乳腺细胞（精选11篇）
乳腺细胞 篇1
乳腺颗粒细胞瘤是一种比较少见的乳腺肿瘤, 本瘤的生物学行为一般是良性的, 但临床表现酷似乳腺癌。现将我院2009年收治1例经病理学证实为乳腺颗粒细胞瘤病例报道如下。
患者女, 36岁, 因4个月前无意中发现右乳肿物而就诊。查体:右乳腺皮肤无红肿及橘皮样改变, 无乳头溢液, 内上象限可触及3.0cm×3.0cm×1.5cm肿物, 质硬, 活动度尚可, 边界欠规则, 无触痛。双腋下未触及肿大淋巴结。辅助检查:X线钼靶摄片示:双侧乳腺纤体增生, 右乳后腺体较致密。病理检查:大体:不规则乳腺组织一块, 体积3.5cm×2.5cm×1.5cm, 切面见体积约1.5cm3的肿物, 无包膜, 灰红色, 质硬, 与周围组织界不清, 未见出血、坏死。镜检:可见肿瘤呈浸润性生长, 肿瘤细胞排列成束状、巢团状, 其间由纤维结缔组织分隔, 并见散在乳腺导管。肿瘤细胞呈多边形、圆形, 胞体较大, 胞质丰富、嗜伊红色颗粒状, 细胞境界清楚, 细胞核小, 位于细胞中央, 圆或卵圆形, 染色均匀, 核分裂少, 有的细胞核中央见一小圆形核仁, 细胞无异型性。肿瘤组织中央及周边部见丰富神经组织, 并见肿瘤细胞围绕神经组织排列。免疫组化:Vim (+) , NSE (+) , S-100 (+) , CD68 (+) , CK (-) , CK7 (-) , P53 (-) , Ki67 (-) 。病理诊断: (右乳腺) 颗粒细胞瘤。
讨论:颗粒细胞瘤 (GCT) 是一种比较少见的肿瘤, 首先被Abrikossff提出, 最初被认为是肌源性肿瘤, 因而被称为肌母细胞瘤, 后来一些专家认为可能来自组织细胞、成纤维细胞、未分化的间充质细胞等, 目前通过免疫组化研究和电镜检查及细胞培养证实其来自于神经鞘细胞。但是也有人认为GCT不仅是发生在神经鞘细胞的肿瘤也能发生于其他多种细胞类型肿瘤中的退行性变[1]。本例免疫组化检查示波形蛋白阳性, 角蛋白阴性, 说明本瘤来自于间充质, S-100蛋白、NSE、CD68阳性, 支持GCT为神经源性。GCT多发生在中老年女性, 男性少见。发病年龄17～75岁。好发于舌、表浅皮下软组织、四肢、颈、胆囊、外阴、膀胱、胃肠道、支气管、肺及腹膜后、乳腺等。发生在乳腺相对少见, 约占全部GCT的5%～8%。大多数患者因发现乳腺无痛性肿块就诊, 病变好发于外下象限, 可侵犯乳头, 大部分病变为孤立性, 也有少数为多发性。GCT通常表现为乳腺实质内多发、质硬和无痛性包块, 表浅肿瘤可导致皮肤皱缩, 甚至乳头内陷。位于乳腺深部肿瘤可继发累及胸壁筋膜, 临床易误诊为乳腺癌。典型影像学表现为边缘呈星芒状的致密肿块阴影, 但是也易与乳腺癌混淆。一旦误诊将会导致过度治疗。光镜下肿瘤细胞呈巢状或片状分布, 为梭形或角形, 胞浆嗜酸性颗粒状, 也有一些胞浆呈空泡化或透明状, 核圆形或卵圆形, 核仁突出。在肿瘤中或卫星灶的周围能够见到小的神经束, 肿瘤呈浸润性生长, 可围绕导管和小叶, 也可浸润到小叶内。GCT绝大部分为良性, 直径多小于3cm, 个别可达6cm, 约2.5%的乳腺GCT为恶性, 体积较大 (平均7.9 cm) [2]。当细胞及核出现异形性, 有明显的核仁、核分裂及肿瘤性坏死时要高度怀疑恶性的可能[3]。肿瘤于近期内生长迅速, 体积增大, 有淋巴结转移及血管浸润是较细胞形态学更为可靠的恶性依据[4]。另外组织学需要与乳腺癌、腺泡状软组织肉瘤、转移性肿瘤、冬眠瘤和黄色瘤、成人性横纹肌瘤、颗粒细胞基底细胞癌、颗粒细胞平滑肌瘤等相鉴别。大多数病例从光镜形态上即可区分, 部分病例如加做免疫组化标记即可作出鉴别诊断。治疗和预后 本病治疗一般行广泛切除, 其预后好, 但切除不完全可出现局部复发。恶性者应行扩大切除, 必要时加上区域淋巴结清扫, 化疗及放疗并不能明显改善恶性颗粒细胞瘤的临床病程[5], 多在诊断后4年内死于淋巴或血行广泛转移[6]。
参考文献
[1]Ordonez NG, Mackay B.Granular cell tumor:a review of the pa-thology and histogenesis[J].Ultrastruct Pathol, 1999, 23:207
[2]武忠弼, 杨光华, 主编.中华外科病理学[M].北京:人民卫生出版社, 2002, 1681 -1682
[3]Uzoaru I, Firfer B, Ray V, et al.Malignant granular cell tumor[J].Arch Pathol Lab Med, 1992, 116:206
[4]Manstein ME, McBrearty FX, Pellechia PE, et al.Granular celltumor of the common bile-duct[J].Dig Dis Sci, 1981, 26:938
[5]Di Tommaso L, Magrini E, Consales A, et al.Malignant granu-lar cell tumor of the lateral femoral cutaneous nerve:report of acase with cytogenetic analysis[J].Hum Pathol, 2002, 33:1237-1240
[6]Silverberg SG.Principles and Practice of Surgical Management[M].New York:Chichester Brisbane, 1983, 233
乳腺细胞 篇2
细胞印片在乳腺肿块诊断中的作用
乳腺肿块的术中细胞印片,方法简单,因细胞的.及时固定,不受冷冻和切片的影响,细胞及核的结构较清晰,可为术中乳腺肿块良恶性冷冻诊断提供参考.现将我院1995年1月至11月乳腺肿块术中冷冻诊断前先行的细胞印片观察情况总结于下.
作 者：徐杭蓓 作者单位：上海市第七人民医院病理科,37刊 名：诊断病理学杂志 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF DIAGNOSTIC PATHOLOGY年，卷(期)：7(2)分类号：B316.2关键词：
浆细胞性乳腺炎临床诊治分析 篇3
【中图分类号】R655.8 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）11-0656-02
1 临床资料
1.1 一般资料
本组40例均为女性，年龄16-47岁，平均年龄30.5岁；24-40岁占80%，2例未婚，其余均有生育史；病史最短者3天，最长4年；既往有急性乳腺炎病史4例。
1.2 临床表现
本组患者临床症状主要为乳房肿块和乳头溢液， 分别为26例和14例；乳房肿块多位于乳晕周围，本组中有12例肿块直径最大为10 cm，伴有疼痛或曾经伴有疼痛，上述所有的肿块边界欠清欠光滑，活动度差；其中8例患者肿块质地较硬，无明显感染炎症表现；13例患者肿块处有红肿疼痛，肿块与皮肤粘连，压痛明显，但与胸肌不固定。14例乳头溢液患者（溢出血性液7例，脓性4例，乳白色油样臭味浓稠物质3例），5例乳头凹陷，1例患者患侧乳房有外伤史，来院就诊时乳腺呈蜂窝织炎改变者2例，脓肿3例，入院前已行脓肿切开引流形成慢性不愈之乳管瘘2例。查病人患侧腋窝淋巴结肿大有12例。
1.3 辅助及实验室检查
40例患者均行常规白细胞计数检查，其中白细胞增多者12例；24例有乳房肿块患者行乳腺B超检查，表现实性或囊实混合性占位，边界不清，其中有4例报告因实质性肿块为乳晕周围、乳腺癌不除外，16例考虑为弥漫性炎症病变、其中5例乳腺导管扩张， 4例考虑良性肿瘤；有32例患者行钼靶X线摄片检查，18例提示乳晕下不规则致密肿块阴影，9例与乳腺实质融合可见钙化斑呈管柱状，其中2例钙化呈沙砾样；19例彩超引导下行细针穿刺细胞学检查， 抽得黄色液体者12例， 细胞涂片见大量的浆细胞9例确诊为浆细胞性乳腺炎，3例诊断不明，但溢液涂片细胞学检查均未发现恶性细胞，细菌培养均为无菌生长；外院预约5例乳腺内镜检查，均提示乳腺增生及乳管扩张，管壁充血粗糙，2例有黄白色絮状物。
1.4 术前诊断
术前诊断为浆细胞性乳腺炎或非哺乳期乳腺炎19例，高度怀疑乳腺癌4例，导管内乳突状瘤4例，乳腺纤维腺瘤6例，慢性乳管瘘2例，4例病人诊断炎性包块，疑是乳腺结核1例。
2 治疗方法
本组病例病初时部分给予广谱抗生素静脉抗炎保守治疗， 部分病例局部红肿消退或瘘管外口暂时愈合，但全部病例最终均手术治疗。其中肿块较大的18例患者行肿块或乳房局段切除，术后给予静脉抗感染治疗；其中9例乳房肿块保守治疗后形成多发脓肿，给予多处脓肿切开引流，术后开放换药6个月前后愈合；5例多發脓肿患者行切开引流，长期不愈，反复发作，病变感染灶累及大部分乳腺，行全乳切除。5例乳晕旁瘘管和窦道型患者行窦道及局段乳腺切除，就是患者形成慢性瘘管在炎症静止期行病灶切除（以病灶为中心做梭形切口，如有瘘口者，可向瘘口内注入美蓝后封闭瘘口，提起病灶，仔细辨认切除瘢痕组织或蓝染组织，直到乳头下真皮处，紧贴乳头真皮结扎切断，一期缝合切口），术中必须将累及的大乳管一并切除并注意矫正乳头内陷；术前怀疑乳腺癌的3例患者术中行冰冻切片排除乳腺癌后行乳房象限区段切除术。
3 结果
40例术后病理报告均为浆细胞性乳腺炎，随访3个月至5年， 均门诊随访或电话随访未见复发或再次入院就诊，无一例发生癌变情况，病人反应良好。乳房外形以一期缝合未复发者外观最好，9例术后开放换药愈合者外观轻度凹陷，完全敞开换药者局部有明显凹陷。
4 统计学处理
采用V2检验，P<0.05为差异有显著性临床意义。
5 讨论
5.1 浆细胞乳腺炎多发于青年妇女， 作者查阅诸多文献起病原因并无一致性看法，与妊娠、哺乳无关，发病机制不明，病因至今尚无定论， 但大多数国内外学者认为主要与乳腺导管排泄障碍，异常激素刺激，感染等因素有关[1]，多种细菌逆行感染，乳头中心凹陷局部不洁引起乳孔闭塞，局部分泌物及污垢潴留，最终导致乳管阻塞及乳腺导管扩张症。钱礼则教授认为系皮肤感染侵袭乳管，是一种与哺乳无关的慢性特殊型感染，陆德铭、唐汉均教授认为：乳头内陷畸形，乳管开口被分泌物阻塞，当梗阻的乳管内分泌物大量积聚并溢出，其分解后产生的化学物质引起对周围组织化学刺激和抗原反应，引起浆细胞浸润和纤维结缔组织增生[2]。
5.2 浆细胞乳腺炎临床表现多样，主要表现可见乳房肿块，乳头溢液，以及乳房炎症表现，可伴乳头内陷、乳房皮肤橘皮样变、腋窝淋巴结肿大、瘘管形成，乳房胀痛等。本组26例乳腺肿块占61.54%，乳头溢液占30.76%，其他占7.7%。本病术前诊断较困难，且其表现与乳腺癌很相似，极易误诊为乳腺癌。文献报道术前误诊率达到31%-89.9%[3，5]。本组术前误诊率为46.15%，其中30.8%误诊为乳腺癌（8/26），可见本病和乳腺癌的鉴别异常重要，结合文献报道[4，5]和自己的体会，作者认为必须注意以下几个方面。本病肿块出现之前常有局部炎症的表现，并且有急性到慢性的发展过程，而乳腺癌起病缓慢，常无意中发现肿块，且肿块出现之前一般没有炎症的表现。本病由于炎症刺激和纤维组织增生，早期便可出现乳头内陷和皮肤橘皮样变以及腋窝淋巴节肿大等表现，而乳腺癌的这些表现大多在晚期才出现。本病多位于乳晕的深部，而乳腺癌常位于乳腺的外上或者内上象限。本病有反复的发作，肿块可随发作反复增大和缩小，而乳腺癌的肿块有从小到大的过程。本病肿大的腋窝淋巴结是炎症反应性的，常有压痛，质软，且可随炎症的消退变小或者消失，而乳腺癌的肿大淋巴结质硬，随着疾病的发展可变硬融合，且不会消退。乳腺导管造影，本病表现为导管扩张，呈囊状，内壁大部分光滑，连续无内生性肿块，而乳腺癌乳管内壁不光滑、破坏、有中断、失去连续性，可有内生肿块或者浸润。肿块针吸细胞学检查或者乳头溢液检查，本病可见坏死物质、浆细胞、脓细胞等，乳腺癌可找到恶性细胞。为减少术前诊断正确率，作者主张：详细询问病史，对本病应有充分的认识。彩超动态监测，诊断价值较大。本组中2例患者钼靶及彩超均提示为乳房实性肿块疑为乳房癌并建议手术，但考虑到本病。并予抗生素治疗，症状明显减轻，4d后复查彩超提示囊实性乳房肿块，从而明确诊断：乳管内镜或乳管造影对以乳头溢液为主要症状者，能大大提高术前诊断率。坚持[6]对2680例乳头溢液的病人行纤维乳管镜认为，纤维乳管镜是乳头溢液病人可靠的初步筛选方法。本组经乳管内镜或者乳管造影明确诊断8例。针吸细胞学或乳头溢液细胞学检查如找到脓细胞、癌细胞，对鉴别诊断有重要意义。浆细胞乳腺炎是一种自身免疫性疾病或自限性疾病，但一般很少能不治而愈。手术是主要的治疗手段，手术治疗的原则是必须完整充分地切除病灶，特别是必须清除乳晕下大乳管内的病灶，否则极易复发[6]对于急性炎症期患者，首先以中西医结合消炎退肿为主：中西医结合的切开！挂线疗法配以中药外敷、内服（尤适用于脓肿型），根据病情再配以西药抗炎，大部分患者病情能缓解，部分能得到治愈[1]；对于上述治疗不缓解或不完全缓解而表现为脓肿局限、肿块。慢性瘘管的，治疗均以手术为主，手术选择切除术：采用西医方法完整切除病灶（适用于瘘管型及肿块型）。本人认为西医切除是对中医疗的有效补充，更彻底、更速效，能达到根治目的。一般急性期可以先通过中药内服外用加西药抗炎治疗，部分患者急性炎症可望获得治愈。上述治疗无明显效果（半月以上）的，则果断采取手术治疗，手术必须做得彻底，病变乳管应广泛切除，否则易复发。乳头凹陷的患者在手术时，须切开通向乳头部的瘘管[4]，同时纠正乳头凹陷，术后换药时注意使乳头外翻，以避免复发。手术设计：一般作沿病变导管为中心的乳晕旁纵形切口或弧形切口，病灶切除后，切缘应为正常洁白的乳腺组织，不应有灰暗的病变组织残留，否则易复发。以化脓性病变为主的病例如行引流术时发现炎症呈蜂窝状，脓腔复杂，则必须改行病变组织广泛切除，否则很难治愈。
参考文献：
[1] 唐汉均.浆细胞性乳腺炎的临床与研究概述.上海：上海中医药大学出版社，2004 19.
[2] 许良中.乳腺病理学.上海：上海医科大学出版社，1999.206-207.
[3] 谷振声，姜鸿刚.现代乳腺疾病诊断治疗学1北京：北京人民军医出版社，1997193-97.
[4] 卞卫和，任晓梅.浆细胞性乳腺炎病机制探讨.南京：南京中医药大学学报，2001，17（4）：212.
[5] 王志坚，杜玉堂，黄鹂.浆细胞性乳腺炎的临床分析.北京：北京中医药大学出版社，199715.
乳腺细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 乳腺组织的获取
用无菌外科手术的方法取处于妊娠后期或泌乳期的健康初产荷斯坦奶牛乳腺组织5～10 g,置于DMEM/F12完全培养液[含青霉素300 IU/mL、链霉素300 μg/mL、两性霉素2.5 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、20%胎牛血清(FBS)]中,迅速带回实验室。
1.2 主要试剂与仪器
DMEM/F12(12400-016),Invitrogen公司生产;胎牛血清(南美洲,SV30087.02),Hyclone公司生产;胰蛋白酶(1∶250,0458),Amresco公司生产;细胞角蛋白-18(MS-142-P0)、波形蛋白(MS-129-P0),Neomarker公司生产;兔/鼠通用S-P免疫组化试剂盒(KIT9710)、DAB(0031),福州迈新生物技术开发有限公司生产;抗体稀释液(C-0007),北京博奥森生物技术有限公司生产;DMSO(D-5879),Sigma公司生产;青霉素钠、硫酸链霉素,华北制药股份有限公司生产;丙酮等其他试剂均为国产分析纯。
CO2培养箱(型号为HEPA class 100),Thermo公司制造;倒置相差显微镜(型号为IX71),Olympus公司制造;普通光学显微镜(型号为YS100),Nikon公司制造;离心机(型号为3-30K),Sigma公司制造;生物安全柜(型号为AC2-4S1),ESCO公司制造。
1.3 奶牛乳腺组织细胞的原代培养
用组织块贴壁法培养原代细胞,具体方法如下:将带回实验室的乳腺组织用37 ℃预热的灭菌生理盐水洗涤数次,清除血迹、乳汁及其他杂质;用无菌小剪镊分离腺泡于盛有灭菌生理盐水的小烧杯中,反复冲洗至冲洗液清亮后,将腺泡转移至生物安全柜中盛有灭菌PBS(含有青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg /mL,pH值为7.4)的小烧杯中;将腺泡组织置于75%乙醇中浸泡约1 min后,用双抗PBS洗涤3次,每次3 min;然后将其转入青霉素小瓶中剪至约1 mm3大小的小块,备用。用牙科探针挑取组织块,将其轻轻铺于细胞培养瓶底壁上,植块间距0.5 cm,尽量使组织块黏附于瓶壁后沿对侧瓶壁加入DMEM/F12培养液(含青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg/mL、15%FBS),旋上瓶盖,翻转培养瓶,使有组织块的一面向上,置于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中翻转培养2 h,使组织块微干涸;然后轻轻将培养瓶翻转过来,使培养液浸没组织块,根据培养液的颜色变化及细胞的生长情况每3～4 d更换一次培养液;待大多数组织块周围游出较多细胞时,用牙科探针轻轻掀掉组织块,并将组织块转瓶,使其继续贴壁培养,原瓶换液使细胞长满至汇合。
1.4 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化培养
每日观察细胞的生长情况并记录,待细胞生长至汇合后,根据成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的耐受时间与贴壁速度的差异,结合使用差时胰酶消化与差时贴壁2种方法分别纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,具体方法如下:弃去培养液,用D-hank’s液冲洗3次后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化3～5 min;至成纤维细胞变圆、细胞间距增大、有少量细胞团块漂起后,加入培养液(含青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL、10%FBS)终止消化,反复轻轻吹打成纤维细胞区域,吸取消化液转入新的细胞培养瓶中,置于培养箱培养1 h;待大多数成纤维细胞贴壁后,轻轻去除上清液,加入新的培养液继续培养至细胞长满并汇合,得到以成纤维细胞为主的细胞;去除成纤维细胞后,用D-hank’s液再冲洗3次,然后加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化4～5 min;至上皮细胞回缩变圆、细胞间距增大乃至细胞成片(团)脱落时加入含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化,反复轻轻吹打,按细胞密度加入培养液,置于培养箱中约1 h;取培养上清液转到新的细胞瓶中继续培养至细胞长满、汇合,得到以上皮细胞为主的细胞。如此反复进行纯化以得到较纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
1.5 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察与鉴定
1.5.1 倒置相差显微镜观察
每天定时观察细胞的形态和生长情况,拍照并作记录。根据每天对细胞生长情况的观察,掌握奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的生长特性和细胞形态的差异。
1.5.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的鉴定
将处理过的小盖玻片置于12孔细胞培养板的底壁,加少量培养液使其粘在培养孔底壁,分别将纯化的乳腺上皮细胞和成纤维细胞接种于含盖玻片的孔中,培养5 d后,用无血清培养基处理24 h并进行鉴定。
姬姆萨染色:将细胞爬片取出,PBS洗3次,每次3 min;冷冰酮固定20 min;用PBS洗3次,每次3 min;姬姆萨染液染色50 min;用灭菌水反复冲洗,置37 ℃温箱干燥6 h以上;二甲苯透明,中性树胶封片,镜检,观察细胞的形态并拍照。
免疫组化鉴定:每组细胞爬片分成3份,分别作为细胞角蛋白、波形蛋白和阴性对照,具体步骤为将细胞爬片取出,PBS浸洗3次,每次3 min;冷丙酮固定20 min,PBS浸洗3次,每次3 min,并将爬片放入湿盒中;加0.5%TritonX-100(用PBS配制)室温作用20 min;用PBS冲洗3次,每次3 min;滴加内源性过氧化酶阻断液(S-P试剂盒A液),避光作用10 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加动物非免疫血清(羊) (S-P试剂盒B液),37 ℃孵育20 min;轻轻甩掉血清,勿冲洗;分别滴加鼠抗人细胞角蛋白-18单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体,均用抗体稀释液按1∶100倍稀释,阴性对照加PBS,37 ℃孵育2 h;PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加生物素标记羊抗鼠/兔IgG(S-P试剂盒C液),37 ℃孵育20 min;PBS液冲洗3次, 每次3 min;滴加链霉素抗生物蛋白-过氧化酶(S-P试剂盒D液),37 ℃孵育20 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加DAB作用5～10 min (现配现用),显微镜下观察并控制显色,用纯化水漂洗终止显色;苏木精复染5 min,在 0.25%盐酸乙醇溶液中浸提一下,自来水返蓝15 min;用纯化水浸洗,37 ℃温箱干燥6 h以上,二甲苯透明,中性树胶封片,镜检并拍照。
1.5.3 细胞生长曲线的绘制
分别将乳腺上皮细胞和成纤维细胞按每孔2×105个接种于24孔板中,每组3孔,共分为14组。分别于接种后每天同一时间计数细胞平均数,每孔计2次,直至细胞的生长达到平台期。以培养时间为横坐标、细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.6 细胞的冻存与复苏
1.6.1 细胞的冻存
用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA将细胞消化下来,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,加入1 mL新鲜培养液重悬细胞,用台盼蓝染色,用血细胞计数板计数后,加含20%FBS的DMEM/F12培养液调整细胞数至5×106～10×106个/mL,并按10%的比例缓慢加入DMSO,混匀后分装于2 mL冻存管中,每管1 mL,4 ℃放置15 min;-20 ℃放置20 min;-80 ℃过夜,然后沉入液氮罐中长期保存。
1.6.2 细胞的复苏
从液氮罐中取出冻存管,立即投入37 ℃水浴中晃动,使其在1 min内完全融化。加入5 mL培养液悬浮细胞,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,根据细胞密度加入生长培养液重悬细胞,将其接种于细胞培养瓶中,置37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。
2 结果
2.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养纯化及形态观察结果
2.1.1 组织块的培养结果(见169页彩图1)
培养1～2 d后细胞贴壁,3～5 d后开始游出,以成纤维样细胞和上皮细胞为主,并且这2种细胞并不混杂生长,存在着明显的界限(见169页彩图1a,b)。其中成纤维样细胞先从组织块周围向外游出,其形态多为长梭形,排列疏松,呈旋涡状或放射状生长(见169页彩图1a,b);而后上皮样细胞从组织块周围游出,多为单层多角形,排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样聚集生长(见169页彩图1a,b)。
2.1.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化及形态学观察结果
经差时胰酶消化和差时贴壁2种方法对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别进行纯化,上皮细胞多成团生长,未纯化完全时成纤维细胞常包裹于上皮细胞的外围生长(见169页彩图1c)。细胞经3～5次纯化后即可分别得到较为纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。纯化的上皮细胞大多为多角形,细胞排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,有时可出现双核或多核现象,核仁清晰可见,以3～5个居多,多呈单层铺路石样或鹅卵石样成团聚集生长(见169页彩图1d)。传代的上皮细胞贴壁后,多成团聚集生长形成岛屿状,并且成团的多角形上皮细胞聚集生长时增殖快,而单个散在圆形贴壁细胞很难继续增殖。随着培养时间的延长,一些上皮细胞的胞浆出现大小不一的空泡和泡状结构(见169页彩图1e),这是上皮细胞分泌产生的大小不等的乳滴。上皮细胞传到第5～6代时生长仍很旺盛,随着细胞密度的增加,多形成类似腔的结构,在腔的周围细胞密集包绕生长,更换培养液后继续培养,一些生长迅速的新生细胞可向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来(见169页彩图1f),细胞沿着支架继续增殖可达到融合,形成类似圆顶样结构,随传代次数的增多和培养时间的加长这种结构会逐渐增多。此外,在一些区域,上皮细胞还可形成腺泡样结构(见169页彩图1g)。上皮细胞传至第7～8代,其形态基本一致,只不过有些细胞体积较大,呈圆饼样,增殖速度慢;有的细胞体积较小,呈鹅卵石样,增殖迅速,随着培养时间的加长,细胞间的界限愈加明显;随着细胞密度的增加,细胞受到挤压,一些细胞呈短梭形。而当细胞传到第8～9代以后形态变得非常不均一(见169页彩图1h),出现长形、梭形和三角形等多种形态共存,而典型的上皮细胞越来越少。纯化的奶牛乳腺成纤维细胞单层生长,呈典型的放射状或旋涡状排列(见169页彩图1i),且随着传代次数的增多,成纤维细胞的形态和生长特性基本不发生改变。
2.2 细胞的鉴定结果
2.2.1 姬姆萨染色法鉴定细胞的形态(见169页彩图2)
乳腺上皮细胞为深蓝染,胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多为3～5个,并且胞浆内常可见大小不一的白色空泡(见169页彩图2a),这是上皮细胞分泌的乳滴。成纤维细胞多呈长梭形,胞核蓝染,为椭圆形,位于细胞中央,一般可见核仁呈旋涡状或放射状排列生长(见169页彩图2b)。
2.2.2 免疫组织化学法鉴定细胞的纯度
镜检可见细胞胞浆内有特异性棕黄色或棕褐色颗粒沉着者判为阳性。结果(见170页彩图3)显示,乳腺上皮细胞角蛋白-18反应呈阳性,波形蛋白反应呈阴性(见170页彩图3a,b);乳腺成纤维细胞角蛋白-18反应呈阴性,波形蛋白反应呈阳性(见170页彩图3c,d);阴性对照均为阴性(见170页彩图3e,f)。经纯化后,2种细胞的纯度均可达到95%以上。乳腺上皮细胞传至第8～9代以后,细胞的形态开始发生变化,出现长形、梭形、三角形等多种细胞共存,而直至细胞传至第14代时,细胞角蛋白-18反应仍呈阳性(见170页彩图3g),阴性对照为阴性(见170页彩图3h)。
2.3 细胞的生长曲线(见图4)
奶牛乳腺上皮的生长曲线(见图4a)和成纤维细胞的生长曲线(见图4b)均呈较典型的“S”型,其中成纤维细胞较上皮细胞潜伏期短,增殖快。
2.4 细胞的冻存与复苏
代次较低的奶牛乳腺上皮(3～6代)细胞经冻存复苏后生长状态良好,传1～2代后细胞的形态和生长特性均未发生改变,而代次较高(7～8代)的细胞冻存复苏后形态正常,但传代后细胞形态就发生了改变。复苏后的成纤维细胞生长状态良好,形态和生长特性均未发生明显改变。
3 讨论
3.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养与纯化
目前,有关奶牛乳腺上皮细胞培养的研究已有很多,培养方法主要有组织块培养法、机械破碎法和酶消化方法。也有人从乳汁中分离出奶牛乳腺上皮细胞[6,7],有待于进一步验证。机械破碎法和酶消化法极易丢失和损伤细胞,最终造成细胞不能正常生长和增殖[8,9],其中以组织块培养法最能保持乳腺上皮细胞二倍体特性,不破坏细胞的活性。本试验根据奶牛乳腺上皮细胞较成纤维细胞贴壁和生长慢、贴壁牢、不易被消化下来的特性,应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化法和差速贴壁法结合的方法,用较少的组织即分别培养及纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
目前,关于奶牛乳腺细胞体外培养的研究主要集中在上皮细胞上,而关于成纤维细胞的报道并不多见,不过后者培养和纯化都相对较容易。研究发现,奶牛乳腺上皮细胞纯化的难易程度跟乳腺组织的取材也有很大的关系,在腺泡发育好的妊娠期和泌乳期取材所获取的细胞活性好,生长快,细胞中上皮细胞占的比例较大[10,11],此时纯化出上皮细胞就相对较容易,所以把握取材时机非常关键。另外,去除脂肪和结缔组织,分离乳腺腺泡进行培养也很关键[10,12]。
3.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察
试验培养得到的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征与王亨等[10]、彭新荣等[11]及E.Matitashvili等[13]的报道基本一致,奶牛乳腺成纤维细胞的形态特征与吴娟等[14]报道的结果一致。乳腺上皮细胞是构成乳腺腺泡的主要成分,具有分泌乳汁的功能。本研究中,在体外培养奶牛乳腺上皮细胞时,胞浆内出现大小不一的空泡和泡状结构即为上皮细胞分泌的乳滴,与崔立莉[7]报道的结果一致;与彭新荣等[11]报道的结果不一致,其认为胞浆内出现的小颗粒和泡状结构可能为变形的线粒体及溶酶体。上皮细胞还可形成乳腺腺泡管样结构,与王治国等[15]和E.Matitashvili等[13]的试验结果一致。不过,王治国等[15]的试验中添加了一些激素和生长因子,E.Matitashvili等[13]的试验中添加了ECM,而本试验中未添加。而上述现象在成纤维细胞中均没有,可见在体外培养条件下,奶牛乳腺上皮细胞仍保留着其原有的一些功能和特性。
体外培养的乳腺上皮细胞传代后的大小和形态并不完全一致,经纯化传代后,细胞多成团、聚集成岛屿状,其中体积较小的呈鹅卵石样,聚集成长的细胞增殖较快,而体积较大的呈圆饼形,细胞的增殖则较慢,这2种细胞可能为乳腺上皮细胞不同发育时期的细胞。前者可能为较幼稚的细胞,分裂增殖较快;而后者为接近终末分化的细胞,故增殖较慢。与王亨等[10]的试验结果相一致。另外,乳腺上皮细胞成团时增殖较快,而单个细胞很难贴壁并增殖[10,11];因此细胞的接种密度对于细胞的生长非常重要。随着上皮细胞生长密度的增加,可形成许多类似腔的结构,细胞继续增殖达融合后,可形成类似圆顶样结构,与丁月云等[16]的试验结果相一致,而8～9代以后部分细胞渐渐分化,细胞形态变得不均一,出现长形、梭形和三角形的细胞,与彭新荣等[11]的试验结果相一致。
3.3 细胞鉴定
奶牛乳腺腺泡上皮细胞中的骨架蛋白以角蛋白-7,8,18为主,而肌上皮细胞以角蛋白-5和14为主[16],故角蛋白-18可用于奶牛乳腺腺泡上皮细胞的鉴定。波形蛋白是间质细胞特异性表达的一种中间纤维蛋白,是间质细胞和成纤维细胞的标志蛋白之一[17],可用于成纤维细胞的鉴定。综合应用这2种蛋白不仅可以鉴定细胞的类型,而且可以鉴定细胞的纯度。本试验结果表明:奶牛乳腺上皮细胞对角蛋白-18反应阳性,与E.Matitashvili等[13]的研究结果一致;对波形蛋白反应阴性,与J.L.Anaya-Lopez等[18]的研究结果一致。而成纤维细胞与上皮细胞的结果相反,对角蛋白-18反应阴性,对波形蛋白反应阳性,表明结果成立。经鉴定,上皮细胞传至14代后,对细胞角蛋白-18的反应仍为阳性,表明虽然细胞的形态发生了变化,但所得的细胞仍为上皮细胞。
3.4 细胞的冻存与复苏
由于原代奶牛乳腺上皮细胞具有二倍体的特性,属于有限细胞系,随着传代次数的增多,细胞的形态和生长特性会逐渐发生改变,导致其失去二倍体细胞的特性甚至发生细胞转化;因此,在纯化后对其及早进行冻存非常重要[5]。与上皮细胞不同,奶牛乳腺成纤维细胞的形态和生长特性受传代和冻存的影响相对较小,但仍应在其生长旺盛、传代次数较少时将其冻存,以防影响细胞的特性。
试验采取妊娠后期或泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织分离腺泡,培养后应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化和差速贴壁结合的方法,用较少的组织即分别培养并纯化出了乳腺上皮细胞和成纤维细胞,所得细胞形态良好,生长曲线呈较典型的“S”型,符合细胞生长的一般生物学规律,经鉴定细胞的纯度可达95%以上。目前,国内外的许多研究者认为乳腺上皮细胞的贴壁依赖于基质,生长依赖于激素和生长因子的添加,而本试验中未使用基质和激素也成功培养出了生长良好并具有泌乳功能的乳腺上皮细胞,避免了胶原和激素所造成的影响,为相关的后续研究奠定了良好的基础。
a.细胞从组织块中游出并在组织块周围生长(100×);b.上皮细胞与成纤维细胞不混杂生长,之间存在明显的界限,上皮细胞排列紧密形成细胞单层,而成纤维细胞排列疏松(100×);c.成纤维细胞包裹未纯化完全的上皮细胞(100×);d.纯化的上皮细胞呈鹅卵石样或铺路石样生长(100×);e.上皮细胞胞浆内有大小不一的空泡和泡状结构(100×);f.细胞向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来,细胞沿着支架继续增殖可达到融合(200×);g.上皮细胞形成腺泡样结构(100×);h.上皮细胞的形态发生改变(100×);i.纯化的成纤维细胞呈旋涡状或放射状生长(100×)。
a.中央处上皮细胞深蓝染,细胞核为圆形或椭圆形,核仁清晰可见,胞浆内还可见许多大小不一的白色空泡;b.成纤维细胞为长梭形,呈旋涡状或放射状排列生长。
西兰花可阻止乳腺癌细胞扩散等 篇5
听音乐可以改善心脏健康
姜文
日前有研究发现，听音乐可以改善心脏健康并能降低胆固醇水平。如果患者每天听30分钟他们喜欢的音乐，不仅会使他们精神放松，而且能扩张和清理血管，对他们的身体也有益。马里兰大学的研究是建立在平均年龄36岁的健康的、不抽烟的男性和女性志愿者基础上的。研究发现，那些听他们感兴趣音乐的志愿者的血管上臂直径扩大了26％。主持这项研究的美国马里兰大学预防心脏病学中心主任Michoel Mil-ler认为，音乐在血液循环中的影响仅持续几秒钟，但是因为听喜欢的音乐所获得的累积收益会持续下去，并且对所有年龄的人都有非常积极的作用。Miller说，血管扩张表明一氧化氨在全身释放出来，这就降低了血栓和低密度脂蛋白(一种可导致心脏病发作的胆固醇)。他还警告说，听有压力的音乐，包括重金属音乐和说唱音乐，可以使血管收缩6％，根据以前的实验，这和吃了大量的汉堡包有相同的效果。Miller建议家长，如果他们十几岁的孩子听音乐感到心烦，那么就要避免听这些音乐，因为这可能相当于听觉意义上的被动吸烟。
吃橄榄油患肠炎风险低90％
朗朗
英国科学家日前发现常吃橄榄油可降低罹患溃疡性肠炎的风险。英国东英吉利大学医学院科学家对2.5万人进行了长期健康情况跟踪研究，被调查者的年龄在40岁至65岁之间，他们在研究开始时都没有患溃疡性肠炎。研究结果发现，与较少进食橄榄油的人相比，经常进食橄榄油的人罹患溃疡性肠炎的风险要低90％。科学家分析说，橄榄油中富含一种叫油酸的物质。这种物质人体必需，但人体不能自主合成。油酸有抑制溃疡性肠炎中炎症因子的作用。
日饮1升可乐精子减三成
连枕
丹麦进行的一项最新研究指出，每天喝大约一升可乐的男性，精子数量平均比不喝可乐的男性减少约30％。2500多名年轻男性参与了这项最新研究。研究发现，那些不喝可乐的人，精子质量更好，平均每毫升精液中含有5000万个精子，而且这些人的生活方式一般会更健康。与之相比，每天喝可乐超过1升的男性中，有93％平均每毫升精液里仅有3500万个精子。而且他们一般喜欢吃很多速食，吃很少水果和蔬菜。对其他来源的咖啡因进行研究，例如咖啡和茶，发现精子质量没有明显下降。目前还不清楚是可乐还是不健康的生活方式，或者两者都有，是导致精子数量下降的罪魁祸首，科学家表示，要想弄明白这个问题，还需进行更多研究。
怀孕早期饮食决定生男生女
陈明真
美国密苏里大学的研究人员发现，女性在怀孕早期的饮食细节将影响到胎儿的性别和健康状况。受孕期间吃传统英式早餐和高脂肪食物的女性更容易生男孩。饮食脂肪含量低或者经常禁食的孕妇则更容易生女孩。人、鼠实验表明，受孕和怀孕早期饮食受限或不合理，会更容易生女孩。研究人员认为这很有可能源于对男性胎儿的一种选择性遗失，因为它们在子宫中更脆弱。
走出离婚阴影需要1年零5个月
殷杨
英国的一项调查显示，离婚者平均需要1年半的时间，精确说是17个月零26天，才能走出离婚阴影。英国一家针对50岁以上人群的约会网站对4000名离婚者进行了调查，结果显示，离婚人群需要将近1年半的时间才能处理清子女抚养和财产分割等实际问题。除此之外，还有很多精神痛苦需要面对。60％的被调查者表示离婚最难忍受的一点是心理失落感，对于其中5％的人来说，适应离婚的过程可能会长达几年。20％的人表示离婚的阴影可能会伴随自己一辈子，55％的人认为离婚是自己一生中最大的痛苦。调查还发现人们在离婚判决生效那一刻的反应存在巨大差异。43％的人感到如释重负：31％的人心存伤感：还有16％的人会精神崩溃。调间才能弥补心灵创伤，但他们从离婚后第16个月零11天时候起心情会逐渐开朗，并会做出重寻伴侣的打算。英国人一般在离婚后15个月零26天就会开始新的约会。多数情况下是由亲友安排相亲，占58％：网上约会占28％，还有20％以上的人会通过单身聚会。49％的人希望和自己有相同经历的人约会，但也有36％的人表示离婚后再也不想亲近异性。
科学家称不忠舅人智商低
郭文化
科学家认为，乱搞男女关系的滥交男子智商可能较低。伦敦政治经济学院的进化心理学家金泽智博士说“一个男子越聪明，就越不可能对他的配偶不忠。”他的理论建立在一个断言之上，该断言认为在进化历史上，男性都是“适度一夫多妻主义者”。所谓“适度一夫多妻”，意指成功男士拥有一个以上的配偶，从而要比成功女士拥有更多的后代。然而，现在有了变化。金泽智博士解释说，对男人来说，保持专一性关系是新的进化成果。依据他的理论，聪明的人更有可能接受符合进化论的“新做法”，以变得“更先进”。因此，就忠诚度来说，那些不能抵御诱惑而有外遇的男人可能更愚蠢。他说：“通过这个理论可以推断出，越是聪明的男子越是珍视性关系的专一性。”依据他的理论，忠诚度与智力之间的关联理论不适应于女性，因为女性总是被期望要对一个男性忠诚，即使在一夫多妻制社会里。
心存恶念的人更容易短命
翁红
荷兰科学家此前对男性做了一项研究，发现心地善良的男性比心存恶念的男性活得长。日前，美国匹兹堡大学的医学专家开始把女性作为研究对象，研究人员对10万名女性发放了复杂的问卷，以便了解其生活观念和对人的态度。8年的跟踪调查表明，与经常对他人怀有恶意的女性相比，善良友好的女性心脏病发病率要低9％，因各种原因死亡的几率也低14％。此外，不善良的人把更多的时间放到琢磨他人上，而善良的人则会把时间用在运动等快乐的事情上。这项研究的负责人希拉里廷德尔表示，善良的女性更乐观向上，喜欢微笑，她们广阔的胸怀更易挺过不幸。不善良的人则因为常对人怀有恶意，斤斤计较，长此以往必定会损害身心健康，让心情总处于憋闷状态，而且容易患上高血压和高胆固醇等疾病，从而影响生活质量和寿命。
公共场合禁烟有助减少心血管疾病患者
阿来
乳腺细胞 篇6
1. 乳腺癌干细胞概述
1.1 乳腺癌干细胞的发现
2003年Al Hajj等[1]利用人类乳腺癌细胞接种免疫缺陷动物模型首次在实体瘤中证实了乳腺癌干细胞的存在。他们筛选CD44, CD24作为乳腺癌细胞的表面标志, 利用流式细胞仪从1例原发病灶和8例癌性胸水中分离出不同表型的癌细胞, 接种于免疫缺陷 (NOD/SCID) 小鼠体内, 发现注射表型为CD44-或CD24+细胞的小鼠体内很少有肿瘤形成, 而具有CD44+CD24�/low标志的100个乳腺癌细胞就可以在小鼠体内形成肿瘤, 并且新形成的肿瘤与原发肿瘤组织病理学特征相似。
1.2 乳腺癌干细胞的起源
乳腺癌干细胞究竟起源于何种细胞至今仍无定论, 人们普遍认为其起源于正常干细胞[2], 因为正常干细胞存在被激活的自我更新机制, 获得较少突变即有可能发生癌变;而且干细胞生存周期长, 容易积累致瘤性基因突变。也有学者认为[3]乳腺癌干细胞是已经分化的细胞在致癌因子作用下去分化重新获得干细胞特性而形成的。另外一种学说[4]认为, 肿瘤干细胞可能是非肿瘤干细胞经由上皮间质转换 (EMT) 而来。Mani等首先证明EMT和乳腺癌干细胞具有相关性, 他们发现诱导乳腺癌细胞EMT可以使乳腺上皮细胞获得干细胞特性, 表现为EMT细胞中CD44+CD24�/low样细胞数及体外培养乳腺微球形成大量增加, 表明EMT可以产生CSC样细胞, 体内试验也同样支持上述结论。
1.3 乳腺癌干细胞的表面标志
自从A l-H a j j首次分离鉴定出乳腺癌干细胞以来, 人们已经普遍接受CD44+CD24�/low作为乳腺癌干细胞的生物学标志。乙醛脱氢酶1 (ALDH1) 也是乳腺癌干细胞常用的识别标志。研究者[5]用试剂标记乳腺癌细胞, 并将其异种移植到NOD/SCID小鼠乳房中, 发现ALDH1+细胞具有干细胞特性, 只需500个便可在小鼠体内成瘤, 而5万个ALDH1-细胞也不能形成肿瘤。相对于普通乳腺癌细胞, 高表达ALDH1的CD44+CD24�/low乳腺癌细胞致瘤性更强。一管标记乳腺癌细胞表面标志可以更加简便精准的筛选乳腺癌干细胞, 但是仍然有很多问题亟待解决。首先, 并非所有的乳腺癌都含有表达现有干细胞标志的细胞亚群, 那么, 不含有已认知标志物的肿瘤干细胞该如何识别?其次, 有些表面标志广泛存在于各种癌组织当中, 乳腺癌干细胞缺乏公认的特异性识别标志, 不利于描述干细胞在乳腺癌发生发展过程中的作用。
2. 乳腺癌干细胞的自我更新调控机制
参与乳腺干细胞自我更新调控的信号途径主要包括Wnt/β-catenin、Hedgehog和Notch信号通路, 他们与乳腺癌的侵袭、转移密不可分。
Wnt蛋白是一种能够影响细胞行为的分泌性信号蛋白。无Wnt信号时, 胞浆中的β-catenin与抑癌基因APC、axin及糖原合成酶激酶3 (GSK3) 以复合物形式存在。GSK3能磷酸化β-catenin, 启动β-catenin的泛素化降解途径。Wnt蛋白与膜受体frizzled结合后激活Wnt途径, GSK3活性受抑制, 磷酸化β-catenin能力下降, 从而阻碍了β-catenin降解过程, 导致β-catenin大量累积。非磷酸化的β-catenin进入细胞核与转录因子 (如TCF/LEF家族) 相互作用, 导致下游基因 (c-Myc、cyclinD1等) 的激活[7]。一项关于Wnt信号途径在人类正常、癌前病变及恶性乳腺上皮细胞基因表达的研究发现[8], Wnt3a/Frizzled8/β-catenin/TCF4/LEF1/c-Myc信号途径过表达在乳腺癌上皮细胞恶性转化中发挥重要作用。
Hedgehog信号[9]传递受靶细胞膜上两种蛋白受体Ptc和Smo介导。当Hh蛋白与Ptch结合时, Ptch活性受抑制, Smo被激活, 从而活化转录因子Gli蛋白, 使其从蛋白复合物中释放并转移到核内诱导目的基因表达。研究者发现Hh信号途径在侧群细胞SP及表型为CD44+CD24�/low的乳腺癌细胞群中mRNA和蛋白水平呈高度表达状态。而抑制Hh信号活性, SP细胞和CD44+CD24�/low细胞增殖能力下降。这表明Hh信号通路对于乳腺癌的发生发展具有重大意义。
Notch信号途径与乳腺癌的发生和进展也有着密切的关联。Ming Qiu[10]等在对三阴性乳腺癌小鼠的研究中发现, 应用中和抗体特异性抑制肿瘤Notch1途径, 可以明显抑制肿瘤生长。Notch信号对乳腺癌的调控作用可能是通过诱导EMT过程实现的, 研究表明激活上皮细胞Notch信号可以促进EMT发生, 而下调Notch信号可以抑制EMT过程[11]。
3. microRNA与乳腺癌干细胞
miRNA是一组非编码蛋白质的短序列RNA, 通常的长度为21-23个核苷酸。miRNA在转录后水平控制靶基因的表达, 功能性的miRNA蛋白复合体与靶mRNA分子3'端非编码区域 (3U'TR) 互补结合而干扰该mRNA分子的正常翻译, 从而调控大多数生物学行为。50%的miRNA基因位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点, 肿瘤细胞与正常组织细胞的miRNA表达谱具有明显差异[12]。2004年, Calin等首先报道了人类乳腺癌染色体脆弱位点的miRNA表达发生改变, 表明miRNA在乳腺癌的发生发展中有重要意义[13]。miRNA能够调控多种蛋白质的表达, 影响多个信号通路的活性, 在乳腺癌的侵袭转移过程中起到重要作用。
3.1 microRNA调控肿瘤干细胞自我更新
乳腺癌干细胞的自我更新调控机制涉及许多信号通路, 这些信号途径受到多种miRNAs的调节。研究发现[14], 上调miR-125b表达能够富集CD44+CD24�/low乳腺癌干细胞, 而抑制miR-125b表达能够富集非干细胞群。研究者使用pMSCV质粒和表达miR-125b的pMSCV-miR-125b质粒转染细胞系, 结果发现含有miR-125b的细胞群中CD44+CD24�/low细胞数量显著提高, 说明了miR-125b能够提高乳腺癌中肿瘤干细胞的数量。并且miR-125b能够增加细胞群中乳腺微球体的形成。miR-125b是由Snail (一种锌指转录因子, 在乳腺癌干细胞的EMT过程中发挥重要作用) 介导的Wnt/β-catenin/TCF4途径转录激活的。
miR-17-92家族可以导致Hh信号途径激活。miR-17-92高表达调节Hh信号途径已经在多种肿瘤中有所描述。M.Kasper等在2009年关于膀胱癌的研究中发现癌细胞中高水平表达miR-17-92家族, 并且Hh配体基因和Gli诱导的靶基因 (FOXM1, IGF2OSF2, H19, and SPP1) 表达上调[15]。几个其他的小miRNAs涉及Hh信号途径的关键调节部分, 包括miR-326和miR-324-5p抑制Hh途径的跨膜蛋白受体smo, miR-324-5p抑制Hh转录因子Gli-1蛋白[13]。
3.2 microRNA调控乳腺癌干细胞侵袭转移
正常上皮依赖于细胞-细胞及细胞-细胞外基质之间一群黏着分子的稳定表达而紧密连接。癌细胞从原位向周围间质侵袭则需下调这些粘附分子的表达, 获得自由运动与迁徙能力。一些microRNA能够抑制乳腺癌细胞迁徙和向外侵袭, 如miR-200家族。miR-200家族主要通过调控EMT影响乳腺癌干细胞的侵袭和转移过程。
EMT是乳腺癌侵袭转移的关键步骤。在这个过程中, 乳腺癌细胞接受间质信号启动EMT程序, 提高了细胞的运动性和侵袭性, 得以淋巴结转移。待建立转移灶时, 间叶型癌细胞再经MET恢复上皮表型。在乳腺侵袭性导管癌、基底样细胞癌及瘤样化生中, E-cadherin表达缺失。E-cadherin在细胞连接的稳定维持中发挥重要作用, E-cadherin的减少或缺失破坏了细胞之间的正常连接状态, 使细胞运动能力增加。TGF-β是一种双重转录因子, 在抑瘤和成瘤过程中通过不同的途径发挥不同作用。TGF-β通过Smad信号与非Smad信号使乳腺癌细胞上皮表型E-cadherin下调及间叶表型N-cadherin与vimentin上调, 这个过程由转录因子Snail, Twist和ZEB (包括ZEB1和ZEB2) 调控, 他们是E-cadherin的转录抑制因子[13]。EMT时, 最常见的是miR-205和miR-200家族水平下降。miR-200家族通过直接抑制编码ZEB1和ZEB2的mRNA表达抑制EMT过程, 维持细胞的上皮表型[16]。
4. 结语
乳腺癌干细胞不仅具有自我更新和多向分化的潜能, 它对于放化疗抵抗作用也广为报道。相对于非干性细胞, 乳腺癌干细胞对放射治疗具有抵抗性。研究发现[18], 人体乳腺组织中已经分化的癌细胞经放射线照射后, 表现出BCSC的特性, 这种放疗抵抗性可能与Notch信号途径、转录因子Oct4和Sox2的活化有关。接受新辅助化疗后癌组织中乳腺癌干细胞的数量也会明显增加[19]。乳腺癌干细胞发挥化疗抵抗作用的原因可能是细胞膜上高水平表达的ABC转运蛋白, ABCG能够利用水解ATP的能量将各种药物从细胞质内转运到细胞外, 从而保护乳腺癌干细胞免受化疗药物的损伤[20]。因此, ABCG抑制剂可能成为杀死乳腺癌干细胞的潜在靶点。
浆细胞性乳腺炎研究现状 篇7
1病因
现代医学对此病大致认为是自身免疫性疾病。苏莉等[1]通过免疫组化法对患者乳腺小叶、乳腺间质和乳腺导管周围组织检测,结果提示其中CD3、CD20、CD45均为阳性,也同时发现少量淋巴细胞及CD68阳性的巨噬细胞浸润。付嘉等[2]研究显示CD4十、CD25十、Treg在浆细胞乳腺炎疾病进展中发挥作用,并且对PCM患者CD4十、CD25十Treg数量的检测也可为乳腺癌的鉴别诊断提供线索。PCM是由于各种原因引起乳腺导管不规则扩张,导管内分泌物积聚、堵塞,从而导致的自身免疫反应的免疫性疾病。赵红梅等[3]通过对比乳腺导管扩张症和浆细胞性乳腺炎的差异提出PCM是以乳头周围主导管内容物积聚、堵塞为病变基础的乳腺导管扩张综合征,是随着疾病的进展而出现的局部浆细胞浸润,所以PCM并不是某一单独的病变,而是因为乳腺导管扩张产生出现,二者属于同一疾病,但处于不同阶段。孙俊平、许红卫、Bun-Bred等[4,5,6]通过各自研究发现提出PCM可能与以下因素有关:(1)乳头部位或乳房发育不良以及其他原因造成乳孔闭塞。乳腺分泌物排泄不畅,导管内分泌物淤积,由于脂性淤积物能与乳腺管壁相互作用,引起炎性反应,诱发浆细胞、淋巴细胞浸润,形成炎性包块,逐渐成脓、破溃。(2)炎症。乳腺炎症促使局部乳管发生增生,导致管腔狭窄、闭塞,管内分泌物积聚,不能顺利排出,从而诱发淋巴细胞浸润。(3)乳腺退行性变。如因反复妊娠或卵巢功能衰退使得乳腺导管退行性病变,出现管壁上皮细胞维持张力功能降低,导管紧张度下降,排泄导管内分泌物能力减弱。(4)哺乳。由于错误的哺乳习惯和不良的卫生条件,易导致乳汁分泌、排泄障碍,引发乳汁在导管内淤积,出现管腔堵塞。(5)内分泌失调。伴随患者年龄的增长,出现卵巢功能衰退,性激素的水平也随之发生改变,诱发导管扩张,管腔内分泌物积聚,从而诱发浆细胞、淋巴细胞浸润。(6)吸烟:吸烟作为一个重要因素,发现乳房局部残留类脂过氧化物、可铁宁、烟酸等一系列代谢剩余物物,引起局部组织损伤,导致厌氧菌在导管内滋生而诱发化脓性典型表现。(7)乳房外伤、手术、乳腺炎等炎性增生致造成导管中断、管腔狭窄闭塞。(8)运用精神类药物[7]。
2病理
2.1浆细胞性乳腺炎的病理表现
PCM病理大体表现为乳头、乳晕下肿块,质地较硬,境界不清楚,直径范围多在1~3cm,可见扩张的导管或小囊,大小不等,内含棕黄色粘稠物,管周厚壁呈灰白色。光镜表现早期病变局限于乳晕下大导管及输乳管,后期可累计乳腺区段导管。唐文等[8]研究发现PCM早期病理主要表现为导管上皮组织的不规则增生,乳腺导管管腔增大,管腔内有脂质性分泌物、脱落上皮、胆固醇结晶或钙化灶,以及泡沫状组织细胞,乳腺导管附近组织呈现不同程度纤维改变,同时存在一定炎症细胞浸润。尤其到了晚期,病变腺体可见乳腺导管厚度增加、纤维化加重,伴有浆细胞为主浸润,可导致纤维化管腔闭塞,其周围常可见一圈或几个被覆上皮的小管。马榕[9]根据其不同病理过程将PCM分导管扩张期、炎块期、脓肿期和瘘管期。
2.2浆细胞性乳腺炎的病理生理
激素的不正常刺激以及乳腺导管闭塞不通畅是导致PCM的主要原因,而以厌氧菌为主的微生物繁殖成为加剧病情、加重感染的重要因素。导管上皮细胞初期不规则增生以及脂类物质的大量分泌,致使乳腺导管扩张,进而出现管内脂质分解,诱发管腔内部异常化学物质的生成,引起乳腺导管内无菌性炎症反应和管壁纤维化,无菌性炎症促使较多浆细胞、淋巴细胞及中性细胞汇集,以浆细胞为主;导管内部纤维化改变导致组织挛缩,进一步加剧阻塞乳管;无菌性炎症逐渐发展、扩大,突破单一乳管延伸到相邻的乳腺导管及周围组织,形成肿块,继而形成脓肿,如果破溃形成瘘管。
3浆细胞性乳腺炎的细菌学表现
在实际临床中PCM细菌学检查结果多为阴性,但进一步研究表明PCM局部仍存在多种分枝杆菌感染,主要为溃疡分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、偶然分枝杆菌和海分枝杆菌等。林特夫、许涛等人在不同研究中对PCM患者的病理学标本进行重新切片、检测,结论提示L型结核分枝杆菌的检出率达到73.20%(牛型卡介苗抗体免疫组化染色)和60.70%(IK抗酸染色),发现研究患者的PCM可能与L型结核分枝杆菌感染有较高的相关性。但随着抗菌药物的广泛使用,分枝杆菌可引发各系统非典型炎症反应,而PCM即为此类,属于一种慢性的、非特异性疾病,由于临床表现、体征无明显特异性,所以分枝杆菌为主细菌学检查结果对诊断显得尤为重要[10,11]。
4浆细胞性乳腺炎的影像学表现
PCM乳腺钼靶X射线影像结果提示以乳晕或乳腺中央为中心,出现散在不规则片状影,或结节样、条索状影像。原本相对对称的乳腺导管呈不规则、不对称分布,病变邻近区域乳腺结构略紊乱,部分患者可能存在积油囊肿,但又与乳腺癌“根粗尖细”的浸润毛刺影有较明显区别[12]。欧阳羽等[13]对经过临床和病理检测明确诊断的患者的影像学结果进行研究,结果提示所有浆细胞性乳腺炎患者的乳腺钼靶影像学结果未见特殊表现,而肿块影、团块影、结节影、乳晕下导管扩张或仅为阴性表现。马骥等人对通过对51例确诊PCM患者行MRI检测,包括T1WI、T2WI平扫和动态增强3DT1W扫描,发现PCM患者的MRI影像学具有特征性,它既能发现晕周病变,也能查出多种类型炎性结节和脓肿,另外也可以有效提示病灶范围、大小、与周围组织的关系等,对于PCM的分期、诊断、治疗、预后评估提供重要的参考[14,15,16]。
5浆细胞性乳腺炎的分期
(1)根据其不同病理过程将其分为不同的期别[9]:导管扩张期、炎块期、脓肿期和瘘管期。(1)扩张期,是疾病的初始阶段,主要表现为乳腺导管的不规则扩张,并出现脂质物质淤积。(2)炎块期,又被称为“肿块期”。主要为导管内脂质分泌物逐渐增多,炎症反应加重,出现管壁的纤维化及不同程度的破坏;含脂质的分泌物因为管壁的破坏而进入周围组织,造成乳腺及导管周围发生严重的炎症反应,进而产生不规则肉芽肿。(3)脓肿期,是既往于前两期的基础上,严重的感染和炎症反应在病变局部形成脓肿。(4)瘘管期,因脓肿久治不愈,引流后瘘管未能正常愈合所致。
(2)根据病程将PCM分为3期:(1)急性期,病程约为2周,乳房肿块伴有疼痛、肿胀、皮肤发红等急性乳腺炎的表现,但全身反应轻,无明显发热。(2)亚急性期,约为3周,炎样症状消失,出现乳房肿块,并与皮肤粘连。(3)慢性期,可持续一至十数年,乳房肿块可缩小成硬结状,乳头回缩,乳晕区皮肤及乳头可见屡管。
6治疗
根据PCM各个阶段临床表现及病理变化,目前治疗主要针对其各自特点采用相应更有针对性的治疗对策。
6.1导管扩张期
此阶段多数患者并无明显炎症反应和临床症状,多数患者未能的重视。随着病情的变化、加重,部分患者可能出现乳头乳晕区疼痛,挤压乳头有“奶酪”样物质被挤出。此时的治疗一般不采用手术治疗,主要是促进乳腺导管的通畅,避免用力挤压,产生管壁的破损。可以使用碘伏等消毒剂局部清洗,并保持乳房皮肤干燥、清洁。也可针对G+球菌及厌氧菌选择适当的抗生素口服治疗,并给予激素控制炎症反应,控制或减轻主要的临床症状。对于病情反复发作的患者,可选择手术治疗切除病变部位的乳管以及所在的整个腺叶[17]。周晓斌等[18]使用地塞米松联合不同方法针对本病不同分期进行治疗,在导管扩张期及肿块期,以激素治疗为主,联合抗感染治疗及局部理疗,取得了满意的效果。隆建萍[19]给予各期PCM患者以强的松联合中药治疗,总有效率88.2%,治疗后进行6个月的随访,仅有3例患者病情反复(占7.3%)。
6.2炎块期
此阶段局部存在较重的炎症反应,局部出现明显红肿、疼痛,回流区附近淋巴结肿大,局部表皮与内部肿块粘连,钼靶X线摄片局部无明显的密度增高阴影,B超提示肿块内呈强回声斑与液性暗区交错的信号。治疗策略主要予以足量的抗炎治疗,可口服或静脉给予抗生素,待炎症控制后可择期手术切除病变乳房内的所有导管及腺叶。若炎症反应进一步加重,造成乳头后方相邻输乳管受累时,手术时应切除病变乳头后方所有的输乳管。苏莉等[20]针对PCM肿块期的患者,采用激素联合抗生素的方法,予以2%利多卡因2m L+阿米卡星0.2g+曲安奈德40mg在肿块局部行封闭治疗,治疗有效率93.33%。刘蕾等[21]对30例导管扩张期及炎块期PCM患者,使用甲硝哇溶液、地塞米松溶液,采用以乳管镜冲洗治疗为主的方法治疗,有效率达93.3%。
6.3脓肿期
病变从乳头扩展到乳晕区,此期可根据炎症程度及脓液多少采取偏向性治疗:消炎为主或者切开排脓为主。有报道采用服用激素治疗,待病灶局限后再行手术切除病灶,既能够最大限度保持乳腺的外形,又可以减少术后复发率[22]。高雅军等[23,24,25]根据PCM的不同分期,在控制炎症反应的基础上,采取相对应的手术方式治疗。如乳腺导管扩张期采取溢液乳段切除术,在炎症期行乳腺区段切除术;有脓肿形成时B超引导下行脓肿穿刺冲洗术、脓肿置管引流术或者脓肿切开引流术;在瘘管期或者窦道形成时行瘘管或窦道切除术,取得一定的疗效。
6.4瘘管期
由于病情加重或之前三期治疗欠彻底,脓肿破溃,局部伤口或切口反复破溃,PCM演变至瘘管期,形成难以愈合的慢性瘘管。此期治疗方式首选手术治疗。因病变累积到所有乳腺导管,手术须以瘘管口为中心,彻底清除病变范围的腺体、组织[26]。由于此期病变广泛,可以采用皮下乳腺切除术,避免术后复发。病变切除后,应对残端导管用电刀烧灼破坏,并彻底冲洗、负压引流。由于PCM可能与非结核分枝杆菌感染存在联系,故一线抗菌药物推荐使用喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺、部分头孢类药物,力求根据细菌学特征选择特异性抗生素[27,28,29]。此外,有研究使用抗分枝杆菌药物(异烟肼、利福平和乙胺丁醇三联)治疗22例多发脓肿及瘘道型PCM患者(疗程为6~12个月)也取得满意疗效。
7结语
浆细胞乳腺炎64例临床分析 篇8
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组共64例, 均为非哺乳期妇女, 年龄18~56岁, 平均37.6岁, 病程4个月~5年, 平均11个月。病变位于左侧乳房32例, 右侧乳房29例, 双侧3例。所有病例均由术后病理结果证实。
1.2 临床特点
多表现为乳腺疼痛、肿块、乳头溢液以及皮肤改变等。其中单纯以乳房肿块就诊者48例, 占75%, 肿块大小2~10cm且不规则, 质地偏硬, 长轴与导管走行一致, 边界不清, 活动差, 部分肿块与皮肤或乳头粘连;乳头溢液27例 (42%) , 乳头溢液多为淡黄色浆液性或者浑浊的黄色黏液。皮肤改变者35例 (55%) ;乳头内陷或平坦者18例 (28%) ;伴有同侧腋下淋巴结肿大并伴有不同程度的疼痛者16例 (25%) 。
1.3 辅助检查
所有病例术前均行血常规检查, 其中16例白细胞略高于正常, WBC: (10.8~11.3) ×109/m L;27例乳头溢液涂片脱落细胞学检查未找到癌细胞, 乳腺导管造影8例, 均示乳腺导管扩张。9例做近红外线扫描, 表现为实性或囊性混合占位, 边界不清。23例行彩色B超, 提示病灶位于乳晕后或乳晕周围, 内部不均匀低回声无包膜, 无恶性特征的肿块, 导管可呈囊状扩张。钼靶X线摄片30例, 乳晕区片状模糊致密型块影, 肿块边缘似有毛刺状改变, 3例表现为高密度或低密度不均匀肿块影, 边缘不清, 疑为乳癌。辅助检查有助于本病诊断, 但缺乏指导性。确诊仍需术中快速冰冻病理检查。
1.4 诊断标准
(1) 有乳头凹陷, 内翻等先天畸形病史, 伴有乳头溢液, 或粉刺样分泌物; (2) 非妊娠哺乳期发生乳晕部红肿疼痛、硬结或波动感、同侧腋下淋巴结肿大, 全身症状不明显; (3) 脓肿破溃或切开引流后形成瘘管, 经抗感染及局部引流换药后暂时愈合, 病情反复多次。
2 结果
本组病例全部实施手术。术前有明显红、肿、疼痛, 经静脉抗炎治疗及局部理疗后行病灶彻底切除14例;先行脓肿切开引流术, 待红肿痛基本消失, 肿块缩小后行病灶部位的区段或象限切除术10例。直接行病灶部位的区段或象限切除术40例。手术后住院时间7~10d, 切口一期愈合59例, 5例切口感染, 经抗炎换药治疗后于1个月内愈合。术后病理可见部分导管扩张, 伴有淋巴细胞及浆细胞浸润。38例患者随访6~49个月, 术后均无复发。
3 讨论
一般认为浆细胞性乳腺炎与哺乳障碍、乳腺外伤、先天性乳头畸形或发育不良、炎症、内分泌失调、乳腺退行性变有关, 也有人认为其发生可能与厌氧菌感染有关。乳腺内积聚的类脂过氧化物引起局部组织损伤, 导致厌氧菌在乳管内滋生而引起化脓性炎症。本病病理特点是由于导管上皮不规则增生, 导管扩张, 周围大量组织细胞中性粒细胞淋巴细胞尤以浆细胞显著分泌功能失常, 使乳头的输乳管内有大量含脂质的分泌物积聚而引起导管扩张, 导管内容物从管内溢出, 刺激导管周围组织, 大量浆细胞浸润。乳腺导管阻塞和激素的异常刺激是该病发生的病理基础, 导管内的细菌滋生是继发感染和加重病情的重要因素。
浆细胞性乳腺炎是一种良性疾病, 预后良好, 但很少不治自愈, 目前治疗该病最有效、彻底的方法是手术切除病灶[1]。手术时机和手术方式应根据临床分期及病变范围来决定, 必须完整切除病灶, 特别是必须清除乳晕下大乳管内病灶, 否则极易复发。急性期:类似急性乳腺炎的表现, 乳晕部肿块增大, 肿痛, 发红和硬结, 可先行抗炎治疗和局部理疗, 脓肿切开引流, 待切口愈合后尽早切除病变导管。本组24例, 经手术切除扩张淤滞的导管及其瘘管, 甲硝唑冲洗术区, 术后应用抗生素, 切口一期愈合, 无复发。亚急性期:急性期缓解, 局部红肿消退、疼痛减轻, 遗留有局限性硬结或肿块。伴乳头溢液者, 从乳头根部切除病变导管。无乳头溢液者, 有结节或肿块形成的, 自乳头根部大导管至肿块的乳腺区段切除术。本组18例, 采用上述术式, 均甲级愈合。慢性期:单发的持续存在的乳房肿块, 质韧, 边界不清。本组19例, 行病变导管区段切除术加象限切除术, 术中用甲硝唑冲洗, 切口甲类愈合。对于病变占据整个乳房或有窦道形成, 伴反复感染病人, 保留乳头乳晕有困难者, 征得患者及家属同意后, 可行乳房单纯切除。
浆细胞性乳腺炎临床表现复杂多样, 术前的确诊率较低, 与急性乳腺炎、乳管内乳头状瘤、乳腺癌等鉴别困难, 对于40岁以上的妇女更易误诊为乳癌。本病发病年龄较轻 (较乳腺癌年轻10岁左右) , 多见于30~40岁的已婚、经产、非哺乳期妇女。多以乳房肿块为首发症状而就诊, 肿块多位于乳晕深部, 且伴有疼痛。病程长短不一, 多伴有乳头发育不良及哺乳不畅史, 常有乳头溢液, 以浆液性或脓性多见, B超示导管扩张。腋窝淋巴结肿多呈炎性反应, 伴有触痛。故应从肿块部位、病程、溢液性状等进行分析。本病急性炎症期, 应与急性乳腺炎 (多为哺乳期或妊娠期妇女, 炎症反应较本病重) 相鉴别。在拟行乳癌根治术前, 应常规行术中快速冰冻切片检查, 进一步确诊, 以提高手术准确率。
参考文献
乳腺颗粒细胞瘤1例临床病理分析 篇9
关键词：乳腺颗粒细胞瘤,病理,诊断,鉴别诊断
乳腺颗粒细胞瘤是一种比较少见的乳腺肿瘤[1], 自1993年至今, 此病例是我院诊断的惟一患者。该病例临床认为是乳腺癌, 行术中快速冰冻检查, 大体取材时亦认为是乳腺癌, 足见其诊断难度。本文结合其临床症状、体征、影像学检查结果、组织病理特点、相关疾病的鉴别诊断及相关的文献资料等进行讨论, 以提高对此类肿瘤的认识, 减少误诊。
1 材料
采取本例的术中快速冰冻切片与常规石蜡切片, 所有常规切片均为10%的福尔马林固定, 脱水, 石蜡包埋, 连续切片, 并经过HE染色。
2 临床资料
患者, 女, 52岁, 因发现左乳约“樱桃”大小肿块入院。查体:双乳房对称, 无局限性隆起或凹陷, 皮肤无红肿及橘皮样外观, 乳头、乳晕无糜烂, 左乳内下象限可扪及一直径约2 cm质硬肿块, 边界不清, 无压痛, 活动度一般。B超检查示左乳内下象限探及1.4 cm×1.3 cm低回声区, 边界不清, 内回声不均匀[2,3]。各种辅助检查均未能给出明确诊断, 故本例患者施行了全麻下左乳肿块切除活检术, 术中诊断考虑乳腺颗粒细胞瘤, 术后未行乳腺扩大切除, 要求术后患者随诊观察。
3 病理相关性研究
3.1 肉眼
乳腺组织一块, 大小约4 cm×3 cm×2 cm, 切面见一灰白色不规则质硬区, 与周围组织边界不清, 无明显点状坏死。
3.2 HE切片
(1) 瘤组织间未见正常小叶结构残留, 瘤细胞与周围脂肪组织无明显界限, 呈浸润性生长, 未见明显包膜。 (2) 瘤细胞呈圆形或多边形, 细胞间边界不清, 胞浆丰富淡染, 胞浆内充满嗜酸性颗粒, 颗粒细小均质, 细胞核小, 染色淡, 多呈小圆形, 位于细胞中央, 无明显异型性[1]。并且所制3张切片均未查见病理性核分裂象[1,4]及凝固性坏死。 (3) 瘤细胞间有丰富的胶原纤维, 胶原纤维分隔瘤细胞呈团样、巢样排列[5], 瘤细胞未侵犯脉管。本例切片, 我院快速冰冻结果为考虑乳腺颗粒细胞瘤, 后为行进一步确诊, 遂远程会诊山东省省立医院王家耀教授, 最终确定诊断为乳腺颗粒细胞瘤。
3.3 鉴别诊断
3.3.1 在冰冻及石蜡切片上, 此病常误诊为乳腺癌, 尤其在冰冻切片上, 若不能作出明确诊断, 可待常规石蜡诊断, 以防手术做大。乳腺癌的细胞核一般核深染, 异型性较明显, 常见的小叶浸润癌和导管浸润癌均有其特征性表现。
3.3.2 常规HE切片中, 胶原纤维明显, 应注意与硬癌的鉴别[1,4,5]。
3.3.3 乳腺大汗腺癌是由大汗腺化生的癌细胞构成, 其瘤细胞胞浆丰富, 均质嗜酸性或呈颗粒状, 与颗粒细胞瘤相似。但大汗腺癌细胞核增大, 核仁明显, 可见核分裂象[6]。
3.3.4 需与少见的特殊类型的乳腺癌鉴别, 如浸润性脂质分泌性癌、组织细胞样癌和鳞状细胞癌[1,4,5], 必要时可用免疫组化鉴别。
3.3.5 应注意与组织细胞性病变和转移性肿瘤 (尤其是肝肿瘤) 相鉴别[4,5]。
3.4 免疫组化
由于本院部分条件限制, 只做了CK、S-100。CK阴性, S-100强阳性, 故支持有关报道中的神经源性[1,2,3,4,5,6]。
4 讨论
乳腺颗粒细胞瘤 (granular cell tumor, GCT) , 是一种少见的以良性增生为主的病变, 可发生于任何年龄, 身体的任何部位, 乳腺相对少见, 以15岁~74岁多见, 女性远多于男性[1,4,5]。GCT常表现为乳腺实质内的单发、质硬和无痛性包块, 但表浅的肿瘤可以导致皮肤皱缩, 甚至乳头内陷, 较深部的肿瘤可累及深筋膜。对于颗粒细胞瘤的组织发生, 各种说法未统一, 最初被认为是肌源性肿瘤, 现在认为此瘤可能来源于外周神经的雪旺细胞。乳腺颗粒细胞瘤恶性者少见, 目前国际上关于恶性GCT缺乏统一的判断标准, 文献中Fanburg-Smith等人提出恶性者的5个判断指标:瘤细胞变为梭形, 空泡状核并有大核仁, 核分裂象 (≥2个/10个HPF) , 肿瘤性坏死, 高核质比和多形性[5]。本例并不符合恶性标准, 应为良性的颗粒细胞瘤, 故本例只做了肿物切除, 并未进行乳腺扩大根治手术, 并要求患者随访观察。
目前, 对乳腺颗粒细胞瘤手术完全切除后通常预后较好, 但切除不彻底可出现局部复发。局部切除、必要时加区域淋巴结清扫是外科认为的乳腺颗粒细胞瘤的主要治疗手段[1,2,3,4,5,6]。
参考文献
[1]武忠弼, 杨光华.中华外科病理学[M].北京:人民卫生出版社, 2002:1681.
[2]陈红妮, 王功普, 赵斌先.乳腺颗粒细胞瘤1例临床诊断和病理分析[J].中国现代医生, 2011, 49 (9) :118-129.
[3]柳莉莎, 冷晓玲.乳腺颗粒细胞瘤超声表现1例[J].中国临床医学影像杂志, 2007, 18 (8) :578.
[4]张杰, 许俊龙, 尹艳华, 等.乳腺颗粒细胞瘤2例临床病理及免疫组化分析[J].肿瘤防治研究, 2006, 33 (9) :665-666.
[5]郭云泉, 赵峰, 房新志, 等.乳腺颗粒细胞瘤9例临床病理分析[J].临床与实验病理学杂志, 2011, 27 (5) :495-498.
乳腺细胞 篇10
关键词：人乳腺肿瘤上皮细胞系；生物反应器；胶质细胞源性神经营养因子；表达载体；帕金森病
中图分类号： Q789文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0016-04
收稿日期：2014-07-23
基金项目：国家自然科学基金（编号：31060304）；内蒙古高等学校科学研究项目（编号：NJ10184） 。
作者简介：张学明（1970—），男，内蒙古包头人，博士，副教授，主要研究方向为重组药物蛋白。E-mail：byzhxm@126.com。帕金森病（Parkinsons disease，PD）是老年人群中常见的一种神经元退行性疾病，其临床表现主要是以静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势平衡障碍为特征。PD的病理特征主要是中脑黑质多巴胺能神经元退行性丧失，导致纹状体中多巴胺含量显著降低[1]。目前用于PD临床治疗的常规药物主要有复方左旋多巴、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物等，这些药物能够暂时减轻或缓解症状，但不能阻止PD的进程，且长期用于PD治疗会出现多种并发症[2]；因而，研制开发新的药物用于PD的有效治疗是非常必要的。
胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-direved neurotrophic factor，GDNF）是由Lin等于1993年在B49神经胶质瘤细胞中分离纯化出的一种分泌性糖蛋白，属于TGF-β超家族成员[3]。研究表明，GDNF对多巴胺能神经元具有营养及保护作用[4]，应用GDNF治疗帕金森病已进入二期临床研究[5]。然而由于GDNF在人和动物体中含量低，从动物组织中分离纯化GDNF用于疾病动物模型和临床实验研究是不现实的；因而，应用转基因技术大量生产重组GDNF用于疾病动物模型和临床研究具有潜在的重大社会效益和经济效益。
本研究构建了牛β-casein基因启动子驱动的人GDNF基因乳腺上皮细胞高效特异表达载体，转染人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37细胞，获得了能够表达重组人GDNF蛋白的转基因Bcap-37细胞系，为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白，并将其用于帕金森病临床治疗的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
大肠杆菌DH5α、pP40R、pCMV-Red、pUC-gdnf为内蒙古科技大学包头医学院医学生物化学实验室保存。
质粒提取试剂盒（QIAGEN公司）、小量RNA提取试剂盒（上海舜华生物工程有限公司）、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN公司）、DNA纯化试剂盒（TIANGEN公司）。
Taq Plus、Pfu DNA聚合酶购自TIANGEN公司；T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、M-MLV反转录酶、Oligo（dt）、限制性内切酶均为TaKaRa产品。
人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37购自中国科学院上海细胞研究所；RPMI-1640、催乳素、氢化可的松、胰岛素购自Sigma 公司；兔抗人多克隆GDNF抗体（Rabbit Polyclonal GDNF Antibody）购自Santa Cruz公司；连接了碱性磷酸酶的羊抗兔二抗（Goat Anti-rabbit Second Antibody Conjugated with Alkaline Phosphatase）及 BCIP/NBT 试剂盒购自博士德公司。
1.2试验方法
1.2.1重组人gdnf乳腺特异表达载体的构建根据Bonsing等发表的牛β-casein基因序列（M55188）[6]设计PCR上游引物：5′-TCTGGGCCCGAAAAGGGAAATGTTGAATGGGAAG-3′，下游引物：5′-GGCCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA-3′，上下游引物两端分别引入ApaⅠ和XhoⅠ 酶切位点。提取牛基因组DNA，PCR扩增牛β-casein基因5′端上游包括启动子、第1外显子、第1内含子及部分第2外显子的3.6 kb调控序列，经ApaⅠ/XhoⅠ双酶切后插入到骨架载体pP40R[7]的ApaⅠ/XhoⅠ双酶切位点作为gdnf cDNA乳腺特异表达的调控序列。XhoⅠ 酶切质粒pUC-gdnf获得人gdnf cDNA基因插入到牛β-casein基因5′端3.6 kb调控序列下游的XhoⅠ位点。PCR检测gdnf cDNA的插入方向，PCR上游引物设计在载体3.6 kb调控序列上，引物序列为5′-ACTATTTCCTCATCTTCCCATTCCCAG-3′，下游引物设计在gdnf cDNA序列上，引物序列为5′-GAGCTCCAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反应条件：94 ℃变性45 s，62 ℃复性45 s，72 ℃ 延伸1 min，共35个循环。正向插入将获得598 bp的特异产物，反向插入则无特异性PCR产物。载体构建完成后，对载体与片段连接处、牛β-casein基因5′端调控序列核心区域进行测序。
1.2.2Bcap-37细胞的稳定转染与筛选用含20%胎牛血清（fetal calf serum，FBS） 的RPMI-1640培养液，于37 ℃、5%浓度、饱和湿度条件下培养B-cap37细胞至70%～80%汇合时，消化细胞，以3×105个细胞/孔接种于6孔板。24 h后，按照脂质体Lipofectamine操作说明，每孔加入2.0 μg 线性化载体DNA转染细胞。48 h后，消化每孔细胞接种于 100 mm 培养皿中，并加入浓度为300 μg/mL 的G418筛选8～10 d后，将表达红色荧光蛋白的细胞克隆分离、扩培、冷冻保存备用。
1.2.3PCR检测稳定转染细胞提取稳定转染细胞基因组DNA，PCR检测 gdnf cDNA是否整合到细胞基因组DNA中。PCR 上游引物：5′-GACCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3′，下游引物：5′-GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3′；反应条件为：94 ℃变性45 s，58 ℃ 复性45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环。
1.2.4转基因细胞的诱导表达阳性转基因细胞生长至80%汇合时，更换诱导培养基（RPMI-1640+4 μg/mL催乳素+10 μg/mL胰岛素+1 μg/mL氢化可的松），分别诱导培养24、48 h 后，收集细胞及细胞培养上清液。
1.2.5RT-PCR分析gdnf的表达诱导培养的细胞按照RNA提取试剂盒操作说明提取RNA，以1.0 μg RNA为模板反转录合成cDNA第1链。以cDNA为模板PCR检测转基因细胞诱导培养后是否有 gdnf 在mRNA水平的表达。PCR引物、反应条件同“1.2.3”节。
1.2.6Western Blot 检测 gdnf 的表达三氯乙酸法浓缩细胞诱导培养上清液，Lorry法测定蛋白浓度。取40 μg 蛋白，12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封膜，一抗4 ℃过夜杂交，二抗室温孵育1 h，BCIP/NBT显色。
2结果与分析
2.1重组人gdnf乳腺特异表达载体的鉴定
载体物理图谱见图1，PCR检测目的基因gdnf的插入方向见图2。酶切鉴定gdnf 插入方向正确的载体，用ApaⅠ单酶切载体后，线性载体大小与预期大小（11 507 bp）相符；用XhoⅠ酶切载体能够获得预期的576 bp的目的基因 gdnf 片段；用ApaⅠ/XhoⅠ双酶切载体能够获得预期的3.6 kb调控序列片段和576 bp目的基因gdnf 片段（图3）。载体与片段连接处、牛β-casein基因5′端调控序列核心区域的测序结果正确（数据未显示）。结果表明，本研究成功构建了以neo基因和DsRed2作为双筛选因子、牛β-casein基因5′端调控序列驱动的重组人 gdnf 乳腺特异表达载体。
2.2转基因细胞的鉴定
线性化载体转染B-cap37细胞，G418筛选8～10 d 后，获得了表达红色荧光蛋白的细胞克隆（图4）。分离扩培红色荧光细胞，提取基因组DNA，PCR扩增重组人gdnf，发现未转染细胞无特异条带，而稳定转染的红荧光细胞获得了与预期一致的特异条带（图5），表明重组人gdnf已整合到细胞基因组之中。
2.3gdnf 基因的诱导表达
2.3.1RT-PCR检测阳性转基因细胞及未转染细胞诱导培养24、48h后提取RNA，以RNA为模板PCR扩增 gdnf cDNA，无特异条带产生，表明RNA未受基因组DNA污染；以RNA为模板反转录合成cDNA第1链，PCR扩增 gdnf cDNA基因，诱导培养24、48 h的转基因细胞获得了558 bp特异条带，而阴性对照无特异条带产生（图6）。结果表明牛β-casein基因启动子能够驱动gdnf cDNA基因转录为mRNA。
2.3.2Western Blot检测诱导培养48 h的转基因细胞上清液经Western Blot探测，有大约15、18 ku 的2条特异带形成，而未转染细胞无特异带形成（图7），表明 gdnf cDNA基因能够翻译成蛋白，而且能进行翻译后加工形成糖蛋白分泌到细胞外。
3结论与讨论
当前，用于疾病动物模型和临床研究的重组人GDNF是用转基因大肠杆菌发酵制备的[8]。用大肠杆菌生产的重组人GDNF不能被糖基化[8]。临床研究表明，糖基虽然对GDNF的神經营养功能不是必要的，但在帕金森病Ⅱ期临床研究中，约有10%的病人由于重组人GDNF缺乏糖基化而产生了抗GDNF抗体的免疫反应[9]；因而，利用大肠杆菌生产重组蛋白虽然快速经济，但该表达系统由于缺乏翻译后修饰功能，而不适用于需要进行翻译后修饰的重组蛋白的生产。而且，已有研究表明利用大肠杆菌生产的重组人GDNF由于蛋
白质的错误折叠而影响了其生物学功能[10]。也有研究者用昆虫细胞和酵母菌制备重组人GDNF，这些低等真核细胞虽然可以表达糖基化的重组人GDNF，但其糖基化与天然的人GDNF的糖基化有差异[11-13]，从而在临床研究中同样存在安全问题。
当前，需要进行翻译后修饰的重组蛋白大多用非人类的哺乳动物细胞进行表达[14]。用非人类的哺乳动物细胞可以表达与天然人蛋白结构一致的重组人蛋白，但也有时候存在差异[15]；因而在治疗应用上，人们更希望利用人细胞系来生产与天然人蛋白结构完全一致的重组人蛋白[16]。
本研究将人gdnf cDNA插入到3.6 kb牛β-casein基因5′端调控序列下游，并用SV40 polyA序列作为其转录终止信号，构建了重组人 gdnf 乳腺特异表达载体。将其转入人乳腺肿瘤细胞系Bcap-37中，获得了随机整合转基因细胞，用激素诱导表达后在细胞上清液中检测到了重组人GDNF蛋白。人GDNF蛋白为同源二聚体糖蛋白，单体糖蛋白18 ku，去糖基化单体约15 ku[17]。本研究从激素诱导的转基因细胞上清液中通过Western Blot 探测到约15、18 ku的2条特异条带，且重组人GDNF蛋白绝大部分为糖基化蛋白（图7）。由于该重组蛋白是用人乳腺肿瘤细胞系作为反应器制备的，因而，我们推测在人乳腺肿瘤细胞系Bcap-37中表达的18 ku重组人GDNF蛋白与天然的人GDNF相比，在结构上应当没有差异，如果用于临床研究应当更具有安全性。本研究为高效制备与天然人GDNF蛋白结构完全一致的重组人GDNF蛋白用于帕金森病临床治疗研究奠定了基础。
参考文献：
[1]Dauer W，Przedborski S. Parkinsons disease：mechanisms and models[J]. Neuron，2003，39（6）：889-909.
[2]谢瑞满. 帕金森病研究进展[J]. 现代实用医学， 2003，15（7）：401-404.
[3]Lin F L，Doherty D H，Lile J D，et al. GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J]. Science，1993，260（5111）：1130-1132.
[4]Tomac A，Lindqvist E，Lin，F L，et al. Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo[J]. Nature，1995，373（6512）：335-339.
[5]Slevin J T，Gerhardt G A，Smith C D，et al. Improvement of bilateral motor functions in patients with Parkinson disease through the unilateral intraputaminal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor[J]. Journal of Neurosurgery，2005，102（2）：216-222.
[6]Bonsing J，Ring J M，Stewart A F，et al. Complete nucleotide sequence of the bovine beta-casein gene[J]. Australian Journal of Biological Sciences，1988，41（4）：527-537.
[7]张学明，罗奋华，苏慧敏，等. 人gdnf基因的克隆及牛β-酪蛋白基因座定位整合载体的构建[J]. 生物技术通报，2009（5）：113-118.
[8]Slevin J T，Gash D M，Smith C D，et al. Unilateral intraputamenal glial cell line-derivedneurotrophic factor in patients with Parkinson disease：response to 1 year of treatment and 1 year of withdrawal[J]. Journal of Neurosurgery，2007，106（4）：614-620.
[9]Lang A E，Gill S，Patel N K，et al. Randomized controlled trial of intraputamenal glial cell line-derived neurotrophic factor infusion in Parkinson disease[J]. Annals of Neurology，2006，59（3）：459-466.
[10]陈哲宇，何志勇，何成，等. 人GDNF结构与功能关系[J]. 生物化学与生物物理学报，2000，32（3）：243-247.
[11]陈哲宇，黄爱军，何成，等. 人GDNF在甲醇酵母及家蚕幼虫中的表达[J]. 生物工程学报，2000，16（5）：561-565.
[12]Jarvis D L，Kawar Z S，Hollister J R. Engineering N-glycosylation pathways in the baculovirus-insect cell system[J]. Current Opinion in Biotechnology，1998，9（5）：528-533.
[13]Wildt S，Gerngross T U. The humanization of N-glycosylation pathways in yeast[J]. Nature Reviews Microbiology，2005，3（2）：119-128.
[14]Chu L， Robinson D K. Industrial choices for protein production by large-scale cell culture[J]. Curr Opin Biotechnol，2001，12（2）：180-187.
[15]Bsze Z，Baranyi M，Whitelaw C B. Producing recombinant human milk proteins in the milk of livestock species[J]. Adv Exp Med Biol，2008，357-393.
[16]Lee S B，Park J S，Lee S，et al. Overproduction of recombinant human VEGF（vascular endothelial growth factor） in Chinese hamster ovary cells[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2008，18（1）：183-187.
[17]Grimm L，Holinski-Feder E，Teodoridis J，et al. Analysis of the human GDNF gene reveals an inducible promoter，three exons，a triplet repeat within the 3′-UTR and alternative splice products[J]. Human Molecular Genetics，1998，7（12）：1873-1886.
乳腺细胞 篇11
越来越多的研究证实,固有免疫系统的活化和炎症反应是很多疾病发生发展的重要病理过程。固有免疫系统通过模式识别受体( pattern - recognition receptors,PRRs) 识别病原相关分子模式( pathogen - associated molecularpatterns,PAMPs) 和损伤相关分子模式( damage - associated molecular patterns,DAMPs) ,来应答病原入侵或者组织损伤。NLRs( NOD - 1ike receptors,NLRs) 和TLRs ( toll - like receptors,TLRs)是PRRs中的两个主要亚家族,能够对病原侵袭和组织损伤做出迅速的应答。核苷酸结合寡聚化结构域2( NOD2) 属于NLRs亚家族成员,在固有免疫和适应性免疫中都发挥着重要的作用。NOD2 能够被革兰氏阳性菌和阴性菌的共同产物识别并激活,例如胞壁酰二肽( muramyl dipeptide,MDP) 是一种肽聚糖衍生物,能够识别NOD2 受体,从而引起NF - KB以及丝裂原激活蛋白激酶( mitogen - activated protein kinase,MAPK) 的活化,进而启动致炎因子的转录[2]。
本研究以小鼠为模型,采用不同浓度的MDP在体乳腺内灌注和对体外小鼠乳腺上皮细胞采用不同浓度的MDP刺激,观察小鼠乳腺组织的病理组织学变化,乳腺组织及细胞中NOD2、RIP2 表达的变化,以及炎性细胞因子TNF - α、IL - 6 的表达变化,为NOD2 介导的炎性信号通路的研究提供一定的依据。
1 材料与方法
1. 1 在体试验
Balb / c小鼠,购自长春市生物制品研究所,适应性饲养1 周后将雄鼠和雌鼠按照1∶2 的比例合笼饲养,使雌鼠受孕。将受孕雌鼠随机分为正常对照组和3 个试验组,每组6 只。受孕雌鼠产仔后7 天,经乙醚麻醉,将灌注针经第4 对乳腺的乳头管插入乳腺,对照组缓慢灌注生理盐水50 μL,试验组分别注入不同浓度的MDP( 0. 02,0. 06,0. 2 μg /μL) 各50 μL,灌注后母鼠与仔鼠隔离饲养。灌注12 h后处死小鼠,消毒腹部,无菌操作剪开腹部,暴露并分离第4 对乳腺: 一侧乳腺组织用中性甲醛固定,制作石蜡切片,H. E. 染色后用光学显微镜进行病理组织学观察; 另一侧乳腺冻存于液氮中,用于提取RNA。
1. 2 体外试验
用Ⅰ型胶原酶消化法获得小鼠乳腺上皮细胞,使其在含10% 胎牛血清( FBS) 、100 IU/m L青霉素和100 μg / m L链霉素的DMEM / F12 培养基中生长,隔天换液。将细胞接种于12 孔板中,放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养,当细胞融合至80% 时,将细胞分为3 个试验组和1 个对照组,试验组分别加入1,3,10 μg / m L的MDP各1 m L,对照组加入1 m L DMEM /F12 培养基,每组设3 个重复孔,12 h后收集细胞。
1. 3 荧光定量PCR检测
按照Mini BEST Universal RNA Extraction Kit说明提取小鼠乳腺组织总RNA,用核酸测定仪检测RNA的浓度及OD值; 用Prime Script RT Reagent Kit反转录为c DNA后,用SYBR Premix Ex Taq进行实时荧光定量检测。实时荧光定量PCR所用引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列见表1。以 β - actin mRNA的表达量为内参进行目的基因相对表达量的计算。
1. 4 数据的统计与分析
采用SPSS17. 0 统计软件进行单因素方差分析,以P < 0. 05 或P < 0. 01 为具有统计学差异。
2 结果与分析
2. 1 小鼠乳腺的病理组织学变化
将MDP按不同剂量灌注小鼠乳腺12 h后,对照组乳腺腺泡正常,没有中性粒细胞的浸润; 灌注1 μg / m L和3 μg / m L MDP的小鼠乳腺腺泡有少量中性粒细胞的浸润; 灌注10 μg /m L MDP的小鼠乳腺腺泡有大量中性粒细胞的浸润。见260 页彩图1。
2. 2 MDP对小鼠乳腺组织中NOD2、RIP2、TNF - α和IL - 6 mRNA表达的影响
见260 页彩图2。
从260 页彩图2 可以看出: 对照组NOD2、RIP2、TNF - α、IL - 6 mRNA表达水平较低。MDP刺激后小鼠乳腺组织中NOD2 mRNA表达水平明显升高,并且表达量随浓度的增加而增加; 其接头分子RIP2mRNA表达水平明显升高; 细胞炎性因子TNF - αmRNA表达水平明显升高; IL - 6 mRNA表达水平较对照组升高,但是升高的幅度没有TNF - α 升高的幅度明显。
2. 3MDP对小鼠乳腺上皮细胞中NOD2、RIP2、TNF - α 和IL - 6 mRNA表达的影响
见260 页彩图3。
从260 页彩图3 可以看出: 对照组NOD2、RIP2、TNF - α、IL - 6 mRNA表达水平较低。MDP刺激后小鼠乳腺上皮细胞中NOD2 mRNA表达水平明显升高,并且表达量随浓度的增加而增加; 其接头分子RIP2 mRNA表达水平明显升高; 细胞炎性因子TNF -α mRNA表达水平明显升高; IL - 6 mRNA表达水平较对照组没有升高。
3 讨论
小鼠乳腺灌注MDP后可见乳腺腺泡有中性粒细胞浸润,表明从乳腺灌注MDP可引起乳腺炎,炎性细胞尤其是中性粒细胞流入乳腺组织,能够在感染早期有效地清除病原,这是宿主抵抗病原入侵的关键[3]。MDP普遍存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖中[4],因此,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都能够引起乳腺组织中性粒细胞的浸润。奶牛乳腺灌注MDP后可引起乳汁中趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3 和CXCL8 的显著升高,乳汁中炎性细胞因子IL - 1β 显著升高,而TNF - α 和IL - 6 有微弱的升高,这些因子在募集中性粒细胞向乳腺组织过程中起重要作用。体外试验用MDP刺激奶牛乳腺上皮细胞IL - 6 没有显著升高,而TNF - α 显著升高[5]。
本试验中,小鼠乳腺上皮细胞在MDP刺激后,TNF - α mRNA显著升高,而IL - 6 mRNA没有显著升高。不同细胞被MDP刺激后细胞因子分泌的表达量是有差别的,例如: MDP不能引起小鼠骨髓树突状细胞IL - 6 表达量的升高[6],但是可以引起小鼠原代肝窦内皮细胞IL - 6 表达量的升高,而不能引起TNF - α 表达量的升高[7]。另外,MDP能够引起人肺泡巨噬细胞和小鼠中性粒细胞TNF - α 和IL - 6 的显著升高[8,9]。小鼠乳腺上皮细胞中NOD2 受体在调控乳腺内炎症反应起重要作用,对研制乳腺NOD2受体激动剂或抑制剂作为免疫调节剂和疫苗佐剂来防治乳腺感染与炎症性疾病具有重要临床意义。
图1不同剂量的MDP注射小鼠乳腺组织的病理组织学变化(H.E.,×200)Fig.1 Histopathological changes in the mammary gland of mice injected with different doses of MDP(H.E.,×200)
图2不同剂量的MDP注射小鼠乳腺后乳腺组织中NOD2、RIP2、TNF-α、IL-6 mRNA的相对表达量Fig.2 Relative expression levels of NOD2,RIP2,TNF-αand IL-6 mRNA in the mammary gland of mice injected with different doses of MDP
图3不同剂量的MDP刺激小鼠乳腺上皮细胞后NOD2、RIP2、TNF-α、IL-6 mRNA的相对表达量Fig.3 Relative expression levels of NOD2,RIP2,TNF-αand IL-6 mRNA in the mammary epithelial cells of mice stimulated with different doses of MDP
摘要：细菌感染是引起奶牛乳腺炎的主要原因,而胞壁酰二肽(MDP)几乎存在于所有细菌中,核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)受体是天然免疫中对病原微生物的病原体相关分子模式识别的一类感受器,在机体天然免疫应答中发挥重要作用。为了研究MDP对小鼠乳腺组织和乳腺细胞NOD2表达的影响,试验以小鼠为模型,采用不同浓度的MDP在体乳腺内灌注和对体外小鼠乳腺上皮细胞用不同浓度的MDP刺激,观察小鼠乳腺组织的病理组织学变化,乳腺组织及细胞中NOD2、下游的受体作用蛋白2(RIP2)表达的变化,以及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达变化。结果表明:从乳腺灌注不同浓度MDP后可引起急性乳腺炎,乳腺组织中炎性细胞增多;MDP刺激后乳腺组织及细胞中NOD2、RIP2、TNF-αmRNA表达水平明显升高,细胞IL-6 mRNA表达水平没有明显升高。说明NOD2介导信号途径促使炎性细胞因子的表达。
关键词：小鼠,乳腺组织,乳腺上皮细胞,胞壁酰二肽(MDP),核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)
参考文献
[1]FITZGERALD J R,MONDAY S R,FOSTER T J,et al.Characterization of a putative pathogenicity island from bovine Staphylococcus aureus encoding multiple superantigens[J].J Bacteriol,2001,183(1):63-70.
[2]FRITZ J H,FERRERO R L,PHILPOTT D J,et al.Nod-like proteins in immunity,inflammation and disease[J].Nat Immunol,2006,7(12):1250-1257.
[3]PAAPE M,MEHRZAD J,ZHAO X,et al.Defense of the bovine mammary gland by polymorphonuclear neutrophil leukocytes[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2002,7(2):109-121.
[4]MOREIRA L O,ZAMBONI D S.NOD1 and NOD2 Signaling in infection and inflammation[J].Front Immunol,2012(3):328.
[5]BOUGARN S,CUNHA P,HARMACHE A,et al.Muramyl dipeptide synergizes with Staphylococcus aureus lipoteichoic acid to recruit neutrophils in the mammary gland and to stimulate mammary epithelial cells[J].Clin Vaccine Immunol,2010,17(11):1797-1809.
[6]SCHAFFLER H,DEMIRCIOGLU D D,KUHNER D,et al.NOD2stimulation by Staphylococcus aureus-derived peptidoglycan is boosted by Toll-like receptor 2 costimulation with lipoproteins in dendritic cells[J].Infect Immun,2014,82(11):4681-4688.
[7]陈明发,孙潺,林永,等.胞壁酰二肽激活小鼠原代肝窦内皮细胞中NOD2信号[J].免疫学杂志,2014,30(11):1025-1028.
[8]JUAREZ E,CARRANZA C,HERNANDZ-SANCHEZ F,et al.NOD2 enhances the innate response of alveolar macrophages to Mycobacterium tuberculosis in humans[J].Eur J Immunol,2012,42(4):880-889.