衰竭实验（共3篇）
衰竭实验 篇1
ARF是危急重症, 死亡率达20%～70%。目前对ARF现代医学和传统中医学尚无特效的治疗方法。肾生方是以温肾健脾、活血化瘀为法则自拟的中药复方制剂, 由黄芪、淫羊藿、水蛭、山楂等中药组成。临床应用有较好效果, 本文研究了肾生方对大鼠初发期ARF的防治作用, 现将结果报告如下。
1实验材料
1.1 动物
雄性Wistar大鼠, 清洁级, 体重220～250g, 购于广西医科大学实验动物中心, 合格证号:SCXK桂2003-0003。
1.2 药品
肾生方浸膏:由广西中医药研究院提供, 含1.06g生药/g, 临用时用蒸馏水配成所需浓度。地塞米松片:天津药业集团新郑股份有限公司生产, 批号:050720。
1.3 试剂
甘油:广东光华化学厂有限公司生产, 临用前加注射用生理盐水配成50%甘油生理盐水。尿素脲酶波氏法试剂盒、肌酐苦味酸法检测试剂盒:四川省迈克科技有限公司生产。钠 (Na) 测定试剂盒、钾 (K) 测定试剂盒:长春汇力生物技术有限公司产品。
1.4 仪器
722型分光光度计;80-2型离心沉淀器;BS224S型电子天平;显微镜等。
2实验方法
大鼠40只, 随机分为5组, 每组8只, 见表1。大鼠单只放入代谢笼中适应3天, 再连续收集两天尿液 (每天收集1次) , 取其平均值作为给药前大鼠的正常排尿量, 然后灌胃给药, 正常组、模型组给予以同体积蒸溜水 (10ml/kg) , 每天1次, 连续9天, 第10天处死。第6天给药后, 禁水24小时, 第7天, 除正常组外, 其余4组在乙醚浅麻醉下臀部肌肉注射50%甘油 (9ml/kg) 制备肾衰模型。造型后24小时尾部采1ml血液, 72小时腹主动脉采血 (乙醚麻醉) , 分别测定血清BUN、Cr、Na+、K+含量 (按试剂盒说明操作) 。72小时采血后处死大鼠, 取出肾脏称重、计算脏器系数并作肾组织病理学检查。统计学方法:采用t检验。
3结果
3.1 各组大鼠排尿量和肾脏系数的比较
见表1。
与模型组比较*P<0.05, **P<0.01 (下同)
3.2 各组大鼠血清BUN、Cr、Na+、K+含量的变化
见表2。
3.3 各组大鼠肾组织病理学观察
正常组:大鼠肾小球球囊清晰, 小球内毛细血管结构正常;小管上皮未见病变, 未见管型, 偶见肾小管凋亡细胞, 间质血管正常。模型组:大部分肾小管上皮细胞轻至中度水肿变性, 部分近曲小管及远曲小管凝固性坏死, 部分肾小管尚有红细胞管型及蛋白管型形成, 偶见坏死的肾小管周围有淋巴细胞和中性粒细胞浸润。地塞米松组:大鼠肾小管坏死较模型组减轻。肾生方大剂量组:肾小管水肿变化明显减轻, 坏死范围减小。小剂量组:坏死范围减小。
4讨论
ARF属中医学的“癃闭”、“关格”等疾病范畴, 主要病机为湿、瘀、毒互结, 气血逆乱, 脏腑功能失调, 三焦气化失司, 病势凶险, 病情危重。因此非一般凉散之法, 或单用破瘀、化湿、解毒等方法可以缓解。肾生方是以温肾健脾、活血化瘀为立法自拟的中药复方制剂, 由黄芪、淫羊藿、水蛭、山楂等中药组成。药理研究表明黄芪浸剂能明显减轻甘油诱导的ARF家兔肾小管、肾小球病理改变, 而且能使损伤组织迅速修复, 不致于发展为肾小球硬化[2]。淫羊藿煎剂对大鼠急性缺血所致的肾衰有防治作用[3], 黄芪可提高肾组织SOD活性, 降低MDA含量, 减轻肾损伤[4]。水蛭具有防治初发期ARF的作用, 用药后血清肌酐、尿素氮升高幅度降低[5]。由黄芪、淫羊藿、水蛭为主药组成的复方制剂能降低肾病综合征患者血纤维蛋白原、血脂、血黏度, 从而缓解高凝状态, 防止肾小球硬化, 保护肾功能[6]。
大鼠肌注甘油造成ARF模型是目前较经典的急性肾小管坏死的造模方法[7]。一般认为该模型兼具有缺血、中毒两种机制。以此模型观察药物的作用具有广泛的说服力。
本文结果表明, 肾生方能够明显增加造模后24小时大鼠排尿量;明显降低造模后24、72小时大鼠血清BUN、Cr的含量;明显降低造模后24小时血清K+含量;明显降低造模后72小时大鼠的肾脏系数;明显减轻肾小管上皮细胞水肿变性、坏死程度;提示肾生方对大鼠初发期ARF具有防治作用。
参考文献
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衰竭实验 篇2
1材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠80只, 体重180～200g, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供并饲养于武汉市第一医院中心实验室SPF动物实验室。
1.2 药物
丁黄洗剂:将大黄、公丁香、威灵仙、徐长卿颗粒剂 (江阴天江药业公司生产) 溶于100毫升蒸馏水中, 制成25%的溶液;再加入甘油, 使其甘油浓度为2%, 制备成丁黄洗剂备用。
1.3 主要试剂
一抗用鼠抗SP抗体、二抗用SP羊抗鼠抗体 (即用型) :北京中山生物制品公司产品。血清P物质检测ELISA试剂盒:R&D公司产品。P物质:Sigma公司产品。
2方法
2.1 造模
SD大鼠先适应性喂养7天, 以3%戊巴比妥钠 (50mg/kg) 腹腔注射麻醉动物, 常规消毒铺巾, 从左腹部切口, 打开腹腔。静脉夹夹住肾蒂后切除左肾上下极 (切除2/3) , 以明胶海绵压迫止血, 复位肾脏。2周后进行第2次手术, 切除右侧肾脏。假手术组采取同样步骤, 暴露肾脏后避免牵拉肾脏。
2.2 分组及给药
造模后大鼠, 随机分为5组。5/6肾切除 (STNx) +P物质皮下注射组;STNx+P物质皮下注射+丁黄洗剂组;STNx模型组对照组;STNx+丁黄洗剂组及设假手术组各15只。
造模后各组分别于4、12、24周各杀检2只大鼠, 留取血标本及肾组织标本检查, 证实慢性肾衰造模成功。24周造模大鼠进入终末期肾衰竭。先剪去大鼠腹部毛备用。P物质以蒸馏水稀释, 浓度为药剂1mg/ml, 大鼠左中腹皮内注射 (100nmol/部位, 0.13mg) 。对照组用等量无菌生理盐水皮内注射。加用中药丁黄洗剂组在注射后于大鼠腹部涂抹丁黄洗剂3次。
2.3 观察指标及测定
将大鼠放于单独的笼中观察30分钟, 观察其搔抓反应, 记录30分钟内的搔抓次数。
各组大鼠在观察完搔抓反应后杀检。经腹腔静脉留取血标本, 分离血清检测SCr、BUN以及用ELISA法检测血中P物质水平。
取大鼠局部皮肤用10%中性甲醛固定、4℃保存, 按常规脱水、透明、包埋, 石蜡切片5μm, 进行免疫组化染色, 染色呈棕褐色者为SP阳性染色。每张切片随机选取5个视野, 输入HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统。半定量法评估皮肤SP阳性程度。
2.4 统计分析
采用t检验。
3结果
3.1 各组大鼠肾功能及血浆P物质水平
见表1。
与假手术比较*P<0.05, **P<0.01;与STNx组比较△△P<0.05, △△P<0.01 (下同)
3.2 各组大鼠皮肤组织P物质表达的免疫组化测定
免疫组化染色分析表明慢性肾衰尿毒症大鼠表皮、汗腺、皮脂腺及血管周围的P物质表达均为阳性, 皮下注射P物质的大鼠表皮、汗腺、皮脂腺及血管周围的P物质为强阳性表达, 呈深棕色。用丁黄洗剂后各部位P物质表达强度减弱。假手术组仅表皮层及个别小血管有少量P物质表达, 见表2。
与STNx+P组比较#P<0.05, ##P<0.01 (下同)
3.3 各组大鼠的搔抓反应
见表3。
4讨论
皮肤瘙痒是尿毒症常见并发症之一, 发生率达25%～40%, 严重影响尿毒症病人的生活质量。其发生机理尚不明确。有研究发现尿毒症皮肤瘙痒病人的皮肤肥大细胞密度增加, 因此推测尿毒症皮肤瘙痒与肥大细胞增生有关[3]。还有研究认为与尿毒症继发甲状旁腺功能亢进有关。但目前也有一些研究不支持。如用抗组胺制剂治疗尿毒症皮肤瘙痒的疗效有限, 且尿毒症皮肤瘙痒是慢性过程, 持续或间断发作, 没有局部皮疹、水肿渗出等急性炎症反应表现。也有研究认为血中甲状旁腺激素 (PTH) 及钙、磷水平与尿毒症病人皮肤瘙痒之间无关, 不支持PTH作为尿毒症皮肤瘙痒的介质[1,4,5]。
神经多肽P物质 (SP) 是近些年来较受关注的致瘙痒介质。SP能导致肥大细胞脱颗粒释放炎性介质, 肥大细胞表面有P物质的特异性受体NK-1表达。近年更有人用电镜技术证实P物质位于特应性皮炎患者皮肤肥大细胞的特定颗粒内, 表明P物质可促进肥大细胞脱颗粒, 同时也释放出P物质, 而释放出的P物质又可作用于肥大细胞, 促进进一步反应发生。另外, 在多种皮肤疾病中很多研究用免疫组化和电镜技术证实P物质染色阳性的神经细胞神经纤维与肥大细胞的分布关系密切。而含P物质的神经末梢有双向传导功能, 向中枢传递受刺激信息起递质作用, 在局部释放P物质及其他神经肽起调节作用, 参与瘙痒与疼痛等感觉的启动过程。由此可见, P物质及肥大细胞在多种急慢性皮肤病如银屑病、特应性皮炎、I型变态反应、白癜风等疾病的发病中起重要作用[6,7,8]。我们在以往的研究中也证实尿毒症病人皮肤中P物质表达增强, 与尿毒症病人皮肤瘙痒有一定相关性[1]。
目前对于尿毒症皮肤瘙痒的治疗, 西医主要为内服或外用抗组胺制剂;增加及改进透析剂量及方式;改善透析器生物相容性等, 而中医在此方面有着较为广阔的前景。尿毒症病人或为气血两虚, 或为脾肾阳虚;脾虚则气血化源不足, 不能敷布濡润肌肤, 血虚则化燥生风。在临床治疗中我们注意到, 有的病人或兼有湿热, 或兼有血瘀, 但大都为本虚标实之证。
丁黄洗剂方中大黄有清热解毒、活血祛瘀之功效, 是肾病科常用的治疗急慢性肾衰的药物;外用亦可治疗多种皮肤疾病;现代研究还发现大黄对心血管及胃肠道等部位的P物质神经纤维及神经细胞有影响, 并可改变与组胺有关的血管收缩与舒张反应。丁香、威灵仙、徐长卿等均是皮肤科常用的止痒药, 疗效确切。其中丁香药性辛、温, 归脾、胃、肾经, 外用可治癣症;威灵仙祛风除湿、通络止痛、止痒;徐长卿亦可祛风除湿、止痛止痒。全方有清热解毒、祛风止痒之功效。且现代研究认为上述药物大体上有以下共同特点: (1) 抗真菌或病毒或细菌作用; (2) 抑制炎症反应作用; (3) 抗变态反应作用。 (4) 有些药物还对神经系统有镇静、安定、镇痛作用[9,10]。
本研究结果表明尿毒症期大鼠血中P物质浓度明显高于假手术组, 而且皮内注射P物质的大鼠血中P物质浓度进一步升高, 明显高于未注射组, 其皮肤不论是表皮层, 或是真皮层内的血管、皮脂腺、汗腺、毛囊P物质表达均明显增强, 该组大鼠的皮肤搔抓次数最多。外用中药丁黄洗剂并不能降低血中P物质浓度, 但能减轻皮肤局部组织P物质的表达, 减轻大鼠的搔抓反应。说明丁黄洗剂的止痒作用与减少皮肤局部P物质的表达有关。
参考文献
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衰竭实验 篇3
1 材料和方法
1.1 研究对象
动物实验:选择21头中国小型雄性家猪21头(徐州医学院动物房提供,经检疫合格),3～4月龄,体重30～40 kg。
临床实验:选择本院2006年10月至2007年4月急性心肌梗死致HF患者8例,其中男5例,女3例,年龄(54±8)岁;下壁心梗2例,前壁心梗6例;合并糖尿病4例,高血压5例;2例前壁心梗合并功能性室壁瘤。所有入选患者左室射血分数(LVEF)<45%,B型钠脲肽(BNP)>100 pg·ml-1。
1.2 动物心力衰竭模型的制备
经股动脉穿刺行选择性左冠状动脉造影,经6F导管送入0.014 inch导丝,导丝先端达回旋支(LCX)或前降支(LAD)远端后固定导丝。在连续X线透视下缓慢退出右冠状动脉导管,再沿导丝导入球囊(2.0～2.5×7～10 mm)至LCX或LAD远端。以4 atm(1 atm=101.325 kPa)扩张5 min共3次,然后以4 atm扩张50～75 min制作心肌梗死模型,术中注意心电图改变,撤出球囊及导丝,术毕结扎股动脉。术后心脏彩超及单光子发射型计算机断层扫描(ECT)测定LVEF<45%及BNP>100 pg·ml-1的动物定为心肌梗死后HF模型成功,随机将模型动物分为实验组(n=11)及对照组(n=10)。
1.3 MSCs的分离、培养及移植
动物实验:所有动物抽取髂骨骨髓40 ml,以40 ml DMEM培养液稀释,与等量percoll液(相对密度1.077)梯度水平离心分离骨髓单个核细胞,将上述所得骨髓单个核细胞按个2×106个·cm2接种于DMEM培养液中,并在孵育箱中应用贴壁法培养MSCs,MSCs扩增至108数量级后进行移植。动物心肌梗死后10～14 d在局麻下行冠状动脉造影,实验组在梗死区中心经微导管注入2 ml MSCs悬液(约108个细胞),对照组则以同法注入PBS。
临床试验:患者抽取髂后上棘骨髓40～60 ml,骨髓液移至肝素生理盐水离心管中等倍稀释,同法进行骨髓单个核细胞分离、培养至第3代MSCs,移植前稀释成10 ml肝素生理盐水细胞悬液备用,细胞计数约108个细胞。患者在局麻下行冠状动脉造影,在0.014 inch导丝导引下,将微导管置于病变血管处,撤出导丝后经微导管缓慢将细胞悬液注入冠状动脉内,推注时间10 min。
1.4 结果判定
所有动物及患者均于MSCs移植术前及术后8周应用心脏彩超(惠普5500)行超声心动图(UCG)测定左室收缩末期直径(LVSd)、收缩末期容积(SYS vol)、梗死区室壁厚度(IWT)及LVEF;美国博适Triage快速测定和诊断仪测定BNP;西门子SPECT行心肌灌注扫描,同时使用Emory University的Cardiac Toolbox心肌分析软件包获得心肌梗死部位面积大小和灌注图像心肌缺血总分值。
1.5 统计学处理
采用SPSS 12.01统计软件处理数据,计量资料以undefined表示,心功能比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况
动物实验:实验组中1头动物于干细胞移植麻醉时死于HF,另有2头动物未达到HF标准;对照组中2头动物于模型制备时死于室颤和急性心包填塞,1头经UCG及ECT证实制模不成功,故最终实验组及对照组分别有8头和7头制模成功。
临床试验:8例患者中靶血管为LAD 6例,右冠脉(RCA)2例;其中5例行经皮冠脉血管成形术(PCI)。所有患者术中均顺利,无一例发生心律失常、心肌梗死及HF,仅1例术后寒战数分钟自行缓解。术后除1例患者因经济原因未能随诊外,其余7例患者获随访资料,动物实验和临床研究的具体情况见表1。
2.2 心功能变化
2.2.1 动物实验
MSCs移植后8周UCG显示,实验组室壁活动与移植术前增强,对照组室壁活动与移植术前比较无明显变化;实验组MSCs移植后LVEF增加,BNP水平由(298±17)pg·ml-1下降至(87±15)pg·ml-1,对照组无明显改变(图1、表2)。
2.2.2 临床试验
MSCs细胞移植后8周心脏彩超结果显示,LVEF较细胞移植前增加(表3),ECT检查示梗死面积缩小,LVEF升高(图2),BNP由(326±34)pg·ml-1下降至(101±7)pg·ml-1。
A. 实验组;B. 对照组
与对照组移植后比较,*P<0.05;与同组移植前比较,#P<0.05
与细胞移植前比较,*P<0.05
1、3、5排为术前ECT检查结果; 2、4、6排为术后8周ECT检查结果
3 讨论
心力衰竭已经成为心血管病中最常见的、对患者危害最大的疾病之一,严重影响患者的生活质量,造成医疗费用支出庞大,因此,必须寻找有效的HF的治疗方法。近年来,MSCs移植作为一种崭新的生物学疗法,引起了人们日益广泛地关注。
2001年,自Orlic等[1]首次采用骨髓干细胞移植成功地治疗动物心肌梗死以来,已有许多动物实验证实,骨髓干细胞移植能明显改善动物缺血心肌的心脏功能。2001年Strauer等[2]的临床研究结果显示,与对照组比较,自体骨髓干细胞移植后,室壁运动障碍范围减少约20%。2004年,由德国Wollert等[3]完成的首次将干细胞随机移植到心肌的研究结果显示,接受干细胞移植患者的左心室功能得到改善。本研究应用UCG、ECT及BNP作为诊断心力衰竭和评价疗效的指标,尤其采用了BNP定量检测,用量化的标准使实验结果更加客观可靠。本研究结果显示,动物MSCs移植后8周,实验组左室功能整体增强,室壁运动得到改善,收缩末期左室容积减少,室壁厚度增加,心室重构程度、心脏收缩功能的改善明显优于对照组。临床研究中我们选择了8例急性心肌梗死后心力衰竭患者,有5例患者行支架植入术同时予MSCs移植,其中1例未能随诊,4例UCG及ECT均提示左室收缩功能和室壁运动改善。余3例因经济原因未行支架置入术,仅予MSCs移植,其中1例患者UCG示心功能无明显改善,但ECT示梗死面积缩小,收缩功能改善。本研究结果显示,MSCs移植后左心室射血分数增加,与Bolognese等[4]研究结果相近。我们认为虽然自体MSCs移植可改善心功能,但自体MSCs移植成功与否还有赖于心肌局部环境、血流供应等因素,在心力衰竭早期MSCs移植辅以PCI术,由于局部充分的心肌血供,可以更有效地改善心肌收缩功能。我们的动物及临床实验证实,自体MSCs取材方便,移植过程简单安全,对机体损伤小,排斥性小,较心肌细胞移植有更好的可塑性,且治疗过程中患者多无不适,无明显的副作用,术后数小时即可活动,在临床治疗心力衰竭方面有更好的应用前景。
骨髓干细胞移植改善心功能的可能机制为[5]:(1)移植细胞分化为心肌样的细胞,与宿主同步收缩从而改善心功能;(2)移植细胞通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1(IL-1)等细胞因子,促进血管再生和内源性血管新生,再生的心肌细胞同样有营养需要,因此维持心脏微血管的血液供应是心肌再生治疗的一个关键。
综上所述,自体MSCs可作为心肌细胞重建术的来源,自体骨髓干细胞移植具有方便、微创,易于开展的特点,但自体骨髓干细胞的存活与否依赖于环境、血液供应、局部炎症反应等因素。细胞移植结合PCI术是移植细胞改善心功能的理想方法,有可能成为HF患者的一种新的治疗模式和选择,对此,临床上还需要进行更大规模随机、双盲研究,以观察其疗效和可能的副作用,同时更需要进一步的基础研究阐明其机制。
摘要：目的观察自体骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对心肌梗死后心力衰竭的疗效。方法选择21只中国小型家猪,应用闭胸经股动脉介入法制作心肌梗死后心力衰竭模型,术后动物左室射血分数(LVEF)<45%、B型钠脲肽(BNP)水平>100 pg.ml-1为心力衰竭建模成功。随机将动物分为实验组(n=11)和对照组(n=10),术后2周内实验组及对照组经冠状动脉途径分别移植MSCs及磷酸盐缓冲液,8周后,行心脏彩超、单光子发射型计算机断层扫描(ECT)及BNP检查,观察心功能的改变。同时,选择心肌梗死致心力衰竭[左室射血分数(LVEF)<45%,BNP>100 pg.ml-1]患者8例,发病2周内经皮冠状动脉途径植入MSCs,术前及术后8周行心脏彩超、ECT及BNP检查,监测心功能的变化。结果动物实验组和对照组分别有8头和7头猪造模成功;心脏彩超结果显示:实验组MSCs移植后LVEF由(39±1.70)%增加至(51±3.52)%,ECT心血池显像显示LVEF由(35.08±3.12)%升高至(52.15±1.21)%,BNP水平由移植前的(298±17)pg.ml-1下降至(87±15)pg.ml-1;对照组以上指标无明显改变。临床观察显示:MSCs移植后患者心脏彩超显示LVEF由(34.06±2.13)%增加至(52.08±1.02)%,ECT心血池显像显示LVEF由(34.12±3.09)%增加至(53.03±1.01)%,BNP水平由(326±34)pg.ml-1降低至(101±7)pg.ml-1。结论自体MSCs移植是治疗急性心肌梗死后心力衰竭安全、有效的新方法。
关键词：心肌梗死,急性,心力衰竭,细胞移植,自体骨髓间充质干细胞
参考文献
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