抗体鉴定（精选9篇）
抗体鉴定 篇1
CD133 是一个五次跨膜糖蛋白,在多种恶性肿瘤细胞以及肿瘤干细胞表面高表达,是鉴定肿瘤干细胞最常用的标志物之一。目前,靶向CD133 以清除肿瘤干细胞( CSC) 并降低肿瘤的耐药性已成为开发针对CSC治疗的手段之一[1]。但当前获得的抗CD133 抗体,包括AC133、293C3 和AC141 等主要用于鉴别CD133 + 表达的干细胞亚群,并不具有对肿瘤干细胞的治疗作用[2]。最近有学者针对CD133制备抗CD133 和偶联免疫毒素的单链抗体,显示出对肿瘤干细胞亚群的抑制作用[3]。但单链抗体由于存在人工接头,易被蛋白酶降解和溶解性差等缺点,限制了其广泛使用,因此,有必要开发新的靶向CD133 的抗体药物。
纳米抗体是源自骆驼天然缺失轻链的单域抗体,是至今可以获得的天然来源并具有完整抗原结合活性的最小抗体分子[4],其具有较好的溶解性和在原核细胞表达量高及易于偶联其他效应分子等优点。另外,纳米抗体不仅能很好地结合常规抗体结合的表位,甚至还能结合一些常规抗体不易结合的表位,如酶的活性中心,受体与配体结合的裂隙以及其他隐蔽表位[5,6]。这些特性使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在抗体基础研究、药物开发等方面具有广阔应用前景。
本文针对CD133 制备靶向CD133 的纳米抗体,研究抗体与CD133 的结合活性,以期为今后在纳米抗体上偶联药物分子,从而开发一种具有肿瘤靶向作用和肿瘤干细胞抑制作用的治疗手段提供了实验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
DH5α 感受态细胞、BL21 ( DE3 ) 感受态细胞购置北京全式金生物技术有限公司; TG1 菌株、载体p ET28a、p MECS均为作者实验室保存。
1. 1. 2 试剂
Taq DNA聚合酶、d NTP、DNA连接酶、限制性内切酶及DNA marker均为Ta KaRa大连宝生物工程有限公司; 质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒为Omega公司产品; 蛋白marker及蛋白预染marker购自Thermo - Fisher Scientific。HRP标记的山羊抗兔Ig G为北京康为世纪生物科技有限公司产品; 抗c -Myc标签鼠单克隆抗体( HRP) 购于武汉CUSABIO,IPTG购于Genview公司,Ni SepharoseTM6 Fast Flow购自GE Healthcare公司。
1. 1. 3 仪器
台式高速离心机( 力康发展有限公司) ; Lynx6000 centrifuge ( Thermo Fisher ) ; 洁净工作台( Bo Xun) ; LAS4000( GE) 等。
1. 2 方法
1. 2. 1 骆驼天然抗体库的构建
收集3 峰新疆双峰驼外周血,分离淋巴细胞,采用Trizol法提取总RNA,反转为c DNA作为扩增VHH基因的模板[7]。VHH基因的扩增采用巢式PCR方法。PCR1 引物为Call01 - leader: 5' - GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG - 3'; Call02 - CH2: 5'- GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC - 3' 扩增得到约900 bp的VHH片段,切胶回收后进行第二轮PCR。PCR2 引物为VHH - back: 5' - GATGTGCAGCTGCA GGAGTCTGGRGGAGG - 3'; PMCF: 5' - CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT - 3',扩增得到约400 bp的VHH序列,将回收的VHH基因片段和p ME CS载体进行PstⅠ和NotⅠ双酶切,16℃ 过夜连接,并转化TG1,鉴定阳性率并计算抗体库滴度。
1. 2. 2 噬菌体的扩增与分离
取0. 5 m L保存在- 80℃中VHH抗体库TG1 菌液( 约107pfu) ,接种至100m L的2 × YTAG( 100 μg /ml Ampicillin,2% Glucose ) 培养基中,在37℃ 、200r / min培养至OD600达0. 45,加入1012辅助噬菌体M13K07,37℃ 恒温箱静置30 min感染TG1 菌,于4 000 r / min、4℃ 离心10 min。将沉淀重悬于300 m L的2 × YTAK ( 100 μg /ml Ampicillin,70 μg /ml knamaycin) 培养基,37℃ 、200 r / min过夜培养。次日离心8 000 r/min,4℃、30 min,将上清转移到新的管中,加入1 /6 PEG8000/ Na Cl溶液,混匀置冰上至少30min。4 000 r / min、4℃ 离心30 min。倒掉上清后将得到的噬菌体用1 m L PBS溶解。13 000 r/min离心5 min,上清于4℃ 保存。
1. 2. 3 抗CD133 纳米抗体的亲和筛选
将定量后的CD133- 606蛋白[8]稀释至50 μg /ml,加入96 孔酶标板,100 μL/孔,4℃ 孵育过夜。加封闭液,37℃孵育1. 5 h。加入1013pfu / 孔噬菌体,37℃孵育2 h,用PBST( 0. 5% Tween20) 洗涤20 次,尽可能的洗掉非特异性结合的噬菌体。每孔加入100 μl p H 2. 0 洗脱缓冲液,反复吹打10 min,洗脱的噬菌体,立刻加入中和缓冲液p H 9. 0,使得p H为7. 0。立即加入10 m L生长处于对数期的TG1 细菌,37℃静置感染30 min。分别取20 μL、40 μL、60 μL、80μL、100 μL菌液涂布于2 × YTAG固体培养基,计算噬菌体输出滴度。4 000 r/min离心收集剩余的菌体。重悬于2 × YTA培养基,加入甘油200 μL/ml混匀后置- 20℃用于下一轮筛选。抗原包被浓度第2 轮为5 μg / ml,第3 轮为0. 5 μg / ml,进行3 轮亲和筛选。每轮筛选获得的单克隆通过菌液PCR鉴定,计算阳性率及噬菌体输出量。
1. 2. 4 抗CD133 纳米抗体的诱导表达与纯化
设计特异引物( 下游引物带有c - Myc标签碱基序列) : 亚克隆引物设计VHH - primer - Forward:5' - GCGGATCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCT - 3',VHH - primer - Reverse: 5' - CCGCTCGAGATTCAA GTCCTCTTCAGAAATGAGCTTTTGCTCTGAGGAGAC GGTGACCTGGGT - 3',提取p MECS - CD133 - VHH重组质粒,使用相对引物PCR扩增VHH基因,PCR产物经Xho Ⅰ 和Bam H Ⅰ 双酶切,连接至载体p ET28a。鉴定正确转化BL21( DE3) ,用0. 2 mmol / L IPTG,30℃ 诱导4 h。亲和层析纯化His - VHH -CD133 - c - Myc重组蛋白,SDS - PAGE与Western Blot检测VHH - 13 抗体的表达及纯化。
1. 2. 5 Western Blot和ELISA检测纳米抗体的抗原结合活性
对纯化的VHH - 13 抗体Western Blot检测其抗原结合性,一抗为VHH - 13 纳米抗体,按不同浓度稀释,二抗为鼠抗c - Myc - HRP单抗( 1∶ 3 000) 。阳性对照为兔源抗CD133 多克隆抗体[8]( 1∶ 2 000) ,阴性为无关蛋白FSHR[9]。ELISA实验中,抗原CD133 包被浓度为0. 4 μg /ml。抗体稀释终浓度为: 10 μg /ml、23 μg /ml、45 μg /ml、78 μg /ml、157 μg / ml共5 个梯度。阳性对照为兔源抗CD133多克隆抗体,阴性抗原为BSA。
2 结果与分析
2. 1 VHH基因片段的PCR扩增
以c DNA为模板经过PCR1 扩增获得900 bp和700 bp的基因片段( 图1a) ,回收900 bp片段,通过PCR2 扩增获得400 bp的基因片段( 图1b) ,即VHH基因片段。与p MECS载体分别双酶切后,连接转化TG1,得到抗体库。
(a)PCR1扩增VH和VHH基因片段;(b)PCR2扩增VHH基因片段。
2. 2 骆驼天然抗体库质量的评价
从大培养皿中随机挑选100 个单克隆,进行菌液PCR鉴定,100 个克隆全为阳性,文库阳性率约为100% 。通过基因测序分析VHH基因多样性,其中有99 个正确插入外源基因。所有克隆的基因序列都不一样,即: 文库的多样性为100% 。通过梯度稀释,在10- 6培养板上的菌落数为140 个,获得库容为1. 4 × 109cfu / ml的天然噬菌体展示文库。
2. 3CD133 抗原筛选获得的VHH - X抗体序列分析
经过3 轮筛选,共获得53 个阳性克隆,随机挑取25 个进行测序,其中有19 个样品测序成功。通过DNAMAN软件比对,其中8、13、14 和21 克隆,31和35 克隆,以及7、18 和36 克隆分别为重复序列,其余克隆均为单一序列。各序列比对结果见图3。选取VHH - 07、VHH - 35 及VHH - 13( 重复最高4次) 的克隆构建至p ET28a进行可溶性表达并转化BL21,结果显示,只有VHH - 13 得到正确表达,而VHH - 07 与VHH - 35 并没有表达出相应抗体蛋白,因此后续工作只选VHH - 13 纳米抗体。
2. 4 VHH - 13 纳米抗体的诱导表达、纯化及Western Blot鉴定
提取质粒p ET28a - VHH - 13,用Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定条带大小正确( 图4a) 。经IPTG诱导约在25k Da有表达( 图4b) 。经过镍离子亲和层析柱纯化His - VHH - 13 - c - Myc重组蛋白,SDS - PAGE和Western Blot检测表明获得了较高纯度的VHH - 13 纳米抗体( 图5) 。
2. 5 VHH - 13 纳米抗体的抗原结合性检测
纯化获得的VHH - 13 蛋白浓度测定为0. 45 mg / ml,CD133 蛋白浓度为0. 8 mg / ml。如下Western Blot结果显示,与无关蛋白FSHR对照组相比,VHH - 13 纳米抗体在测定浓度下均可以与CD133 蛋白特异性结合。ELISA检测中,可以看出VHH - 13 抗体能与CD133 蛋白结合。
3 讨论
本研究中,我们构建了一个来自多头骆驼淋巴细胞的VHH噬菌体展示文库。其库容和多样性均较好。我们虽然构建了库容为1. 4 × 109cfu / ml的骆驼天然抗体库,与前人文献库容可达1013左右[10,11]相比还有待提高。
(a)双酶切结果:1:p ET28a-VHH-13;2:双酶切产物(箭头为VHH-13基因)。(b)小量诱导蛋白表达结果:1:未诱导;2:诱导后(箭头为VHH-13蛋白25 k Da)。(a)results of double digestion:M:DNA marker(DL5000);1:p ET28a-VHH-13;2:double digestion products(Arrow of VHH-13gene);(b)results of protein expression:1:uninduced;2:induced(Arrow of VHH-13 protein about 25 k Da).
(a)诱导表达VHH-13;M(14.4~116 k Da);1:未诱导;2:诱导后;3:上清;4:沉淀。(b)纯化VHH-13;1:未诱导;2:诱导后;3:沉淀蛋白纯化;4:上清蛋白纯化。(c)Western Blot检测VHH-13蛋白表达;1:上清;2:沉淀;3:诱导后;4:未诱导。(a)Inducible expression of VHH-13:M(14.4-116);1:uninduced;2:induced;3:supernatant;4:precipitation.(b)Purification of VHH-13:1:uninduced;2:induced;3:purification of precipitation;4:purification of supernatant.(c)Detection of VHH-13 protein expression by Western Blot:1:supernatant;2:precipitation;3:uninduced;4:induced;
从天然文库中筛选抗体具有自身的优势,其不需要预先对骆驼进行免疫,可以针对任何抗原进行筛选。但天然文库也存在固有缺点,即得到的抗体的亲和力可能不够[11]。从本研究结果来看,纳米抗体VHH - 13 在较高浓度下( 10 μg /ml) 才具有结合抗原的活性,显示得到的抗体亲和力并不太高,另外,该抗体是否能与细胞表面的CD133 结合有待于进一步验证[12]。
本研究中,多个克隆如VHH - 07 与VHH - 35在大肠杆菌中未获得预期的表达,就其原因可能是由于宿主菌为原核表达系统,而纳米抗体基因为真核序列,原核生物与真核生物虽然在表达蛋白的机制相似,但在密码子的选择上具有偏好性,真核表达系统偏好的密码子在原核中就是所谓的系有密码子,如果稀有密码数量达到一定的值,蛋白就不会表达。因此通过优化VHH - 13 基因,得到VHH - 13抗体蛋白的正确表达,且与抗原CD133 特异性结合。由于抗原CD133 带His标签,因此在构建抗体的重组载体中引入c - Myc标签,便于检测VHH -13 蛋白的正确表达及其抗原结合性。
M:蛋白预染Marker;1,2:CD133抗原上样量均为64μg,VHH-13抗体浓度分别为45μg/ml、9.0μg/ml;3:FSHR上样量300μg;4:CD133上样量90μg,VHH13抗体浓度为450μg/ml;5:FSHR上样量300μg。M:Prestained protein molecular weight marker;1,2:CD133 antigen were 64μg,VHH-13 antibody were 45μg/ml,9.0μg/ml;3:FSHR protein were 300μg;4:CD133 were 90μg,VHH-13 antibody were 45μg/ml;5:FSHR protein were 300μg.
从骆驼及骆驼科动物体内获得的单域抗体与传统抗体相比,分子量仅为常规抗体的1 /5,这些特点使得它们在进行结构改造和抗原结合方面可能具有优势,也成为今后开发小分子抗体的一个方向[12]。因此,在不久的将来,纳米抗体有望应用于结构生物学和疾病的分子检测及诊断和治疗。CD133 作为一个广泛使用的肿瘤干细胞表面标记物,目前还缺少更多的检测抗体,本实验获得了骆驼纳米抗体VHH- 13 蛋白,有望为今后肿瘤干细胞的检测和治疗提供了新的手段[13]。
摘要：[目的]获得骆驼来源的与人CD133抗原特异性结合的纳米抗体。[方法]从3峰新疆双峰驼外周血中分离淋巴细胞,采用巢式PCR扩增获得cDNA并构建VHH天然噬菌体展示文库。包被CD133-606于ELISA板,对天然文库进行3轮亲和筛选,菌落PCR和基因测序确定能结合CD133的候选克隆。挑选重复序列VHH克隆构建到pET28a并转BL21用IPTG诱导表达。IMAC方法纯化重组VHH抗体蛋白,Western Blot和ELISA检测与CD133的抗原结合性。[结果]从109淋巴细胞中构建了库容为1.4×109cfu的噬菌体展示文库,Western Blot及ELISA结果显示重复4次核苷酸序列的VHH-13的纳米抗体能与CD133-606有较好的结合活性。[结论]通过对VHH天然展示文库的亲和筛选及鉴定,成功获得了能与人重组CD133胞外区特异结合的纳米抗体。
关键词：CD133,纳米抗体,天然噬菌体展示文库,亲和筛选,ELISA
抗体鉴定 篇2
采用重氮化法合成磺胺二甲嘧啶(SM2)-人血清白蛋白(HSA)免疫抗原和SM2-卵清白蛋白(OVA)包被抗原.经紫外光谱扫描法确认SM2与载体蛋白偶联成功;经计算SM2与HSA、OVA的结合比分别为9:1和15:1.利用杂交瘤技术和有限稀释法经过5次亚克隆,得到三株特异性稳定分泌SM2抗体的.杂交瘤细胞,经鉴定该单克隆抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,为入链,分子量为162 Ku,染色体数目90条左右,亲和常数为6.1×1012 M-1.与其他四种磺胺药和两种载体蛋白HSA、OVA均无交叉反应.
作 者：丁良君 李继昌 周艳君 付锐 霍贵成 张东玲 DING Liang-jun LI Ji-chang ZHOU Yan-jun FU Rui HUO Gui-cheng ZHANG Dong-ling 作者单位：丁良君,李继昌,霍贵成,张东玲,DING Liang-jun,LI Ji-chang,HUO Gui-cheng,ZHANG Dong-ling(东北农业大学,动物医学院,黑龙江,哈尔滨,150030)
周艳君,ZHOU Yan-jun(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001)
付锐,FU Rui(伊春市金山屯区林业医院,黑龙江,伊春,1500263)
SHN3多克隆抗体纯化与鉴定 篇3
SHN3是一种具有跨膜结构的树突细胞因子，我们前期研究发现shn3基因在没有分化的神经干细胞中高表达，而在分化终末的神经细胞中表达较低;随后的研究表明shn3基因可以维持神经干细胞的状态，与神经干细胞的分化有关，各种研究结果显示shn3在神经系统中起着重要作用[1]。
抗体是生物科学研究之中最为重要的科学研究工具之一，利用抗原抗体特异性结合的原理，在蛋白水平上，可以用于各类蛋白的免疫识别，利用免疫共沉淀的方法分离特定蛋白;在细胞水平上，可以应用流式细胞技术区分和鉴定细胞;在组织水平上，则可以分析待检测组织中表达的蛋白质或是显微镜下直接观察[2]。
抗体不仅在科学研究中占据重要地位，随着越来越多的研究转向人类疾病的研究与治疗，抗体的医用价值也备受人们关注。无论是在诱导癌细胞凋亡还是心血管疾病中利用“生物导弹”的导向治疗等，抗体作为新型的治疗手段和药物的医学价值日益显著[3]。
无论是抗体的科研价值还是医用价值的体现，都对抗体的免疫特异性要求越来越高。所以，本实验创新性的改进传统Ig G纯化技术，创新性的通过筛选免疫特异性肽段，并结合亲和层析纯化的方式改进出一种有效地提高抗体免疫特异性的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验材料
作者实验室自制SHN3多克隆抗体[4];HEK293T和U251细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;Pmal-C2载体和BL21(DE3)表达宿主菌由作者实验室保存。
1.1.2 试剂
Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶购于Fermanters公司;T4DNA连接酶、Tag酶连接酶购于Takara公司;羊抗兔、羊抗鼠红外标记二抗(Odyssey)购于Invitrogen公司;β-actin抗体购于Abcom公司;mbp抗体购于康为世纪公司;硝酸纤维素膜NC膜(Whatman);IPTG购于北京拜尔迪公司;引物合成于上海捷瑞公司。
1.1.3 引物设计
根据实验室前期所制备的鼠源shn3 c DNA中130～228位碱基序列，设计抗体纯化特异性片段复性引物。4条片段复性后分别用Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶插入到Pmal-C2载体中，引物序列如下:
1.2 方法
1.2.1 重组表达载体的构建
将合成好的4对引物用灭菌后的dd H2O稀释到100μmol/L，再用1*Annealing Buffer稀释至10μmol/L，分别取上下游引物25μl混合后运行Anneal PCR程序。Anneal PCR程序为:先95℃预变性10min，再按从95℃至25℃每3min降低5℃复性，得到PCR产物回收，dd H2O溶解4℃保存。Pmal-C3载体Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶双酶切过夜，割胶回收后分别与复性后4个片段T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建PmalC2-Part-1、Pmal-C2-Part-2、Pmal-C2-Part-3、PmalC2-Part-4。利用热激法将构建好的载体转化入BL21(DE3)中，菌种PCR鉴定、测序[5]。
1.2.2 融合蛋白的原核表达
从平板上挑单菌落至装有4mL LB培养基的试管中，37℃、220r/min摇床摇约5h，测OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导培养，37℃继续振荡培养4h后，取100μl菌液12 000r/min,5min离心后取上清，100μl 1*SDS-PAGE loading Buffer裂解，孵育器99℃煮蛋白10min,-20℃保存。
1.2.3 Western blotting筛选特异片段
取煮好的蛋白，经SDS-PAGE电泳转入硝酸纤维素膜后，分别用兔抗SHN3多克隆抗体抗体和鼠抗MBP多克隆抗体进行Western blotting，用Odyssey成像系统检测4段重组蛋白。
1.2.4 亲和层析纯化目的抗体
将人工合成筛选出的特异性片段与预先处理膨胀的Thiolsepharose 4B混合装载成柱，4℃旋转混合过夜。将实验室自制SHN3多克隆抗体PBS透析后稀释过柱，得到目的抗体，Western blotting检验亲和特异性[6]。
2 结果与分析
2.1 抗体特异性片段设计
原抗体免疫原为c DNA 130bp～228bp共99个碱基，为了增强抗体识别的特异性，避免杂带，将这99个碱基换分为4个等长且互相重叠的区段，分别为Part-1(112～159bp)、Part-2(142～186bp)、Part-3(172～219bp)、Part-4(202～249bp)四个片段。则片段示意图如图1。
2.2 4个抗体特异性片段阳性克隆PCR鉴定
连接产物经转化、抗性筛选后，挑取克隆菌种PCR鉴定，以每个片段的上游引物和设计的用于鉴定的Part-5下游引物进行PCR鉴定，理论目的片段长为514bp，鉴定结果如图2。
Note:1:Marker;2:control;3:Pmal-C2-Part-1;4:Pmal-C2-Part-2;5:Pmal-C2-Part-3;6:Pmal-C2-Part-4.
2.3 特异性片段的筛选
将鉴定正确的4个载体的克隆测序正确后，原核诱导后抽提蛋白，用抗体Western blotting检验特异性最强的片段，Pmal-C2载体上本身带有标签MBP(麦芽糖结合蛋白)，用MBP抗体作蛋白表达的阳性对照，筛选特性片段。结果表明，4个片段中，Part-3表达的肽段与抗体的特异性最强，则选取Part-3肽段序列人工合成肽段，作为纯化抗体的配基与抗体结合。
Note:1:Part-1;2:Part-2;3:Part-3;4:Part-4.
2.4 Western纯化后抗体特异性
HEK-293T细胞转染人源和鼠源SHN3后，培养48h抽提细胞蛋白，小鼠海马组织蛋白，人源胶质瘤细胞系U251细胞蛋白，Western检验纯化抗体特异性。结果表明，无论是在过表达HEK细胞中，还是在小鼠脑组织细胞人源胶质瘤细胞抽提蛋白中，纯化后抗体杂带减少，免疫特异性明显增强。
3 讨论
抗体不仅是现代生物科学研究的重要工具之一，更在医学治疗方面拥有巨大潜力[7]。然而，无论是科学研究还是医学应用[8]，对抗体的亲和特异性都越来越高。
传统的抗体纯化技术仅是以Ig G特异性蛋白protein A为结合蛋白，纯化得到单一的Ig G抗体，但并不能提高抗体本身的特异性。本研究则是创新的以本实验室自制SHN3多克隆抗体为基础，结合蛋白亲和层析原理[9]，将免疫原分割成更小的片段来减少由于过长的肽段结构而产生的非特异性，筛选并合成亲和特异性最高肽段，再用亲和层析的方法筛选获得与目的蛋白特异性结合的多克隆抗体。
Note:A:Expression of SHN3 in HEK293T cells(1:Murine;2:Humanized);B:The hippocampus of mice;C:U251.
研究结果表明，在原免疫原中确实存在特异性更高更小的片段，以其为亲和层析的结合片段，不仅排除了冗余结构免疫的干扰，同时也将动物免疫过程中的非特异干扰除去。无论是细胞水平还是组织水平的蛋白特异性均获得显著提高。本研究不仅为SHN3的进一步研究提供了更为可靠的工具，也为各种实验室自制非商业性多克隆抗体的纯化提供了较为可行的方法。
参考文献
[1]居相春,王海烽,吴婕,等.重组小鼠树突状细胞因子DCF1的原核表达与纯化[J].生物技术,2010,20(1):23-25.
[2]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术[J].中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152.
[3]Andrew M.Scott,Jedd D.Wolchok,Lloyd J.Old.Antibody therapy of cancer[J].Nature Reviews Cancer,2012,12(4):278-287.
[4]Helga Spieker-Polet,Periannan Sethupathi,Pi-Chen Yam,et al.Rabbit monoclonal antibodies:generating a fusion partner to produce rabbit-rabbit hybridomas[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1995,92(20):9348-9352.
[5]Joseph Sambrook,David W.Russell.Molecular Cloning A Laboratory Manual[M].3rd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001:385-417.
[6]Ana Cristina Grodzki,Elsa Berenstein.Antibody purification:ammonium sulfate fractionation or gel filtration[J].Methods in Molecular Biology,2010,588:15-26.
[7]O.C.Boerman,E.P.Mijnheere,J.L.V.Broers,et al.Biodistribution of a monoclonal antibody(RNL-1)against the neural cell adhesion molecule(NCAM)in athymic mice bearing human small-cell lung-cancer xenografts[J].International Journal of Cancer,1991,48(3):457-462.
[8]Gregory P Adams,Louis M Weiner,Monoclonal antibody therapy of cancer[J].Nature Biotechnology,2005,23(9):1147-1157.
抗体鉴定 篇4
运用杂交瘤细胞技术,以牛型结核分支杆菌免疫Balb/c小鼠,用其超声波裂解液筛选杂交瘤细胞,得到了2株能稳定分泌抗牛型结核杆菌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5D4和4C3,并对它们的特性作了初步鉴定.经鉴定,2株单克隆抗体均为IgG1 亚类.腹水经ELISA检测,效价可达1∶1×104～1∶1×105,同时分析了2株单抗的抗原位点,结果表明2株单抗针对不同的`抗原位点.单抗的特异性试验结果显示,2株单抗与大肠杆菌,沙门氏菌,金黄色葡萄球菌等均没有反应,但都与人型结核分支杆菌有不同程度的交叉反应.并应用免疫胶体金技术制备牛结核杆菌胶体金快速诊断试纸条做应用性鉴定.该试纸条只与结核杆菌发生反应,而不与沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、李氏杆菌等发生交叉反应.该试纸条最低能检测出浓度为1×106个/mL的牛结核杆菌菌液,有较高的灵敏度.
作 者：朱德全 杜惠芬 李克生 余四九 ZHU De-quan DU Hui-fen LI Ke-sheng YU Si-jiu 作者单位：朱德全,余四九,ZHU De-quan,YU Si-jiu(甘肃农业大学动物医学院,甘肃,兰州,730070)
杜惠芬,李克生,DU Hui-fen,LI Ke-sheng(甘肃兰州雅华生物技术有限公司,甘肃,兰州,730030)
抗体鉴定 篇5
1 资料和方法
1.1 设备、材料
离心机:LDZ4-0.8 (判读结果) 。 LDS-2A (洗涤红细胞) :离心机的转数应达到4000 r/min, 且达到4000 r的时间不应超过3 s。
水浴箱:HH-WZ1-600 水浴箱37℃恒温, 温度上下波动不超过1℃。
显微镜:OLYMPUS显微镜性能良好, 备有100、400二套物镜。
实验所用试管清洁干燥, 吸管均采用一次性。所用试剂在室温 (18～25℃) 平衡30 min, O型红细胞和谱细胞均配成2%～4%的悬液, 抗人球蛋白效价为8的最适效价, 聚凝胺试剂结果准确可靠。
1.2 对象
在无偿献血者中ABO正反定型不符。在临床输血者中有输血反应史、死胎史, 流产史、新生儿不明原因的溶血、黄疸等。
1.3 方法
1.3.1 鉴定前被检标本的处理
采集被检者抗凝血2 ml, 不抗凝血3 ml。抗凝血用来洗涤红细胞, 不抗凝血应在4℃保存14～16 h或在37℃保存2 h, 或用离心机将血清析出。患者的红细胞要配成2%～4%的红细胞悬液, 确保被检者血清无乳糜, 红细胞无细菌污染, 标本新鲜。
1.3.2 检测步骤
①将被检者的标本预处理好, 并标记清楚;②准备14个试管, 编号1～12号, 作为谱细胞反应管, 另二管作阴性、阳性对照;③将被检者的血清加入试管2滴 (1～12号和阴对) , 阳性对照管加入抗-D血清2滴;④1～12号管加入解冻后的谱细胞各1滴, 阴对管中加入被检者RBC 1滴, 阳性对照管中加入O型混合细胞1滴;⑤37℃孵育45 min。洗涤RBC 4次, 2000 r/min, 1 min/次, 每次均扣干;⑥每管加2滴抗人球蛋白, 3400 r/min, 离心15 s;⑦镜下判读结果;⑧根据谱细胞的反应格局, 筛出被检者抗体的特异性。对已筛出的抗体, 做吸收放散试验。
1.3.3 筛选谱细胞标准
① 经常参加无偿献血的健康人群;② ABO血型为O型;③ 每个人含有ABO以外的抗原不同;④ 谱细胞所表达的抗原特异性高。
1.3.4 需进行不规则抗体筛选的人
1.3.4.1 输血
①ABO正反定型不符;②受血者血清与供血者的红细胞不配合;③受血者的红细胞与供血者的血清不配合;④全血输注或血浆输注后, 出现输血反应。
1.3.4.2 妊娠
①孕妇有不明原因的流产史;②孕妇有不明原因死胎史;③新生儿有不明原因的黄疸、水肿、贫血、肝脾肿大、核黄疸。
2 结果
结果见表1。显示用谱细胞筛选和不用谱细胞筛选出的抗体数是不同的, 用谱细胞筛选检出不规则抗体数高于不用谱细胞筛选。
3 典型病例
患者, 男, 37岁, 血型为B型, 2003年来血站无偿献血200 ml, 实验室诊断:ABO正反定型不符, 实验室反应格局见表2, 与12个谱细胞反应格局见表3。
患者红细胞P1抗原定型 (-) 。吸收放散实验:放散液与P1阳性细胞反应, 与P1阴性细胞无反应。效价:8, 直接入袋血报废。经过谱细胞的筛选及红细胞抗原的鉴定和吸收放散试验的证实, 此人血清中含有IgM抗-P1抗体, 效价为8.说明:①在此试验中, 阴性对照应无凝集.阳性对照应有凝集在阴性对照管中加入1滴已致敏的O型RBC, 如有凝集则试验成立, 否则此次试验失败;②鉴定被检者抗体的同时, 应测被检者RBC上的抗原血清中有此种抗体, RBC上就没有相应的抗原;③洗涤RBC最后一遍时应留取上清液作平行对照。
4 讨论
谱细胞就是用多个不同红细胞抗原的细胞组成的细胞谱, 用来检测被检者血清中含有的不规则抗体的性质。在用谱细胞筛选不规则抗体一组中, 所筛选210例标本中共检出45例不规则抗体。不用谱细胞筛选不规则抗体, 在所筛选347例标本中, 通过正反定型检出不规则抗体14例。应用谱细胞筛选不规则抗体检出抗体率明显高于不用谱细胞筛选。不规则抗体是临床输血中发生输血反应的重要因素, 也是诊断的重要依据, 应用谱细胞能较快的鉴定出抗体的特异性, 为挽救患者的生命缩短了时间, 市售的谱细胞保存短, 价格昂贵。本站根据大部分无偿献血者定期献血的规律, 适当的筛选了一些经常献血的人群, 对其进行红细胞抗原的鉴定, 在其献血时, 将此人的红细胞用甘油冰冻保存起来, 可保存2～3年, 其红细胞上的抗原不失活性。待有不规则抗体需要鉴定时, 将冰冻保存的红细胞经过一系列的解冻, 洗涤并配成红细胞悬液, 用来检测不规则抗体。
参考文献
[1]李勇, 杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.红细胞血型应用.中国科学技术出版社, 1999:126-139.
[2]Walker RH.Branch DR.Dzik WH, et al.Technical Manual.11thed.Bethesda:AABB, 1993;171-173, 208, 209.
抗体鉴定 篇6
1 材料和方法
1.1 主要试剂及试验动物
p GEX-6p-1原核表达载体、E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)感受态细胞,均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院基础兽医学实验室提供;DNA凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒,购自北京索莱宝生物技术有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、Bam HⅠ和XhoⅠ限制性内切酶,购自Fermentas公司;IPTG,Biosharp公司产品;HRP标记羊抗鼠Ig G,购自北京中杉金桥生物技术有限公司;IRDye700DX羊抗鼠Ig G,购自Li-COR公司;ECL发光液试剂,购自Biotopped公司;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,Sigma-Aldrich公司产品;8周龄的Balb/c雌性小鼠,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
1.2 基因的合成及引物的设计
参考Gen Bank中猪整合素β3核苷酸序列(GenBank NM_214002),利用CBS网站(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在线分析该氨基酸序列的疏水性,分析蛋白的跨膜区,截取胞外区氨基酸部分,再利用DNAStar软件中的Protean工具分析氨基酸的主要抗原区,并优化针对大肠杆菌具有偏嗜性的密码子,分别在5'和3'末端加入Bam HⅠ和XhoⅠ两种酶切位点,人工合成了猪整合素β3核苷酸序列。将合成的基因连接至p GH载体上,该重组质粒p GH-β3由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。然后利用Primer Premier 5.0软件设计1对引物,序列为:β3-F(上游引物)5'-ATCGGATCCATGCGTGGTGT-GAGCTCCTGC-3',β3-R(下游引物)5'-GGACTCGAGTTAGTCAGGGCCCTTCGGACA-3',用于猪整合素β3基因载体构建的鉴定。
1.3 猪整合素β3基因的原核表达及纯化
用重组质粒p GH-β3和p GEX-6p-1载体分别进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切后产物利用胶回收试剂盒进行胶回收,然后将纯化后的猪整合素β3基因和p GEX-6p-1载体进行连接,转化E.coli DH5α感受态细胞。随机挑取10个单菌落,利用β3-F和β3-R引物进行菌落PCR鉴定。将筛选出的阳性菌提取质粒,然后转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,挑取单菌落于含有100μg/m L Amp+的LB液体培养基中培养,当OD600值到0.6时,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h,然后利用SDS-PAGE电泳鉴定猪整合素β3基因重组蛋白的表达。表达猪整合素β3基因的菌体用PBS洗5次后,进行超声破碎,取菌体的上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳鉴定,然后将含有目的蛋白的凝胶切下,用电透析的方法将蛋白洗脱下来,100 V电离1 h,获得纯化的猪整合素β3重组蛋白。
1.4 猪整合素β3重组蛋白的鉴定
将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳,转印至硝酸纤维膜(NC膜)上。用5%的脱脂乳封闭,37℃封闭2 h,用PBS洗3次,每次10 min。以GST单克隆抗体(m Ab)为一抗(1∶3 000),37℃孵育2 h,洗涤同上。以山羊抗鼠HRP-Ig G为二抗(1∶2 000),37℃孵育1 h,洗涤同上。将NC膜置于Super ECL Plus超敏发光液中,用扫描成像系统进行扫描。
1.5 猪整合素β3重组蛋白抗体的制备
将纯化的猪整合素β3重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后,按50μg/只的剂量于皮下、腹腔多点注射,对Balb/c小白鼠进行免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂,二免和三免用弗氏不完全佐剂,对照组为健康Balb/c小白鼠。每次免疫间隔14 d,三免3 d后对小鼠进行采血,分离血清,于-20℃保存。
1.6 猪整合素β3重组蛋白抗体效价的ELISA检测
用终浓度为1μg/m L的纯化蛋白包被96孔板(100μL/孔),置于4℃过夜。次日弃去液体,用PBS洗3次,每次5 min。拍尽孔中液体后每孔加5%的脱脂乳150μL,37℃封闭2 h,洗涤同上。以待测血清为一抗,并利用方阵法确定血清稀释度(每孔100μL,37℃孵育1 h,洗涤同上)。以山羊抗鼠HRP-Ig G(1∶2 000)为二抗,37℃孵育1 h,洗涤同上。每孔加入100μL TMB底物显色液,避光作用10 min,每孔再加入2 mol/L硫酸终止液100μL终止其反应,用酶标仪读取OD450值。
1.7 猪整合素β3重组蛋白抗体的Western-blot鉴定
利用含有天然整合素β3蛋白的猪小肠黏膜上皮细胞(IEC细胞)、猪睾丸细胞(ST细胞)、猪肾细胞(PK15细胞)及仔猪小肠组织,分别利用裂解液获取总蛋白,样品处理后进行SDS-PAGE电泳,转印至NC膜上。用5%的脱脂乳室温封闭2 h,用PBS洗3次,每次10 min。以制备的猪整合素β3多克隆抗体作为一抗(1∶200),室温孵育2 h,洗涤同上。以IRDye700DX羊抗鼠Ig G为二抗(1∶5 000),室温孵育1 h,洗涤同上。在荧光扫描成像系统上进行扫膜分析,进一步验证制备的猪整合素β3多克隆抗体是否与天然整合素β3蛋白具有反应原性。
2 结果
2.1 猪整合素β3跨膜区与抗原性分析结果
利用CBS网站(www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM-2.0/)对猪整合素β3的跨膜区进行预测,结果表明,第1~6位和738~784位氨基酸为胞内区,第7~29位和715~737位氨基酸为跨膜区,第30~714位氨基酸为胞外区(见275页彩图1)。进一步利用DNAStar软件中的Protean工具对猪整合素β3胞外区(第30~714位氨基酸)进行抗原性分析,结果表明,猪整合素β3胞外区(第30~714位氨基酸)具有较好的抗原性(见276页彩图2)。
2.2 猪整合素β3主要抗原区的原核表达结果
猪整合素β3主要抗原区重组质粒p GH-β3用Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切,获得了2 907 bp和2 079 bp 2个片段,与预期大小相符(见图3)。重组质粒p GEX-6p-1-β3以IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在100 ku左右可见特异性的表达条带,与预期条带大小相符(见图4)。
M.DL-10 000 Marker;1.合成的猪整合素β3质粒DNA双酶切;2.合成的猪整合素β3质粒DNA PCR扩增。
M.蛋白Marker;1.诱导后p GEX-6p-1对照;2.诱导后p GEX-6p-1-β3菌体裂解物;3.超声后p GEX-6p-1-β3沉淀物;4.纯化的目的蛋白。
2.3 猪整合素β3主要抗原区重组蛋白纯化结果
细菌经超声破碎后,经SDS-PAGE电泳,结果目的蛋白存在于沉淀内,表明蛋白以包涵体形式存在。将含有目的蛋白条带的胶条切下进行纯化,获得了纯化的猪整合素β3重组蛋白,见图4。
2.4 猪整合素β3重组蛋白的Western-blot分析结果
纯化后的重组蛋白经Western-blot分析,在100 ku左右有1条特异性条带,与预期的102 ku大小一致(见图5),表明猪整合素β3主要抗原区与p GEX-6p-1载体的GST标签正确融合。
2.5 猪整合素β3抗体鉴定结果
ELISA检测结果表明,猪整合素β3多克隆抗体效价为1∶12 800。Western-blot检测结果表明,制备的猪整合素β3多克隆抗体能够识别IEC细胞、ST细胞、PK15细胞和仔猪小肠组织中的天然整合素蛋白(见图6)。
M.蛋白Marker;1.纯化蛋白;2.GST标签对照。
M.蛋白Marker;1.PK15细胞;2.仔猪小肠组织;3.ST细胞;4.IEC细胞。
3 讨论
病毒表面囊膜蛋白与宿主细胞表面受体蛋白的相互作用是病毒能否侵入宿主细胞以及复制的关键所在。随着对病毒以及病毒受体研究的不断深入,目前认为病毒受体是一组位于细胞表面的蛋白质分子复合物[11]。大量研究显示,整合素在众多病毒感染中发挥作用,具有成为共性受体蛋白的趋势,在病毒学研究领域倍受关注。前期研究揭示,在Vero E6细胞中鉴定的627个膜蛋白中17种蛋白与病毒受体相关,其中包括整合素蛋白[12]。D.Sun等[13]报道,猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero E6细胞后,整合素β3蛋白表达水平上调。进一步分析表明,PEDV的纤突蛋白S中含有整合素配体识别序列DGE、KGE、RLD和LDV,具有与整合素相互作用的氨基酸基序[14]。猪整合素β3在PEDV感染过程中可能发挥着潜在作用。
抗体鉴定 篇7
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, C.jejuni)是一种革兰氏染色阴性的嗜热微需氧菌,[1],该菌菌体纤细,无芽孢,有鞭毛,运动活泼,在光镜下呈螺旋状运动,具有多形性。本菌广泛分布于温带、亚热带和热带地区。作为鸟类肠道的寄生菌,自1972年由Dekeyser等首次从腹泻患者粪便中分离出来以后逐渐认识到,C.jejuni和C.coli是世界性分布的细菌性腹泻最常见的病原菌之一。人类通常通过摄入未煮熟的禽类而感染空肠弯曲菌。空肠弯曲菌感染人类肠道的的致病机制了解的相对比较贫乏,包括黏膜粘附,侵袭宿主细胞和毒素分泌[2]。Pei等纯化了可能位于外膜的只有在经过甘氨酸处理后才会释放的同源的不同的4种蛋白PEB1—4[3]。通过与HELA细胞的结合能力调查了空肠弯曲菌和结肠弯曲杆菌属的外膜成分的功能,Fauchere 等证明分子量在26—30 kDa的几种蛋白在黏附中起重要作用,制备的这些蛋白的兔抗血清与菌HELA细胞共同孵育,明显减少了这些细菌与HELA细胞的黏附[4]。重要的是,PEB1a突变株显示在组织培养中粘附减弱,并且在小鼠感染模型中菌量也是明显减少的[5]。目前研究表明 PEB1蛋白是由PEB1A基因编码,分子量28 kDa,存在于所有C.jejuni 的表面,具有保守性,无血清型改变,是空肠弯曲菌的共有抗原和主要细胞粘附分子[6]。通过电子显微镜证明表面暴露的PEB1,具有很高的免疫原性,在空肠弯曲菌黏附在HELA细胞上的过程中是必需的[7],指示PEB1a是空肠弯曲菌重要的毒力因子和主要黏附分子,在CJ与肠道黏膜的粘附中发挥重要作用。为制备抗原特异性的肠道高亲和力口服疫苗创造了条件。本实验小组前期构建了胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG[8],为进一步研究介导PEB1的rBCG的免疫特性及功能,我们纯化了PEB1蛋白,并大量制备了它的高效价的多克隆抗体,为肠道粘附疫苗的进一步研究提供了基础。
1 材料
1.1 试剂
表达PUC19-PEB1质粒的E.coli DH5α菌种由本研究小组前期构建保存,氨苄青霉素(Amp)购自北京鼎国生物技术有限公司。谷胱甘肽—琼脂糖树脂(上海锐谷生物科技有限公司)、分子筛(上海雨青分子筛有限公司),蛋白分子量Marker (Fermentas公司),异丙基硫代-G-D-半乳糖苷(IPTG)(大连TaKaRa公司),辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG均购自博士德生物工程有限公司;其余试剂为国产分析纯或分子生物学专用试剂。
1.2 实验动物
新西兰兔,体重2—3 kg,由第四军医大学实验动物中心提供。
1.3 主要仪器
Heraeus Eppendoff高速台式离心机(Biofuge Pico公司),Soniprep 150型超声破碎仪(MSE公司),H2Q—X100振荡培养箱(哈尔滨东联电子开发技术有限公司),酶标仪(SUN公司),DY—3B稳压稳流定时电泳仪(江苏兴化分析仪器厂),超净工作台(杭州超净器材厂)。
2 实验方法
2.1 PEB1蛋白的纯化及鉴定
取10μl表达PUC19-PEB1质粒的E.coli DH5α菌种接种到50 mL含Amp的LB液体培养基中,培养过夜,第二天早上取20 mL接种到1 L含Amp的LB液体培养基中 ,培养3 h后,加入1 mL 1 mol/L的IPTG进行诱导,继续培养4 h后。取菌液离心,用100 mL pH7.0的PBS悬浮细菌,超声波破碎细胞,离心后取上清和沉淀,分别电泳。留上清,去沉淀。根据上清电泳分析,表达的蛋白量比较高。根据蛋白质的等电点9.04,我们将上清调pH到9.04,在4 ℃放置过夜,在4 ℃条件下离心30 min,离心速度16 500 r/min。离心沉淀用pH 7.0的PBS复溶。将复溶的蛋白调pH到4.2,上阳离子交换柱。用pH 7.0 PBS+0.25 mol/L的氯化钠洗脱。用分子筛脱盐,即得到目标蛋白,将纯化蛋白制样行12%SDS—PAGE分析
2.2 PEB1抗体的制备
2.2.1 动物免疫
PEB1蛋白经变性、复性后,按500 μg/kg的纯化蛋白加等量弗氏完全佐剂(FCA)乳化后接种于兔颈背部皮内,间隔2w后再进行第二、三、四次免疫。
2.2.2 免疫兔血清中PEB1蛋白特异性抗体滴度的测定
用间接ELISA法测定免疫兔血清中PEB1特异性抗体的滴度。用纯化的PEB1蛋白包被96孔板,20 μg/孔,4 ℃过夜。PBST液洗板4次,甩干后加入10 g/L的BSA,37 ℃封闭30 min。PBST洗涤后加入倍比稀释的待测免疫兔血清,37 ℃孵育1 h,PBST洗涤后再加入HRP—羊抗兔IgG,37 ℃孵育1 h,洗涤后加入OPD底物溶液显色,测定波长490 nm光吸收值。以未经免疫的兔血清为阴性对照。
2.2.3 免疫兔血清中PEB1蛋白特异性抗体的western-ploting检测
检测抗体效价达到标准后颈动脉插管收集血液,将血液离心,将血细胞去掉,留血清,过PROTEIN A柱纯化抗体,最后WB检测抗体效果。以1∶1 000稀释的兔抗血清为一抗,二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体,Western印记分析多克隆抗体能否特异识别PEB1蛋白。
3 结果
3.1 PEB1蛋白的纯化
对洗脱液进行SDS—PAGE分析的结果表明获得了纯化的PEB1蛋白。定量检测: lorry法测定蛋白浓度1.12 mg/mL,总体积95 mL左右。
M—低分子量蛋白Marker,1—纯化的重组蛋白, 2—菌裂解液上清中的蛋白
3.2 兔抗PEB1抗体的效价测定
第四次免疫结束2 w后从兔子身上取2 mL的血液进行ELISA的效价检测。间接ELASA法检测表明鼠抗PEB 1血清效价达到1∶10 000,而作为阴性对照的未经免疫的血清以及未加抗原的孔管全部呈阴性。
3.3 免疫兔血清中PEB1蛋白特异性抗体的western-ploting检测
制备的多克隆抗体,经Western印记检测表明,该抗体能与PEB1蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。如图2。
M—低分子量蛋白Marker,1—纯化蛋白与制备的 抗PEB1多克隆抗体的Western印迹
4 讨论
哮喘是呼吸系统常见疾病,近年发病率和死亡率持续上升,严重影响人类健康。Th2优势的Th1/Th2平衡紊乱是哮喘的免疫基础。BCG可调节TH1/TH2平衡,引起TH1优势的免疫应答,同时又是一种很好的免疫佐剂。本实验小组将过敏原Der p2基因转入BCG中表达,制备出Der p2重组BCG(Recombinate BCG,rBCG)。结果表明改变了以往对Der p2抗原Th2特征的应答方式,转变为Th1优势的应答[9,10]。这意味着哮喘等过敏性疾病可以利用过敏原rBCG作为疫苗而得到治疗。实践证明,短期内重复注射接种会引起局部严重的迟发变态反应(DTH),严重影响注射接种的可重复性,甚至有可能影响疗效。为此,我们采用口服接种Der p2-rBCG,结果同样诱导了抗原特异性的Th1应答[11]。因为BCG不是肠道定植菌,为提高免疫刺激的效果,我们曾给予大量rBCG口服,结果导致肠道正常菌群失调和口咽部感染,免疫效果仍不理想。
C.jejuni侵袭、定植宿主肠道细胞之前需要黏附到宿主肠道细胞表面,目前研究认为可溶性蛋白PEB1在C.jejuni的黏附中发挥着重要作用。Pei 等[6]的研究说明PEB1可以黏附Hela细胞。Kervella等[12]等发现,C.jejuni与Hela细胞的黏附可以被抗PEB1血清明显抑制,并且纯化的PEB1蛋白可以竞争性地抑制细菌与Hela细胞的黏附。为提高rBCG疫苗与肠道的亲和力,提高口服免疫的效力,本实验小组利用基因重组技术,又制备了胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1的重组BCG。本试验中利用纯化的蛋白免疫兔,所获得的抗体血清效价高达1∶10 000。Western印记检测表明,该抗体能与PEB1蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。为下一步观察肠黏膜高亲和力重组BCG的口服免疫特性打下了坚实的基础。
参考文献
[1] Altekruse S F,Stern N J,Fields P I,et al.Campylobacter jejuni—An emerging foodborne pathogen.Emerg Infect Dis,1999;5(1):28—35
[2] Ketley J M.Pathogenesis of enteric infection by Campylobacter.Mi-crobiology,1997;143(1):5—21
[3] Pei Z H,Ellison R T.Identification,purification,and characteriza-tion of major antigenic proteins of Campylobacter jejuni.J Biol Chem,1991;266:16363—16369
[4] Fauchere J L,Kervella M,Rosenau A,et al.Adhesion to HeLa cellsof Campylobacter jejuni and E.coli outer membrane components.Re-search in Microbiology,1989;140(5):379—392
[5] Pei Z H,Burucoa,C Grignon,B,et al.Mutation in the peb1A locusof Campylobacter jejuni reduces interactions with epithelial cells andintestinal colonizationof mice Infect Immun,1998;66(3):938—943
[6] Pei Z,Blaser M J.PEB1,the major cell-binding factor of Campy-lobacter jejuni,is a homolog of the binding component in gram-nega-tive nutrient transport systems.J Biol Chem 1993;268(25):18717—18725
[7] Kervella M,Pages J M,Pei Z,et al.Isolation and characterization oftwo Campylobacter glycine-extracted proteins that bind to HeLa cellmembranes.Infect Immun,1993;61(8):3440—3448
[8]邵成,史皆然,郭晓雅,等.胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG的构建和鉴定.科学技术与工程,2010;10(17):4135—4138
[9]史皆然,师长宏,吴昌归,等.分泌表达Der p2的重组BCG的构建与鉴定.解放军医学杂志,2006;31(8):767—769
[10]史皆然,张新海,师长宏,等.胞壁表达Der p2的重组BCG对BALB/c小鼠Th细胞免疫应答的影响.细胞与分子免疫学杂志,2005;21(3):287—289
[11]史皆然,张金山,师长宏,等.胞壁型rBCG经口服免疫可以诱导BALB/c小鼠产生抗原特异性TH1应答.中华微生物学和免疫学杂志,2007;27(2):107—110
抗体鉴定 篇8
1 资料与方法
1.1 一般资料
标本来自2006年8月~2009年4月我院住院的3例患者,其病历摘要见表1。3例患者均给予输血治疗,因均有输血史,输血前做不规则抗体筛查,患者1和患者3不规则抗体筛查阳性,患者2不规则抗体筛查阴性。复查ABO血型和Rh D血型结果与输血单上所填内容相同。
1.2 血型、配血及输血分析
1.2.1 患者1的血型、配血及输血分析
临床申请输红细胞悬液6 U,输血科复查患者1的血型确定为B型,Rh D(+),取B型,Rh D(+)的供血者血液[已复检为B型Rh D(+)]与患者血样采用盐水法、凝聚法交叉配血。盐水法主次侧均相合,凝聚胺法主侧不合,次侧相合。患者血清的不规则抗体筛查阳性。从患者血清与筛检红细胞反应格局(微柱凝胶卡式法)初步判断不规则抗体可能为抗-E和抗-c。将患者血样送至本血站做进一步检查,患者血清与谱细胞反应,结果提示血清中含有Ig G性质的抗-E和抗-c,抗体效价测定,抗-E效价为256,抗-C效价为16,说明患者缺乏E抗原和c抗原,因有输血史,可能曾输入了含有E抗原和c抗原的红细胞,而产生了免疫性抗体抗-E和抗-c。为了输血安全,血站血研室对患者1做Rh血型分型,结果为CCDee,选择B型Rh D(+)供者血液20 U(10袋),做Rh血型分型,结果显示,CCEee 4袋、Cc DEE 3袋、Cc Dee 2袋、cc DEE 1袋。将B型CCEee的供者红细胞6 U取回输血科与患者1做交叉配血(采用盐水法、凝聚胺法、抗人球法)主次侧均相合,输给患者1后,未发生不良输血反应,输后第2天患者1的Hb升至78 g/L,病情好转。
1.2.2 患者2的血型、配血及输血分析
给予输注红细胞悬液2 U,输血科复查患者2的血型为A型、Rh D(+)。输血科有库存A型Rh D(-)红细胞悬液2 U,此袋血距有效期限11 d,为避免报废,在符合输血原则情况下,此袋血中的红细胞拟输给患者2。在交叉配血中,盐水法主、次侧均相合;用凝聚胺法主侧相合,次侧不合(有明显凝集);采用抗人球法结果同凝聚胺法。再次复检患者2和此袋血的血型,结果同前。对患者2和供者血样做不规则抗体筛查,结果为患者2不规则抗体筛查阴性,供者不规则抗体筛查阳性,对照不规则抗体筛查反应格局初步判断供者血样中含有抗-D,将患者2的血样和供者血样送至本血站血研室进一步检查。供者血样中含有Ig G性质的抗-D,效价为64。Rh血型分型结果:患者2为CCDee,供者为Ccdee。如果供者血液输给患者2,因供者含有c抗原,可能会使患者2产生免疫性抗体(抗-c),再次输入含c抗原的血液易发生溶血性输血反应,故此袋血不能输给患者2。血站从4袋库血[A型、Rh D(+)]中经Rh血型分型,挑选出1袋同型(A、CCDee)血液,与患者2交叉配血相合。输注给患者2后,Hb上升到77 g/L,改善了贫血症状,病情好转。
1.2.3 患者3的血型、配血及输血分析
给予输注红细胞悬液4 U,输血科复检患者3血型和两者供者(2袋红细胞悬液)的血型均为O型、Rh D(-)。盐水法、凝聚胺法对患者3和2个供者的血样进行交叉配血。盐水法主侧有凝集,次侧相合;凝聚胺法同盐水法。患者3血清的不规则抗体筛查阳性。血站检测患者3的血清不规则抗体确定为抗-C和抗-e,抗-C的Ig M效价为8,Ig G效价为16;抗-e的Ig M效价为32,Ig G效价为64。Rh血型分型结果,患者3 Rh血型为ccd EE。本市血站165例Rh D(-)献血员档案中无供者Rh血型与患者3 Rh血型Ccd EE完全相同者,考虑到患者3是未婚女性,年龄22岁,如输入缺失的抗原会产生免疫性抗体,影响婚后生育,供者中只有1例为O型ccde E。该供者E抗原阴性,从理论上讲可以输给患者3,患者3血样(O型ccd EE)与该供者(O型ccde E)交叉配血均相合,输入该供者2 U红细胞悬液后改善了贫血症状,经补铁和营养等临床综合治疗后,患者3病情好转出院。
2 讨论
Rh血型是继ABO血型系统之后最具临床意义的血型系统[2],也是血型抗原和抗体最为复杂的血型系统。依据5种抗原的抗原性强弱依次为D>E>C>c>e,汉族人5种抗原的阳性率分别为D:99.66%;E:47.88%;C:87.45%;c:56.31%;e:52.12%。因此,临床上一次随机输血产生抗-E的机会要比抗D大2.5倍,多次输血的患者易产生抗-E,而导致溶血[3]。抗-D主要通过Rh血型不合的输血和妊娠产生,Rh D阴性个体经妊娠途径受到D抗原刺激后,有50%~70%产生抗-D,Rh D阴性个体接受1ml Rh D阳性血液后约75%产生抗-D,抗-D的产生可导致严重的溶血性输血反应和HDN,严重者可导致受血者新生儿或胎儿死亡[3]。抗-c仅能通过免疫产生,其在Rh抗体中的重要性仅次于抗-D和抗-E[4]。免疫产生的抗-E的患者可合并出现抗-c,其滴度可能会比抗-E弱,呈现剂量效应。患者1 Ig G抗-E效价为256,抗-C效价为16,与上述论点相符。亦有学者认为抗-E阳性患者即使没有检出抗-c,也要避免输注含c抗原的血液,从而避免因抗-c导致的迟发性溶血性输血反应[5],一般情况下抗-C常和抗-Ce(复合抗体)同时产生[6]。东方人c DE抗原阳性率为21%,对于缺乏C抗原和e抗原的受者易产生复合性抗体即抗-Ce。Rh血型系统还有Rh亚型、Rh缺失型等,抗体还有抗-Cw、抗-Cx等。因为Rh血型系统的抗原抗体复杂性,及引起的溶血性输血反应和HDN,输血时要做好Rh血型分型,做到同型相输,避免免疫性抗体产生而造成不良输血反应。
有输血史的3例患者中,无论Rh D(+)还是Rh D(-),患者和供者ABO血型相同,Rh D血型相同或相容的情况下交叉配血中出现不相合。Rh血型分型后找到相同血型的供者血液或配合型供者血液,输注后,Hb上升至应有水平,无不良输血反应,输血治疗效果满意,说明仅做ABO血型、Rh D血型和不规则抗体筛查是不够的,必须做不规则抗体鉴定和Rh血型分型,使受供双方C、c、D、E、e抗原均相同或相配合才能保证输血安全。
血站在Rh血型分型的基础上,建立献血员档案,档案内容包括献血员姓名、性别、身份证号、电话号码、ABO血型、Rh D血型、Rh血型表现型、血清中有无抗体、抗体效价等,本地区Rh D阴性献血员档案全部建立并入稀有血型库。Rh D阳性献血员也要建立档案并入血型库。血型库和稀有血型库信息可传输到医院输血科,做到信息共享,医院输血科开展不规则抗体鉴定和Rh血型分型工作,一旦遇上不规则抗体阳性的患者,鉴定其不规则抗体类别,效价和Rh血型分型,并将患者的其他数据信息传至血站,医院输血科和血站均可从血型库和稀有血型库中查找同型血液或配合型血液,患者能及时输注安全的血液。
临床上需要反复输血的患者,特别是尚未生育的女性,除常规配血选择配合型血液输注外,建议进行Rh系统分型,选择Rh同型血液输注,避免患者缺乏的抗原输入体内,并产生相应的抗体[7]。Rh血型同型输注,避免了产生免疫性抗体而引起的输血后溶血性反应和HDN的发生,提高了临床输血安全性。
参考文献
[1]谭庆芬,崔徐江.聚凝胺法交叉配血不合的输血处理[J].中国输血杂志,2008,21(8):660-661.
[2]丁肖华,郭如华,田兆嵩.Rh免疫球蛋白的临床应用[J].中国输血杂志,2008,21(6):474-476.
[3]崔云昊.Rh血型,采供血规范化监督管理与血液制品检测新技术新标准实用手册[M].银川:宁夏大地音像出版社,2004:581-587.
[4]杨天楹,杨成民,田兆嵩.临床输血学[M].北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1993:71-73.
[5]吕鹏.最新输血新技术学[M].北京:人民卫生出版社,1994:63-198.
[6]肖星甫.输血技术手册[M].成都:四川科学技术出版社,1992:78.
抗体鉴定 篇9
关键词：孕酮,免疫抗原,纯化,杂交瘤,单克隆抗体
孕酮是一种甾体类激素, 主要由黄体及胎盘产生。它是卵巢活动的精确“提示剂”。因此, 对孕酮含量进行监测可以达到提高奶牛生产性能和增加经济效益的目的。国外已经相继研制出了10多种乳汁P4现场测定试剂盒, 能够在现场眼观判断奶牛的妊娠、发情情况或进行繁殖障碍疾病的诊断。目前, 国内李伟雄、史远刚等也制备了P4单克隆抗体。利用酶免和放免技术研制的P4试剂盒在现场应用的效果不是很理想, 还有待于进一步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 完全抗原
P4完全抗原 (免疫抗原P4-SA, 检测抗原P4-OVA) , 自行制备。
1.1.2 细胞
SP2/0骨髓瘤细胞, 军事研究所病毒室提供。
1.1.3 动物
6～8周龄雄性Balb/c小鼠和产仔后的雌性Balb/c小鼠, 购自长春生物制品研究所试验动物中心。
1.1.4 抗体
HRP标记的羊抗鼠酶标二抗, Geview进口, 分装, 工作浓度为1∶2 000, -20℃保存。
1.1.5 其他
细胞培养液RPMI-1640和筛选培养基HAT、HT, 均购自GIRCORRI公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫脾细胞的制备
试验采用了大剂量、长期免疫的小鼠免疫方案 (见表1) 。
1.2.2 细胞融合
按常规方法取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0) 混合无菌取免疫小鼠的脾细胞, 将其与骨髓瘤细胞用适量的基础培养液RPMI-1640混合 (脾细胞∶SP2/0细胞=5∶1) , 细胞悬液1 200r/min离心10min。倒去上清液, 轻微振荡离心瓶, 振散细胞团, 立起离心瓶, 在1min内滴加0.8mL 50%聚乙二醇 (PEG) , 边加边摇动, 加完后静置90s, 然后缓慢转动离心瓶并加入40mLRPMI-1640静置15min, 1 200r/min离心10min。倒去上清液, 轻轻振散细胞, 加入18mL含20%新生牛血清的HAT-1640培养液混合成细胞悬液, 然后将细胞悬液逐滴加入含有饲养细胞的细胞培养板中, 在37℃、5%CO培养箱中培养。
注:FCA为完全弗氏佐剂, FIA为弗氏不完全佐剂
1.2.3 阳性孔的筛选
融合后, 待杂交瘤细胞长至培养孔底1/3～1/2时, 采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。取培养上清液进行抗体检测。建立间接ELISA方法对细胞上清液进行检测。用方阵滴定法确立最佳抗原包被量。细胞生长杂交瘤培养上清液用间接ELISA方法检测, 同时用PBS作阴性对照。用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆, 直至筛选结果100%阳性为止。
1.2.4 腹水的制备
雌性Balb/c小鼠 (最好为产仔后的雌性小鼠) 每只腹腔注射1mL石蜡油, 并每只腹腔注射67个杂交瘤细胞观察小鼠状态, 待肿瘤生长11d后收集腹水, 用间接ELISA法测其效价, 收集到的腹水置4℃过夜, 经过处理后分装, -20℃冰箱冻存。
1.2.5 单克隆抗体亚类鉴定
用鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定杂交瘤细胞培养上清液 (按试剂盒说明书进行) 。
1.2.6 培养上清液和腹水效价测定
用间接ELISA法检测8G6和11A11培养上清液和腹水中和抗体效价。
1.2.7 单克隆抗体的特异性检测
以检测抗原P4-OVA和OVA分别包被酶标板, 按间接ELISA程序测定各孔OD490值, 以检测单克隆抗体与检测抗原分子中的P4残基部分结合反应的特异性。
1.2.8 单克隆抗体相对亲和力测定
2株8G6、11A11单克隆抗体分别经过辛酸-硫酸铵法初步纯化后, 用间接ELISA法测定2株单克隆抗体对P4相对亲和力的大小。
2 结果与分析
2.1 免疫小鼠血清效价的检测结果 (见表2、表3)
注:NC为阴性对照, BC为空白对照。
注:NC为阴性对照, BC为空白对照。
由表2可见, 第8次融合1, 2号小鼠效价比较, 1号小鼠效价较高, 所以选择1号免疫小鼠作为第8次融合使用。由表3可见, 第11次融合1, 2号小鼠血清效价比较, 2号小鼠效价较高, 所以选择2号免疫小鼠作为第11次融合使用。2次融合小鼠效价均达到16 000倍以上, 为细胞融合奠定了的基础。
2.2 细胞融合和阳性孔的筛选、克隆
由表2、表3可见, 在第8, 11次融合才得出阳性较高的杂交瘤细胞株。融合率分别为92.7%、71.53%。第8次融合阳性筛选时, 8G6OD490值 (1.883) >1且接近于阳性对照值, 经过3次有限稀释克隆成为稳定的杂交瘤细胞株。第11次融合阳性筛选时, 1F8、11G5和11A113株OD值分别为1.114, 0.895, 1.388, 但在以后的3次有限稀释克隆中11F8、11G5阳性逐渐减弱并最终消失, 只有11A11较稳定, 最后成功完成克隆
2.3 单克隆抗体的亚类鉴定结果
经过亚类试剂盒的ELISA法检测, 结果8G6主要亚类是IgG1, 11A11主要亚类是IgG 2a。
2.4 8G6、11A11培养上清液和腹水抗体效价测定结果
用间接ELISA检测2株单抗细胞株的培养上清液和腹水中抗体项目效价, 结果见表4。
2.5 单克隆抗体的特异性反应鉴定结果 (见表5)
注:NC为阴性对照, BC为空白对照。
由表5可见, 以检测抗原P4-OVA和OVA分别包被酶标板, 按间接ELISA程序测定各孔OD490值, 以检测单克隆抗体与检测抗原分子中的P4残基部分结合反应的特异性。结果为2株单抗对OVA和BSA包被的酶标板所测OD490值与空白对照值没有显著差异。而用P4-OVA包被的酶标板所测OD490值与BSA、OVA的OD490值比较却差异显著, 说明所获得的2株单抗都是特异性地针对P4的。
2.6 单克隆抗体的相对亲和力测定结果
2株8G6、11A11单克隆抗体分别经过辛酸-硫酸铵法初步纯化后用间接ELISA方法测定其对P4的相对亲和力, 结果为8G6>11A11, 见图1。
由图1中各单抗50%饱和OD490值时抗体的稀释度计算出2株单抗浓度8G6为2.23mg/mL, 11A11为2.67mg/mL。
3 结论