抗体保护率（共7篇）
抗体保护率 篇1
鸭疫里默氏菌 (Riemerella anatipestifer, RA) 主要侵害8周龄内的雏鸭和雏鹅, 引起鸭疫里默氏菌病 (又名鸭传染性浆膜炎) , 其特征性症状是纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎, 是鸭场常见的细菌性传染病。常用的预防方法为注射与流行菌株血清型相同的灭活疫苗。为明确鸭疫里默氏菌免疫后产生的抗体效价与免疫保护率的相关性, 特进行此试验, 现将试验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株RA-2分离株RAf71, 由本所禽病研究室分离、纯化、鉴定并冻干保存。
1.2 试验鸭
120羽1日龄健康雏番鸭, 购自无发病鸭场, 隔离饲养, 分别于3、6、9、12日龄时采血制备血清并进行RA-2抗体效价检测。将6日龄时抗体效价为阴性的鸭用于免疫, 其余鸭继续隔离饲养, 作为攻菌试验的对照。
1.3 试验用疫苗
RA-2油佐剂灭活疫苗的制备, 参考文献[1]进行。
1.4 抗体效价测定
血清中RA-2抗体效价的测定, 采用间接ELISA法, 参考文献[2]进行。
1.5 攻菌保护试验
分别于免疫后6、9、12、15 d采血分离血清, 测定血清中的抗体效价, 为确保试验的一致性, 将抗体效价为1∶100、1∶200、1∶400、1∶800的鸭分别合为一组, 连同对照组一起以肌肉注射的方式攻菌。攻菌后观察7 d, 剖检死亡鸭并记录。
2 结 果
2.1 雏番鸭RA-2母源抗体效价的消长规律
在雏番鸭3日龄时, 检测40羽鸭血清, 无抗体效价的有21份, 抗体效价达1∶100的有19份, 占47.5%;隔离饲养至6日龄时, 检测80羽鸭血清, 无抗体效价的高达68份, 抗体效价为1∶100的仅有12份, 占15%;隔离饲养至9日龄和12日龄, 血清中均检不出RA-2抗体。详见表1。
2.2 雏番鸭免疫后血清中RA-2的抗体效价
免疫后6 d, 血清中开始出现抗体, 免疫后不同时间的抗体效价详见表2, 从表中可见, 同一时间不同鸭的抗体效价存在差异。
2.3 攻菌保护试验
肌肉注射致死量的RA-2后, 无抗体效价对照组鸭的死亡率为100%, 各试验组的保护情况详见表3, 抗体效价越高, 保护率也越高。抗体效价为1∶100时, 保护率仅为66.7%;抗体效价为1∶200时, 保护率升为86.7%;抗体效价为1∶400和1∶800时, 免疫保护率高达100%。抗体效价与保护率的关系见图1。
3 分析与讨论
1) 我们对同一鸭场的雏番鸭血清中的RA-2母源抗体进行了动态监测, 结果显示, 出壳后3 d鸭血清中的母源抗体参差不齐, 有母源抗体的占47.5%, 但效价较低。随着时间的推移, 其母源抗体逐渐消失, 至6日龄时仅占15%, 而至9日龄时, 已检不出母源抗体。我们对该鸭场的调查表明, 种鸭没有接种鸭疫里默氏菌疫苗, 而鸭疫里默氏菌病在临床上多侵害8周龄内的雏鸭, 种鸭场一般不会对种鸭进行免疫, 所以该结果具有代表性, 可供参考。
2) 我们用制备的RA-2油佐剂灭活疫苗免疫没有母源抗体的雏番鸭, 对免疫后6、9、12、15 d血清中的抗体进行监测, 挑取ELISA抗体效价相同的鸭组成试验鸭, 进行攻菌保护试验, 结果表明, 血清中抗体效价与免疫保护率呈正相关, 抗体效价为1∶100时, 保护率66.7%, 抗体效价为1∶200时, 保护率86.7%, 抗体效价≥1∶400时, 保护率100%。此试验确定了抗体效价与攻菌保护的相关性, 为以后测定疫苗的免疫效果提供了理论依据。
摘要：以在实验室条件下制备的2型鸭疫里默氏菌 (RA-2) 油佐剂灭活疫苗免疫7日龄雏番鸭后, 每隔7d采血, 采用间接ELISA法测定免疫鸭血清中的抗体效价, 并同时进行攻菌保护试验, 寻找血清中RA-2ELISA抗体效价与免疫保护率之间的相关性。结果表明血清中RA-2ELISA抗体效价为1∶100时, 其免疫保护率为70%;为1∶200时, 免疫保护率为83.3%;而在抗体效价≥1∶400时, 其免疫保护率高达100%。可见, 血清中RA-2ELISA抗体效价与免疫保护率呈正相关。
关键词：鸭疫里默氏菌,抗体效价,保护率,相关性
参考文献
[1]黄瑜, 苏敬良, 李文杨, 等.1型鸭疫里默氏菌3种不同佐剂灭活疫苗的比较[J].中国兽医学报, 2002, 22 (6) :561-562.
[2]程龙飞, 施少华, 傅光华, 等.2型鸭疫里默氏菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用[J].福建农业学报, 2006, 21 (2) :131-134.
抗体保护率 篇2
1 材料与方法
1.1 材料
(1) 3批鸭病毒性肝炎高免抗体:批号为201001、201002和201003, 由青岛宝依特生物制药有限公司制备。 (2) 4日龄和7日龄易感雏鸭:未注射过鸭肝炎疫苗;未发生过鸭病毒性肝炎;蛋黄中和抗体效价<1:4的种鸭孵化的雏鸭。 (3) 检验用强毒SD株F3代由青岛青岛市畜牧兽医研究所分离、保管。
1.2 方法
1.2.1 注射途径
皮下和肌肉。
1.2.2 试验设计及分组
将3批鸭病毒性肝炎高免抗体每批任取5瓶, 中和效价稀释为1:512, 等量混合。每批分别经肌肉和皮下注射4日龄和7日龄易感雏鸭各10只, 4日龄雏鸭注射剂量为0.5ml/只, 7日龄雏鸭注射剂量为1.0ml/只, 同时设攻毒对照各10只。在注射抗体后24h, 每组雏鸭各皮下注射鸭病毒性肝炎强毒SD株病毒液0.2ml (含100LD50) , 同时设4日龄、7日龄健康对照各10只, 肌肉注射生理盐水0.2ml/只。观察10d, 记录雏鸭发病死亡情况。
2 结果
(1) 3批鸭病毒性肝炎高免抗体肌肉注射4日龄、7日龄雏鸭攻毒保护结果见表1。
从表1可以看出, 3批鸭病毒性肝炎高免抗体肌肉注射4日龄、7日龄雏鸭, 注射后24h攻毒, 攻毒对照组90%～100%死亡, 健康对照组100%健活, 试验组雏鸭保护率均100%。
(2) 3批鸭病毒性肝炎高免抗体皮下注射4日龄、7日龄雏鸭攻毒保护结果见表2。
(ml)
注:“/”未注射
(ml)
注:“/”未注射
从表2可以看出, 3批鸭病毒性肝炎高免抗体皮下注射4日龄、7日龄雏鸭, 24h攻毒, 攻毒对照组90%～100%死亡, 健康对照组100%健活, 试验组雏鸭保护率均100%。
3 结论
通过实验室制备的3批鸭病毒性肝炎高免抗体以肌肉和皮下2途径注射4日龄和7日龄雏鸭, 从攻毒结果来看, 2种注射途径均能起到100%预防效果, 2种注射途径无差异。为临床使用提供了依据。
摘要：将实验室制备的3批鸭病毒性肝炎高免抗体, 分别皮下和肌肉注射4日龄和7日龄雏鸭。4日龄0.5ml/只, 7日龄1.0ml/只。注射后24h用0.2ml (含100LD50) SD株强毒进行攻击。结果表明, 3批抗体皮下和肌肉注射4日龄和7日龄雏鸭, 攻毒保护率均为100%;攻毒对照组90%100%死亡, 健康对照组100%健活;证明鸭病毒性肝炎高免黄抗体皮下和肌肉2种途径注射的雏鸭, 均可达到良好的预防效果。
抗体保护率 篇3
预防传染病的发生, 免疫是关键。实践证明, 在任何情况下, 我们都不能忽视对新城疫的预防接种工作, 并且应寻找能够提供鸡群最安全的接种方式。那么如何才能提供鸡群足够的保护力, 理论上只要提供连续的高免疫力就可以, 然而实际上很复杂, 它涉及到母源抗体。雏鸡出壳后在一段时期都有母源抗体的存在, 尤其当前种鸡广泛使用油乳剂灭活疫苗, 使小鸡母源抗体水平普遍提高。以前灭活疫苗的研制及应用不及今天, 因此, 种鸡能提供给雏鸡的母源抗体并不高, 但随着油乳剂灭活疫苗质量及研制技术的进步, 它能提供给种鸡极高的免疫力, 也就能够传递给雏鸡相当高的母源抗体。而母源抗体对传统的新城疫弱毒活疫苗有着强烈的干扰作用, 故针对新城疫流行地区的养鸡场, 早期活毒疫苗的选择及接种时间更应该认真考虑。因此, 为了做好新城疫的预防工作, 我们有必要了解下列3个问题: (1) 新城疫母源抗体能够提供多少保护率; (2) 早期的疫苗接种受到母源抗体的干扰程度; (3) 早期接种弱毒活疫苗的HI滴度是否达到保护率的指标。
1 新城疫母源抗体提供的保护率
在某鸡场选择同批健康的刚出壳的300羽雏鸡进行试验, 随机分为3个组, 每组100羽, 第1组为空白对照组, 第2组于出壳的第1 d便以新城疫强毒作肌肉注射攻毒, 第3组以滴眼攻毒。第2 d, 试验1组无死亡, 第2组和第3组开始出现死亡, 7 d后统计, 第1组存活率98%, 第2组存活率69%, 只有69%的保护率, 第3组存活率71%, 有71%的保护率。同样的鸡群随着日龄的增加其母源抗体的保护率明显下降, 当具有高母源抗体的小鸡饲养到了35日龄时, 若不进行任何新城疫疫苗的预防接种, 此时攻毒的结果是只剩下7%的保护率。也就是说, 假设我们养了100羽鸡, 到此时便剩下7羽鸡可以存活。
假如将此试验结果放在实际的饲养环境里, 我们可以说具有高滴度且一致母源抗体的鸡群在初生阶段, 若遇野外强毒侵袭, 鸡群只有67%～73%的保护率, 有将近三成的小鸡无法逃过野外强毒的攻击, 进而容易暴发新城疫。
基于这种情况, 加上鸡群可能来自不同的种鸡场, 来自不同周龄的种鸡群, 甚至来自使用不同厂家、不同质量的新城疫油乳剂灭疫苗的种鸡, 就很难知道母源抗体是否一致。因此, 在新城疫非常流行的季节和地区, 要尽早做好新城疫的预防接种, 以早日产生和建立有效的免疫保护力。理论上1～4日龄预防接种新城疫疫苗是必要的, 以期能早日获得免疫保护。但如果在1～4日龄接种, 疫苗又容易受母源抗体的干扰, 因此, 何时接种显得比较重要。
2 早期疫苗接种受到母源抗体的干扰程度
早期的弱毒疫苗接种都会受到母源抗体的干扰, 这是众所周知的事实, 传统的鸡新城疫弱毒B1株 (Ⅱ系苗) 也不例外。据报道, 疫苗要在母源抗体很低的时候, 即低到不足以抵抗野毒攻击的时候才有很好的免疫效果。一般情况下, 如果要较好排除母源抗体的干扰, 小鸡在12日龄以上接种疫苗才有满意的结果, 然而在此时接种则会太危险, 因为在母源抗体消失而免疫抗体尚未产生的真空期是早期暴发新城疫的最重要原因。传统的LaSota (Ⅳ系) 疫苗固然可以突破母源抗体的干扰, 但是由于其过于强烈的病原性, 3周龄以内的鸡接种LaSota疫苗会产生许多难以接受的困扰, 如导致雏鸡上呼吸道敏感细胞的病理损害, 进而增加其他病原菌的继发感染, 导致死亡率增加、生产性能差等严重后果。因而LaSota疫苗产生的保护力并不经济, 对3周内的雏鸡免疫LaSota疫苗要慎重。综上所述, 小鸡既要及早进行免疫接种, 又要有效避免母源抗体的干扰, 还要使小鸡保持健康体况和良好的生产性能, 传统方法是首免应在7日龄用Ⅱ系苗, 在22～25日龄用LaSota疫苗加强免疫, 在新城疫高发区首免和二免可以适当提前2～3 d。另外在B1首免的基础上结合油乳剂灭活疫苗于10日龄作皮下接种, 则效果更佳。随着克隆技术的发展, 国内外生产的经过克隆化的新城疫Clone30疫苗, 可以排除B1会受到母源抗体的干扰及LaSota反应太强的缺点, 融合了B1的温和反应及LaSota高免疫力的优点。在实践中选择3组具有高滴度母源抗体的肉鸡群, 1日龄时分别以B1、LaSota、Clone30疫苗免疫, 同时设不接种任何疫苗的对照组, 14日龄时用标准鸡新城疫强毒株攻击鸡群, 然后统计其保护率, 并随机采集鸡血样各10羽份, 测定其HI抗体滴度, 结果显示Clone30的保护率要高于B1, 亦优于LaSota疫苗免疫组, 测得HI抗体滴度B1:9 log2、7 log2、6 log2、5 log2;LaSota:8 log2、7 log2、6 log2、5 log2;Clone30:7 log2、6 log2、5 log2, 视其HI滴度, 3组的差异并不大, 实践证明也是如此。
3 早期接种弱毒活疫苗的HI滴度与保护率的关系
HI抗体滴度是体液性抗体的测定, 对于大多数8周龄以内的小鸡而言, 并不能作为测试保护率的指标, 真正的保护应该是通过攻毒试验, 以存活率的多寡为标准。因此, 8周龄以内早期的HI滴度高低只能参考, 而不能作为保护率的指标。
4 结论
1) 具有母源抗体的雏鸡, 在1日龄做攻毒试验只有67%～73%的保护率。
2) 新城疫母源抗体对B1株 (Ⅱ苗系) 会产生严重干扰现象。
3) 新城疫母源抗体对LaSota疫苗的干扰情况虽不重要, 但是LaSota疫苗病原性强, 早期接种会导致生长缓慢, 加重继发感染, 饲料转换率差, 育成率降低。
抗体保护率 篇4
关键词：鸡传染性法氏囊病,琼扩抗体效价,攻毒保护,相关性
鸡传染性法氏囊病 (infectious bursal disease, IBD) 是危害雏鸡的一种急性、高度接触性、病毒性传染病。病原为鸡传染性法氏囊病病毒 (infectious bursal disease irus, IBDV) [1]。目前该病已遍布全球养禽地区, 在工业化养禽业发达地区尤为严重。邝荣禄于1979年在广州首先发现我国存在该病, 此后北京、上海等地发现了该病[2,3]。1990年以后, 我国报道分离到IBD超强毒株和变异毒株, 使该病出现了新的流行特点, 给我国养禽业造成了很多的经济损失[4]。
常规疫苗存在的潜在免疫病理作用是无法克服的缺陷, 对病毒不断变异也束手无策。另一方面, 基因工程疫苗或药物的生产越来简易并趋于产业化, 这些都是传统疫苗无法比拟的。VP2蛋白是IBDV的主要结构蛋白和宿主保护性抗原, 也是病毒衣壳的主要成分, 与病毒中和抗体的诱导与识别、病毒毒力变异、病毒的抗原漂移、细胞凋亡的诱导等有很大关系[5,6], 为此, 采用近年流行的超强毒株制备了IBD VP2亚单位灭活疫苗。为了解鸡传染性法氏囊病亚单位灭活疫苗免疫鸡只琼扩抗体效价与攻毒保护之间是否存在一定的相关性, 将不同批次的疫苗以不同的免疫剂量免疫SPF鸡后测定琼扩抗体效价并攻毒, 现将试验报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 疫苗将表达IBDV VP2的重组大肠杆菌发酵菌体破碎后离心取上清, 纯化后检测其琼扩效价, 调整至不低于1:16用于配苗, 水相:油相为1:3。制备3批疫苗, 批号分别为201001、201002、201003, 100ml/瓶, 经各项检验合格, 置2~8℃保存备用。
1.1.2 SPF鸡120只SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.1.3 攻毒用的毒种鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株, 购自中国兽医药品监察所。
1.1.4 诊断抗原鸡传染性法氏囊病琼扩诊断抗原购自中国兽医药品监察所。
1.2 方法
将120只21日龄SPF鸡随机分成12组, 每组10只, 分别接种3个批次疫苗, 每个批次的疫苗肌肉注射接种剂量分别为0.05、0.1、0.2、0.3ml, 另10只不接种作为对照, 免疫后21日采血, 采用琼扩方法检测抗体, 并点眼攻IBD强毒0.1ml⁄只 (实含病毒量为100BID) , 观察记录发病情况并于攻毒后72~96h剖检, 观察法氏囊病变。具体试验设计方案见表1。
2 结果
3批疫苗以不同剂量肌肉注射21日龄SPF鸡, 21日后测血清琼扩效价同时用100BID的强毒BC6/85攻毒, 结果显示不同批次、不同剂量IBD亚单位灭活疫苗免疫的SPF鸡, 当免疫剂量为0.05ml/只时, 部分免疫鸡琼扩抗体效价转阳, 攻毒保护数为5/10~7/10;免疫剂量为0.1ml/只时, 少数免疫鸡的琼扩抗体效价为阴性, 攻毒保护数为当琼扩抗体效价为8/10~9/10;免疫剂量为0.2ml/只以上时, 免疫鸡只琼扩抗体均为阳性, 攻毒保护数均为10/10。将每只鸡的琼扩抗效价与攻毒保护情况进行一一对照, 表明琼扩抗体效价与攻毒保护具有相关性。具体试验数据见表2。
3 讨论
3.1 鸡只的个体差异
不同批次疫苗相同免疫剂量攻毒保护结果不同可能由于鸡只的个体差异。不同批次IBD亚单位灭活疫苗免疫的SPF鸡, 当免疫剂量为0.05ml/只时, 攻毒保护数为5/10~7/10;免疫剂量为0.1ml/只时, 攻毒保护数为当琼扩抗体效价为8/10~ 9/10。不同批次疫苗免疫剂量相同时, 保护率存在一定差异, 推测可能是由于鸡只的个体差异造成的这一结果。
3.2 抗体效价与攻毒保护的相关性
采用实验室制备的3批鸡传染性法氏囊病VP2亚单位疫苗以不同免疫剂量免疫21日龄SPF鸡, 免疫后21日采血分离血清测定琼扩抗体效价并用BC6/85株强毒以100BID/只剂量攻毒, 攻毒后72~96h剖杀所有试验鸡, 观察法氏囊病变, 将每只鸡的琼扩抗体效价与攻毒保护情况一一对应, 结果显示, 所有琼扩抗体转阳的鸡只均能抵抗强毒的攻击, 琼扩抗体效价与攻毒保护具有一定的相关性, 但由于本文所用的疫苗批次及试验鸡数量有限, 琼扩抗体效价转阳鸡只是否一定能获得攻毒保护尚需大规模的试验验证。
参考文献
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抗体保护率 篇5
1 材料与方法
1.1材料鹅卵由吉林农业大学鹅场提供,新西兰大白兔购自长春实验动物中心。主要试剂:高碘酸钠、硼氢化钠购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;硫酸铵购自北京化工厂;正辛酸购自北京Solarbio科技有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒、山羊抗兔酶标二抗购自北京康为世纪生物科技有限公司。
1.2方法
1.2.1鹅卵黄抗体Ig Y的提取打开鹅卵,将鹅卵黄与蛋清进行分离,去除蛋清。用注射器刺破卵黄膜吸取一定体积卵黄原液于烧杯中,加入8倍体积的双蒸水,搅拌混匀。用稀盐酸调节p H值至5.3,静置2 h。7 000 r/min离心20 min,上清用双层滤纸过滤,在滤过液中加入正辛酸使其终浓度为10 m L/L,搅拌20 min,静置20 min,7 000 r/min离心20 min;抽取第3层上清液,经双层滤纸过滤后即为Ig Y初提液。
1.2.2鹅卵黄抗体Ig Y的纯化取一定量的Ig Y初提液于烧杯中,缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液 , 边加边搅 拌。置于4℃冰箱盐 析过夜。5 000 r/min离心10 min,弃去上清;用PBS溶液重新溶解沉淀至初体积,缓慢加入一半初体积的饱和硫酸铵溶液,边加边搅拌,静置1 h;再次离心弃上清,用PBS溶液重新溶解沉淀至初体积,如此反复洗涤3次;最后用适量PBS溶解,将溶解液装入截留分子质量为50 KDa的透析袋中,以100倍体积PBS透析过夜,期间更换3次透析液。12 000 r/min离心10 min,上清即为鹅卵黄抗体Ig Y,分装后置于-80℃保存。
1.2.3鹅卵黄抗体Ig Y浓度的测定按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明进行Ig Y浓度测定。用酶标仪测得OD562 nm值,以OD562 nm值为纵坐标,以蛋白浓度为横坐标绘制标准曲线,求出标准曲线方程,进而得出Ig Y蛋白浓度。
1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析将Ig Y蛋白液进行适当稀释,与适当体积的4×SDSProtein Buffer混合,沸水水浴8 min后冷却备用。按照配方配制15%分离胶和5%浓缩胶,每孔上样20μL,广谱彩虹预染蛋白Marker 5μL。采用80 V 20 min、120 V 100 min进行间歇电泳。凝胶经G-250染色1 h,脱色后观察。
1.2.5动物免疫背部皮下多点注射免疫试验兔,每隔2周进行1次。第一次免疫0.5 m L Ig Y(1.00 mg蛋白)和0.5 m L弗氏完全佐剂的乳化物;第二次用弗氏不完全佐剂和Ig Y进行乳化,剂量和方法同上;第三、四次直接用2 m L纯化的Ig Y(含1.00 mg蛋白)在背部皮下多点注射;第五次通过耳静脉注射0.80 mg Ig Y;末次免疫后10 d,颈动脉采血,收集血清。
1.2.6免疫扩散试验用免疫扩散试验检测兔抗鹅Ig Y血清的琼脂扩散效价。按2倍稀释法配制成不同稀释度的兔血清,依次加入到外周孔中。中间加入鹅卵黄抗体Ig Y。37℃湿盒中放置24 h后观察沉淀线。
1.2.7 Western Blotting试验将纯化得到的Ig Y与适量4×SDS Protein Buffer混合后煮沸10 min,上样到SDS-PAGE胶加样孔内,加入蛋白广谱彩虹Marker。120 V进行电泳。利用Bio-Rad标准湿式转膜装置将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白条带转移到PVDF膜上,电流为200 m A电泳60 min;转膜完毕后,TBST洗去膜上的转膜液,放入5%脱脂奶粉的封闭液中,4℃封闭过夜;加入稀释好的一抗(兔抗鹅Ig Y抗血清),4℃孵育6 h;弃去一抗,TBST缓冲液洗涤5次,每次10 min;将PVDF膜加入稀释好的山羊抗兔酶标二抗中,室温缓慢孵育1 h,弃去二抗,TBST缓冲液洗涤5次,每次10 min;使用Western发光检测试剂ECL滴于PVDF膜上,在暗室中将胶片压在PVDF膜上,盖上暗盒作用30~90 s,胶片放于显影液中显影,再放于定影液中定影,然后拍照。
1.2.8兔血清Ig G的初步提纯将血清与5倍体积p H为5.0醋酸缓冲液混合,加入正辛酸使其终浓度为10 m L/L,室温搅拌10 min后4℃静置2 h,8 000 r/min离心10 min。上清经双层滤纸过滤后即为Ig G初提液。将等体的积饱和硫酸铵溶液缓慢加入到装有Ig G初提液的烧杯中,边加边搅拌。将烧杯置于4℃冰箱中盐析2 h,8 000 r/min离心10 min,弃去上清;用PBS重新溶解沉淀至初体积,缓慢加入一半初体积的饱和硫酸铵溶液,边加边搅拌,静置1 h;再次离心弃上清,用PBS重新溶解沉淀至初体积,反复洗涤3次;最后用适量PBS溶解并装入到截留分子质量为50 KDa的透析袋中,以100倍体积PBS透析过夜,期间更换3次透析液,用奈氏试剂检测合格后分装保存在-20℃冰箱内。即为兔血清Ig G初纯液。
1.2.9兔Ig G过柱纯化将Protein G Resin灌入到柱管中,用20 m L PBS洗去树脂中的乙醇并平衡树脂;将兔血清Ig G初纯液从冰箱中取出,经12 000 r/min离心10 min后吸取上清加入到柱管中,控制流速在1 m L/min左右,待全部流出后加入0.01 mol/L PBS进行洗涤去除杂蛋白,用量约为30 m L。流净后逐次加入1 m L Elution Buffer(50 m M Tris-HCl 10 m M Reduced Glutathione,p H=8.0)进行洗脱,收集每次流出的洗脱液进行SDS-PAGE分析后,用0.01 M p H 9.5的碳酸盐缓冲液通过浓缩管离心洗涤并浓缩目的蛋白,用BCA试剂盒测定其浓度。方法如1.2.3所述。
1.2.10辣根过氧化物酶(HRP)标记称取10 mgHRP溶解于2 m L蒸馏水中 。加入0.4 m L新配的0.1 M Na IO4溶液,室温下避光搅拌20 min。将上述溶液装入蛋白浓缩管中,用1m M p H 4.4的醋酸钠缓冲液进行洗涤,并恢复原体积。加入0.2 M p H9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化HRP的p H升高到9.0~9.5, 然后立即 加入2 m L Ig G( 含20 mgIg G),室温避光轻轻搅拌2 h。加入0.4 m L新配的4 mg/m L Na BH4液,混匀,4℃静置2 h。将上述液装入透析袋中,对0.15 M p H 7.4 PBS透析,4℃过夜。将透析后液体在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1 h。3 000 r/min离心30 min,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗2次,最后沉淀物溶于少量0.15 M p H 7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中,用0.15 M p H 7.4的PBS缓冲溶液透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10 000 r/min离心30 min去除沉淀,上清液即为酶结合物,加入无菌甘油至40%,分装后,-20℃冻保存。
1.2.11酶标抗体使用稀释倍数的测定将鹅卵黄Ig Y用碳酸盐包被液稀释至10μg/m L,加入到酶标板中,每孔100μL,4℃包被过夜,5%脱脂乳37℃封闭2 h,PBST洗涤3次,200μL/次,5 min/次 , 将酶标抗 体用5% 脱脂乳进 行100、200、400、800、1 600倍稀释,并设置2组平行,每孔100μL 37℃孵育1 h,PBST洗涤3次,每次200μL/5 min,拍干后加入100μL TMB底物显色液,37℃显色15 min后加入50μL硫酸终止液,用酶标仪在450 nm处进行读数,以OD值为纵坐标,稀释倍数为横坐标绘制滴定曲线,通过曲线方程得出OD值为1.0时的稀释倍数为酶标抗体最佳稀释倍数。
2 结果与分析
2.1鹅卵黄Ig Y SDS-PAGE分析及浓度测定Grey等[5]相关研究结论表明,鹅和鸭在免疫球蛋白方面同它们在系统发生学上有很高的亲源性一样,有着很高的相似性。鸭的Ig Y重链大小为62~67 KDa,轻链大小为22~25 KDa。本试验用SDS-PAGE分析经辛酸-硫酸铵方法纯化得到的鹅卵黄Ig Y,出现纯度比较高的2条特异性条带,分子质量大小约为66 KDa和27 KDa,见图1,经Quantity One软件分析,结果表明Ig Y纯度为92%。采用BCA蛋白试剂盒方法测定并绘制标准曲线如图2,测定样品(Ig Y10倍稀释液)吸光值为1.195,带入标准曲线方程得到Ig Y原液浓度为11.5 mg/m L。
2.2免疫扩散试验结果将倍比稀释的兔抗鹅血清及鹅卵黄Ig Y加入琼脂梅花孔中进行琼脂扩散,24 h后观察到在兔抗鹅血清与鹅卵黄Ig Y之间出现了清晰的沉淀线(如图2),结果显示兔抗鹅血清IgG效价为25,达到了制备酶标抗体的要求。
2.3Western Blotting将纯化后 的Ig Y进行SDS-PAGE电泳,采用湿式转移法将凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上,并以兔抗鹅Ig Y的抗血清作为一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G为二抗进行免疫印记试验。如图4所示,出现两条特异性的印记条带,证明兔抗鹅Ig Y血清中产生了抗Ig Y轻(L链)、重链(H链)的特异性抗体,并具有生物活性,能够特异性的结合Ig Y,符合制备酶标抗体特异性要求。
2.4兔抗鹅Ig G的纯化结果以辛酸-硫酸铵法初提Ig G,再通过Protein G Resin纯化,经SDS-PAGE分析,结果表明,如图3所示出现2条特异性条带,大小约为57 KDa和26 KDa,经蛋白浓缩管浓缩后测得兔抗鹅Ig G浓度为12 mg/m L。
2.5酶标抗体稀释度确定结果采用直接ELISA方法包被鹅卵黄Ig Y,每孔1μg/100μL,用5%脱脂乳将酶标抗体稀释成不同稀释度,并设置2组平行,测得OD450 nm值,通过曲线方程计算得到在OD450 nm为1.0时酶标抗体的稀释度为1 100。
3 结论与讨论
卵黄中除大量免疫球蛋白之外,还有很多杂质,包括脂类、非免疫蛋白等[6]。其中Ig Y是水溶性γ球蛋白。李冰等[7]采用水稀释结合硫酸铵盐析法,成功获得鸡源抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体,应用到防治仔猪流行性腹泻病上,并提高40%的成活率。证明用水进行溶解后以硫酸铵盐析沉淀的方法提取卵黄抗体是可行的。本实验采用水稀释法结合辛酸去脂,硫酸铵盐析沉淀的方法进行鹅卵黄Ig Y的提取与纯化,得到了较纯的鹅卵黄抗体Ig Y,经过浓度测定达到11.5 mg/m L。
随着鹅产品逐渐走上人们的餐桌,养殖规模不断扩大,鹅养殖业发展迅速,也促进了学者对鹅类疾病相关研究。而鹅卵黄抗体以其获得方便、效果显著、安全等优势逐渐被重视。刘菲等[8]以GPV灭活疫苗免疫种鹅,从鹅卵中成功提取了抗GPV的卵黄抗体。本试验获得的鹅卵黄抗体Ig Y通过SDS-PAGE分析表明,其重链大小约为66 Kda,轻链大小约为27 KDa,与刘菲得到的卵黄抗体大小一致,这证明本试验得到的确实为鹅Ig Y。
机体对外来抗原物质能够进行识别进而产生能够与之结合的特异性抗体,而产生的抗体种类则由抗原自身的抗原决定簇决定的[9]。鸟类卵黄抗体Ig Y分为H链和L链,都能诱导兔子产生特异性抗体。林树柱等[10]制备了十六种鸟类的酶标二抗,通过Western Blotting证实其制备的酶标二抗能与其抗原轻链和重链作用。故本试验以鹅Ig Y为目的蛋白,以兔抗鹅Ig Y血清为一抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ig G为二抗进行蛋白免疫印记试验,获得了两条特异性条带,也证明了兔机体产生了抗鹅Ig Y H链及L链的抗体。用抗鹅Ig Y血清提纯兔Ig G制备酶标二抗能够特异性的与鹅血清中抗体结合,给未来研究鹅传染病抗体检测提供了一个有力的工具。而酶标抗体作为ELISA检测试剂的重要组成部分,在免疫学诊断中发挥重要作用,本研究制备的兔抗鹅Ig Y酶标抗体为鹅相关疫病的免疫学诊断奠定了基础。
摘要：本试验采用辛酸去脂、饱和硫酸铵溶液盐析法提纯鹅卵黄抗体Ig Y,采用SDS-PAGE方法分析其纯度;用纯化后的Ig Y免疫试验兔,收集血清,测定血清抗体效价;采用辛酸-硫酸铵法结合Protein G树脂亲和层析法纯化兔血清Ig G,用改良的高碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记,直接ELISA法测定标记物效价。结果表明,提纯的鹅卵黄Ig Y浓度为11.5 mg/m L,纯度约为92%;血清琼脂扩散抗体效价为1:32;Western Blotting试验证明,兔血清中含有抗鹅卵黄抗体Ig Y重链及轻链的特异性抗体;直接ELISA法测得标记物效价为1:1 100。
抗体保护率 篇6
猪瘟是由猪瘟病毒( CSFV) 引起的一种猪的急性、 烈性传染病,被国际兽疫局( OIE) 列为A类传染病[1]。 我国每年因猪瘟死亡的猪占病死猪的1 /3以上,直接经济损失有数十亿元[2]。目前,治疗该病尚无特效药物,疫苗免疫仍是预防猪瘟的主要手段[3,4]。
四川黑猪是四川省畜牧科学研究院经过多年育种培育而成的猪种,现已通过国家畜禽品种审定委员会现场审查。该品种由国内外优良生猪品种资源选育而成,具有抗病能力强、适应性广、肉质鲜嫩、风味美等特点。本试验通过对四川黑猪仔猪母源抗体和初免抗体进行跟踪监测,系统地反映猪瘟母源抗体及免疫后抗体的消长规律和免疫效果,旨在为进一步掌握四川黑猪猪瘟疫苗的免疫效力及免疫期、制订合理的免疫程序及扑灭和净化猪瘟提供科学依据。
1材料
1.1主要试剂
猪瘟病毒抗体检测试剂盒( 生产批号为04 43220 - 01) ,购自美国IDEXX公司。
1.2疫苗
猪瘟兔化弱毒疫苗( 批号为2011100903) ,由中牧集团生产。
1.3试验动物
年龄、胎次、饲养状况、环境条件相近的5头健康经产母猪,由四川省畜牧科学研究院养猪所提供。将5头母猪所产的50头仔猪分为A组和B组,A组编入母源抗体检测组,B组编入疫苗免疫抗体组。仔猪20日龄时断乳,试验期间及时淘汰弱仔猪、死猪。
2方法
2.1免疫接种
将分好组的试验用母猪于配种前2周用猪瘟兔化弱毒疫苗肌肉注射免疫[5],每头母猪免疫4头份, 疫苗免疫抗体组仔猪于35日龄首免2头份,60日龄二免2头份。
2.2采血及血清制备
从分娩当天( 第0天) 开始,母猪和母源抗体检测组仔猪分别于第0,1,4,7,10,20,25,30,35日龄同步采血,母猪于耳缘静脉采血,仔猪于前腔静脉采血, 2 ~ 3 m L / 头,置已编号的无菌试管内,37 ℃ 作用1 h; 然后于4 ℃ 过夜冷凝析出血清; 取血清注入离心管内,3 000 r/min离心5 min; 取上清液,- 20 ℃ 冷冻, 待检。
根据母源抗体检测组仔猪的检测结果,疫苗免疫抗体组仔猪于35日龄免疫,并在第35,45,55,65, 80,90,120日龄采血,2 ~ 3 m L / 头,置已编号的无菌试管内,37 ℃作用1 h; 然后于4 ℃ 过夜冷凝析出血清; 取血清注入离心管内,3 000 r/min离心5 min; 取上清液,- 20 ℃冷冻,待检。
2.3抗体检测
按照猪瘟病毒抗体检测试剂盒说明检测抗体。
2.4猪瘟抗体效价的换算(见表1)
注: 抗体阻断率大于 81% 时按照 81% 计。
3结果
3.1母猪猪瘟抗体效价的测定(结果见表2)
lb
由表2可知,试验期间,母猪的抗体效价没有明显波动,较为平稳,且维持在很高的抗体水平。仔猪断奶后第30日龄,母猪的抗体效价出现下降,但仍维持在较高的抗体水平。
3. 2仔猪猪瘟抗体检测
猪瘟抗体检测结果见表3和表4。
lb
由表3可知,无论母猪抗体水平高低,所产仔猪在吃初乳前抗体水平均为0,仔猪采食初乳后母源抗体水平迅速提高。仔猪在1日龄时抗体效价即达到很高的水平,20日龄后抗体水平出现明显下降,此时平均抗体水平为8. 4 lb,35日龄平均抗体效价为4. 2 lb,达到了保护力临界值( 临界值4. 0 lb) 。
lb
由表4可知,35日龄首免猪瘟兔化弱毒疫苗后仔猪猪瘟抗体效价呈上升趋势,60日龄左右略有下降,二免后抗体效价再次上升,至120日龄时仍具有较高的抗体效价,能够提供坚强的保护力。
3.3仔猪猪瘟母源抗体消长规律(结果见图1)
由图1可知,母猪猪瘟抗体一直维持在较高水平,且较平稳,25日龄后母猪猪瘟抗体水平下降,至35日龄为9. 2 lb,但仍具有很高的保护力。仔猪1 ~ 7日龄抗体效价均维持在很高水平,与母猪猪瘟抗体水平呈正相关,母猪猪瘟抗体水平越高,仔猪的抗体水平也越高,10 ~ 20日龄仔猪猪瘟母源抗体水平下降,但下降不明显且抗体水平仍较高,而母猪猪瘟抗体水平依然较高且高过仔猪猪瘟母源抗体水平,说明仔猪从母乳中吸收母源抗体进入血液的量在减少或已经不能从母乳中吸收母源抗体进入血液。20日龄断乳后抗体水平开始出现明显下降。
3.4仔猪猪瘟免疫抗体消长规律(结果见图2)
由图2可知,35日龄首免,60日龄二免后仔猪猪瘟抗体效价较高,在60日龄左右免疫抗体效价略有下降,经过二次免疫后猪瘟抗体明显上升且保护时间长,至120日龄时仍具有较高的抗体效价。目前, 许多规模猪场控制猪瘟疾病多采用20日龄首免的方法,免疫效果不理想,猪瘟抗体效价参差不齐,易受猪瘟野毒感染,分析原因可能是20日龄时仔猪的母源抗体还处在较高水平,过早免疫被母源抗体中和部分抗原,从而影响 仔猪抗体 产生,易造成免 疫效果低下[6]。
4讨论
目前,采用猪瘟疫苗免疫预防和控制猪瘟是降低猪瘟感染率和发病率的重要方法。对仔猪猪瘟的防制关键是排除母源抗体干扰,确定合适的首免日龄[7]。针对四川黑猪母源抗体的研究可以初步确定四川黑猪仔猪确切的首免日龄,对排除母源抗体干扰造成的免疫失败具有现实意义[8]。本试验针对仔猪出生后0 ~ 35日龄母源抗体进行了系统监测,结果显示,吃初乳前 仔猪母源 抗体效价 为0,吃初乳后 第1天仔猪猪瘟母源抗体效价迅速上升,表明仔猪从母猪体内获得了大量母源抗体。仔猪出生后的1 ~7 d内猪瘟母源抗体效价维持在较高水平,效价达到210及以上。陈祝三等[9]研究证实,仔猪的母源抗体在15日龄时达到峰值; 蔡葵蒸等[10]研究证实,20日龄达到峰值; 李明义等[11]研究证实,仔猪母源抗体在7日龄时达到高峰,7日龄后虽然仔猪仍然吸食初乳, 但已不能满足自身生长的需要,推测可能与仔猪自身生长迅速有关。本研究还发现,四川黑猪仔猪虽然7日龄后猪瘟母源抗体水平下降,但下降速度缓慢, 至25日龄时仔猪 猪瘟母源抗体 水平仍高达27. 5, 35日龄下降到24. 2。
本试验结果表明,35日龄时猪瘟母源抗体水平为24. 2,已接近保护力抗体水平的临界值,此时免疫受母源抗体干扰作用将会非常小,疫苗免疫能够产生较高的抗体水平。因此,四川黑猪断奶仔猪的首免日龄在35日龄。35日龄首免、60日龄二免能够刺激黑猪机体产生较高的保护性抗体,且维持时间长,消退慢。
参考文献
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抗体保护率 篇7
接头和药物三部分组成[3,4]。利用抗体对肿瘤细胞表面抗原的选择特异性, 对抗癌药物进行主动靶向设计研究, 可提高抗癌药物对肿瘤细胞的选择性, 降低其对正常器官的毒性[5,6], 抗体-药物偶联物能显著地提高抗体和药物的活性。
抗体分子含有很多可用来修饰交联的基团:氨基和羧基。氨基有赖氨酸ε氨基和N端α-氨基[7], 羧基有C-末端以及天门冬氨酸和谷氨酸残基。由于氨基和羧基在抗体和大部分蛋白中广泛存在, 偶联产物不均一, 且常常屏蔽抗原结合位点, 从而导致抗体药物偶联物活性的降低[8]。抗体分子独特的二硫键结构为抗体和药物的偶联提供了很好的选择。抗体内的链间二硫键只存在于特定的位置, 选择这些位置作为偶联位点, 可以很好的保留抗体的抗原结合位点。因此, 选用二硫键作为结合位点制备偶联药物的方法以及制备过程中的检测方法成为研究抗体药物偶联物的热点。
1 抗体的还原与检测
抗体二硫键的还原可以通过游离的或者固定的还原剂完成还原反应。根据还原二硫键位置及数量的不同, 抗体的还原形式有5种 (见图1a) 。其中1为抗体, 2, 3, 4, 5, 6为其5种形式。中间产物的形式也有5种, 见图1b。
游离的还原剂可以高效地还原蛋白中的二硫键, 甚至可以还原包裹在三级结构内部的二硫键。但是在还原反应结束之后, 必须通过脱盐柱Sephadex G-25去除这些还原剂[9]。游离的还原剂包括硫醇类和膦类。硫醇类如二硫苏糖醇、巯基乙醇等。这些还原试剂能有效地还原二硫键, 但不能在酸性条件下进行, 而且有时与肽段形成加合物, 使质谱图复杂。膦类如三正丁基膦 (TBP) 和三羧乙基膦TCEP) 。目前常用的试剂TCEP能在宽的pH范围下使用且反应温和、易溶、毒性小, 不与蛋白质中的其他功能基团反应。固定化的还原试剂有固定化TCEP二硫化物还原凝胶, 可以在更宽的pH值和温度范围以及在盐及去垢剂存在的条件下使用, 并且可以方便地从样品中去除。
药物偶联物研究领域的研究人员一致认为, 每个抗体分子上连接4个药物, 可以达到药效药代以及体内存活率最高[9]。由于ADC上的载药数量很大程度上取决于每个抗体还原后含有巯基的数目, 因此要有可靠的方法检测, 用以优化还原反应参数, 获得要达到所需巯基合适的还原反应条件。主要方法有Ellman试剂法[10], 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) [11], 毛细管电泳[12], 分子排阻色谱 (SEC) 分子排阻色谱-质谱联用 (SEC-MS) [13]。
1.1 Ellman试剂法
5, 5'二硫代双 (2-硝基苯甲酸) (DTNB) 为Ellman试剂。用于比色法测定生物样品中巯基。它易溶于水, 在巯基化合物的存在下, 无色的DTNB将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。其中DTNB中可以添加1mol/L的EDTA, EDTA在反应混合物中的作用不只是保护疏基不致氧化, 而且也是为了防止某些金属离子影响颜色的进展。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412nm处具有最大吸收, 因此可以得到巯基数量。此种方法优点是能快速检测, 但是不能得到还原二硫键的位置以及还原过程的信息。
1.2 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
电泳是指溶液中带电离子在电场作用下发生迁移的电动现象, 也是一种在生化实验中经常使用的检测方法。在还原反应的不同时间段进行取样, 同时在取出的样品中加入0℃的pH偏酸的缓冲液进行终止反应。通过与未还原蛋白的对比, 可以判断抗体在还原剂还原的程度。通过与标准蛋白 (Marker) 的比对, 能够初步判断各个还原产物的量。通过用Tanon软件对洗脱后的凝胶进行扫描, 然后利用Tanon GIS分析软件分析凝胶图像。分析软件可以对各种还原反应产物进行光密度分析, 可以得到各个产物的百分含量, 然后根据每个产物上含有的巯基数量, 可以大致得到每个抗体上含有的平均巯基数量。这样还可以得到整个反应动力学过程, 对于优化实验条件提供了快捷简便的方法。
1.3 毛细管电泳
十二烷基硫酸钠毛细管电泳 (CE-SDS) 和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 相比, CE-SDS微量、快速、定量准确分离效率高, 操作方便和自动化, 并降低运营成本。另外, 对比经典的SDS-PAGE平板凝胶技术, CE-SDS不需要大量的有毒试剂[14,15]。检测采用Proteome Lab PA 800目标蛋白快速鉴定系统 (贝克曼-库尔特, 美国) 和未涂层熔融石英毛细管。进样时方法设置为:进样5kV, 20s;分离电压为15kV, 维持40min, 两端加压138KPa;电流25μA, 温度25℃;检测波长:220nm。待检测的抗体还原后产物在100μL缓冲液 (100mMTris-HCl, pH9.0, 1%SDS) 中, 浓度为1~2mg/mL。进样前, 在PA800电泳系统中加入2μL的10KDa标准蛋白。最后按照标准蛋白绘制相对分子质量-迁移率标准曲线, 根据曲线计算还原后各个产物的相对分子质量。CE-SDS可以检测在不同还原条件 (不同还原剂, 不同还原剂浓度, 反应时间和反应pH值以及温度) 下抗体还原后产物[16]。
1.4 分子排阻色谱-质谱联用 (SEC-MS)
分子排阻色谱 (SEC) 是以分子量和形状的差异为基础, 实现不同物质的分离。在尺寸排阻的分离介质中有大量不同孔径的网状孔道, 排阻极限以下的小分子物质可以进入颗粒内部的孔道, 排阻极限以上的大分子则不能进入孔道中。SEC已广泛用于检测抗体聚集体, 单体和片段。抗体的重链和轻链是由链间二硫键和很强的非共价键作用连接在一起的, 二硫键可以用还原剂还原断裂, 此时抗体并不是以重链, 轻链, 或者重链-轻链等游离在溶液中, 而是靠链间的非共价键维系的一个整体, 因此, 采用SEC检测时, 流动相中需要加入6mol/L盐酸胍或者6mol/L的脲对还原后的抗体变性使非共价键破裂[17]。但是高浓度的变性剂影响后面的质谱检测, 因此, 有研究表明采用含有乙腈, 三氟乙酸, 甲酸的流动相可以使通过SEC还原后的抗体轻链和重链分离, 并且允许耦合SEC到质谱仪获得直接的分子量测定。
分离色谱、质谱的联用技术结合了色谱高效的分离特性和质谱良好的检测性能, 一次分析可以得到大量的有用信息。Liu Hongcheng等[12]通过对TSKgel G3000SW, TSKgelG3000SWx, Shodex KW-804, Protein-Pak 300SW, BioSuite 250不同柱子的比较, 其中TSKgelG3000SW对轻链和重链的分辨率最高, 分离效果也很好。通过对流动相组成, 流速等的优化, 当流动相为超纯水中含20%乙腈, 0.1%TFA, 0.1%甲酸, 流速为0.2mL/min时, 检测效果达到最优。
2 抗体与药物偶联与纯化
抗体与药物的偶联反应很温和, 仅仅需要稍微过量的马来酰亚胺, 在pH7-8左右、0℃下反应1h。例如抗体被还原到平均每个抗体上有4个巯基, 通常可加入4~5倍的马来酰亚胺接头的药物, 反应30min。当药物的水溶性很好时, 药物加入到还原后的蛋白中然后混匀即可。当药物接头的水溶性很差, 需要适当的有机溶剂来溶解药物, 保证抗体和药物接头都是在溶液中, 整个反应都是在溶液中进行。通常采用二甲基甲酰胺 (DMF) 或者二甲基乙酰胺 (DMAC) 先将药物溶解, 然会与还原后的产物等体积反应。反应0.5h后, 通常是使用5倍的半胱氨酸或者N-乙酰半胱氨酸进行猝灭, 来阻止马来酰亚胺与抗体上的巯基进一步反应。
药物接头的马来酰亚胺被猝灭后, 接下来就是要除去多余的药物接头以及有机溶剂, EDTA等小分子。可以采用亲和层析, 凝胶过滤, 离子交换等色谱方法去除, 另一个方法是用离心超滤杯除去小分子并且将ADC置换到所需的缓冲液中, 但该种方法可能会使蛋白质吸附在膜上, 蛋白质的损失比较大。
3 药物载量测定
抗体与药物进行偶联后, 需要检测生成产物的均一性以及药物载量测定。方法主要有疏水层析 (HIC) 和反相高效液相色谱分析 (R-HPLC) 以及质谱分析[18,19,20]。下面主要介绍两种色谱分析法。
3.1 疏水层析
疏水层析是利用被分离样中不同生物分子表面的疏水性差别, 而将其分离纯化的一种层析技术。由于药物和药物接头通常比暴露在球状蛋白表面的残基 (包括抗体) 的疏水性强, 因此HIC对于分析连接有不同数量药物的ADC是非常有效的方法。抗体还原后的巯基是成对出现, 因此每个抗体上偶联的药物数量只能是0, 2, 4, 6, 8个, 分别记为D0, D2, D4, D6, D8。由于这种方法并没有变性, 因此, 即使是所有的链间二硫键完全被还原, D0, D2, D4, D6, D8仍然是完整的从柱子上依次洗脱下来, 这种方法不仅能够得到每个抗体偶联药物的平均数量, 还能够得到连接有不同数量药物的ADC分布, 整体的平均药物载量可以通过构成峰的积分面积和每个峰的药物载量作为加权因子来计算。
常用的色谱柱是用丁基-NPR 4.6×3.5mm, 粒径2.5μm的高性能生物大分子分离用疏水色谱分析柱, 方法是从100%A液 (1.5mol/L (NH4) 2SO4, 50mmol/L KHPO4, pH 7.0) 到100%B液 (25mmol/L KHPO4, pH 7.0+20%异丙醇) 12min。
3.2 反相高效液相色谱
反相色谱也是基于抗体载药量的不同来来分离的, 载药数量越高的ADC, 保留时间越长, 根本不同是反相色谱是在还原的条件下分离的, 此时抗体的重链轻链是分离的, 并没有共价结合为一体, 因此重链轻链是分别洗脱下来的。部分还原后偶联药物生成的药物偶联物是一个依靠链间的共价键结合在一起的复杂的混合物, 从该混合物中的物种衍生的反相色谱图很难解释, 所以这个方法的样品制备包括DTT处理的步骤, 以减少任何其它分子间的二硫化物。样品完全还原后, 所有的抗体以单独的链进行洗脱, 所有的重链轻链连有不同数量药物, 重链H, 轻链L, 重链连有1个药物H1, 依次类推, 产物有L0, L1, H0, H1, H2, H3分别计算出来, 这样, 结合每个抗体平均载药量以及抗体是由两条重链和两条轻链组成的基本知识, 每个载有不同药量的重链轻链可以分别被计算出来。
4 结论