整合素β3（精选6篇）
整合素β3 篇1
O PN可由子宫内膜产生, 并且在整个生殖周期中的表达具有波动性。目前研究表明[1], 孕4~7 d时兔子宫O PN表达明显增多, 与循环中孕激素 (P) 的升高和胚泡开始着床的时间一致。O PN在孕6~7.5 d的子宫内膜腺上皮显著表达, 但滋养细胞无表达。而非孕子宫的内膜无O PN m R N A或蛋白表达。进一步研究表明[2], O PN m R N A及其蛋白在人子宫内膜增殖期表达低, 在分泌中期至晚期的内膜上皮细胞、内膜白细胞和子宫分泌物中表达明显升高。O PN受体整合素β3 m R N A和蛋白在整个月经周期的基质细胞都有表达, 在分泌中期至晚期的内膜上皮细胞显著表达, 从而认为O PN在月经期的内膜上皮细胞和分离的基质细胞上的高表达可能是免疫源性的[3]。
O PN是子宫-胎盘微环境的重要组成部分, 可能的作用如下: (1) 整个妊娠期子宫-胎盘表面黏附和信号转导的必需组成之一; (2) 由子宫基质产生促成子宫基质产生促成子宫内膜发生与孕体侵袭有关的蜕膜样转变; (3) 子宫和胎盘免疫细胞的产物, 可调节它们的活动和细胞因子的生成[4,11]。
新近发现, 胚胎上的整合素αvβ3通过R G D位点与子宫内膜上已被M M Ps水解的骨桥蛋白结合, 两者相互协调, 相互作用, 共同介导胚胎的植入[5]。另外, 骨桥蛋白与整合素β2同时表达于滋养细胞上, 在胚胎着床时, 它们与内膜上的整合素β3和骨桥蛋白起到相互补充的作用[6]。为进一步探讨骨桥蛋白 (O PN) 和整合素 (αvβ3) 在胚泡着床的机制, 我们在已建立的小鼠受孕模型基础上, 采用抗体中和技术, 将抗骨桥蛋白 (O PN) 抗体、抗整合素 (αvβ3) 抗体注射至妊娠小鼠子宫, 中和骨桥蛋白 (O PN) 和整合素 (αvβ3) , 探讨其对小鼠胚泡着床的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物
成年昆明小鼠20只, 4~6周年, 体重30 g, 雌、雄各半, 由中南大学实验动物中心提供。颗粒饲料喂养, 随意饮水, 室温22℃。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠PM SG和H C G处理和抗体注射
取成年昆明雌鼠10只, 体重约30 g, 腹腔注射PM SG 10u, 48 h后注射10 u H CG, 随后雌:雄小鼠1∶1合笼, 次日检查阴栓。发现阴栓计为1 d。将妊娠小鼠随机分成4个组:O PN抗体组、整合素β3组、生理盐水组, 正常妊娠对照组。于妊娠4 d, 在全身麻醉下实行子宫双侧手术, 分离小鼠子宫和输卵管, 从小鼠输卵管与子宫交界处方向分别注射抗骨桥蛋白 (O PN) 单克隆抗体、抗整合素 (β3) 单克隆抗体或生理盐水, 每只5μg。空白对照组未做任何处理。于手术后的8 d, 将用颈椎脱臼法处死, 迅速解剖, 检查子宫, 记录所有孕鼠数及每只孕鼠的胚泡数。
1.2.2 观察子宫内膜的形态结构
取3只小鼠, 在着床胚泡间取一段子宫标本。一部分用4%的福尔马林固定, 石蜡包埋切片, H E染色, 制组组织片, 光镜观察子宫内膜膜上皮细胞、间质的变化。
1.2.3 观察卵巢的形态结构
取3只小鼠, 将卵巢标准本4%福尔马林固定, 石蜡包埋, H E染色, 制作组织切片, 光镜观察卵巢黄体的变化。
1.2.4 反向免疫组化检测A b-O PN、A b-β3与子宫内膜O PN、β3结合
已脱蜡用于免疫组化检测的组织切片, 加数滴过氧化酶阻断剂, 完全覆盖组织点, 室温下孵育10 m in, PBS液冲洗3次, 每次3m in, 加数滴非免疫性动物血清, 室温下孵育10m in, 甩干, 依次加抗兔抗体 (1∶500) , 完全覆盖组织点, PBS液代替一抗作为阴性对照, PBS液冲洗3次, 每次3 m in, 依次加数滴生物素标记的驴抗兔二抗 (1∶1 000) 及数滴链亲和素一过氧化物酶, 完全覆盖组织点, 室温下孵育10 m in, PBS液冲洗3次, 每次3 m in, 加数滴新鲜配制的D A B液, 完全覆盖组织点, 镜下观察染色, 终止反应, 自来水冲洗, 苏木素浅染, 冲洗返蓝, 脱水透明封片。
1.3 统计学处理
全部统计学分析均采用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量资料全部用均数±标准差 (x±s) 表示。计量资料的比较采用t检验。临床病理资料等计数资料分析采用χ2检验或Fisher精确概率法。免疫组化结果与临床病理资料的相关性分析采用Spearm an’s correlation coefficient分析。用K aplan-M eier法进行生存分析并绘制生存曲线。生存时间采用均数±标准差 (x±s) 表示。采用Log-rank检验比较生存率的差别。以α=0.05为检验水准 (双侧) , P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 Ab-OPN、Ab-β3对小鼠受孕胚泡着床数的影响
A b-O N P组10只小鼠有6只受孕, 受孕率为60%, 胚泡着床数在1~3间, 平均胚泡着床数为1.6±1.19, A b-β3组10只小鼠有7只受孕, 受孕率为70%, 胚泡着床数在1~3间, 平均胚泡着床数为1.7±1.28, 均低于生理盐水组 (10±1.63) 和正常对照组 (10.5±1.58) , P值均<0.05。表明注射A b-O PN和A b-β3严重影响小鼠卵泡的着床, O PN和整合素β3在小鼠受孕率和胚泡着床起重要作用。
2.2 受孕小鼠子宫内膜形态结构
子宫内膜形态结构表现为子宫内膜脱膜化。光镜下可见:间质脱膜化, 可见大片脱膜组织, 脱膜细胞核仁明显, 核分裂像多见。腺上皮细胞微绒毛密集, 胞质内含丰富的粗面内质网, 腺腔内含有丰富的分泌颗粒;间质疏松, 有散在的不规则排列的胶原纤维, 脱膜细胞散在排列, 形态不规则, 核清洗, 核仁明显, 核大, 染色疏松、均匀, 内质网扩张, 血管扩张, 充血。
2.3 反向免疫组化检测Ab-OPN、Ab-β3与子宫内膜OPN、β3结合
A b-O PN组和A b-β3组子宫组织切片免疫组化染色显示, 子宫内膜细胞上有明显棕色颗粒沉淀物, 而注射生理盐水组和正常对照组未见棕色颗粒沉淀物。这些棕色颗粒沉淀物可能就是实验注射A b-O PN、A b-β3, 这些抗体已于子宫内膜细胞上的骨桥蛋白O PN和整合素β3结合。提示通过手术注射入小鼠子宫的A b-O PN、A b-β3有效地干预了小鼠胚泡的着床。
3 讨论
妊娠的建立需要子宫内膜与胚胎细胞的相互识别, 在胚胎的着床过程中, 子宫内膜腺体分泌特定的多肽, 有助于建立和维持妊娠, 其中包括O PN和αvβ3。人类月经周期第19天内膜上皮细胞开始表达整合素, 与胚泡着床期相对应, 同时O PN由内膜腺上皮分泌到宫腔[13], 滋养层和种植前的胚泡上皮表面都表达αvβ3和O PN。αvβ3识别并结合R G D序列 (O PN及其他配体) , 参与细胞间的相互作用[12]。O PN有2个R G D依赖的结合位点, 故认为O PN是内膜与滋养层间的桥接分子[6]。容受性子宫内膜的一个形态特征就是胞饮突 (pinopode) 的出现。胞饮突的出现时间与“植入窗期”出现的时间相吻合。而且αvβ3特异的出现于胞饮突[7]。胞饮突作为子宫内膜容受性的形态学标志, 特异性表达αvβ3支持αvβ3作为子宫内膜容受性分子一说。
为进一步证实O PN和αvβ3在受孕过程的重要性, 明确其对受孕的影响。本课题在前期建立小鼠受孕模型以及明确O PN和αvβ3在妊娠过程表达规律, 采用手术的方式, 将O PN和αvβ3单克隆课题注入小鼠子宫角, 中和小鼠子宫腔内O PN和αvβ3, 观察小鼠受孕的情况。由于没有现成的抗αvβ3抗体, 实验人员采用了抗β3抗体来替代αvβ3抗体。结果发明, 注射O PN抗体和β3抗体组小鼠胚泡着床数都低于对照组。在此基础上, 进一步明确注射入子宫的O PN抗体和β3抗体是否与宫腔内的O PN和β3结合, 实验人员采用抗O PN抗体和β3抗体的抗抗体进行免疫组化验证。免疫组化的结果表明, O PN抗体和β3抗体与O PN和β3有效地结合。这提示O PN抗体和β3抗体与宫腔内的O PN和β3结合, 从而导致小鼠胚泡的有效着床。李英等[15]体外研究整合素α5对小鼠胚泡着床的影响, 发现A b-α5在体外有效阻断小鼠胚泡的着床。梁虹等[16]将A b-α5直接注射到小鼠子宫, 发现A b-α5在体内中和α5有效阻断小鼠胚泡的着床。这表明O PN和αvβ3在受孕过程中起重要作用。
αvβ3整合素识别含三种氨基酸序列 (R G D) 的细胞外基质配体, 该序列在滋养细胞附着和生长中起作用[8]。研究发现, 大鼠阻断整合素或 (和) 配体结合可减少着床, 可能的作用包括胚胎携带信号通过纤粘连蛋白 (FN) 启动或刺激胚胎或胎盘滋养细胞的侵袭性显型[9]。在多各细胞类型中, O PN通过结合αvβ3调节细胞黏附[9,10]。人子宫内膜和滋养细胞类型中, O PN可能通过与多种整合素结合调节细胞粘附。而细胞的增殖只有通过O PN与αvβ3的结合[9,10]。
有研究表明, 骨桥蛋白和整合素β3共表达于狒狒、小鼠、免等的围种植窗内膜腺上皮、蜕膜化的基质细胞以及下在入侵内膜的胚泡细胞滋养层中[4], 骨桥蛋白是内膜上皮细胞中黏附分子的作用底物, 这种上皮细胞中表达整合素β3, 它以一种依赖R G D序列的作用方式怀骨桥蛋白结合, 将细胞外部信息传递到细胞内部, 引起细胞内部结构变化, 同时还可以激发细胞内部第二信使钙离子的升高, 激活蛋白酶和磷酸酶等, 启动细胞外信号传导, 将信息传递到细胞核以调控基因表达, 从而影响细胞的增殖、分化及细胞行为[14]。此外, 胚泡表面的整合素β3也可通过认别R G D结构与内膜的骨桥蛋白特异性结合。两者的协调作用在胚泡着床过程中扮演了重要的角色[4]。
胚泡表面和子宫内膜表面的整合素作为O PN有受体, 与O PN结合, 从而使胚泡向子宫膜黏附。在“植入窗期”, 子宫内膜表面整合素因为得到甾体激素和一系列细胞因子、生长因子的调控, 表达增加, 亲和力提高, 使子宫内膜达到最大容受状态。同时, 胚泡滋养层细胞表面同样表达整合素分子。两者都与O PN结合。这样就形成了一个识别复合物:O PN处于两整合素分子之间, 介导了胚泡与子宫内膜的交互对话, 要达到这种条件, 子宫内膜处于最大容受性状态与胚泡发育的同步是成功妊娠的必要条件。
参考文献
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整合素β3 篇2
1 材料和方法
1.1 主要试剂及试验动物
p GEX-6p-1原核表达载体、E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)感受态细胞,均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院基础兽医学实验室提供;DNA凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒,购自北京索莱宝生物技术有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、Bam HⅠ和XhoⅠ限制性内切酶,购自Fermentas公司;IPTG,Biosharp公司产品;HRP标记羊抗鼠Ig G,购自北京中杉金桥生物技术有限公司;IRDye700DX羊抗鼠Ig G,购自Li-COR公司;ECL发光液试剂,购自Biotopped公司;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,Sigma-Aldrich公司产品;8周龄的Balb/c雌性小鼠,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
1.2 基因的合成及引物的设计
参考Gen Bank中猪整合素β3核苷酸序列(GenBank NM_214002),利用CBS网站(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在线分析该氨基酸序列的疏水性,分析蛋白的跨膜区,截取胞外区氨基酸部分,再利用DNAStar软件中的Protean工具分析氨基酸的主要抗原区,并优化针对大肠杆菌具有偏嗜性的密码子,分别在5'和3'末端加入Bam HⅠ和XhoⅠ两种酶切位点,人工合成了猪整合素β3核苷酸序列。将合成的基因连接至p GH载体上,该重组质粒p GH-β3由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。然后利用Primer Premier 5.0软件设计1对引物,序列为:β3-F(上游引物)5'-ATCGGATCCATGCGTGGTGT-GAGCTCCTGC-3',β3-R(下游引物)5'-GGACTCGAGTTAGTCAGGGCCCTTCGGACA-3',用于猪整合素β3基因载体构建的鉴定。
1.3 猪整合素β3基因的原核表达及纯化
用重组质粒p GH-β3和p GEX-6p-1载体分别进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切后产物利用胶回收试剂盒进行胶回收,然后将纯化后的猪整合素β3基因和p GEX-6p-1载体进行连接,转化E.coli DH5α感受态细胞。随机挑取10个单菌落,利用β3-F和β3-R引物进行菌落PCR鉴定。将筛选出的阳性菌提取质粒,然后转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,挑取单菌落于含有100μg/m L Amp+的LB液体培养基中培养,当OD600值到0.6时,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h,然后利用SDS-PAGE电泳鉴定猪整合素β3基因重组蛋白的表达。表达猪整合素β3基因的菌体用PBS洗5次后,进行超声破碎,取菌体的上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳鉴定,然后将含有目的蛋白的凝胶切下,用电透析的方法将蛋白洗脱下来,100 V电离1 h,获得纯化的猪整合素β3重组蛋白。
1.4 猪整合素β3重组蛋白的鉴定
将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳,转印至硝酸纤维膜(NC膜)上。用5%的脱脂乳封闭,37℃封闭2 h,用PBS洗3次,每次10 min。以GST单克隆抗体(m Ab)为一抗(1∶3 000),37℃孵育2 h,洗涤同上。以山羊抗鼠HRP-Ig G为二抗(1∶2 000),37℃孵育1 h,洗涤同上。将NC膜置于Super ECL Plus超敏发光液中,用扫描成像系统进行扫描。
1.5 猪整合素β3重组蛋白抗体的制备
将纯化的猪整合素β3重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后,按50μg/只的剂量于皮下、腹腔多点注射,对Balb/c小白鼠进行免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂,二免和三免用弗氏不完全佐剂,对照组为健康Balb/c小白鼠。每次免疫间隔14 d,三免3 d后对小鼠进行采血,分离血清,于-20℃保存。
1.6 猪整合素β3重组蛋白抗体效价的ELISA检测
用终浓度为1μg/m L的纯化蛋白包被96孔板(100μL/孔),置于4℃过夜。次日弃去液体,用PBS洗3次,每次5 min。拍尽孔中液体后每孔加5%的脱脂乳150μL,37℃封闭2 h,洗涤同上。以待测血清为一抗,并利用方阵法确定血清稀释度(每孔100μL,37℃孵育1 h,洗涤同上)。以山羊抗鼠HRP-Ig G(1∶2 000)为二抗,37℃孵育1 h,洗涤同上。每孔加入100μL TMB底物显色液,避光作用10 min,每孔再加入2 mol/L硫酸终止液100μL终止其反应,用酶标仪读取OD450值。
1.7 猪整合素β3重组蛋白抗体的Western-blot鉴定
利用含有天然整合素β3蛋白的猪小肠黏膜上皮细胞(IEC细胞)、猪睾丸细胞(ST细胞)、猪肾细胞(PK15细胞)及仔猪小肠组织,分别利用裂解液获取总蛋白,样品处理后进行SDS-PAGE电泳,转印至NC膜上。用5%的脱脂乳室温封闭2 h,用PBS洗3次,每次10 min。以制备的猪整合素β3多克隆抗体作为一抗(1∶200),室温孵育2 h,洗涤同上。以IRDye700DX羊抗鼠Ig G为二抗(1∶5 000),室温孵育1 h,洗涤同上。在荧光扫描成像系统上进行扫膜分析,进一步验证制备的猪整合素β3多克隆抗体是否与天然整合素β3蛋白具有反应原性。
2 结果
2.1 猪整合素β3跨膜区与抗原性分析结果
利用CBS网站(www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM-2.0/)对猪整合素β3的跨膜区进行预测,结果表明,第1~6位和738~784位氨基酸为胞内区,第7~29位和715~737位氨基酸为跨膜区,第30~714位氨基酸为胞外区(见275页彩图1)。进一步利用DNAStar软件中的Protean工具对猪整合素β3胞外区(第30~714位氨基酸)进行抗原性分析,结果表明,猪整合素β3胞外区(第30~714位氨基酸)具有较好的抗原性(见276页彩图2)。
2.2 猪整合素β3主要抗原区的原核表达结果
猪整合素β3主要抗原区重组质粒p GH-β3用Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切,获得了2 907 bp和2 079 bp 2个片段,与预期大小相符(见图3)。重组质粒p GEX-6p-1-β3以IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在100 ku左右可见特异性的表达条带,与预期条带大小相符(见图4)。
M.DL-10 000 Marker;1.合成的猪整合素β3质粒DNA双酶切;2.合成的猪整合素β3质粒DNA PCR扩增。
M.蛋白Marker;1.诱导后p GEX-6p-1对照;2.诱导后p GEX-6p-1-β3菌体裂解物;3.超声后p GEX-6p-1-β3沉淀物;4.纯化的目的蛋白。
2.3 猪整合素β3主要抗原区重组蛋白纯化结果
细菌经超声破碎后,经SDS-PAGE电泳,结果目的蛋白存在于沉淀内,表明蛋白以包涵体形式存在。将含有目的蛋白条带的胶条切下进行纯化,获得了纯化的猪整合素β3重组蛋白,见图4。
2.4 猪整合素β3重组蛋白的Western-blot分析结果
纯化后的重组蛋白经Western-blot分析,在100 ku左右有1条特异性条带,与预期的102 ku大小一致(见图5),表明猪整合素β3主要抗原区与p GEX-6p-1载体的GST标签正确融合。
2.5 猪整合素β3抗体鉴定结果
ELISA检测结果表明,猪整合素β3多克隆抗体效价为1∶12 800。Western-blot检测结果表明,制备的猪整合素β3多克隆抗体能够识别IEC细胞、ST细胞、PK15细胞和仔猪小肠组织中的天然整合素蛋白(见图6)。
M.蛋白Marker;1.纯化蛋白;2.GST标签对照。
M.蛋白Marker;1.PK15细胞;2.仔猪小肠组织;3.ST细胞;4.IEC细胞。
3 讨论
病毒表面囊膜蛋白与宿主细胞表面受体蛋白的相互作用是病毒能否侵入宿主细胞以及复制的关键所在。随着对病毒以及病毒受体研究的不断深入,目前认为病毒受体是一组位于细胞表面的蛋白质分子复合物[11]。大量研究显示,整合素在众多病毒感染中发挥作用,具有成为共性受体蛋白的趋势,在病毒学研究领域倍受关注。前期研究揭示,在Vero E6细胞中鉴定的627个膜蛋白中17种蛋白与病毒受体相关,其中包括整合素蛋白[12]。D.Sun等[13]报道,猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero E6细胞后,整合素β3蛋白表达水平上调。进一步分析表明,PEDV的纤突蛋白S中含有整合素配体识别序列DGE、KGE、RLD和LDV,具有与整合素相互作用的氨基酸基序[14]。猪整合素β3在PEDV感染过程中可能发挥着潜在作用。
整合素β3 篇3
1 整合素的结构及生理作用
整合素是一个细胞黏附分子膜受体家族。每个成员的分子都由α和β两条靠共价键连接形成的异源双体跨膜糖蛋白。至今已经证明存在8种β亚基、18种α亚基及其通过非共价连接形成的24组成员的整合素家族。α亚基与β亚基的每一种组合是限定性的, 在多种情况下, 一种β亚基可以和不同的α亚基组合构成整合素亚家族, 具有一定的特性和功能[5]。
整合素介导细胞与细胞、细胞和细胞外基质间的相互作用, 发挥其黏附和信号转导两项基本功能, 参与胚胎发育、免疫应答、创伤修复、恶性肿瘤转移等生理和病理过程。正常月经及妊娠早期子宫内膜的整合素表达具有时间相关性和空间特异性。其异常表达将导致子宫内膜容受性的缺陷, 从而引起不孕[6]。
一般认为, 排卵后的5~7天是子宫内膜容许胚胎种植的一个短暂时期, 被称为着床窗口期 (the implantation window) , 这一时期的子宫内膜结构和功能均发生了重要改变。过程又可分为3个连续部分, 即黏附、侵入和胎盘形成, 每一部分都有相应的黏附分子、细胞因子和相关酶类发挥作用[2]。现代研究认为, 有3种整合素 (α1β1、αVβ3、α4β1) 共同表达在胚胎着床窗口期, 这些整合素的表达被认为与子宫对胚泡的接受状态有关, 有助于子宫内膜由非黏附状态到黏附状态的改变, 是子宫内膜容受性的标志分子。现在的研究认为, 整合素主要作用于胚泡与子宫内膜的黏附过程[7]。本文仅以β3为主要研究对象。
亚单位β3主要表达于黄体中期即正常月经周期第19天以后的子宫内膜及早孕蜕膜中, 与宫内膜的植入窗开放同步, 与胚胎黏附时问相一致[8], 从而提示整合素β3在着床过程中的子宫内膜容受性方面起重要表达作用。此外胚泡表面的整合素β3可通过认别RGD结构与子宫内膜的细胞外基质发生特异性结合[9], 进而使细胞骨架固定于浆膜, 将细胞外信息传到细胞内, 进而引起细胞内部结构的变化, 同时还可激发细胞内第二信使钙离子升高, 激活蛋白酶和磷酸酶等, 启动细胞外信号传导, 将信息传递到细胞核, 调控相应基因表达, 从而影响细胞增殖、分化。
2 整合素β3与PCOS子宫内膜容受性的关系
子宫内膜由多种细胞、细胞外基质成分构成, 在月经周期、胚胎植入、妊娠、分娩等生理过程中经历了一系列重大的变化, 这需要特殊的细胞-细胞、细胞-细胞外基质问的相互作用[10]。在卵泡发育、成熟、排卵、黄体形成过程中, 子宫内膜在雌孕激素作用下发生了周期性变化, 黄体中期被认为是最适合胚胎着床的窗口期[9]。整合素β3有助于子宫内膜由非黏附状态到黏附状态的转变, 为胚泡黏附及植人作好准备, 是“植入窗口”期子宫内膜接受性的标记分子[11]。
吴丽萍等[12]通过研究认为, 子宫内膜上皮细胞MMP-9与整合素αV、β3的表达均呈现正相关, 说明在胚泡植入过程中, MMP-9与整合素αV、β3高度协调, 从而保证了胚泡植入的准确性。程琰等[13]以整合素αV、β3的表达作为评价子宫内膜容受性的指标, 得出14-3-3τ蛋白并不是惟一调节容受性的因子, 容受性增高可能是与滋养细胞分泌的其他细胞, 如雌、孕激素、人绒毛膜促性腺激素因子共同作用的结果。王颖等[14]通过研究发现, 正常妇女子宫内膜整合素αV、β3表达在“着床窗口期”呈现强阳性;氯米芬 (CC) 及绝经期促性腺激素 (hMG) 抑制αV、β3的表达, 使其表达呈弱阳性;促性腺激素释放激素激动剂对整合素αV、β3的表达无影响, 由此得出结论, 使用CC、CC/hMG促排卵时黄体中期子宫内膜容受性下降, 整合素αV、β3表达下降或缺失。刘润侠等[15]认为, 子宫内膜整合素的表达主要受雌、孕激素的调节, 孕激素诱导子宫内膜表达整合素, 而雌激素则抑制整合素的表达。谭晓珊等[16]通过研究发现, 整合素β3表达下降可能是导致薄型子宫内膜血管生成障碍的一个原因。促进子宫内膜整合素β3的表达或血管生成, 有可能成为一种改善薄型子宫内膜容受性, 提高胚胎种植率的治疗方法。魏丽坤等[3]认为, 整合素的异常表达与子宫内膜容受性缺陷有关。在临床上, 通过监测αV、β3对IVF-ET移植时间有重要指导意义。Thomas等[17]通过对66名妇女接受IVF-ET前、后子宫内膜行整合索αV、β3检测, 发现IVF-ET术后的妊娠期妇女子宫内膜整合素αV、β3表达量显着高于非妊娠组, 提示种植窗期子宫内膜整合素αV、β3表达减少所导致的子宫内膜容受性低下, 是IVF-ET失败的原因之一。
3 结语
总之, 整合素β3在PCOS中的作用途径尚未完全清楚。整合素对子宫内膜容受性有很大影响, β3可作为子宫内膜容受性的标志分子[18], 在不断将研究细微化的同时, 子宫内膜和胚泡植入的整体性研究仍是一个热点[19], 子宫内膜接受性异常是导致IVF-ET失败的重要因素之一, 测定β3在子宫内膜的表达可作为预测妊娠成功与否的指标之一[20]。随着祖国医学的发展, 在中医方面加强对多囊卵巢综合征和子宫内膜容受性标记物整合素β3的关系进行探讨和研究, 是值得继续研究的方向。
摘要：多囊卵巢综合征 (PCOS) 是青春期及育龄妇女最常见的妇科内分泌病之一。近年研究发现, PCOS患者体内复杂的内分泌和代谢环境影响了子宫内膜容受性, 从而导致生育力减弱和不良妊娠结局。本文探讨了整合素β3与PCOS发病之间的关系, 研究表明, 它影响子宫内膜容受性, 进而影响孕卵着床。
整合素α4β7在肠道表达的意义 篇4
1 材料与方法
1.1 主要试剂和材料
脱氧核糖核酸酶Ⅰ (美国Sigma公司) ;中性蛋白酶 (北京索莱宝科技有限公司) ;胶原蛋白水解酶Ⅳ (美国Sigma公司) ;Pecoll分层液 (美国GE公司) ;PBS缓冲液 (北京中杉金桥生物技术有限公司) ;胎牛血清 (美国Hyclone公司) ;40μm细胞滤器 (美国BD公司) 。
1.2 流式细胞荧光标记抗体
鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD4-Per CP、鼠抗人整合素α4-PE、鼠抗人整合素β7-APC、鼠抗人整合素α4-PE同型对照鼠抗人Ig G1-PE、鼠抗人整合素β7-APC同型对照鼠抗人Ig G2a-APC (美国BD公司) 。
1.3 主要仪器
净化工作台 (苏州净化SW-CJ-2FD型) ;恒温振荡器 (太仓市科教器材厂HZ-9211K型) ;流式细胞仪 (美国BD公司FACSAriaⅢ型) ;显微镜 (日本Olympus公司BX60型) ;台式高速冷冻水平离心机 (美国Thermo公司Legend RT-Plus型) 。
1.4 标本来源
肠道组织和外周血标本取自2012年9月~2013年1月收住桂林医学院附属医院普外科的同一结肠癌患者, 共15例 (年龄45~68岁, 平均56.2岁) 。肠道组织来源于距病变边缘5 cm正常组织, 在手术切除后迅速置于冷冻的PBS缓冲液中保存, 全部病例术前均未行放、化疗。血液标本以肝素抗凝的无菌干燥管收集, 采集量为5 m L。
1.5 方法
1.5.1 外周血单个核细胞的制备
用注射器针头吸取60%Pecoll分层液 (比重1.077 g/m L) 5 m L加入离心管, 然后沿管壁缓慢加入5 m L肝素抗凝的外周血 (外周血用PBS缓冲液对倍稀释) 形成清晰的界面。台式高速冷冻水平离心机2 000 r/min离心20 min后, 小心吸取Pecoll分层液界面上环状乳白色层, 用2 m L PBS缓冲液重悬, 6 h内流式细胞仪上机检测。
1.5.2肠道单个核细胞的制备
①术中取得的肠道组织去除肠系膜脂肪组织, 纵向切开肠道, 并用4℃的PBS缓冲液冲洗肠道组织后切成1 mm2的小块;②组织块放入盛有5 m L PBS缓冲液 (内含有4%的胎牛血清、0.5 mg/m L胶原蛋白水解酶Ⅳ、0.5 mg/m L脱氧核糖核酸酶Ⅰ和50 u/m L中性蛋白酶) 的培养皿中, 将培养皿置于恒温摇床上37℃30 min, 然后用40μm的细胞滤器过滤。这个过程重复3次;③3次消化的细胞悬液沿管壁缓慢加入盛有60%Pecoll分层液 (比重1.077 g/m L) 的离心管中, 形成清晰的界面。台式高速冷冻离心机2 000 r/min离心20 min后, 小心吸取Pecoll分层液界面上环状乳白色层, 用2 m L PBS缓冲液重悬[5], 6 h内流式细胞仪检测。
1.5.3 流式细胞仪检测
①外周血和肠道组织分别配制4管浓度为2×106个/m L的单个核细胞悬液;②第1管加入鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD4-Per CP、鼠抗人整合素α4-PE同型对照和鼠抗人整合素β7-APC同型对照, 流式细胞荧光标记抗体各20μL;③第2管加入鼠抗人整合素α4-PE流式细胞荧光标记抗体各20μL。④第3管加入鼠抗人整合素β7-APC流式细胞荧光标记抗体各20μL。⑤第4管加入鼠抗人CD3-FITC、鼠抗人CD4-Per CP、鼠抗人整合素α4-PE和鼠抗人整合素β7-APC流式细胞荧光标记抗体各20μL。⑥混匀后置25℃避光孵育30 min, PBS缓冲液洗涤两次, 用400μL的PBS缓冲液悬浮上机。将流式细胞仪调整至最佳工作状态, 检测细胞免疫表型为CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7表达率。
1.6 统计学方法
采用SPSS 18.0软件进行数据分析, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 用t检验进行比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 外周血CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7的表达
流式细胞仪分析并经补偿对照处理, 外周血CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7表达率为 (30.2±5.1) % (n=15) , 图1为其中一次CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7表达率的流式细胞仪检测结果。
2.2 肠道组织CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7的表达及肠道组织病理检测
流式细胞仪分析并经补偿对照处理, 肠道组织CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7表达率为 (45.2±6.2) % (n=15) , 图2为其中一次CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7的表达率及肠道组织病理 (HE×100) 结果。
外周血和肠道组织CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7表达率差异有统计学意义 (P<0.01) , 肠道组织CD3+CD4+T淋巴细胞整合素α4β7表达率高于外周血。
3 讨论
整合素是一种细胞黏附分子, 整合素不仅介导细胞与细胞间的黏附, 也介导细胞与细胞外基质的黏附[6]。整合素由18个α亚基和10个β亚基构成24种不同的异二聚体[7]。整合素在细胞生长、移行、增殖和分化方面发挥重要功能, 其中在治疗癌症、感染、血栓形成和自身免疫性疾病等方面潜力巨大, 在病毒感染宿主细胞过程中也发挥极大作用[8,9,10]。
整合素α4β7作为整合素家族中重要的一员, 其配体为黏膜地址素细胞黏附分子-1 (mucosal vascular addressin molecule-1, MAd CAM-1) 表达于毛细血管上。两者的相互作用构成了淋巴细胞群向GALT定向归巢的基础[11,12]。肠道归巢受体α4β7已经被确认为HIV-1的受体, HIV外膜糖蛋白gp120的V2环中的三肽可以模拟MAd CAM-1与表达整合素α4β7的CD4+T淋巴细胞相结合, 该结合使得HIV-1以GALT的CD4+T淋巴细胞为靶细胞, 导致大量CD4+T淋巴细胞在肠道被迅速消耗[13,14]。
整合素β3 篇5
整合素是由18 种 α 亚基和8 种 β 亚基在细胞表面形成的异型二聚体, 可以形成24 种整合素。 研究发现, 按照 β 亚基的不同可将其分为8 个亚组:β1~β8 亚基。 整合素 β1 与细胞增殖与分化、细胞间信号转导、 血管的发生以及肿瘤的发生等生物学功能相关[4,5,6]。 本研究针对牛整合素 β1 基因序列设计特异性引物, 并在上下游引入Xho I和Bam H I酶切位点, 将其克隆到真核表达载体p EYFP-C1 构建真核表达重组质粒, 与脂质体共转染COS-7 细胞, 发现其有较好的生物学活性, 可为进一步研究牛整合素 β1 基因的生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂和载体Trizol购自Invitrogen公司;PCR扩增酶、T4 DNA Ligase购自Takara公司;细胞培养嵌套 (cell culture inserts) , 0.4 μm孔径, 购自Nunc公司;DNA琼脂糖胶回收试剂盒购自天根生物公司;质粒提取试剂盒购自博大泰克生物公司;真核表达载体p EYFP-C1 购自优宝生物公司。
1.2 p EYFP-C1-β1 的扩增
1.2.1 引物设计参照牛整合素 β1 基因 (Gen Bank登录号AF468058) [7]序列设计特异性引物, 并在上下游引物5'-端分别引入Xho I和Bam H I酶切位点, 预期扩增片段为2 400 bp左右。 具体引物序列如下:β1-F: 5'-CTTCTCGAGATGAATTTGCAACTGATA-3';β1-R:5'-TTAGGATCCTTTTCCCTCATATTTC-3'。 所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.2.2 核酸提取和c DNA的制备收集牛气管组织, 按照常规方法研磨后, 4 000 r/min离心15 min。按照Trizol试剂盒说明书提取RNA。 将提取的组织RNA按照反转录体系说明书反转录成c DNA, 简要步骤为在无菌EP管中加入: 总RNA 5 μL、Oligo (d T) 18 3 μL、DEPC水3 μL, 轻轻混匀, 70 ℃ 、5 min后置于冰上冷却2 min。 在上述体系中再加入5 × 逆转录酶缓冲液4 μL、10 m M d NTP混合物2 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL (20 U) 、DEPC水4 μL, 将反应体系轻轻混匀, 37 ℃水浴5 min, 然后加入1 μL (200 U) 逆转录酶, 42 ℃水浴60 min。70 ℃热激10 min, 冰上冷却后于-20 ℃保存, 即为本研究PCR扩增的模板c DNA。
1.2.3 PCR扩增按照说明书PCR扩增体系配置反应液, 将反应体系轻轻混匀进行PCR反应。 反应程序: 95 ℃ 、5 min;95 ℃、55 s;50 ℃、45 s;72 ℃、150 s, 35 个循环后72 ℃延伸10 min, 经常规琼脂糖 (1.0%) 电泳检测PCR扩增产物。
1.3 p EYFP-C1-β1 重组表达质粒的构建将真核表达载体质粒p EYFP-C1 和含有整合素 β1 基因的PCR产物经Xho I和Bam H I进行双酶切, 37 ℃ 反应4 h。 将酶切产物电泳后胶回收特异性目的片段。使用T4 DNA连接酶进行连接, 16 ℃连接过夜, 转化感受态细胞后涂布平板, 按照常规方法挑取单菌落, 经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定筛选阳性质粒p EYFP-C1-β1。
1.4 转染试验将获得的阳性重组质粒p EYFPC1-β1 使用无血清、 无抗生素DMEM培养基稀释后, 加入1 μL脂质体, 混合后室温孵育30 min, 共转染小心加入处于对数生长期的COS-7 细胞, 转染6 h后, 将细胞上清换成含血清的DMEM培养基。 转染48 h后观察荧光强度, 确定细胞转染效率。
2 结果
2.1 牛整合素 β1 基因的PCR扩增利用本研究设计的特异性引物对制备的c DNA进行PCR扩增, 获得预期大小的目的片段, 大小约为2 400 bp, 见图1。
2.2 p EYFP-C1-β1 重组表达质粒的鉴定利用获得的阳性重组质粒p EYFP-C1-β1, 经PCR鉴定、Xho I和Bam H I双酶切鉴定, 获得的阳性重组质粒p EYFP-C1-β1 符合试验预期。 基因测序结果显示, 重组质粒插入序列完全正确 (见图2-图3) 。
2.3 p EYFP-C1-β1 重组表达质粒的转染效果鉴定p EYFP -C1 -β1 重组表达质粒和脂质体 (Lipofectamine 2000) 共转染后的COS-7 细胞, 经过48 h后可见明显荧光强度, 表明获得的p EYFP-C1-β1 重组表达质粒共转染COS-7 细胞后可获得有效表达。
3 讨论
人类整合素 β1 根据胞浆内结构域分为5 个亚型:β1A、β1B、β1C-1、β1C-2 和 β1D。 研究发现, β1A可在除骨组织和心肌组织外的所有组织表达, 而 β1D则仅在骨组织和心肌组织表达。 研究还发现, 角质细胞和生殖细胞迁移高度依赖整合素 β1, 但肌细胞、 神经细胞和淋巴细胞在缺乏整合素 β1也可正常迁移。 此外, 研究发现整合素 β1 调控不同的信号通路和基因表达, 体内缺失整合素 β1 可降低Er K、FAK的活性和Fgfr-3 的表达活性[8,9]。 前期的研究发现, 牛口蹄疫病毒有4 种整合素受体, 更深入的研究并不多[10]。
本研究通过扩增获得牛整合素 β1 基因并将其克隆到真核表达载体p EYFP-C1, 获得阳性重组真核表达质粒p EYFP-C1-β1。 利用PCR鉴定、双酶切鉴定符合试验预期的p EYFP-C1-β1 重组真核表达质粒和脂质体共转染对数生长期COS-7 细胞, 结果可见有明显的荧光信号, 表明本研究成功构建牛整合素 β1 基因的真核表达载体, 且在COS-7 细胞中验证具有良好的生物学活性, 为进一步开发针对牛整合素 β1 基因的生物学功能研究以及该基因在牛疫病中的生物学功能奠定研究基础。
参考文献
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整合素β3 篇6
K.Tani等[2]的研究表明,当1,10,100,1 000 ng/m L人中性粒细胞肽(Human neutrophil peptides,HNPs)分别与刀豆蛋白A(Con A)协同诱导T淋巴细胞时发现,T淋巴细胞以剂量依赖的方式增长,并且与对照组相比在10,100,1 000 ng/m L时均有显著性差异。而J.W.Lillard等[3]在研究HNPs对T淋巴细胞反应的影响时发现:10 ng/m L HNPs可显著性促进T淋巴细胞的增长,100 ng/m L的剂量也可促进增长但是不显著,而在1 000 ng/m L时呈现抑制或减少的状态,当加入1 000 ng/m L的HNPs 6 h后发现淋巴细胞数量较对照组减少50%之多。目前,人β-防御素3(HBD3)对淋巴细胞增殖反应的影响未见报道。为此,本试验设置了不同浓度HBD3协同Con A诱导淋巴细胞增殖反应,进而观察HBD3在体外对淋巴细胞增殖反应的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物
雌性清洁级昆明种小鼠(18~22 g),购自内蒙古大学动物中心。
1.2 试剂
HBD3,购自美国Peprotech公司;RPMI 1640培养液和完全培养基,购自Hyclone公司;胎牛血清和淋巴细胞分离液,均为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品;刀豆蛋白A(Con A),购自Sigma公司;细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8试剂盒),购自日本Dojindo公司。
1.3 仪器
酶标仪,购自BIO-RAD公司;二氧化碳培养箱,购自Thermo Forma公司;200目不锈钢筛网,购自Solarbio公司。
1.4 淋巴细胞悬液的制备
脱臼处死小鼠,用75%乙醇浸泡5 min后,无菌取出脾脏,置于5 m L RPMI 1640培养液中,用1 m L注射器的针芯轻轻碾压;将碾压过的脾脏同培养液一起经200目不锈钢筛网过滤后将细胞悬液轻轻加入到淋巴细胞分离液上层,3 000 r/min离心20 min;吸取乳白色的淋巴细胞层转入离心管中,用RPMI 1640培养液洗涤2次;最后用RPMI 1640完全培养基(含10%胎牛血清)重悬细胞,台盼蓝染色计数,调整细胞浓度为1×107/m L[4,5]。
1.5 Con A最佳剂量的筛选
吸取细胞悬液50μL同50μL RPMI 1640完全培养基(含有Con A)混匀后接种于96孔细胞培养板,Con A的终浓度分别为0,1,2,4,8,16μg/m L。另以RPMI 1640完全培养液作为空白对照,每个样品设3个复孔(为防止边缘效应将边缘孔加入100μL RP-MI 1640),细胞置于5%CO2、37℃的培养箱培养48 h后,取出细胞培养板并加入10μL/孔的CCK-8放入细胞培养箱中继续培养4 h,再取出细胞培养板测定450 nm处的吸光度。
1.6 HBD3对Con A诱导淋巴细胞增殖反应的影响
吸取50μL细胞悬液与50μL RPMI 1640完全培养基(含有HBD3和Con A)接种于96孔细胞培养板,其中Con A的终浓度为2μg/m L,HBD3的终浓度分别为0,1,10,100,500,1 000 ng/m L。另设空白对照孔(不含细胞的培养基)和对照孔(含50μL细胞悬液和50μL RPMI 1640完全培养基)。
1.7 数据的统计分析
参考刘万里等[6]的秩和检验方法,用非参数Kruskal–Wallis检验法比较非方差齐性多组间数据的总体差异,对组间两两比较采用Mann-Whitney U检验法。以上的统计工作均使用统计软件SPSS 17.0完成。所有数据均以Mean±SD的形式在Graph Pad Prism 5绘制的柱状图中呈现。
2 结果
2.1 最适Con A浓度的筛选
试验分别用浓度为1,2,4,8,16μg/m L的Con A刺激淋巴细胞,结果表明,各试验组与不添加Con A(对照组)均差异极显著,其中当Con A浓度为2μg/m L时的OD值最高,见图1。
注:与不添加Con A比较,**表示差异极显著(P<0.01)。
2.2 HBD3对Con A诱导淋巴细胞增殖反应的影响
试验用2μg/m L Con A协同不同浓度的HBD3刺激淋巴细胞,结果表明:1,10,100 ng/m L的HBD3对Con A诱导的淋巴细胞增殖反应具有促进作用,但是这种促进作用随着浓度的升高逐渐降低,并且500 ng/m L和1 000 ng/m L的HBD3对增殖反应有显著抑制效应,见图2。
注:与不添加HBD3比较,*表示差异显著(P<0.05)。
3 讨论
研究发现,β-防御素可以作为内源性配体与Toll样受体4结合触发一个信号级联反应,从而介导协同刺激分子(如B7家族成员)的表达上调和幼稚型树突状细胞的成熟,进而活化T细胞触发强有力的特异性免疫应答[7,8]。此外,β-防御素可以竞争性结合趋化因子受体CCR6,趋化诱导幼稚型树突状细胞和记忆T细胞聚集到炎症部位,促进幼稚型树突状细胞成熟,进而激活细胞免疫和体液免疫,从而提高机体的获得性免疫水平[9]。以上的研究提示,β-防御素在获得性免疫系统中具有作为配体的免疫调节作用以及趋化作用。
因为防御素本身并不是有丝分裂原[2,3],所以本研究并没有设计HBD3+细胞+培养基的对照,而是以Con A作为T淋巴细胞的非特异性有丝分裂原协同HBD3刺激淋巴细胞,因此Con A浓度的高低能明显影响淋巴细胞的增殖反应。试验结果表明,当Con A的终浓度为2μg/m L时OD值最高,但是随着Con A浓度的增高OD值不但没有继续增高反而降低。程晓霞等[10]认为,该种现象可能是由于过高浓度的Con A导致细胞死亡造成的。综上所述,本试验选择浓度为2μg/m L的Con A协同HBD3刺激淋巴细胞,结果表明,HBD3对Con A诱导的淋巴细胞增殖反应有影响,并且与J.W.Lillard等[3]报道的HNPS对淋巴细胞增殖反应的作用趋势一致,都是逐渐降低。不同的是本研究发现,1 ng/m L的HBD3比10 ng/m L的HBD3增强效应更明显,而HBD3在100 ng/m L时增强作用显著,但是相比HBD3在1 ng/m L和10 ng/m L时的作用相对较弱。值得注意的是,HBD3在500 ng/m L时就表现出一定程度的抑制效应。本研究的结果提示:HBD3在一定浓度范围内对Con A诱导的淋巴细胞增殖反应具有促进作用,而超出这一浓度范围就会出现抑制作用。