胞培养瓶中常规培养FCHO细胞,至对数生长期进行抗体库的转染。用质粒提试剂盒提取全长抗体库的质粒DNA,取4μg抗体库的质粒与36μg pOG44共同溶于2mL Hanm's-F12;将100μL转染试剂溶于2mL Hanm's-F12。上述两种液体在室温条件下放置2～3min后,将DNA溶液加入转染试剂溶液中,混合后室温放置20～30min。然后将此混合液加入T-75细胞培养瓶中,37℃继续培养。细胞经转染后24h,将细胞消化,按1∶4传代培养。转染后48h,将细胞的培养基更换为含有潮霉素B的细胞培养基,继续培养12～15d;将细胞回收,按1.3×107个/管的细胞浓度进行细胞冻存,即获得可稳定展示全长抗体的细胞库。(5)流式细胞仪检测全长抗体在FCHO细胞表面的展示:将细胞库中对数生长期的细胞用不含胰酶的消化液消化回收,与PE荧光标记的鼠抗人Kappa链抗体进行反应,每50μL反应体系中含有5×105个细胞和3μL荧光标记的抗体;反应混合物混匀后在冰上放置30min,用染色缓冲液(含2%FBS的1×PBS)洗涤细胞1次,然后将细胞重悬于400μL的染色缓冲液中,用流式细胞仪检测抗体在FCHO细胞表面的表达,采用FCS Express V3软件对流式细胞数据进行分析。
2 结果
2.1 抗体基因的PCR扩增
2.1.1 抗体重链可变区基因的初次PCR扩增
以总RNA为模板,分别使用三组重链引物(PH1、PH2、PH3)进行RT-PCR扩增。结果如图2,可见三组重链可变区基因的大小均为0.45kb;其中,用引物PH3扩增的产物较多、PH1扩增的产物较少、PH2扩展的产物最少。
图2重链可变区基因PCR扩增图M:Marker;1～4:PH1扩增产物;5～8:PH2扩增产物;9～12:PH3扩增产物
2.1.2 抗体重链可变区基因的二次PCR扩增
纯化回收初次PCR扩增的产物,将其作为模板,分别使用三组重链引物(PH1、PH2、PH3)进行二次PCR扩增。结果如图3,可见三组重链可变区基因的二次PCR产物的量均得以增加;经纯化回收时,由于PH2扩增产物的量仍较少,故只成功回收了PH1和PH3的PCR产物。
图3重链可变区基因二次PCR扩增图M:Marker;1～2:PH1扩增产物;3～4:PH2扩增产物;5～6:PH3扩增产物
2.2 载体及抗体基因的酶切
2.2.1 载体p DGB4的酶切
使用BsmBI对载体pDGB4进行酶切,随后进行凝胶电泳,纯化回收8.65kb的条带(图4)用于克隆抗体的重链可变区基因片段。
图4载体pDGB4经BsmBI酶切后的电泳图M:Marker;1～3:经BsmBI酶切的pDGB4
2.2.2 重链可变区基因的酶切
使用BsmBI对抗体的重链可变区基因进行酶切,随后进行凝胶电泳,纯化回收0.45kb的条带(图5)用于构建抗体基因库。
图5重链可变区基因经BsmBI酶切后的电泳图M:Marker;1～2:PH3扩增产物经BsmBI酶切;3～4:PH1扩增产物经BsmBI酶切
2.3 抗体基因库的构建
将酶切并纯化后的抗体重链可变区基因与载体pDGB4进行连接、转化,根据所生长的细菌克隆数量推算抗体库的库容量。其中,用PH1扩增产物所构建的抗体库的库容量为1.33×104,用PH3扩增产物所构建的抗体库的库容量为6.44×104;两库合用,相当于抗体库的库容量为7.77×104。
2.4 构建可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库
提取抗体库的质粒DNA,稳定转染FCHO细胞,获得可稳定展示全长抗体的FCHO细胞库。随后,用流式细胞仪分析全长抗体在FCHO细胞表面的展示;可见,有67%的细胞表面可展示能够被检测到的抗体(图6C)。
A:未转染的FCHO细胞经PE标鼠抗人kappa链抗体染色;B:稳定转染抗体库的FCHO细胞,未染色;C:稳定转染抗体库的FCHO细胞经PE标鼠抗人kappa链抗体染色
3 讨论
当前,应用最为广泛、发展也较成熟的抗体库技术和抗体展示技术是噬菌体抗体库及噬菌体展示技术[5];但该技术无法用于全长抗体的直接筛选,且作为原核生物的噬菌体在表达真核蛋白的过程中存在不可预见的表达偏差。酵母展示技术是近年来发展起来的真核展示技术[11],其可表达经翻译后修饰的、接近天然状态的抗体分子;但酵母表面也仅能展示Fab或scFv等小分子抗体。经噬菌体展示或酵母展示所筛选到的小分子抗体需转换为全长抗体,再导入哺乳动物细胞中进行大量生产并纯化,从而进入后续的研究及临床使用[12]。但抗体转换过程通常费时、费力,成功率低,因此,需要开发一种可直接筛选全长抗体的技术。
哺乳动物细胞表面展示技术是一种可用于全长抗体的直接筛选的新技术[7,8,9],已得到越来越多的重视。本课题组在前期研究中已经成功构建了可直接表达全长抗体的哺乳动物细胞表达载体pDGB4[7];在本研究中,我们以来自于HIV患者外周血淋巴细胞的RNA为模板,用RT-PCR扩增抗体基因,插入载体pDGB4构建了一个可在哺乳动物细胞表面展示全长抗体的基因库,并建立了可稳定表达全长抗体的哺乳动物细胞库。
由于HIV患者的外周血淋巴细胞来源有限,故所获得的RNA较少,在进行PCR扩增过程中,仅成功扩增了抗体的重链可变区基因,未能获得抗体的轻链基因。由于抗体的特异性主要决定于抗体的重链,因此,我们利用所获得的抗体重链可变区基因与载体pDGB4中原有的轻链基因进行匹配,构建了可展示全长抗体的基因库;在后续筛选获得特异性的抗体后,可考虑将特异性抗体的重链基因信息与不同的轻链进行匹配,以提高抗体的亲和力。