分泌型表达（精选7篇）
分泌型表达 篇1
摘要：为了构建牛皮蝇的皮蝇素A(hypodermin A,HA)基因的分泌型真核表达载体pEF1α-HAAcGFP,并在Cos7细胞中表达与鉴定,试验从牛皮蝇中提取RNA,反转录成cDNA,扩增出HA基因,并在HA基因序列的上游加1段信号肽序列;通过双酶切将带有信号肽的HA基因序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP中,得到分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP;再利用脂质体法转染Cos7细胞,并以RT-PCR和Western-blot技术在RNA和蛋白水平上检测HA基因是否在Cos7细胞中表达。结果表明:经双酶切及测序鉴定,分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP构建成功;转染Cos7细胞后,在RNA和蛋白水平上能检测到HA基因的表达。说明成功构建了HA基因的分泌型真核表达载体PEF1α-HA-AcGFP。
关键词：牛皮蝇,宿主,真核表达载体,HA基因,载体构建,基因表达
皮蝇素A ( hypodermin A,HA) 是牛皮蝇一期、二期幼虫分泌的一种丝氨酸蛋白酶,具有抗炎及免疫抑制作用[1]。牛皮蝇幼虫能在宿主组织中移行8个月, 其分泌的4种丝氨酸蛋白酶———皮蝇素A、B、C和D对宿主起免疫抑制作用,导致宿主不能用免疫机能杀死牛皮蝇幼虫。HA能裂解补体C的组分C3,使C3降解产物不具有生理特性[2]。此外,HA能抑制C介导的细胞毒性及延迟移植排斥反应[3]。牛皮蝇幼虫通过HA抑制淋巴细胞的增殖,从而逃避宿主的免疫应答[4]; 还通过表达前列腺素E2( PGE2) 及减少白细胞介素-2( IL -2) 生成,抑制免疫排斥[5]。HA的这些免疫调节功能抑制了宿主对牛皮蝇幼虫的排斥反应,保证了牛皮蝇幼虫在宿主体内的成活。
牛皮蝇蛆虫的防治方法主要是用化学药物驱虫, 而长期应用化学药物会造成虫体耐药性、引起毒副作用和污染环境,更重要的是导致动物性食品中的药物残留,进而对人类的身体健康构成威胁。HA是牛皮蝇分泌的一种蛋白酶,具有抗炎和免疫抑制作用,可作为诊断和免疫用抗原。本研究克隆HA基因的cD- NA序列,并构建了真核表达载体,为牛皮蛆病免疫诊断和预防提供依据,现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1试验动物
牛皮蝇的一期幼虫,采自宁夏尖扎县康扬镇牦牛屠宰厂。
1. 2主要试剂
真核表达载体pEF1α - IRES - AcGFP、Cos7细胞,由徐州医学院神经生物学研究中心保存; 限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、Taq酶、T4 DNA连接酶、 DH5α 感受态细胞、反转录试剂盒及TRIzol试剂,均购自TaKaRa公司; 质粒提取试剂盒,Promega公司生产; 凝胶回收试剂盒、Lipofectamine 2000 、DNaseⅠ, Invitrogen公司生产; HA抗体,由苏州百奇生物公司合成; 羊抗兔荧光二抗,Odyssey Gene公司生产。
1. 3总RNA的提取、cDNA合成及带有信号肽HA基因的扩增
提取牛皮蝇一期幼虫总RNA,反转录合成cD- NA。以cDNA为模板,上、下游引物为F1 5' - AT- GCTGAAGTTTGTTATTTTATTGTGC - 3',R1 5' - TAGGATCCTTAAATAGATTCTGCATTACTGAC - 3' ( 下画线部分为BamH Ⅰ酶切位点) ,扩增片段大小为771 bp。为得到HA基因的分泌型蛋白,在HA基因起始位点用重叠PCR方法加1段信号肽序列,其序列为5' - ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT- GGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGA CGCGGCC - 3'。同时设计1对带有酶切位点的引物: F2 5' - GTGAATTCATGGAGACAGACACACTCC - 3'( 下画线部分为EcoR Ⅰ酶切位点) ,R1 5' - TAG- GATCCTTAAATAGATTCTGCATTACTGAC - 3' ( 下画线部分为BamH Ⅰ酶切位点) 。PCR扩增条件: 94 ℃ 4 min; 94 ℃1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环; 72 ℃ 10 min。扩增结束后,用1% 琼脂糖凝胶电泳,目的条带与扩增条带大致相近,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序。
1. 4分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP的构建
对HA基因的PCR产物及真核表达载体pEF1α - IRES - AcGFP纯化回收,同时用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ 双酶切; 酶切产物用1% 琼脂糖凝胶电泳,切胶回收并按照3∶1的摩尔比混合,用T4 DNA连接酶连接3 h; 反应产物转化DH5α 感受态细胞,用卡那霉素平板筛选,挑取8个单菌落,分别接种于含卡那霉素的3 mL LB培养基中,37 ℃ 振荡培养过夜; 分别在HA基因片段与质粒上设计F3( 5' - AGCGGGCGGGT- GAGTCA - 3') 和R3( GATACTTGCCAAGGAAAATC - 3') 引物,对培养过夜的菌液进行PCR; 扩增结束后, 用琼脂糖凝胶电泳,取扩增片段大小正确的菌液进行质粒提取,同时送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序鉴定。
1. 5细胞培养及转染
复苏Cos7细胞株,用含10% FBS的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞生长到70% 左右时,依照Lipofectamine 2000转染说明书,用分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP和空载体pEF1α - IRES - AcGFP分别转染Cos7细胞。
1. 6 RT - PCR检测HA基因的表达
分别收集分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP和空载体pEF1α - IRES - AcGFP转染48 h后的Cos7细胞,提取RNA,用DNase Ⅰ消化处理后,参照反转录试剂盒说明转录得到cDNA序列,以得到的cDNA序列为模板分别扩增HA基因序列。PCR扩增条件: 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环; 72 ℃ 10 min。扩增结束后,用1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 7 Western - blot检测
用分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP和空载体pEF1α - IRES - AcGFP转染Cos7细胞,取培养48 h后的细胞培养基,参照免疫沉淀试剂盒说明得到HA重组蛋白,蛋白定量后,取80 μg用10% SDS - PAGE凝胶分离,40 mA恒流作用30 min转移到PVDF膜上,5% 脱脂奶粉封闭2 h。用HA抗体( 1∶1 000) 于4 ℃ 孵育过夜; 用TBST洗涤3次,每次5 min; 用羊抗兔荧光二抗( 1∶100) 室温避光孵育2 h; 然后避光用TBST洗涤3次,每次5 min; 最后扫描。
2结果与分析
2. 1HA基因的cDNA序列扩增( 结果见图1和图2)
由图1、图2可知,PCR扩增得到的目的条带为均一条带,其大小与预期一致。氨基酸序列与Gen- Bank ( 登录号为X74303) 中序列对比显示,有15个氨基酸发生改变,主要位于N端。
2. 2分泌型真核表达载体的鉴定( 结果见图3、204页彩图4)
由图3、彩图4可知,分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后得到大小为833 bp( 含信号肽序列) 和5 990 bp的2条条带,鉴定结果表明分泌型真核表达载体构建成功。经跨酶切位点测序再次表明,分泌型真核表达载体构建成功。
M. Marker 3; 1. HA 基因的 cDNA 序列扩增结果。
M.Marker 3;1.分泌型真核表达载体的双酶切片段。
2. 3 RT - PCR检测( 结果见图5)
由图5可知,在分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP转染的Cos7细胞中获得目的条带,转染空载体pEF1α - IRES - AcGFP的Cos7细胞中未见条带。
2. 4 Western - blot检测( 结果见图6)
由图6可知,分泌型真核表达载体和牛皮蝇一期幼虫蛋白均在28 ku处有明显特异性条带,空载体未见有特异性条带。
1.空载体蛋白;2.分泌型真核表达载体蛋白;3.牛皮蝇一期幼虫蛋白。
3讨论
HA对牛的免疫系统具有免疫抑制作用[6 -7]。J. H. Mckerrow[8]研究发现,HA能抑制人的补体,进一步阻止异基因的超急性排斥反应。B. Malassagne等[9]用从牛皮蝇一期幼虫中提取的HA静脉注入大鼠、小鼠体内,能够降解血清中C3。体外试验结果显示,在培养基中加入经过HA处理的大鼠血清,细胞表面C3沉积,以及因补体调节细胞死亡数都显著低于未经HA处理的对照组。N. Moire等[10]分离得到了HA基因的cDNA序列,并推测出氨基酸序列。本研究从牦牛一期幼虫中得到HA基因的cDNA序列, 经测序、翻译及与GenBank中的序列比对发现,HA基因共有15个氨基酸发生变化,可能由采样区域及遗传背景不同造成。
本研究所采用的真核表达载体pEF1α - IRES - AcGFP的启动子为EF1α,具有较强的启动能力。在启动子下游IRES的酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ 之间插入带有信号肽的HA基因,构建分泌型真核表达载体。应用RT - PCR和Western - blot技术分别验证了HA基因在RNA和蛋白水平上的表达,为进一步研究其分子机理,以及降低牛皮蛆病的发病率提供了分子技术支持。
A. 箭头左侧为载体序列，右侧为信号肽序列; B. 箭头左侧为 HA 终止序列，右侧为载体序列。
分泌型表达 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
20只 (40耳) 纯种Wistar大鼠, 不限雌雄, 每只大鼠体重在200 g~250 g之间, 实验前所有的书都不存在噪声暴露和药物使用历史, 检测其耳廓反射显示有较高的灵敏度, 使用电耳镜对外耳道及鼓膜进行检查显示无任何异常现象。
1.2 方法
20只大鼠随机抽取6只 (12耳) 为正常对照组, 其余18只大鼠使用浓度为1%的戊巴比妥钠40 mg/kg完成腹腔注射麻醉, 外耳道的消毒使用安尔碘消毒液, 斜行在耳廓后取一切口, 将听泡完全暴露在外显示。在表面打出3个孔, 其中两个孔用来药物注射, 另外一个孔用来稳定平衡听泡中存在的压力, 而后使用微量注射器将纤维蛋白封闭剂完成注射, 剂量为20μL, A液与B液各注射10μL, 通过不同的通路完成注射动作, 注射5 min后在其中注射进浓度为1mg/m L的LPS30 u L[2]。以上动作完成后使用医用造牙树脂将小孔闭合, 并且进行切口的缝合, 观察鼓膜内没有破裂情况且存在积液征之后, 把实验动物做统一有序的编号, 分别松进动物房中进行饲养。6只正常对照组大鼠在其听泡内完成20μL生理盐水的注射即可。
14只分泌性中耳炎动物模型在2 h的制备后, 随机选取6只大鼠作为模型组, 另外8只作为杀菌-通透性增强蛋白组, 直接将50μL (2 g/L) 的杀菌-通透性增强蛋白注射进分泌性中耳炎的大鼠耳腔之中。
杀菌-通透性增强蛋白组的8只大鼠在分别注射了杀菌-通透性增强蛋白之后的1 d、2 d、14 d、21 d与35 d后使用浓度为1%的戊巴比妥钠40 mg/kg完成腹腔注射麻醉之后立刻断头将其处死, 另外正常对照组和模型组的大鼠则各自在注射了杀菌-通透性增强蛋白7 d之后断头处死。因为这个时候大鼠呢的AQP1蛋白含量和m RNA的表达量是最高的, 另外AQP与MUC5B、MUC5AC蛋白含量与m RNA的表达量程度最低, 并且在每个不同时间点的差异较为明显, 所以7 d作为一个对照最为合理。完成听泡取出动作之后使用去RNA酶将处理过的器械完成听泡打开动作, 透过解剖显微镜完成中耳腔骨岬、中下鼓室和咽鼓管周边的黏膜剥离, 剥离动作完成后立刻将组织放进-80℃的冰箱内冰冻保存[3]。因为大叔中耳黏膜量不多, 因此把两只动物中耳黏膜标本放在一起当成一份样本观察。RNA的提取方式使用Trizol方式, 检测方式使用琼脂糖凝胶电泳。
1.3 统计学方法
所有患者经过治疗后, 数据资料使用SPSS 17.0统计学软件对数据做处理, 计数使用率 (%) 表示, 计量资料使用 (±s) 表示, 行χ2做检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
接受治疗后各项蛋白指标的含量对比, 见附表。
3 讨论
分泌性中耳炎的高发人群为儿童, 是造成儿童传导性耳聋的主要病症因素, 此项病症的并发症与后遗症后一直延续到成年, 因此如何有效治疗分泌性中耳炎成为人们高度关注焦点[4]。本次研究中使用内毒素制备分泌性中耳炎大鼠作为研究模型, 对各组的大鼠提供杀菌-通透性增强蛋白之后中耳积液和中耳黏膜的中水通道蛋白、黏蛋白与三叶因子的表达方式, 用来探究杀菌-通透性增强蛋白在处理分泌性中耳炎模型大鼠的中耳积液过程中蛋白程度的具体控制效能, 研究目的在于深入的研究分泌性中耳炎的发病机制与科学的对临床用药的提供指导参照标准[5]。
分泌性中耳炎的发病机制, 从本次研究结果中可以看出, 将脂多糖注射进大鼠中耳鼓室内会明显的使得大鼠的中耳黏膜加厚, 在咽鼓管鼓室口中能够明显的观察到纤毛细胞减少以及杯状细胞增多等现象, 上鼓室的上皮层观察到数量多的假复层立方体纤毛细胞。在变厚的上皮层中还能够看见扩张的血管和水肿问题, 其中有中性粒细胞、巨噬细胞与淋巴细胞浸润的问题[6]。从以上研究结果中显示, 脂多糖能够让中耳黏膜出现程度突出的炎症性反应表现, 直接造成中耳上皮的细胞发生形态性的变化而使得黏液纤毛清除系统发生紊乱问题。
AQPs在机体分布上有极度广泛的层次, AQPs会在哺乳动物中较多层次的选择分布在一些体液吸收与分泌的上皮细胞之中, 完成着各自部分的水分多重性吸收以及细胞的内外水平稳定。虽然任何一项的AQP还不甚清楚其在中耳调节当中的水平性功能模型还没有确切的定论, 但是其加入到中耳积液的形成与吸收机制却是可以被肯定的, 还会加入金纤毛周边的液体调控, 免疫形态学的研究过中也证实了在AQP1当中有不同的内耳成纤维细胞, 其属于水转运与离子梯度的重要参照标准[7]。
中耳的形态学恢复表示的是慢性分泌性的中耳炎优化好转的一项重要参照标准, 所以找寻游侠的治疗方式完成脂多糖的中和, 减少脂多糖对于中耳黏膜而另外形成的不良性毒副作用药物, 已成为医学界学者重点关注的对象。杀菌-通透性增强蛋白其药物内核本质为内源性表现的抗感染性病因分子, 其以抗生素蛋白的形式存在现如今已经证实得出其能够和脂多糖广泛的结合, 同时能够实现脂多糖效能中和的目的, 不少研究实践中表示把1ug/m L的杀菌-通透性增强蛋白加入到存在1ng/m L的脂多糖培养板当中, 完成2周细胞培养动作之后的细胞肿胀数目和细胞的破裂问题会比实验2周之后的情况更加严峻, 一般4周之后的表现程度是绝大部分的细胞形态恢复至正常状态, 只有少量的细胞有增大的迹象, 部分细胞存在破裂与死亡的迹象[8]。脂多糖自身特点具有入侵性作用, 可是如果存在杀菌-通透性增强蛋白, 即可发挥中和脂多糖的作用, 同时对于控制被脂多糖诱导的中耳形态变化有突出作用, 能够将中耳黏膜保护起来使其不受到外界的恶劣侵害, 切实的确保黏液纤毛细胞的传输运送体系中的运输性表现功能[9]。本次研究中显示, BPI组的AQP4、MUC5B、MUC5AC的蛋白含量与其中相应的m RNA表达量相比模型组明显更高, 此研究结果显示杀菌-通透性增强蛋白能够切实的控制智斗唐发生生物学的诱导不良反应, 对控制分泌性中耳炎的黏性蛋白分泌与积液内容的形成有突出作用, 进而实现减轻急性期出现的不良炎症反应与控制慢性分泌性中耳炎的出现, 加速病症的优化康复。
分泌性中耳炎是临床出现概率较高的一项病症, 同时也是造成儿童听力降低与语言障碍的一项重要性因素, 现如今大量的研究都将视线集中在了分泌性中耳炎有关细胞因子的免疫机制调节作用层面之上, 可是却没有多少研究是集中在临床治疗方面, 要是这些研究可以把其中的免疫机制与临床有关治疗相互结合, 对炎症不良病症的发生具有良好的抑制性作用, 能够切实降低中耳积液在耳腔内的形成, 对于未来探寻更多新的有效治疗方式分泌性中耳炎的救治方式有促进性意义, 所以相关的分泌性中耳炎的细胞因子免疫调节控制机制的研究还有更长远的研究要执行[10]。
参考文献
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分泌型表达 篇3
在本研究中,采用基因重组技术构建真核分泌表达载体p SecTag2A-HBV-L,研究其含有前S1抗原与前S2抗原的乙型肝炎病毒L蛋白的体外分泌表达情况,为进一步研究HBV DNA疫苗奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要材料和试剂
质粒p SVsig LMS由本教研室保存(包含全部的乙肝表面抗原编码基因序列);分泌型真核表达载体p Sec Tag/Hygro A、脂质体转染试剂盒Lipofectamine 2000等均购于Invitrogen公司;Hind III、Bam H I内切酶、聚合酶、连接酶、DNA分子量marker、RT-PCRS试剂盒等购于大连大连宝生物公司;鼠抗Pre Sl m Ab购自virostat公司,其余试剂均为国产或进口分析纯试剂;293T细胞株由本教研室保存。
1.2 方法
1.2.1 聚合酶链反应(PCR)扩增HBV-L
根据pSVsigLMS中的L基因序列设计PCR反应引物。P1为5′-AG GCA AGC TTG ATG GGA GGT TGG TCT-3′,P2为5-C GCG GAT CCA TAA TGT ATA CCC AAA GAC C-3′,分别在上下游引物中引入Hind III和Bam H I酶切位点(下划线序列),并保证阅读框的正确性。以p SVsig LMS质粒为模板,100μl体系进行PCR反应。反应条件为94℃,5min预变性,然后经94℃30s、55℃45s、72℃45s循环35次,最后72℃延伸10min。PCR产物电泳分离后,回收纯化。
1.2.2 pSecTag2A-HBV-L真核分泌表达质粒的构建
用Hind III和Bam H I对上述PCR产物和质粒pSecTag2A分别行双酶切后,琼脂糖凝胶电泳、分离、回收纯化酶切产物。用T4DNA连接酶连接以上酶切产物,将HBV-L基因定向克隆入质粒pSecTag2A的多克隆位点,命名为pSecTag2A-HBV-L。抗生素平板筛选后,BglⅡ和EcoRI双酶切鉴定,测序证实重组质粒插入片段的正确性。
1.2.3 细胞培养与蛋白表达
6孔培养板中培养293T细胞至生长密度约为80~90%,脂质体法分别转染用去内毒素质粒提取试剂盒提取的pSecTag2A-HBV-L重组质粒,具体操作按lipofectamine2000说明书进行。
1.2.4 RT-PCR分析转染效果
转染24h后,收集细胞(约4×106个)用Trizol、氯仿、异丙醇抽提总RNA。将RNA反转录为c DNA:42℃1h,95℃10min。PCR反应体系参照大连宝生物两步法RT-PCR试剂盒操作步骤进行,产物琼脂糖凝胶电泳、成像。内参引物(人actin)P3:5′-GGG AAT GGG TCA GAA GGA CTC-3′;P4:5′-AGA AGG AAG GCT GGA AAA GAG C-3′(665bp)。
1.2.5 Western blot鉴定细胞中的融合蛋白的表达
转染48h后收集细胞培养上清,1200r/min离心10min以去除细胞碎片,澄清后的上清缓慢加入终浓度为100g/L的PEG6000粉末,室温下搅拌30min后4℃过夜,混合10000g离心30min,沉淀重新融解于10m L离心缓冲液(10mmol/LTris-HCI,pH7.5,150mmol Nacl,1mmol/L EDTA),20000g离心30min去除未溶解的物质,样本做进一步的连续超离心纯化。纯化蛋白电泳前加等体积2×SDS加样缓冲液,100℃水浴10min,冰浴冷却后20μL加样行120g/L SDS-PAGE。蛋白分离后经考马斯亮蓝染色,脱色液脱色后JS-300凝胶图像分析仪分析结果。行Western blotting时蛋白分离后,电转至硝酸纤维素膜,一抗(鼠抗Pre S1 1:200)4℃过夜,二抗室温反应2h,增强化学发光法显影,暗室压片。
2 结果
2.1 PCR产物和重组质粒的鉴定结果
PCR扩增产物为均一条带,约1.2KB,与预期相符(图1)。重组质粒经Hind III和BamH I双酶切后,切出约1.2KB和5.7KB的片段,大小与预期相符(图2)。经上海生物工程有限公司测序证实插入序列及顺序完全正确,重组质粒pSecTag2A-HBV-L构建成功。
M:1Kb DNA ladder;1,2:HBV-L PCR product.
M:1 kb DNA ladder;1,2:p Sec Tag2A-HBV-L digest with Hind III and Bam H I
2.2 RT-PCR
如图3所显示,第一泳道为以阳性克隆细胞的基因组cDNA为模板,P1、P2为引物而获得的1.2Kb的片段,以内参引物获得665 bp的内参产物。第二泳道仅有一条665 bp的内参条带,而无1.2Kb的条带,示293T细胞本身无HBV-L融合蛋白的表达。
2.3 蛋白印迹检测目的蛋白
DAB显色后可见在预期大小(49KD)处有一特异条带.而转染空质粒pSecTag2A的细胞没有染出条带(图4)。
M:DNA Marker;1.Target cells;2.293T cells
M:Protein marker;1,2:293Tcells transfected by p Sec Tag2A-HBV-L;3,4:293T cells transfected by p Sec Tag2A.
3 讨论
乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白,由3种蛋白组成,主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)。目前使用的乙肝疫苗主要成分为S抗原。本研究中选择的乙肝抗原基因为可以表达乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的s区全基因,即可表达Pre S1、Pre S2和S抗原三种抗原成分的L蛋白。研究表明,Pre S1肽段含有好几个免疫原性比S蛋白更强的T细胞和B细胞表位,由Pre S1引起的特异性细胞免疫应答可以帮助克服某些人对S蛋白的免疫无反应状态或同时对S和Pre S2蛋白的双重无反应状态;Pre S2中也含有多个抗原表位和病毒中和位点[8,9]。因此,在疫苗中加入Pre S1和Pre S2后,可降低人群对乙肝疫苗的不反应和低反应性。
但是,无论是在哺乳细胞还是酵母细胞,L蛋白虽然能插入到细胞的内质网膜,却不能出芽到内质网腔组装成颗粒[10],分泌活动受到影响。研究发现,通过基因工程方法将外源性信号肤融合到Presl区的氨基端能清除这种出芽阻滞作用[11]。曾建平[12]等将一种融合β内酞胺酶信号肽编码序列融合到L基因前面,在体外细胞上清液中成功表达L蛋白。本研究所选择的p Sec Tag2A表达载体,具有多拷贝、强启动、操作方便等优点,它在体外转染细胞效率较高,更为重要的是其携带的小鼠Igκ链V_T2_C区域的分泌信号,是专为重组蛋白的高效分泌而设计,适合于多种细胞系中表达和分泌融合蛋白的真核质粒,可以带动多克隆位点的L基因表达产物到胞外,必将有利于机体识别PreS1、PreS2和S抗原,从而增强免疫应答效果。结果表明,真核分泌表达质粒pSecTag2A-HBV-L构建成功,转染293T细胞后,在细胞培养上清液中检测出L蛋白的表达,这将为HBV DNA疫苗免疫效果的进一步研究奠定坚实的基础。
摘要：目的 探索乙型肝炎病毒大蛋白(L蛋白)的分泌表达。方法 用PCR方法克隆得到HBV-L基因,通过酶切、连接、转化构建pSecTag2A-HBV-L分泌型真核表达载体;通过脂质体介导的方法瞬时转染293T细胞,用RT-PCR和West blot鉴定融合蛋白的表达。结果 成功构建真核分泌表达载体pSecTag2A-HBV-L,HBV-L在mRNA和蛋白水平表达成功。结论 融合IgκVT2C区域的外源性分泌信号能有效的引导L蛋白的组装和分泌,为进一步研究其DNA疫苗及免疫保护效果奠定了基础。
分泌型IgA与儿童呼吸道疾病 篇4
1 SIg A的形成
在支气管分泌液中能检查出各种免疫球蛋白, 从浓度和功能上看SIg A是呼吸道局部抗感染的最重要免疫球蛋白。分泌性免疫球蛋白A是在人体外分泌液中存在的一种Ig A类抗体, 其来源、分布、结构和功能与血清单体Ig A不同, 从而形成了SIg A与血清Ig A两种独立体系。上呼吸道分泌液中主要是SIg A, 下呼吸道分泌液中Ig A相对含量介入上呼吸道和血清含量之间。SIg A以多聚体形式存在, 比单体具有更大的抗原结合力。由于分泌片的存在, 增加了SIg A的稳定性, 不被蛋白酶、胃酸、消化酶等降解。SIg A进入分泌液中与上皮细胞紧密结合在一起, 分泌到粘膜表面, Ig A活化补体, 不与Fc R结合, 因此不引起炎症反应, 而是直接阻止相应病原粘附于上皮, 达到局部抗感染作用。
2 小儿呼吸系统特点
婴儿期缺少鼻毛, 对调节吸入空气的温度与湿度能力差, 粘膜柔嫩, 受冷及干燥空气刺激易发生感染, 感染时粘膜充血肿胀可使鼻腔更加狭窄, 甚至引起呼吸困难。小儿鼻、咽和喉腔粘膜具有丰富的毛细血管网, 能使吸入的冷空气加温至与体温相同, 并使之湿化后进入气管、支气管。小儿的气管和支气管腔相对狭窄且毛细支气管发育较气管、支气管、肺泡发育慢, 管腔更为狭窄。软骨柔软、弹力纤维组织发育不良, 粘膜血管丰富, 粘液腺分泌不足, 使纤毛运动差, 不能有限地排除炎性分泌物, 上呼吸道炎症易于下延, 使呼吸道产生狭窄阻塞等症状。且局部免疫功能低下, SIg A分泌少。
3 SIg A的作用
SIg A是粘膜表面重要的抗病毒和抗毒素免疫因素, 是机体抗感染的一道重要屏障, 能抑制细胞生长、凝聚抗原、中和毒素、中和病毒, 对保护呼吸道粘膜, 防止病菌和其他抗原物质侵入起重要作用。其主要作用有: (1) 阻止细菌在粘膜表面的粘附。SIg A能使细菌发生凝聚, 丧失活动能力而不能黏附在粘膜表面, 游离于分泌液中易于被清除;Ig A与细菌等微生物抗原结合成复合物刺激粘膜中的杯形细胞, 分泌大量粘液起"冲洗"作用; (2) 溶解细菌。不管是血清型Ig A还是SIg A都无直接杀菌作用, 但能通过激活补体旁路引起细菌溶解; (3) 中和病毒和毒素。SIg A不需要补体参与既能中和呼吸道病毒, 如流感病毒和鼻病毒等。SIg A覆盖在病毒表面, 使其不能附着在易感细胞上; (4) SIg A能增加乳铁蛋白的抑菌效果; (5) SIg A只有免疫排除功能, 即SIg A可与饮食中大量的可溶性抗原以及肠道正常菌群病原微生物所释放的热物质相结合, 阻止他们进入到血液。因此, Ig A缺乏的患者容易发生呼吸道感染, 而且一旦感染后病变部位不易修复愈合, 即表现为反复的呼吸道感染。
SIg A不能通过胎盘, 新生儿很少有产生SIg A的浆细胞。因此婴幼儿易患呼吸道感染, 母乳特别是初乳中含有丰富的SIg A, 母亲可以通过哺乳将SIg A传递给幼儿, 经乳汁进入新生儿的SIg A促成了新生儿的免疫系统的完善[1]。SIg A的局部免疫作用主要局限在抗原刺激部位, 因此局部抗原刺激引起的SIg A的抗原能力比全身感染或注射的抗原感染能力强。经过国内外多项实验证实, 局部滴入治疗后增加唾液和支气管肺泡浴洗液中的SIg A, 可明显降低上述细胞的感染率和感染程度[2]。
4 展望
近年来随着对SIg A研究的深入, 发现诱导粘膜免疫反应能有效地预防粘膜表面的感染, 并触发全身免疫反应, 已证实细菌的提取物 (包括死的菌体、细胞壁糖蛋白和抗原提取物) 是目前最强的外源性免疫调节剂[3], 并已在临床应用多年。从初乳中提取、通过转基因激素和体外制备SIg A以及提高初乳中SIg A的浓度受到广泛的关注, 具有较好的应用前景。
参考文献:
[1]张绍兰, 杨致邦.初乳SIg A研究进展[J].国外医学 (流行病学传染病学分册) , 2004, 31 (3) :184~188.
Biotechnol, 2003, 4 (1) :51~67.
[3]Bollinger RR, Everett ML.Human secretary immunoglobulin A may contribute to biofilm formation in the gut[J].Immunology, 2003, 109 (4) :580~587.
参考文献
[1]张绍兰, 杨致邦.初乳SIgA研究进展[J].国外医学 (流行病学传染病学分册) , 2004, 31 (3) :184~188.
[2]Corthesy B.Recombinant secretary immunoglobulin A in passive immunotherapy:linking immunology and biotechnology[J].Curr PharmBiotechnol, 2003, 4 (1) :51~67.
乳腺分泌型癌1例报道并文献复习 篇5
1临床资料
患者,女,56岁,主因右乳肿物10年余伴刺痛2周入院,查体:右乳外上象限可扪及一肿物,大小4.0cm×3.0cm,质地硬,边界清,活动度可,轻压痛。临床初步诊断为右乳肿物:(1)纤维腺瘤?(2)乳腺囊性增生症?(3)乳腺癌待除。乳腺彩色超声示:右乳实质性占位性病变(建议手术)。乳腺钼靶示:右乳外上象限多发肿块,呈不规则高密度影,边缘见分叶状可见毛刺,相邻皮下脂肪浑浊皮肤增厚,BI-RADS 4C类。术中所见:右乳外上象限见一肿物,大小4.5cm×3.5cm×2.5cm,质地中等偏硬,边界欠清,活动度差,包膜不完整。右腋下多个肿大淋巴结,质地稍硬,无粘连、融合。
2病理诊断
送检手术新鲜标本经冰冻机快速冷冻切片;剩余肿物标本经4%中性甲醛固定,石蜡包埋切片;免疫组化采用Maxvision二步法,单克隆抗体及试剂购于福州迈新生物技术开发有限公司;特殊染色采用淀粉酶消化的PAS及AB联合染色。
2.1肉眼检查:送检术中冰冻标本乳腺组织一块,切面见一肿物大小4.0cm×3.5cm×2.5cm,结节状,切面灰白,质地偏硬,边界欠清,包膜不完整。术中冰冻切片病理报告为:(右乳肿物)乳腺浸润性癌。送检右乳肿物单纯切除术后改良根治标本:术腔见残留肿物大小0.5cm×0.5cm×0.45cm,乳头、皮肤及基底未见肿物累及,同侧腋窝找到淋巴结共22枚,肉眼未见转移灶。
2.2光学显微镜检查:肿瘤细胞主要排列成囊泡状、筛孔状,囊腔内充满嗜酸性分泌物,部分囊腔内充满甲状腺胶质样分泌物,酷似甲状腺滤泡,部分区呈实性巢团状,小管状及乳头状结构,被覆细胞常空泡状;肿瘤细胞异型性不明显,核分裂像少见,罕见病理性核分裂像;小部分区肿瘤坏死;肿瘤间质纤维化明显,中等量慢性炎症细胞浸润。癌组织浸润乳腺周围脂肪组织,未见神经侵犯及脉管内癌栓。
2.3免疫组化:ER、PR及HER-2均(-),Ki-67(5%+);癌细胞表达:CKH、CK8/18、S-100、P120(胞膜+)、E-cadherin及GC-DFP-15;不表达:肌上皮标记calponin、P63及SMA。
2.4特殊染色肿瘤细胞内外、囊腔及小管腔内见AB-PAS染色阳性的分泌物。
3讨论
乳腺分泌型癌属乳腺癌的一种罕见类型,因其有肿瘤的生长速度缓慢、边界较清楚、活动度较好及可有部分包膜等特点,临床常易将其误诊为乳腺良性肿瘤。SCB组织形态特殊,只要提高该肿瘤的认识,熟悉它的组织学特征,病理确诊不难。
3.1临床特点SCB罕见,多数为年轻女性,中老年女性和男性病例近年亦有报道[2]。临床上多表现为生长缓慢、可移动的无痛性肿块,超声图像常类似边界清楚的乳腺良性肿瘤[3],与其他界限清楚的乳腺癌(如髓样癌、乳头状癌及黏液癌)的超声表现相近[4]。个别病例可伴有胀痛或乳头血性溢液[5]。
3.2组织学特点SCB肿瘤边缘常呈膨胀性生长,局部也可浸润性生长。肿瘤组织除了浸润性生长区域外,还可伴有导管内乳头状瘤和导管内乳头状癌图像[6]。SCB组织学上通常有微囊、实性和小管状3种主要结构,常以不同比例混合存在。(1)微囊型:细胞内、外有大小不等的微囊,囊内均充满嗜酸性分泌物,酷似甲状腺滤泡结构。(2)实质型:肿瘤细胞紧密排列成实质巢状结构,实质区域内可见少数含有分泌物的囊腺样腔隙。(3)小管型:由大量小管组成,管腔内含有分泌物。SCB常有2种类型的癌细胞,一种细胞胞质淡染、透明,内有大小不等的空泡,空泡可融合成微囊性腔隙,腔隙内充满红染的分泌物,有的细胞核被分泌物挤压成印戒状,核圆,小至中等大小,异型性不明显,可有小核仁。另一种细胞比较少见,细胞有丰富的嗜酸性颗粒状胞质,圆形核具有明显的核仁。肿瘤间质常有纤维化和透明变性。少数情况可见淋巴结转移[7]。癌细胞具有分泌黏液的特点,分泌物淀粉酶消化后PAS染色阳性,Alcin Blue染色亦阳性。
3.3免疫表型目前大多数文献资料报道的SCB免疫组化为ER(-)、PR(-)、S-100(+)、EMA(+),也有文献报道ER(+)、PR(+)的SCB,其中日本有报道ER、PR阳性病例;我国吴雅媛等[8]报道39例SCB,ER阳性表达17例,PR阳性11例,在ER、PR均有检测的29例中,ER、PR双阳性9例,ER阳性、PR阴性6例,ER阴性、PR阳性2例,ER、PR双阴性12例;郞荣刚等[9]对11例病例进行ER及PR检测,其中ER、PR均阳性者5例,ER阳性而PR阴性者2例,PR阳性而ER阴性者1例;此外肿瘤细胞ER、PR呈阳性反应的亦有个别报道。见于ER、PR阳性SCB病例报道主要集中在中国及日本,考虑ER、PR阳性SCB的发生与人种有关,在亚洲人中发生率较欧美洲人高[10]。
3.4分子遗传学研究SCB多数为二倍体,有特征性的染色体移位t(12;15)(p13;q25),产生ETV6-NTRK3融合基因,编码一种嵌合酪氨酸激酶,导致信号传导子和转录激活子(STAT)5a在SCB中过表达,而STAT 5a不在其他类型的乳腺癌中表达。此外比较基因组杂交研究表明,SCB有2个基因改变,染色体8q和1q的重组以及22q的缺失。SCB有着不同于其他乳腺癌的分子遗传学特点,所以SCB是一种独立类型的乳腺实体肿瘤。
3.5鉴别诊断(1)妊娠或哺乳期乳腺疾病SCB与其都有明显的腺腔内分泌物,但后者见于妊娠或哺乳期的乳腺,呈弥漫性病变,结合临床病史可以相鉴别。(2)乳腺良性疾病:(1)乳腺胶原小体病[11]:SCB与其都有筛孔状腔内嗜酸性分泌物,分泌物均为AB-PAS染色阳性,其组织形态极其相似,但乳腺胶原小体病均为镜下病变,往往作为一种伴随病变出现,且有完整的肌上皮,而SCB可触摸到肿块,为肿瘤单克隆性病变,缺乏肌上皮,可以相鉴别。(2)乳腺微腺性腺病:SCB与其镜下都是无小叶状结构,缺乏肌上皮,小管上皮表达S-100,管腔内可有耐淀粉酶消化的PAS阳性分泌物,两者有许多相似点,但SCB腺腔与腺腔紧挨着为囊泡状、筛状结构,肿瘤间质纤维化明显,可以相鉴别。(3)乳腺恶性疾病:(1)腺样囊性癌:SCB与其都有筛孔状结构,但腺样囊性癌肿瘤细胞成团片梁状,腺腔明显较大,有腺上皮和肌上皮两种细胞形成真假腺腔,免疫组化肌上皮标记阳性,可以相鉴别。(2)浸润性筛状癌:SCB与其都有筛孔状结构,腔内都有黏液阳性的分泌物,两者形态相似,但浸润性筛状癌癌细胞有异型性,腔内分泌物相对较少,没有囊泡状、乳头状结构,可以相鉴别。
3.6预后SCB性质为低度恶性。SCB的预后与年龄有关,在儿童和青少年中预后较好,有报道称,3~15岁女童均做局部切除手术,无淋巴结及远处转移,5年生存率100%。吴雅媛等[8]报道39例,术后中位随访时间73(2~221)个月,其中6例发生远处转移,转移部位主要为骨、肺、肝,至随访结束,2例于9个月及11.8个月死亡,4例仍存活。以上资料显示,儿童和青少年分泌型乳腺癌预后很好,成人的淋巴结转移和生存率差异较大,但总的预后尚好。淋巴结转移率较低,致死性病例较少。年幼无淋巴结转移征兆者通常采用单纯乳腺切除即可,年长的患者建议做区域淋巴结及同侧腋窝淋巴结清扫,辅以放疗和(或)化疗。Cadoo等[12]认为辅助性化疗和放射治疗主要用于淋巴结阳性的患者。本例患者术后行4个周期化疗,定期随访1年半,至今未见肿瘤复发和转移。
摘要：目的 探讨乳腺分泌型癌的临床病理学特征。方法 对1例乳腺分泌型癌的临床资料、病理形态学、免疫组织化学及特殊染色进行观察,并通过复习相关文献进行分析。结果 乳腺无痛性肿物10余年伴刺痛2周,术中所见肿物质地中等偏硬,边界欠清,活动度差,包膜不完整。显微镜下肿瘤细胞排列成囊泡状、筛孔状,腔内充满嗜酸性分泌物,酷似甲状腺滤泡,部分区呈实性巢团状,小管状及乳头状结构,被覆细胞常空泡状;肿瘤细胞异型性不明显,核分裂像少见,罕见病理性核分裂像。免疫组化:ER、PR、HER-2均(-),Ki-67(5%+),癌细胞表达CKH、CK8/18、S-100、E-cadherin、P120(膜+)、GCDFP-15,不表达肌上皮标记calponin、p63及SMA。特殊染色:肿瘤细胞内外、囊腔及小管腔内见AB-PAS染色阳性的分泌物。结论 乳腺分泌型癌是一种罕见且预后较好的肿瘤,该肿瘤组织形态特殊,属于特殊类型乳腺癌,临床病史及影像学检查很容易误诊为乳腺良性肿瘤。
分泌型表达 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6雌性小鼠54只,6～8周龄,体重(18±2)g,购自中国医学科学院实验动物研究所。
1.2 主要试剂
分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌由本实验室前期研究制备提供;卡介苗菌株购自成都生物制品研究所;rmIFN-γ购自深圳晶美公司;小鼠IL-12、TNF-a ELISA检测试剂盒购自大连宝生物公司;NO检测试剂盒、H2O2检测试剂盒购自日本MBL公司。
1.3 分别制备分泌表达ES AT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌
用0.5 m L生理盐水和苏通培养液的混合液(体积比为1:3),分别将分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌稀释,接种于罗氏斜面培养基上培养,18d后分别刮取罗氏培养基上生长良好的菌落于磨菌器中,加入少量0.05%Tween-20的生理盐水研磨,稀释成均匀浑浊菌液。镜下计数,调整细菌浓度为3.5×107个/m L。
1.4 实验分组及动物接种
C57BL/6小鼠54只,随机分成3组,每组18只。(1)分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种组(实验组):于每只小鼠尾根部皮内注射分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌0.1 m L(含活菌数约1.2×106个),使其成皮丘。(2)卡介苗菌皮内接种组(对照组):于每只小鼠尾根部皮内注射卡介苗菌液0.1 m L(含活菌数约1.2×106个),使其成皮丘。(3)未免疫组(空白对照组):于每只小鼠尾根部皮内注射生理盐水0.1×m L,使其成皮丘,随实验组一起喂养。
1.5 腹腔巨噬细胞的制备及培养上清液的收集
在免疫后30 d和60 d,分别从3组中随机取小鼠各9只,眼球放血,拉颈处死,75%酒精浸泡30min。无菌打开腹腔,以预冷的无血清RPM11640灌洗腹腔细胞,离心10 min(1 500 r/min),弃上清,沉淀以无血清RPM11640洗2次,调整细胞浓度至1.5×106个/m L。细胞悬液加至24孔培养板,0.5m L/孔,置37℃,5%二氧化碳培养箱中培养4h,洗去非黏附细胞即为腹腔巨噬细胞。将该巨噬细胞分为两组,一组每孔加入含10%小牛血清的1640培养液0.5 m L,另一组每孔加入含IFN-γ的1640培养液0.5 m L(IFN-γ终浓度为20 ng/mL)。37℃,5%二氧化碳温箱培养48 h后收集上清,-20℃冰箱保存备用。
1.6 细胞因子测定
取巨噬细胞培养上清液,按ABC-ELISA双抗体夹心法按试剂盒说明书测定IL-12、TNF-α的浓度。
1.7 NO活性测定
取巨噬细胞培养上清液,应用Griess法按试剂盒说明书测定NO活性。
1.8 H2O2活性测定
取巨噬细胞培养上清液,按照试剂盒说明书采用化学法测定H2O2活性。
1.9 统计学分析
利用SPSS10.0统计分析软件,数据用均数±标准差表示采用t检验进行组与组之间的分析。
2 结果
2.1 皮内免疫小鼠腹腔巨噬细胞IL-12的表达
分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌分别皮内接种小鼠,接种30 d、60 d时,腹腔巨噬细胞分泌表达的IL-12分别为(22.18±3.12)pg/mL、(20.82±2.84)pg/mL和(21.92±2.42)pg/mL、(21.07±3.09)pg/mL,与未免疫组(5.43±1.07)pg/ml和(5.04±1.32)pg/ml比较,其差异具有明显的统计学意义(P<0.01);但分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌组两时间段IL-12表达水平与卡介苗菌组相比较无明显差异;在免疫30 d、60 d后,分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌组和卡介苗菌组IL-12表达水平均随时间延长呈下降趋势;而当巨噬细胞体外受IFN-γ刺激后,IL-12表达水平较未受IFN-γ刺激时的各组水平明显增强,见表1。
注:1)与未免疫组比较,P<0.01;2)与BCG组比较,P>0.05
注:1)与未免疫组比较,P<0.01;2)与BCG组比较,P>0.05
2.2 皮内免疫小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的表达
分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌分别皮内接种小鼠,接种30 d、60 d时,腹腔巨噬细胞分泌表达的TNF-α水平与未免疫组比较,其差异均有显著的统计学意义(P<0.01);但分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌与卡介苗菌免疫组相比,TNF-a表达水平差异无统计学意义(P>0.05);受IFN-γ刺激后的各组水平,较未受IFN-γ刺激的水平明显增强,见表2。
2.3 皮内免疫小鼠腹腔巨噬细胞NO的分泌
分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌分别皮内接种小鼠后,均可诱导腹腔巨噬细胞分泌产生多量的NO,与未免疫组比较,其差异具有统计学意义(P<0.01);但分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌免疫组间差异无统计学意义。免疫30d、60d后,分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌、卡介苗菌组NO产量均随时间延长呈下降趋势,各组两时间段之间无显著性差异;IFN-γ对NO的产生有促进作用,见表3。
2.4 皮内免疫小鼠腹腔巨噬细胞H2O2的分泌
分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌分别皮内接种小鼠后可显著增强腹腔巨噬细胞产生H2O2的水平,与未免疫组比较,其差异具有统计学意义(P<0.05);但分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌免疫组间无显著性差异;IFN-γ对H2O2的产生也具有增强效应,见表4。
注:1)与未免疫产组比较,P<0.01;2)与BCG组比较,P>0.05
注:1)与未免疫组比较,P<0.01;2)与BCG组比较,P>0.05
3 讨论
结核病疫苗对结核杆菌感染的免疫保护效应,关键在于可激活宿主机体内的巨噬细胞和T细胞介导的细胞免疫,进而杀灭和清除进入机体的结核分枝杆菌,发挥结核病疫苗的免疫保护作用。
分子免疫学研究表明,CD4+T细胞产生的γ-干扰素(IFN-γ)是激活巨噬细胞抗菌活性的主要因素[5、6]。IFN-γ等细胞因子可激活巨噬细胞,引起呼吸爆发,产生大量活性氧介质(ROI,H202),并诱导产生i NOS酶(诱导型一氧化氮合酶),合成大量活性氮介质(RNI,NO)[7,8]。NO是活化巨噬细胞杀灭结核杆菌的重要效应分子,而ROI与RNI的联合作用,则能明显增强巨噬细胞杀灭结核分枝杆菌的功能[9,10];与此同时,活化的巨噬细胞还能分泌表达一系列抗结核细胞因子:如TNF-a,IL-12,IL-18等。IL-12能促使Th0细胞向Thl细胞分化,在增强Th1型细胞免疫,介导天然免疫和特异性免疫之间的联系,以及介导抗结核免疫中都起着十分重要的作用[11];TNF-a则能显著诱导感染结核分枝杆菌的巨噬细胞凋亡,促进结核肉芽肿形成,从而对宿主产生有利的免疫保护应答[12];IL-18也是新近发现的在机体抗结核免疫中起主要作用的一种细胞因子[13]。因此探讨分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌免疫小鼠后巨噬细胞氮氧化物的产生、细胞因子的表达等,对于了解分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌激活宿主T细胞介导的细胞免疫以及激活巨噬细胞;阐明分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌作为结核病疫苗,发挥抗结核分枝杆菌感染的免疫保护作用机制等,均具有十分重要的意义。
本研究结果表明,分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌免疫小鼠后30d及60 d,其腹腔巨噬细胞NO、H202的产量、巨噬细胞IL-12,TNF-α的表达水平与未免疫组比较,其差异具有显著性(P<0.05),而与卡介苗菌组比较无明显差异。由此说明,分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌免疫小鼠后,能显著诱导巨噬细胞活化并产生较强的激活作用,且该作用与卡介苗菌组比较无明显差异。分析其原因,可能的机理是分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,也可以通过一定的机制刺激T淋巴细胞发生增殖转化并产生IFN-γ,再由IFN-γ激活巨噬细胞引起呼吸爆发所致。当被免疫激活的巨噬细胞在体外受IFN-γ再次刺激后(模拟体内环境-即机体持续受到致敏T淋巴细胞产生的IFN-γ刺激),其活化作用进一步增强,则更进一步证实分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌免疫激活诱导产生的IFN-γ,是激活巨噬细胞抗结核活性的中心活性因子[14]。未免疫组由于未接受分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种,无特异性抗结核细胞免疫产生,因此巨噬细胞不会受到T细胞持续分泌的IFN-γ刺激,故在实验安排中,我们没有使用IFN-γ体外激活。
我们同时也注意到,分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌、卡介苗菌组的IL-12、TNF-α、NO及H2024项指标水平,均随免疫时间延长而下降,显示出巨噬细胞的激活效应似乎随接种时间推移而减弱的趋势。作者认为这可能与免疫60d后,体内的机体抗结核细胞免疫相对减弱,使IFN-γ分泌减少所致;但接种分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌已免疫刺激产生特异性致敏T细胞,并有记忆存在,一但致病性结核杆菌进入体内,即可触发抗结核细胞免疫,分泌IFN-γ并诱使巨噬细胞活化产生抗结核免疫作用,从而保护机体避免患病。
总之,我们的研究结果说明,分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,能显著诱导巨噬细胞活化并产生氮氧化物效应物质和抗结核细胞因子,有较强的抗结核免疫效应,但该抗结核免疫效应与卡介苗菌相比无明显差异。
摘要：目的探讨小鼠皮内注射分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌后,小鼠腹腔巨噬细胞是否被激活,以及激活后氮氧化物的产生、抗结核细胞因子的表达。比较研究分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌和卡介苗菌激活小鼠腹腔巨噬细胞的抗结核免疫应答过程及免疫效应。方法用分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌、卡介苗菌和生理盐水分别皮内注射小鼠30d、60d后,分别采用Griess法、化学法、ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞产生的NO、H2O2以及IL-12、TNF-α的表达。结果分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,能显著诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌表达IL-12和TNF-α,与卡介苗菌组相比较,无明显差异;与生理盐水组比较,其差异均有统计学意义(P<0.05)。分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,也能诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生NO、H2O2,与卡介苗菌组相比较,无明显差异,与未免疫组比较具有统计学意义(P<0.05)。结论分泌表达ESAT-6的重组卡介苗菌皮内接种小鼠后,能诱导小鼠腹腔巨噬细胞活化并产生较强的抗结核免疫效应,但该效应与卡介苗菌无明显差异。
分泌型表达 篇7
1资料与方法
1.1一般资料
收集2015年6月—2016年3月该院内分泌科收治的56例2型糖尿病患者定义为研究对象,按照随机数字表法将其分为糖尿病干预组A组(27例)和糖尿病对照组B组(27例)。 其中糖尿病干预组男性16例,女性11例,年龄38~70岁,平均年龄(56.8±5.9)岁;病程在1~20年,平均(7.8±5.6)年;BMI指数在20.5~28.0 kg/m2, 平均(23.5±2.6)kg/m2。 糖尿病对照组B组男性15例,女性12例,年龄38~70岁,平均年龄(56.2±5.7)岁;病程在1~20年,平均(8.1±5.5)年;BMI在20.0~30.0 kg/m2, 平均(24.8±2.6)kg/m2。 正常对照组C组27例,男性14例,女性13例,年龄30~70岁,平均年龄(55.8±5.1)岁。 3组男女比例、 年龄均值比较差异无统计学意义(P > 0.05)。
1.2治疗方法
糖尿病干预组: 对糖尿病患者进行饮食和生活方式指导, 在进行常规糖尿病口服药物治疗的基础上行海洋胶原肽干预疗法。 其海洋胶原肽为北京中食海氏生物有限公司生产,是一种小分子多肽混合物,其低聚肽含量≥88%。 批号为:2014/11/25;2015/09/21。 所有糖尿病患者均于早上空腹时和临睡前冲服海洋胶原肽6.2 g,为期3个月。 糖尿病对照组:对照组糖尿病患者同样进行饮食和生活方式指导, 仅进行常规口服降糖药物治疗以控制其血糖水平,为期3个月。 将正常人空白对照组同时进行为期三个月的平行对照试验, 仅进行饮食和生活方式督导。
1.3观察指标
测定并记录每组试验前后的空腹血糖血脂水平、 胰岛素水平和脂肪内分泌激素(游离脂肪酸、瘦素、抵抗素、脂联素)的浓度,将所得数据进行统计学分析。
1.4统计方法
实验数据录入SPSS 14.0专业统计学软件完成分析检验,计量资料用(±s)表示,行t检验,计数资料用百分比(%),完成秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组干预前后的FBG、血脂、胰岛素水平变化
治疗前A、B组间的FBG、TG、TC、LDL-C、HDL-C差异无统计学意义(P>0.05),但与C组比较存在异常(P< 0.05);A组的TG、TCHO、LDL-C在服用海洋胶原肽3个月后明显降低,HDL-C浓度水平较干预治疗前明显升高(P<0.05);B组则升高;见表1。
2.2各组干预前后的脂肪内分泌激素水平变化
治疗前A、B组的游离脂肪酸、抵抗素、瘦素浓度水平明显高于正常对照组C(P<0.05);治疗后,A组游离脂肪酸浓度、瘦素水平明显低于治疗前,抵抗素和脂联素水平在干预治疗后明显增高(P<0.05);见表2。
3讨论
近年来,糖尿病的发病率呈上升趋势,严重威胁着人类的身体健康,其患者机体各方面功能衰退,免疫系统功能逐渐降低,引起各种严重并发症。 患者脂肪组织内分泌的瘦素、脂联素、抵抗素等激素水平的变化对慢性糖尿病的发展起到调节作用。 大量研究表明[3,4],脂肪组织产生的瘦素、抵抗素、游离脂肪酸浓度的增加及脂联素浓度的降低能促进胰岛素抵抗的发生。 而制定有效的控制血糖浓度的方案, 减少和预防并发症的发生具有至关重要的意义。
研究结果显示: 海洋胶原肽治疗后糖尿病患者空腹血糖水平控制佳,且游离脂肪酸、脂联素、抵抗素、瘦素浓度显著恢复,与干预前比较(P<0.05),与B组和C组比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示海洋胶原肽对糖尿病患者的治疗中能够有效控制血糖, 同时有效帮助患者脂肪内分泌激素水平恢复。 该研究所探讨的海洋胶原肽是一种纯天然无污染的小分子多肽, 其化学本质为一种蛋白质,是由深海海鱼的鱼皮为原来,应用现代生物工程技术和酶工程技术提取炼制而成, 它可以被人体主动无障碍吸收,无需经过消化,可以被身体各组织充分利用[5,6]。 该研究提示海洋胶原肽对糖尿病患者的血糖、 血脂浓度及脂肪内分泌激素的表达均起到积极的作用, 可能与海洋胶原肽能增加体内某些酶的活性,降低脂质过氧化物的水平有关。
综上所述, 糖尿病患者采用海洋胶原肽治疗效果佳,可对患者的脂肪内分泌激素起到积极的调节作用, 对糖尿病和其并发症的控制有积极意义, 将对临床应用提供有力的依据。
参考文献
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