分泌型表达bFGF（共4篇）
分泌型表达bFGF 篇1
摘要：为了构建牛皮蝇的皮蝇素A(hypodermin A,HA)基因的分泌型真核表达载体pEF1α-HAAcGFP,并在Cos7细胞中表达与鉴定,试验从牛皮蝇中提取RNA,反转录成cDNA,扩增出HA基因,并在HA基因序列的上游加1段信号肽序列;通过双酶切将带有信号肽的HA基因序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP中,得到分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP;再利用脂质体法转染Cos7细胞,并以RT-PCR和Western-blot技术在RNA和蛋白水平上检测HA基因是否在Cos7细胞中表达。结果表明:经双酶切及测序鉴定,分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP构建成功;转染Cos7细胞后,在RNA和蛋白水平上能检测到HA基因的表达。说明成功构建了HA基因的分泌型真核表达载体PEF1α-HA-AcGFP。
关键词：牛皮蝇,宿主,真核表达载体,HA基因,载体构建,基因表达
皮蝇素A ( hypodermin A,HA) 是牛皮蝇一期、二期幼虫分泌的一种丝氨酸蛋白酶,具有抗炎及免疫抑制作用[1]。牛皮蝇幼虫能在宿主组织中移行8个月, 其分泌的4种丝氨酸蛋白酶———皮蝇素A、B、C和D对宿主起免疫抑制作用,导致宿主不能用免疫机能杀死牛皮蝇幼虫。HA能裂解补体C的组分C3,使C3降解产物不具有生理特性[2]。此外,HA能抑制C介导的细胞毒性及延迟移植排斥反应[3]。牛皮蝇幼虫通过HA抑制淋巴细胞的增殖,从而逃避宿主的免疫应答[4]; 还通过表达前列腺素E2( PGE2) 及减少白细胞介素-2( IL -2) 生成,抑制免疫排斥[5]。HA的这些免疫调节功能抑制了宿主对牛皮蝇幼虫的排斥反应,保证了牛皮蝇幼虫在宿主体内的成活。
牛皮蝇蛆虫的防治方法主要是用化学药物驱虫, 而长期应用化学药物会造成虫体耐药性、引起毒副作用和污染环境,更重要的是导致动物性食品中的药物残留,进而对人类的身体健康构成威胁。HA是牛皮蝇分泌的一种蛋白酶,具有抗炎和免疫抑制作用,可作为诊断和免疫用抗原。本研究克隆HA基因的cD- NA序列,并构建了真核表达载体,为牛皮蛆病免疫诊断和预防提供依据,现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1试验动物
牛皮蝇的一期幼虫,采自宁夏尖扎县康扬镇牦牛屠宰厂。
1. 2主要试剂
真核表达载体pEF1α - IRES - AcGFP、Cos7细胞,由徐州医学院神经生物学研究中心保存; 限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、Taq酶、T4 DNA连接酶、 DH5α 感受态细胞、反转录试剂盒及TRIzol试剂,均购自TaKaRa公司; 质粒提取试剂盒,Promega公司生产; 凝胶回收试剂盒、Lipofectamine 2000 、DNaseⅠ, Invitrogen公司生产; HA抗体,由苏州百奇生物公司合成; 羊抗兔荧光二抗,Odyssey Gene公司生产。
1. 3总RNA的提取、cDNA合成及带有信号肽HA基因的扩增
提取牛皮蝇一期幼虫总RNA,反转录合成cD- NA。以cDNA为模板,上、下游引物为F1 5' - AT- GCTGAAGTTTGTTATTTTATTGTGC - 3',R1 5' - TAGGATCCTTAAATAGATTCTGCATTACTGAC - 3' ( 下画线部分为BamH Ⅰ酶切位点) ,扩增片段大小为771 bp。为得到HA基因的分泌型蛋白,在HA基因起始位点用重叠PCR方法加1段信号肽序列,其序列为5' - ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT- GGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGA CGCGGCC - 3'。同时设计1对带有酶切位点的引物: F2 5' - GTGAATTCATGGAGACAGACACACTCC - 3'( 下画线部分为EcoR Ⅰ酶切位点) ,R1 5' - TAG- GATCCTTAAATAGATTCTGCATTACTGAC - 3' ( 下画线部分为BamH Ⅰ酶切位点) 。PCR扩增条件: 94 ℃ 4 min; 94 ℃1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环; 72 ℃ 10 min。扩增结束后,用1% 琼脂糖凝胶电泳,目的条带与扩增条带大致相近,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序。
1. 4分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP的构建
对HA基因的PCR产物及真核表达载体pEF1α - IRES - AcGFP纯化回收,同时用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ 双酶切; 酶切产物用1% 琼脂糖凝胶电泳,切胶回收并按照3∶1的摩尔比混合,用T4 DNA连接酶连接3 h; 反应产物转化DH5α 感受态细胞,用卡那霉素平板筛选,挑取8个单菌落,分别接种于含卡那霉素的3 mL LB培养基中,37 ℃ 振荡培养过夜; 分别在HA基因片段与质粒上设计F3( 5' - AGCGGGCGGGT- GAGTCA - 3') 和R3( GATACTTGCCAAGGAAAATC - 3') 引物,对培养过夜的菌液进行PCR; 扩增结束后, 用琼脂糖凝胶电泳,取扩增片段大小正确的菌液进行质粒提取,同时送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序鉴定。
1. 5细胞培养及转染
复苏Cos7细胞株,用含10% FBS的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当细胞生长到70% 左右时,依照Lipofectamine 2000转染说明书,用分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP和空载体pEF1α - IRES - AcGFP分别转染Cos7细胞。
1. 6 RT - PCR检测HA基因的表达
分别收集分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP和空载体pEF1α - IRES - AcGFP转染48 h后的Cos7细胞,提取RNA,用DNase Ⅰ消化处理后,参照反转录试剂盒说明转录得到cDNA序列,以得到的cDNA序列为模板分别扩增HA基因序列。PCR扩增条件: 94 ℃ 4 min; 94 ℃ 1 min,58 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共30个循环; 72 ℃ 10 min。扩增结束后,用1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 7 Western - blot检测
用分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP和空载体pEF1α - IRES - AcGFP转染Cos7细胞,取培养48 h后的细胞培养基,参照免疫沉淀试剂盒说明得到HA重组蛋白,蛋白定量后,取80 μg用10% SDS - PAGE凝胶分离,40 mA恒流作用30 min转移到PVDF膜上,5% 脱脂奶粉封闭2 h。用HA抗体( 1∶1 000) 于4 ℃ 孵育过夜; 用TBST洗涤3次,每次5 min; 用羊抗兔荧光二抗( 1∶100) 室温避光孵育2 h; 然后避光用TBST洗涤3次,每次5 min; 最后扫描。
2结果与分析
2. 1HA基因的cDNA序列扩增( 结果见图1和图2)
由图1、图2可知,PCR扩增得到的目的条带为均一条带,其大小与预期一致。氨基酸序列与Gen- Bank ( 登录号为X74303) 中序列对比显示,有15个氨基酸发生改变,主要位于N端。
2. 2分泌型真核表达载体的鉴定( 结果见图3、204页彩图4)
由图3、彩图4可知,分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后得到大小为833 bp( 含信号肽序列) 和5 990 bp的2条条带,鉴定结果表明分泌型真核表达载体构建成功。经跨酶切位点测序再次表明,分泌型真核表达载体构建成功。
M. Marker 3; 1. HA 基因的 cDNA 序列扩增结果。
M.Marker 3;1.分泌型真核表达载体的双酶切片段。
2. 3 RT - PCR检测( 结果见图5)
由图5可知,在分泌型真核表达载体pEF1α - HA - AcGFP转染的Cos7细胞中获得目的条带,转染空载体pEF1α - IRES - AcGFP的Cos7细胞中未见条带。
2. 4 Western - blot检测( 结果见图6)
由图6可知,分泌型真核表达载体和牛皮蝇一期幼虫蛋白均在28 ku处有明显特异性条带,空载体未见有特异性条带。
1.空载体蛋白;2.分泌型真核表达载体蛋白;3.牛皮蝇一期幼虫蛋白。
3讨论
HA对牛的免疫系统具有免疫抑制作用[6 -7]。J. H. Mckerrow[8]研究发现,HA能抑制人的补体,进一步阻止异基因的超急性排斥反应。B. Malassagne等[9]用从牛皮蝇一期幼虫中提取的HA静脉注入大鼠、小鼠体内,能够降解血清中C3。体外试验结果显示,在培养基中加入经过HA处理的大鼠血清,细胞表面C3沉积,以及因补体调节细胞死亡数都显著低于未经HA处理的对照组。N. Moire等[10]分离得到了HA基因的cDNA序列,并推测出氨基酸序列。本研究从牦牛一期幼虫中得到HA基因的cDNA序列, 经测序、翻译及与GenBank中的序列比对发现,HA基因共有15个氨基酸发生变化,可能由采样区域及遗传背景不同造成。
本研究所采用的真核表达载体pEF1α - IRES - AcGFP的启动子为EF1α,具有较强的启动能力。在启动子下游IRES的酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ 之间插入带有信号肽的HA基因,构建分泌型真核表达载体。应用RT - PCR和Western - blot技术分别验证了HA基因在RNA和蛋白水平上的表达,为进一步研究其分子机理,以及降低牛皮蛆病的发病率提供了分子技术支持。
A. 箭头左侧为载体序列，右侧为信号肽序列; B. 箭头左侧为 HA 终止序列，右侧为载体序列。
分泌型表达bFGF 篇2
1 材料与方法
1.1 动物实验部分
1.1.1 动物、药品和主要器材
(1)健康新西兰雄性大白兔45只(体重2.0~2.5 kg/只,中南大学湘雅二医院动物实验室提供和喂养);(2)微型牙科电动打磨机1台(型号handengine C-33,日本CH IY O D A公司生产);(3)正畸测力计1台(规格0-500 g,长沙添美齿科器材厂生产);(4)游标卡尺1把(精确到0.01m m,三圆牌,上海产);(5)丹参注射液100 m L(云南生物谷丹参药业有限公司生产);(6)2%戊巴比妥纳200 m L;(7)4%多聚甲醛250 m L。
1.1.2 实验动物分组
45只兔分笼普食饲养,自由摄食饮水。适应性喂养1周后进行实验。兔随机分为A﹑B﹑C 3组,A﹑B组分别设1﹑3﹑7和14 d 4小组,每小组5只。每组均以双侧下颌第一磨牙为实验观察牙。A组下颌双侧设计正畸加力装置,以两下颌切牙为支抗每侧60 g近中牵引下颌第一磨牙,同时右侧第一磨牙近中和颊侧以碧兰麻针头注射丹参注射液(A-R组),左侧第一磨牙近中和颊侧注射生理盐水作为对照(A-L组)。B组不设计正畸加力装置,仅右侧注射丹参(B-R组),左侧注射生理盐水作为对照(B-L组)。C组既不注射药物又不设计正畸加力装置,作为空白对照组。A-R、A-L、B-R、B-L组均每2天给药1次,每次1 m L。各小组兔到期处死,取组织标本,测量牙移动距离,取牙周组织制成切片,分别进行H E染色组织学观察和免疫组织化学检测b FG F的表达。
1.1.3 正畸加力模型的建立
A大组20只兔均建立双侧下颌第一磨牙近中移动的正畸加力模型。仿照刘鸿虎﹑刘侃等的方法[1,2],2%戊巴比妥钠经耳缘静脉将兔麻醉(2 m L/kg)后,仰卧固定,使用微型牙科电动打磨机以长柄金刚砂石将双侧下颌切牙和第一磨牙颈部磨小沟,以直径0.25 m m结扎丝将两下颌切牙8字结扎,远中侧留圈,左﹑右两侧各将一根镍钛螺旋拉簧以结扎丝连于第一磨牙于同侧切牙之间(见图1、2),用正畸测力计测得力值60 g,并以两脚圆规和游标卡尺准确测得双侧第一磨牙与切牙之间的初始距离。隔天加力一次。
1.1.4 标本制取和牙移动距离的测量
兔1﹑3﹑7﹑14 d组到期则以耳动脉空气栓塞处死,以两脚圆规和游标卡尺测量左﹑右第一磨牙与切牙之间的距离(测量从下颌第一磨牙近中颈部被磨的小沟处量至同侧下颌切牙近中颈部被磨的小沟处)。测量采用双盲法由同人重复3次进行,取均值。拆除正畸加力装置,取双侧下颌第一磨牙及其周围组织的标本,分别编号并挂相应标签。标本浸入4%多聚甲醛固定液中,待检。
1.2 病理实验部分
1.2.1 主要实验试剂
免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供)内含:(1)5%BSA封闭血清2 m L;(2)免抗兔b FG F抗体(一抗)2 m L;(3)生物素化山羊抗兔lg G(二抗)2 m L;(4)SA BC(链霉素和素—生物素—过氧化物酶复合物)(三抗)2 m L。D A B显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司提供)内含:A﹑B﹑C显色剂各3 m L。
1.2.2 主要仪器
(1)熔蜡恒温箱;(2)浸蜡金属盒;(3)组织切片机(Leica R M 2126型,上海产);(4)电烤箱;(5)电冰箱;(6)微波炉;(7)普通光学显微镜。
1.2.3 组织制片
组织脱钙脱水,蜡块包埋和切片,蜡块冷冻数小时后在组织切片机上选取所需部位制成厚5 um的近远中向切片,每个部位连续切片4张。
1.2.4 HE染色
按常规方法进行,滴中性树脂加盖玻片封片,待组织学检查。
1.2.5 免疫组织化学染色程序
切片脱蜡至水,胰酶修复抗原,滴加一抗,滴加二抗,D A B显色,苏木素轻度复染,脱水封片待显微镜观察。
1.2.6 b FG F表达的结果判断标准
b FG F以胞质出现黄色颗粒为阳性。采用BR ESA LIER等的半定量公式,判断染色结果[3]用双盲法由两名专业医师独立评估结果。在每张切片的张力侧及压力侧的牙根上1/3区牙周膜随机选择10个视野,根据b FG F在胞浆中的染色强度分为以下四级并分别记分;(1)阴性-细胞无显色,记0分;(2)弱阳性-细胞显色为浅黄色,记1分;(3)中度阳性-细胞显色为棕黄色,记2分(4)强阳性-细胞显色为棕褐色,记3分。记数每强度的视野数,根据以下公式计算每张切片的平均染色强度。计分:Is=∑{(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)},F=%×10。式中F为每一强度级别的视野数。观测结果不一致时,由第三人重新评价,以达到一致结果。判断一致性采用K appa值进行检验。
1.3 统计学分析
用SPSS11.5软件进行统计学处理,P<0.05有统计学意义。A组不同加力天数其右侧与左侧牙移动距离均值比较采用两样本均数配对t检验。b FG F表达灰度均值的比较采用的统计学方法如下:A-R组﹑A-L组﹑B-L组以及B-R组不同天数之间的比较,采用方差分析;A-L组同一天以及A-R组同一天内压力侧与张力侧之间的比较采用配对t检验;同一天的B-L与B-R组之间的比较采用成组t检验。
2 结果
2.1 A组牙移动距离
A组不同加力天数的牙移动距离情况:正畸加力组(A组)在1﹑3﹑7﹑14 d双侧下颌第一磨牙移动距离均值见表1。从中可明显看出,在恒定正畸力(60 g)下,加力时间越长,正畸牙移动距离越多(P<0.01);而且A-R组(正畸加力合并丹参注射组)比A-L组(单纯正畸加力组)在同一时间的牙移动距离更大(P<0.01)(见图1、2)。
2.2 组织学观察
各组下颌第一磨牙近中根的颈1/3部分的近中和远中侧牙周组织H E染色组织学观察结果如下:
A-R组:反应变化与A-L组类似,只是各种表现更明显,成骨和破骨细胞出现时间更早。A-L组:微血管反应较轻微,少量炎性细胞浸润,压力侧破骨细胞增多,张力侧成骨细胞增多。B-R组:微血管扩张,红细胞数量增加,其余同对照组。C组和B-L组:拥有正常数量、形态的微血管﹑血细胞﹑成骨细胞和破骨细胞。无炎性细胞浸润。
2.3 免疫组化结果
注:1)P<0.01;2)P>0.05
A:加力第3天;B:加力第7天;C:加力第14天
各组下颌第一磨牙近中根的颈1/3部分的近中和远中侧牙周组织b FG F表达强弱﹑部位及随时间的变化详见图4;各实验组b FG F表达灰度计分的半定量结果详见表3。
A-R组:正畸加力合并丹参注射组;A-L组:单纯正畸加力组
A:压力侧,可见破骨细胞和骨吸收陷窝:B:加力张力侧,可见成骨细胞、新生血管和新骨形成
A:为C组,阴性表达;B:为B-R组第7天,可见牙周膜纤维和血管内皮细胞弱阳性表达;C:为A-L组第7天,可见牙周膜纤维、成纤维细胞阳性表达;D:为A-R组第3天,可见牙周膜纤维及成骨细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞均强阳性表达
3 讨论
3.1 本实验正畸加力模型的建立
目前动物实验中正畸加力模型的建立方式主要有以下3种[7,8]:(1)利用切牙为支抗近中牵引磨牙,常在上颌或下颌切牙与同颌同侧的第一磨牙之间放置镍钛螺旋拉簧;(2)利用骨支抗或种植支抗来远中移动前牙;(3)利用切牙交互支抗来使切牙远中移动。其中第(1)种方法是目前国内国外最常用的,本实验就采用该方法。
3.2 正畸力大小的选择
适当大小的矫治力量是正畸牙齿移动的关键。正畸力量太小,不足以引起牙周组织的明显反应,牙体无显著移动;正畸力量太大,牙周膜内的血管可因过度受压而局部缺血坏死,成骨细胞和破骨细胞的代谢和分化也就停止了。FR IED ICH等[8]认为,加在单个牙齿上的正畸力值应在0.1~1.5N的范围内。对不同的实验动物适宜的正畸力值大小不一,国内外对兔正畸实验的文献报导中正畸力值大小从25~150 g大小不等[1,2,8]。本实验建立的是以兔两下颌切牙为支抗双侧加力牵引第一磨牙向近中的动物模型,双侧加力的力值均以正畸测力计测得为60 g,隔天加力1次,同时切牙和第一磨牙颈部均预先磨切了小沟,加力装置不易滑脱。在长达14 d的实验期间,未发现1例加力装置松脱。因此,可以认为本实验的正畸力值是恒定的,且力值大小适中,既能产生快速有效的牙移动,又不至于产生明显的副作用。
3.3 本实验正畸力作用下牙周组织的系列组织反应以及丹参对其产生的影响
从本实验表2、3和图3的组织学观察结果可以看出,下颌第一磨牙受到持续的60 g大小的近中牵引力后,牙周膜﹑牙槽骨和牙骨质均产生了一系列的组织学反应:(1)牙周膜的变化:下颌第一磨牙远中侧牙周膜受牵张,近中侧牙周膜受压迫,牙周膜产生代谢改变。压力侧牙周膜组织因受挤压而紧缩,牙周间隙变窄,血管受压血流量减少,胶原纤维和基质降解吸收,并分化出现破骨细胞,这些变化见于加力后1~3 d。而与此同时张力侧的牙周膜纤维被拉伸变长,牙周间隙增宽,胶原纤维和基质增生,成纤维细胞增多,成骨细胞分化。(2)牙槽骨的变化:在受力后3~7 d,张力侧牙槽骨的内侧面见成骨细胞活跃,有新骨沉积。压力侧牙槽骨的牙周膜面(即固有牙槽骨)有骨吸收,表面出现蚕食状骨吸收陷窝,陷窝内可见破骨细胞。
从本实验B-R组可以看出,单纯丹参局部注射(在没有正畸力作用下)并不能引起牙齿任何移动,但可使局部牙龈﹑牙周膜和牙槽骨内血管扩张充血;当合并有正畸力作用时(即本实验的A-R组),则可明显加快牙齿移动。说明丹参可能通过增加局部血流量,加快局部牙周膜的反应性变化和局部牙槽骨的改建进程,从而协同正畸力加快正畸牙移动。
3.4 碱性成纤维细胞生长因子与正畸牙槽骨改建的关系
骨改建是一个复杂的生物学过程,在旧骨吸收和新骨形成的同时,伴随着新生血管的形成。近年来关于b FG F在正畸牙槽骨改建中的作用正逐渐引起重视。目前研究发现,b FG F家族至少包括19个成员[10,11]:a FG F(FG F-1)、b FG F(FG F-2)、k G F(FG F-7)、FG F-8、FG F-9、K gf-2(FG F-10)、FG F-11和癌基因产物int-2(FG F-3)、hst-1(FG F-4)、FG F-5、hst-2(FG F-6)等。b FG F存在两类受体:一类是高亲和力受体FG FR s,属于酪氨酸激酶(tyrosin kinase,TK)受体第4型;另一类为低亲和力受体H SPG s,即肝素样受体。b FG F包括酸性和碱性两大类,它们作用于共同受体,可以促进包括成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、神经细胞、成骨细胞、软骨细胞等在内的众多中胚层和神经外胚层细胞发生有丝分裂、增殖和分化,在机体的胚胎形成、血管新生、神经营养和创伤愈合方面起着重要作用[11,12]。从图4的免疫组化染色各组b FG F表达结果可看出,健康兔(C组和B-L组)牙周组织b FG F表达很弱甚至无法表达,单纯丹参注射组(B-R)和单纯正畸加力组(A-L)的b FG F表达增强(P<0.01),二者合并组(A-R)则表达更强(在第1~3天表现明显,P<0.01)。B-R组的峰值为2.1290,在第3天左右;A-L组的峰值2.009,在第7天左右;A-R组的峰值最高,平均达3.1235,也在第3天左右。另外从表5的半定量结果中还可看出,正畸加力时,受力牙压力侧与张力侧的b FG F表达几乎是同步的(B-L组第1~3天时压力侧略高于张力侧),即在表达高峰期之前,随天数增加其表达均逐渐增强,且同时达到高峰;当高峰期过后,则同步下降,到第14天时几乎回到第1天的水平。目前研究证实,b FG F能促进牙周膜细胞的增殖,降低其碱性磷酸酶的活性,动物实验也发现,局部应用外源性b FG F能明显促进牙周膜、牙骨质和牙槽骨的修复重建[10]。张燎等[11]对正畸力作用下兔牙周组织中第1、2周的b FG F的表达进行了检测,结果发现兔正畸牙周组织中b FG F的染色增强,且第2周强于第1周,表达的部位主要在张力侧及压力侧的牙周成纤维细胞、毛细血管内皮细胞、成骨细胞和巨噬细胞中。本实验结果b FG F的阳性表达位于胶原纤维以及成纤维细胞﹑成骨细胞和成牙骨质细胞胞浆中,破骨细胞中无表达。1 d组压力侧先出现阳性表达;3 d组压力侧表达增强,张力侧也有表达;7 d组压力侧和张力侧均达到表达高峰;14 d组表达有所减弱。两个实验均说明,b FG F参与了正畸牙槽骨改建,其机制可能是:b FG F主要表达于成纤维细胞,而牙周组织中最先接受正畸力的细胞也是成纤维细胞,正畸力可能通过一个类似b FG F通道,启动正畸牙移动中软硬组织的改建;早期力的作用使牙周组织中的b FG F更多的结合靶细胞,从而使b FG F染色有一定程度的升高;而在机械力持续作用下,靶细胞被激活和增殖,b FG F蛋白分泌增多,含量增加而使b FG F表达增强;到后期可能是机械力减小或机体已适应,成纤维细胞接受刺激减少而分泌b FG F减少,使b FG F表达减弱。
3.5 丹参增强正畸牙牙周组织b FG F表达与加快正畸牙移动的可能机理
丹参(Salvia M iltiorhiza)系唇形科鼠尾草属植物的根,是中医活血化瘀法的代表性药物。其化学成分主要包括:丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、丹参酮ⅡB、丹参新酮、鼠尾草酚、隐丹参酮等及其异构体等,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等广泛的药理作用,其水溶性成分主要为酚酸类物质,具有抗氧化、抗缺血、改善微循环等作用。丹参与灯盏花同属活血管药物,可能选择地作用于血管壁上的血管内皮细胞,使之分泌一些血管活性因子。本实验的单纯丹参注射组(B-R组)在H E染色组织学观察时见微血管扩张,红细胞数量增多;而在免疫组化结果中可见b FG F在血管内皮细胞中表达明显增强。但因无正畸力作用,并不能活化成骨细胞、破骨细胞和成纤维细胞,b FG F在这些细胞中表达仍弱。同时因为血管内皮细胞被丹参药物直接活化并且自分泌b FG F的时间比成骨细胞被正畸力间接活化并出现b FG F表达的时间短,所以有丹参注射的A-R组和B-R组其b FG F的表达高峰要比单纯正畸加力组(A-L组)出现早(前者的高峰期在第3天左右,而后者要到第7天左右)。
正畸力作用于牙齿时,受力牙的张力侧首先出现牙周膜纤维和牙周膜内血管受牵拉,刺激牙周膜成纤维细胞和血管壁上的血管内皮细胞自分泌和旁分泌b FG F和V EG F。b FG F和V EG F选择性地作用于成纤维细胞、血管内皮细胞和成骨细胞,引起这些细胞活性明显增强,细胞明显增殖和分化,形成新生血管、新生骨组织和新生胶原纤维,此时血管内皮细胞﹑成骨细胞﹑成纤维细胞胞浆内均发现b FG F阳性颗粒,不过血管内皮细胞的表达不如丹参导入组强,所以总的表达在高峰期和高峰期出现之前要弱于A-R和B-R组;且表达高峰较晚,在第7天左右。
正畸受力牙压力侧出现的情况与此类似。不过是首先出现牙周膜纤维和牙周膜内血管受压迫,也刺激血管内皮细胞自分泌和旁分泌b FG F,后者选择性地作用于破骨细胞前体细胞(precursor cells of osteocalasts),使之激活分化产生破骨细胞,导致牙槽骨受压区表面骨吸收陷窝出现并逐渐骨质吸收。因而出现本实验B-L组压力侧H E染色的组织学结果;免疫组化结果该侧b FG F的表达略早于张力侧,但阳性表达的细胞主要是破骨细胞和血管内皮细胞。
而正畸加力合并丹参导入组(B-R组),它结合了A-R组和B-L组的双重作用。因此,其H E染色组织学结果和免疫组化b FG F表达灰度值均比单个的A-R组或单个的B-L组在同一时间段时要强,不过并不是二者的算术累加。
本实验A-R﹑B-L和B-R组的牙周组织中b FG F表达在第3天或第7天的表达高峰期过后逐渐减弱,提示b FG F主要是在正畸牙移动初期起作用,而表达高峰期过后,b FG F所起的作用可能不那么重要,此时可能是其他细胞因子起了主要作用;也可能是正畸移动初期的b FG F诱导了牙周组织中其他细胞因子的分泌,但这些均有待进一步的实验研究。
摘要：目的 探讨丹参对正畸牙移动及其牙周组织中碱性成纤维细胞生长因子表达的影响。方法 45只兔随机分为A(20只)、B(20只)、C(5只)3组,A、B组分别进行相应的处理,C组做空白对照,试验后测量牙移动距离,取组织标本,制成牙周组织切片,分别进行H E染色组织学观察和免疫组织化学检测bFG F的表达。结果 ①A组3﹑7﹑14 d牙齿移动距离左右侧差异有显著性(P<0.05,0.01);随时间延长而增加,右侧更为明显。②A-R组﹑A-L组和B-R组bFG F表达增强,以A-R组最强,A-R组和B-R组表达高峰在第3天,A-L组在第7天。bFG F在成纤维细胞、血管内皮细胞﹑成骨细胞和成牙骨质细胞中均有表达,在破骨细胞中无表达。结论 中药丹参可能通过上调正畸牙齿移动初期牙周组织中bFG F的表达而加速其移动;bFG F在正畸牙齿移动初期牙周组织中表达增强,可能在正畸牙齿移动初期牙周组织的改建中起重要作用。
分泌型表达bFGF 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
兔抗人cTnI抗体、兔抗人bFGF抗体购自北京博奥森生物科技有限公司,即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒(二抗)、DAB显色液购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.1.2 实验对象及分组
收集内蒙古医学院法医学系、内蒙古自治区人民检察院、包头市检察院近5年尸检案例的石蜡包埋组织标本及切片40例。分为对照组(非SCD组)20例及冠心病猝死组(SCD组)20例。SCD组排除了中毒及其他疾病死亡和暴力性死亡的案例,其中男性15例、女性5例,年龄31～71岁,平均年龄46岁。SCD组均有冠状动脉Ⅱ-Ⅳ级狭窄,HE切片经光镜观察可见心肌纤维凝固性坏死、核碎裂、核消失,胞质呈均质红染及不规则颗粒状、间质水肿、少量炎细胞浸润等表现。对照组中,男性12例,女性8例,年龄19～60岁,平均年龄42岁;其中颅脑损伤致死10例,腹部损伤4例,缢死4例,溺死2例;尸检及HE染色排除心肌炎、心肌病及冠状动脉病变。
1.2 方法
1.2.1 实验方法
免疫组织化学染色法(MaxVision二步法):石蜡切片脱蜡,水化,抗原修复,阻断内源性过氧化物酶的活性,加一抗(工作液浓度均为1∶300,阴性对照加PBS液代替一抗),4℃冰箱过夜,加二抗,DAB显色,苏木素复染核,经过梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
1.2.2 图像分析及统计学分析
应用OlympusBX 41显微镜在10×20倍数下,随机取5个视野,利用Image-ProPlus 6.0图像分析软件,测量阳性反应物累积光密度反映选定区域的蛋白表达总量应用SPSS11.5软件进行数据统计分析。
2 结果
2.1 cTnI免疫组化染色
对照组心肌低倍镜下见心肌纤维胞浆内cTnI棕黄色强阳性染色,均匀分布;高倍镜下阳性着色呈横纹样,染色清晰。SCD组在低倍镜下见缺血区小灶样、小片状、条带状的cTnI缺失,有不完全性缺染;高倍镜下可见缺染心肌呈均质状,有的心肌细胞内则见阳性着色弥散向细胞膜周边聚集,而其余心肌细胞部分阳性着色仍呈横纹样改变。见图1、图2、图3、图4。
呈强阳性染色、横纹状、分布均匀
椭圆形内示染色缺失明显
椭圆形内示部分细胞呈弱阳性染色
↑示棕黄色阳性颗粒向包膜周边聚集
图像分析发现,在cTnI免疫组化染色中,对照组心肌细胞阳性反应物IOD值明显高于SCD组心肌细胞阳性反应物IOD值,两组比较差异有统计学意义(P<0.01),见表1。
*与对照组比较P<0.01
2.2 bFGF免疫组化染色
对照组20例中仅3例见心肌细胞胞浆和血管内皮细胞胞浆内呈散在土黄色、弱阳性染色,其余均为阴性结果。SCD组中心肌细胞核、细胞浆以及血管内皮细胞核、平滑肌细胞核、细胞浆均可见棕黄色、强阳性染色颗粒,尤以心肌梗死灶周围残存的心肌细胞为明显,见图5、图6。
阴性(非特异性着色)
↑示血管内皮细胞核、血管平滑肌及心肌细胞核、浆内呈棕黄色颗粒
图像分析发现,在bFGF免疫组化染色中,对照组阳性反应物质IOD值明显低于冠心病猝死组,两组数据比较差异有统计学意义(P<0.01),见表1。
3 讨论
3.1 SCD及其在法医学中的重要地位
在法医检案实践中,常会遇到猝死案例。由于猝死的意外性、急骤性、突然性,容易引起法律纠纷。而在各种猝死的病因中,冠心病猝死(Suddencoronarydeath,SCD)是最常见的原因。Kuller报道猝死病因中冠心病占61%。SCD多发生在发病后1～2h内,常规病理学检验多见心肌细胞肥大、嗜酸性变等改变,缺乏典型的形态学依据,这给冠心病猝死的诊断和鉴定增加了难度。免疫组织化学技术以其高度的特异性和敏感性,将形态、机能和代谢三者密切结合,并且快捷、简便、实用、操作方法统一,成为近年来研究冠心病猝死的有效方法。目前,如何探索一种或几种对诊断和鉴定SCD具有特异性、敏感性、稳定性的免疫组织化学指标仍然是法医病理学的一个热点和难点。
3.2 cTnI在SCD的诊断意义
肌钙蛋白I(TnI)在心肌和骨骼肌中均存在,但cTnI在N末端有31个额外的氨基酸残基[1],使得cTnI成为心肌特异性抗原。cTnI是肌钙蛋白抑制亚基,即肌钙蛋白-原肌凝蛋白调节复合物中的抑制蛋白,通常结合在心肌纤维中,当心肌细胞受到损伤时cTnI释放入血。在临床中,测定血cTnI是诊断急性心肌梗死的金标准[2]。贾建长等[3]通过动物实验及人体冠心病心肌组织cTnI免疫组化方法研究发现,cTnI对早期心肌梗死的诊断具有稳定性及特异性等特点。
在cTnI免疫组化染色中,梗死区心肌组织可见不规则分布的点状、灶状、片状、条带状染色缺失区,部分心肌细胞cTnI呈弱阳性表达,亦可见棕黄染色颗粒向心肌细胞胞膜边缘聚集的情况。考虑在心肌细胞受损后cTnI由横纹脱落进入细胞浆,随着损伤程度加重,细胞膜通透性增加,使cTnI入血,所以出现染色不规则、向细胞膜周边聚集和染色缺失等表现。因此,心肌组织cTnI免疫组织化学染色法诊断心肌梗死的结果是确切的,稳定的。
3.3 bFGF对SCD的诊断意义
人bFGF基因位于4q27。bFGF由146个氨基酸组成的阳离子生长因子,是成纤维细胞生长因子家族中的一员,广泛存在于人体各种正常组织器官中,具有多种生物学功能,主要刺激多种间质来源和神经外胚层来源的细胞分裂增殖和趋化;对内皮细胞和某些上皮细胞也有作用[4],能刺激血管内皮细胞分裂和迁移促进平滑肌细胞增生有很强的促血管形成作用。bFGF存在于胚胎和成年心肌细胞中,心肌细胞合成产生的bFGF可通过自分泌和旁分泌在心脏的形成和发育等过程中发挥一定作用,也参与心肌缺血和梗死后的组织修复等[5]。成年大鼠心肌细胞中含有微量的bFGFmRNA和bFGF蛋白,运用普通方法无法检测,但放免分析可以检测到bFGF的存在[6]。诱导bFGF表达的因素主要是缺血和缺氧,心肌缺血后,缺血区及周围的心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞中bFGF的mRNA含量极度增高。陈建国等[7]运用免疫组织化学染色方法发现急性心肌缺血30min开始在缺血区心肌细胞内即可出现bFGF的阳性表达,并随缺血时间的延长而增强,缺血3h达到高峰并持续一定时间。
本研究将bFGF免疫组化染色应用于人心肌组织中。SCD组在心肌梗死周围呈棕黄色强阳性表达,分布在心肌细胞核及胞浆、血管内皮细胞核、平滑肌细胞核及胞浆中,对照组20例中仅有3例见心肌细胞核及血管内皮细胞核中散在弱阳性表达,其余呈阴性表达。这表明心肌组织bFGF免疫组化染色可以为SCD的诊断提供客观的病理形态学依据,有望成为可疑SCD死后诊断的一种有价值的标志物。
3.4 cTnI、bFGF在法医病理工作中的诊断意义
在实际检案中,冠心病猝死的诊断,需要排除暴力性死亡、中毒及其他疾病性死亡,并结合案情调查、现场勘验、尸体解剖所见和实验室辅助检查来综合进行死因判断。其中,病理组织学检查是最重要的客观指标。cTnI只存在于心肌,是结构蛋白,有调节心肌收缩的功能,且在心肌损伤早期便能通过免疫组化方法测定出其缺失及分布的失规律性,反映了心肌损伤的状况,所以成为诊断冠心病猝死敏感的、特异性指标。bFGF是由心肌细胞及血管内皮细胞合成,参与心肌缺血和梗死后的组织修复过程。cTnI及bFGF的免疫组织化学方法的联合应用,将结构与功能相结合,对SCD的死后诊断具有非常重要的意义。
参考文献
[1]Solaro RJ.Prognostic significance of elevated 306 cardiactroponin I after heart surgery[J].Biol Chem,2008,283:26829-26833.
[2]左鹰,王克英,王英,等.心肌肌钙蛋白I和肌钙蛋白T对急性缺血性心脏病预后相关性分析[J].中国综合临床,2004,20(12):1066-1068.
[3]贾建长,赵子琴,顾云菊.家兔急性心肌梗死CTnI免疫组织化学实验研究[J].法医学杂志,2005,2l(2):104.
[4]Baguma-Nibasheka M,Li AW,Murphy PR.The fibroblastgrowth factor-2 antisense gene inhibits nuclear accumula-tion of FGF-2 and delays cell cycle progression in C6 glio-ma cells[J].Mol Cell Endocrinol,2007,267:127-136.
[5]De VE,Decrock E,De BM,et al.Connexin hemichannelsand gap junction channels are differentially influenced byLipopolysaccharide and basic fibroblast growth factor[J].Mol Biol Cell,2007,18:34-46.
[6]Haworth RS,Cuello F,Herron TJ,et al.The fibroblast growthfactor-2 antisense gene inhibits nuclear accumulation[J].Circ Res,2004,95:1091-1099.
分泌型表达bFGF 篇4
1 材料与方法
1.1 实验材料
雄性Sprague-Dawley大鼠72只, 体重250~300 g, 由福建医科大学实验动物中心提供。兔抗大鼠b FGF多克隆抗体 (Santa Cruz公司) ;免疫组化染色试剂盒及AEC试剂盒 (迈新公司) ;Trizol试剂 (Invitrogen公司) ;PCR试剂盒及逆转录试剂 (MBI Fermentas公司) 。数码显微照相系统 (Nikon公司) ;凝胶成像系统 (思博明科学器材公司) 。
1.2 模型建立及给药
实验大鼠随机分为假手术组、脑缺血模型组、生理盐水组、药物治疗组, 每组再分3 d、7 d、14 d三个亚组, 每个亚组6只。脑缺血模型组、生理盐水组、药物治疗组参考Longa等[2]改良线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型, 即大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉, 仰卧固定, 取颈部正中切口, 分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉, 并在颈内外动脉分叉处结扎颈外动脉, 右侧颈总动脉剪口, 插入尼龙栓线, 插入深度约为 (18.5±0.5) mm, 越过大脑中动脉开口处到达大脑前动脉起始部, 阻断大脑中动脉的所有血液来源。将颈总动脉连同尼龙线一起结扎, 关闭并缝合皮肤切口。假手术组大鼠接受相似手术处理, 但是不插入线栓。术中大鼠用小加热毯保持肛温37℃。模型成功的分级标准参考Longa[2]及Bederson[3]的标准, 手术后神经功能评分为1~3分的大鼠入选本次研究。缺血1 h后再将插线拔除, 让缺血区得到再灌注, 为再灌注开始。药物治疗组于缺血1 h再灌注24 h后予通心络1.0 g/ (kg·d) 、每天分2次灌胃, 连用3 d;生理盐水组予2 m L生理盐水代替通心络胶囊灌胃。
1.3 免疫组化法检测b FGF表达
各组大鼠在各个时间点分别处死取出全脑, 取右侧大脑半球, 取视交叉后6~11 mm的脑组织置入4%多聚甲醛溶液中后固定, 切片经脱腊至水, 3%H2O2孵育10 min, 微波修复10 min, 自然冷却至室温。正常血清封闭20 min, 甩去多余液体。滴加兔抗大鼠b FGF的一抗 (工作浓度约为1∶200) , 4℃过夜。滴加聚合物增强剂, 室温孵育20 min。滴加酶标山羊抗鼠/兔Ig G聚合物, 室温孵育30 min。AEC室温显色, 自来水冲洗, 苏木素复染, 水性封片剂封片。阴性对照用PBS代替一抗。各步骤间用0.01 mol/L PBS (p H 7.2) 冲洗3次, 每次5 min。阳性细胞计数:阳性反应物质主要分布在细胞浆, 显色为红褐色。在400倍光学显微镜下分别随机选取5个视野, 计数反应阳性的细胞数。
1.4 RT-PCR法检测b FGF的表达
取大鼠脑组织提取总RNA, RT-PCR步骤严格按照试剂盒说明书操作。b FGF上游引物:5'-atcacttcgcttcccgcact-3';下游引物:5'-tccaggcgttcaaagaagaaac-3', 扩增产物为304 bp。β-actin上游引物:5'-attgtaaccaactgggacg-3', 下游引物:5'-tctccagggaggaagagg-3', 扩增产物为490 bp。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳, 应用凝胶成像分析系统半定量分析电泳条带的吸光度, 结果以目的基因与β-actin吸光度的比值计算mRNA的相对含量。
1.5 统计学处理
实验数据用±s表示, 采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析, 以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 实验动物b FGF mRNA的表达水平
假手术组b FGF mRNA表达水平较低, 脑缺血模型组、生理盐水组于造模成功后3 d即达到高峰, 随后下降, 14 d降至正常水平。药物治疗组b FGF mRNA的表达在各个时间点均明显高于脑缺血模型组、生理盐水组, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 详见表1、图1。
*与假手术组相比, P<0.01;#与脑缺血模型组和生理盐水组相比, P<0.01
M:100 bp ladder;1:假手术组;2:脑缺血模型组;3:生理盐水组;4:药物治疗组
2.2 实验动物b FGF蛋白的表达水平
b FGF蛋白表达主要集中在损伤皮层及缺血周边。假手术组可见少量b FGF阳性细胞表达。脑缺血模型组、生理盐水组b FGF表达的阳性细胞于造模后3 d升高, 7 d后达到高峰, 14 d后下降。药物治疗组在各个时间点b FGF蛋白表达均明显高于脑缺血模型组、生理盐水组, 差异具有统计学意义 (P<0.01) , 详见表2、图2。
*与假手术组相比, P<0.01;#与脑缺血模型组和生理盐水组相比, P<0.01
A、B、C分别为假手术组3 d、7 d、14 d;D、E、F分别为脑缺血模型组3 d、7 d、14 d;G、H、I分别为生理盐水组3 d、7 d、14 d;J、K、L分别为药物治疗组3 d、7 d、14 d
3 讨论
脑缺血再灌注损伤涉及多重病理生理机制, 它与中风危险因素、缺血部位及范围、病程等密切相关。因此, 在恢复血流的同时, 采取针对不同损伤机制的神经保护治疗, 可减轻再灌注损伤, 其中神经生长因子在脑缺血再灌注损伤病理过程中的作用日益受到重视。
b FGF是近年研究较多的一种神经保护剂, 是一种多肽类的神经生长因子。b FGF属于成纤维细胞因子家族成员, 是由154个氨基酸组成的18 k D的阴离子多肽类生长因子。其受体位于细胞膜表面, 至少存在4种受体亚型, 分布于神经元、胶质细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞, 其中尤以神经元中含量最为丰富[4]。b FGF与受体结合, 可引起受体二聚化, 产生信号传导和细胞效应[5,6]。离体实验证实b FGF能促进神经元存活和突起生长[7]。在原代培养的大脑星形胶质细胞损伤模型和颅脑损伤模型, 内源性b FGF表达上调是神经损伤后的早期反应, 损伤越重, 反应越早。应用b FGF能促进培养的胚胎中脑细胞增生, 减少海马神经元因轴突损伤引起的变性坏死[8]。在体内, b FGF具有保护神经元免受机械性损伤并能阻止缺血后神经元死亡的作用[9]。动物实验发现, 缺血后数小时内给予b FGF, 可以显著减小脑梗死体积, 缺血后24 h给药虽不能降低梗死体积, 却仍能促进神经功能的恢复[10]。b FGF在正常成人和动物组织中仅有微量的表达, 但在病理条件下如脑缺血时无论mRNA水平还是在蛋白水平均有过量的表达。本实验通过RT-PCR和免疫组织化学法证实, 在脑缺血再灌注损伤后即可见b FGF明显升高。在表达b FGF mRNA和b FGF蛋白上, 这种迅速的变化可能是对缺血损伤的一种反应, 以减少神经元死亡。有研究表明, 在缺血性脑梗死模型中, 梗死早期 (1d) , 便可观察b FGF增加。随后的3~5 d便出现明显的细胞增殖, 并可产生b FGF, 此时, 围绕局部缺血皮质的组织中, 内源性b FGF的水平增加了2~3倍, 3周后仍维持较高水平。