拆方研究

拆方研究（精选7篇）

拆方研究 篇1

“四大血”是在民族医药调研工作中搜集到的一个苗药验方,该方在黔北、川南、渝南山区广为流传,其治症广泛,常用于治疗风湿疼痛、跌打损伤、血瘀、月经不调、瘫痪等病症,是苗医通气散血治疗法的代表性方剂[1]。“四大血”由苗药nangx dlob ghat(仰嗟嘎)、hsob hxangt(梭向)、ghab jongx bel sob xok(嘎龚布梭学)和vob mongb dlenb(莴蒙棱)等藤本药材以一定比例组成,广泛用于治疗气阻血瘀所引起的各种病症,为苗医常用验方。本课题经研究已证实“四大血”的水、醇提取物具有良好的抗炎、镇痛作用[2],为进一步了解“四大血”组方中各药物在方中的作用,研究其配伍规律,项目组对该方进行了抗炎、镇痛药理作用的拆方研究。

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠,体重18～22g,SPF动物,许可证号为SCXK(渝)2007-0006,由重庆市中药研究院实验动物研究所提供。饲养条件:室温20～25℃,相对湿度50%～60%。予固体饲料,自由饮水。

1.2 实验药液制备

取“四大血”的四味药材分别按处方比例组成5个组方:1号方为全方、2号方缺少vob mongb dlenb(莴蒙棱)、3号方缺少ghab jongx bel sob xok(嘎龚布梭学)、4号方缺少hsob hxangt(梭向)、5号方缺少nangx dlob ghat(仰嗟嘎)。各方分别用水提取3次,合并滤液,并浓缩至1g生药/mL后,按药液-乙醇(1∶1)的量加入95%乙醇,摇匀后于常温下静置24h,经抽滤弃渣,回收乙醇后,将药液浓缩至所需浓度即可。

1.3 药品与试剂

痛舒胶囊(TSJN,下同),国药准字Z2005478,批号:090507(云南药物研究所制药厂),临用时用蒸馏水配制成溶液使用。0.9%氯化钠注射液,批号:090826(贵州科伦药业有限公司)。所用试剂0.6%醋酸,二甲苯,1%角叉菜胶,3%戊巴比妥钠等由贵阳中医学院药理教研室提供。

1.4 仪器

电子天枰(BS110S型,北京赛多利斯仪器系统有限公司),YLS6B智能热板仪(上海特惠仪器设备有限公司),TG16-W型离心机(上海隆白生物科技有限公司),752紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司),数显游标卡尺(中美得力工具有限公司)。

2 实验方法

2.1 抗炎作用研究

2.1.1 对二甲苯致小鼠耳廓炎症的影响[3]

取体重18～22g昆明种小鼠70只,雄性,随机分成7组,10只/组。第1组为阴性对照组,每只动物给予等体积的生理盐水,第2组为1号方组,第3组为2号方组,第4组为3号方组,第5组为4号方组,第6组为5号方组,均按4.0g/kg原生药的剂量给药,第7组为阳性给药组,每只小鼠均按0.75g/kg给予TSJN溶液;按以上药物剂量以体重0.2mL/10g灌胃给药,1次/d,连续5d。于末次给药45min后,用微细针管将二甲苯0.04mL/只均匀涂在右耳前后两面致炎,40min后颈椎脱臼法处死小鼠,立即剪下双耳,用直径8mm打孔器分别在左右耳相同部位取下耳片,用电子分析天平称重。以左右耳差值作为肿胀度,并按下式计算抑制率(%)。

2.1.2对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响[4]

取体重18～22g昆明种小鼠70只,雌雄各半,分组与给药方式同“2.1.1”项,连续给药7天。各组小鼠末次给药后1h左足跖皮下注射1%角叉菜胶。于皮下注射角叉菜胶后1h、2h、4h、6h、8h、24h时用游标卡尺测定左右足跖的肿胀厚度(mm)之差。以左右足差值作为肿胀度,并按下式计算抑制率(%)。

2.2 镇痛作用研究[5]

2.2.1 对小鼠痛阈的影响(热板法)

取体重18～22g的雌性昆明种小鼠,于实验前将小鼠放在(55±0.5)℃的热板上测痛阈值,以小鼠舔后足为痛阈出现指标。凡痛阈值超过30s或低于5s的小鼠淘汰。用此法选出痛阈值在5～30s之间的小鼠70只,随机分为7组,分组与给药方式同“2.1.1”项。将选出的小鼠按上述方法重复测定其痛阈值。将每只小鼠所测两次痛阈值平均后,作为其给药前的痛阈值。每日给药1次,连续3d,测定末次给药后30、60、90min的痛阈值,若小鼠在热板上60s内仍无痛觉反应,立即取出按60s计,比较各组间痛阈值差异。

2.2.2 对小鼠扭体反应的影响

取体重18～22g的昆明种小鼠,雌雄各半。随机分为7组,分组与给药方式同“2.1.1”项,每日给药1次,连续3d,末次给药后30min,各鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液0.2mL,观察小鼠的痛阈及扭体出现的时间,以腹部收缩内凹、躯体扭曲、后肢伸展、臂部高举为指标,记录15min内各组的扭体次数,并按下式计算各组的镇痛率。

2.3 统计学处理

各组数据以(珚x±s)表示,采用SPSS10.0软件处理数据,用t检验测验其组间差异。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 抗炎作用

3.1.1 对二甲苯致小鼠耳廓炎症的影响

“四大血”1、2、4、5号方,对二甲苯诱发的小鼠耳廓肿胀具有明显的抑制作用,与生理盐水组比较具有显著差异(P<0.05,P<0.01),而3号方与生理盐水组比较不具显著性差异,说明3号方中所缺的药材(嘎龚布梭学)对二甲苯致小鼠耳廓炎症的抑制作用贡献较大。结果见表1。

注:与生理盐水组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3.1.2 对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响

“四大血”全方及拆方对小鼠足跖肿胀均有显著的抑制作用(P<0.05,P<0.01),且1、3号方的作用强于2、4、5号方,且各方的作用在8h时抗炎效果最强。说明全方的组方合理,且3号方作用强度与全方类似。结果见表2。

注:与生理盐水组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3.2 镇痛作用

3.2.1 对小鼠痛阈(热板法)的影响

小鼠热板实验表明:“四大血”全方及拆方对小鼠药后痛阈值均有所提高,120min时痛阈提高最大,且1号方组的效果优于2、3、4、5号组。其中1号方组在60、90和120min小鼠痛阈值明显高于NS组,具有极显著差异(P<0.001),故可认为“四大血”对热板所致的非特异性疼痛具有显著抑制作用。从各拆方的镇痛效果看,2号方>4号方>3号方>5号方。结果见表3。

注:与生理盐水组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3.2.2 对小鼠扭体反应的影响

小鼠扭体实验结果表明:“四大血”全方及2、4号方组小鼠扭体次数少于生理盐水组,并有显著性差异(P<0.05,P<0.001),说明“四大血”对醋酸腹腔注射引起的大面积深部疼痛有对抗作用。从各拆方的镇痛效果看,2号方>4号方>3号方>5号方(见表4)。

注:与生理盐水组比较*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

5 讨论

抗炎实验的拆方研究表明“四大血”全方及其拆方均有一定的抗炎效果,而全方的药效普遍强于各拆方。本方各药材均有一定的活血化瘀作用,合方同用后起到了明显的协同增效的作用,说明本方配伍合理。但在二甲苯小鼠耳廓炎症的实验中,3号方因缺少嘎龚布梭学而抑制炎症的作用明显减弱,但在对角叉菜胶致小鼠足肿胀实验中,3号方的作用与全方类似,表现出较强的抑制作用,其对此两种炎症的作用机制有待进一步研究。

镇痛实验的拆方研究表明“四大血”全方的镇痛作用明显强于各个拆方。各个拆方组的镇痛作用明显减弱,从各拆方组的镇痛作用可看出四味药物对该方镇痛作用的贡献依序为:仰嗟嘎>嘎龚布梭学>梭向>莴蒙棱。

本方中四味藤类药物均具有一定的抗炎镇痛作用,在缺少其中某一味药物的情况下综合作用均不如全方。该方通过配伍使方中各药物作用出现协同或相加,达到了增效的作用,说明“四大血”中四种药物配伍的合理性与科学性。

摘要：目的:研究苗药验方“四大血”的配伍规律。方法:通过全方与拆方水提醇沉液的抗炎、镇痛实验,评价各组方的药效。结果:全方抗炎、镇痛综合作用均强于各个拆方。在镇痛作用中,各组分对全方的贡献依序为:仰嗟嘎>嘎龚布梭学>梭向>莴蒙棱。结论:“四大血”中四种药物配合使用具有合理性和科学性。

关键词：苗医验方,拆方研究,抗炎镇痛

参考文献

[1]曾定伦,熊传榘,王毅刚,等.苗药方“四大血”形性特征与适应症范围[J].中国民族医药杂志,2004,8(6):153-154.

[2]田振华,谢达莎,包雪爱,等.苗医验方“四大血”抗炎、镇痛作用研究[J].中国民族医药杂志,2012,18(8):45-48.

[3]王志文,张爱国.麝香乌龙丸抗炎及镇痛药理研究[J].时珍国医国药,2007,18(3);584.

[4]陈奇.中药药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,1993:356.

拆方研究 篇2

该方传统服用方法是汤剂,在全方水煎煮过程中会产生大量的沉淀,且提取物具有 “用量大、易结块、吸湿等物理特性”[6],这些物理特性使其难以做成适合的现代药用剂型,从而影响了该方在临床上的推广应用。本实验通过高效液相测定方法研究黄连解毒汤全方及其有效部位群中化学成分变化,创立和研制新方提供理论依据。

1材料

1.1药物与试剂

黄连产于四川,栀子产于江西,黄柏产于辽宁,黄芩产于内蒙,经辽宁中医药大学鉴定教研室初正云教授鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch. 的干燥根茎,芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid. 除去粗皮的干燥树皮,唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根,茜草科植物桅子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实。

对照品栀子 苷 ( 110749 - 201115 ) 、黄芩苷 ( 110715 201117) 、盐酸药根碱( 110733 - 201108 ) 、盐酸巴马汀( 110732 - 201108) 、盐酸小檗碱 ( 110713 - 201212 ) 对照品均购于中国药品生物制品检定所均购自中国药品生物制品检定所。乙腈 ( MERCK) 、甲醇( MERCK) 、异丙醇均为色谱纯,其余试剂均为市售分析纯。

1.2实验仪器

FA1004电子天平,上海舜予恒丰科学仪器有限公司; RE - 52A旋转蒸发仪,上海市亚荣生化仪器厂; SHZ - D ( III) 循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司; HH - 4数显恒温水浴锅,江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司; DZF - 6050型真空干燥箱,巩义市予华仪器有限责任公司; TDZ4 - WS低速台式离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司; 安捷伦1260高效液相色谱仪,安捷伦化学工作站; Sartorious CP225D型精密天平,北京塞多斯仪器系统有限公司; FD - EA - 50冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司。

2方法

2.1色谱条件[7,8]

色谱柱为Agilent TC - C18( 4. 6 mm × 250 mm,5 μm) ; 流动相为乙腈( A) - 0. 2% 磷酸水( B) ; 线性梯度洗脱程序: 0 ~ 20 min,2% ~ 22% A; 20 ~ 80 min,22% ~ 24% A; 检测波长: 260 nm; 体积流量1. 0 m L / min; 进样量10 μL; 柱温40 ℃ 。

2.2样品的制备[9,10,11]

取黄连9 g,黄芩6 g,黄柏6 g,栀子9 g,粉碎,过120目筛制成细粉,加10倍量水常温浸泡1 h,回流提取1 h,趁热过滤,得滤液; 药渣加8倍量水,水煎煮回流提取1 h,趁热过滤,得滤液,合并两次滤液,减压浓缩,冷冻干燥,得黄连解毒汤全方浓缩液固体粉末,依法制备8批固体粉末; 分别取黄连9 g,黄芩6 g,黄柏6 g,栀子9 g,按上述方法分别煎煮、 干燥,得到4味药的固体粉末。

取黄连、黄芩、黄柏、栀子 ( 3∶2∶2∶3) 30 g,粉碎, 过120目筛制成细粉,煎煮方法同上,趁热过滤,得滤液,合并两次滤液,静置,沉降3天后,离心 ( 4200 r/min,30 min) , 将离心得到的上清液合并,减压浓缩,得到浓度为0. 25 g/m L的药液,采用大孔树脂水 - 50% 乙醇系统洗脱,收集洗脱液, 低温浓缩,减压干燥,得到黄连解毒汤全方50% 醇的有效部位群; 沉淀部分冷冻干燥,得到黄连解毒汤全方沉淀有效部位群。

2.3供试品溶液的制备

精密称定黄连解毒汤全方浓缩液固体10 mg,置5 m L量瓶中,加30% 甲醇超声溶解并稀释至刻度,摇匀,0. 45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,得全方供试品溶液; 同法制得黄连解毒汤有效部位群的供试品溶液。

2.4对照品溶液的制备

精密称取栀子苷3. 00 mg、黄芩苷3. 02 mg、盐酸巴马汀3. 10 mg、盐酸小檗碱3. 05 mg、盐酸药根碱3. 11 mg,分别置于5 m L量瓶中,加色谱甲醇,超声、定容,各对照品储备液浓 度分别为0. 60 mg /m L、0. 60 mg/m L、0. 62 mg/m L、 0. 61 mg / m L、0. 62 mg / m L。

2.5方法学考察

2.5.1精密度试验

取全方供试品溶液,连续进样5次,检测指纹图谱,计算得各色谱峰保留时间的RSD < 1. 0% ,峰面积的RSD < 3. 0% , 表明仪器精密度良好。

2.5.2稳定性实验

取全方供试品溶液,分别在0、3、6、12、24 h检测指纹图谱,计算得各色谱峰保留时间的RSD < 1. 0% ,峰面积的RSD < 3. 0% ,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.3重复性实验

按2. 2. 3项下方法,制备供试品溶液5份,检测指纹图谱, 计算得各色谱峰保留时间的RSD < 1. 0% ,峰面积的RSD < 3. 0% ,表明方法重复性良好。

2.6共有峰的确定及归属

通过对8批全方样品的HPLC色谱图测定、比较,确定共有峰为27个( 见图1) 。其中峰面积超过3% 的色谱峰为10、 11、13、14、20、21、22、23、24、27号峰。其中10号峰为栀子苷,20号峰为药根碱,22号峰为黄芩苷,23号峰为巴马汀, 24号峰为小檗碱,且小檗碱、巴马汀、药根碱属于生物碱类成分,可以粗略代表方中总生物碱的含量,黄芩苷属于黄酮类成分,可以粗略代表方中黄酮的含量,栀子苷属于环稀醚萜类成分,可以粗略代表方中环烯醚萜的含量。

3结果

( 1) 按 “2. 3”项下方法制备供试品溶液,分别对黄连解毒汤全方及其各单味药进行液相色谱的测定,通过对保留时间定位可得到各单味药的指纹特征峰: 黄连的主要特征峰为8、 11、12、13、17、19、20 ( 药根碱) 、21、23 ( 巴马汀) 、24 ( 小檗碱) 号峰; 黄芩的主要特征峰为14、15、16、22( 黄芩苷) 、 25、26、27号峰; 黄柏的主要特征峰为7、9、11、12、13、20 ( 药根碱) 、23( 巴马汀) 、24( 小檗碱) 号峰; 栀子主要特征峰为7、10( 栀子苷) 11、14、18号峰。其中11号峰属于非特异性吸收,在黄连、黄柏、栀子液相色谱图中均有其吸收峰,黄连和黄柏的共有吸收峰为11、12、13、20( 药根碱) 、23( 巴马汀) 、24( 小檗碱) 号峰。

( 2) 对色谱图得到的峰面积,以随行的标准曲线计算含量,并折算成一个处方中药材 ( 黄连9 g、黄芩6 g、黄柏6 g、 栀子9 g) 所含的化合物的质量,结果表明各成分在上清液和沉淀中含量的加和大于全方浓缩液的含量,单味药材中各成分的含量之和亦大于全方中的含量。见图2,具体结果见表2。

4结论

本研究运用HPLC - DAD技术对黄连解毒汤全方及其的化学成分进行了系统的分析。通过比较全方与单味药中化学成分的变化可知,全方的特征峰源于各单味药的特征峰,并未产生明显的新特征峰,全方中主要成分溶出率比单味药煎煮时要低,可能与全方中不同种类化合物相互作用及酸性化合物与碱性化合物反应产生沉淀有关。

黄连解毒汤中黄连和黄柏同为清热燥湿、泻火解毒的要药,主要化学成分都是生物碱类化合物,理化鉴定很难鉴别二者,为了更好的对黄连和黄柏进行区分、鉴别,可根据黄连的特异性吸收峰8、17、19、21号峰和黄柏的特异性吸收峰9号峰对两味药材进行区分,客观控制两药质量。

通过比较全方、上清液50% 醇洗和沉淀有效部位群中主要成分的变化可知,上清液50% 醇洗有效部位群包含了全方和沉淀有效部位群中所有成分,且主要成分峰面积增大、含量增高,说明上清液经50% 醇洗后能使黄连解毒汤中主要成分含量增加,这一发现为黄连解毒汤的新药研究奠定一定基础。

摘要：研究黄连解毒汤全方及其拆方有效部位群主要成分溶出变化规律。采用HPLC方法分析全方及不同拆方的有效部位群,色谱柱为Agilent TC-C18(4.6 mm×250 m,5μm),以乙腈(A)-0.2%磷酸水B)为流动相,梯度洗脱,体积流量1.0 m L/min,检测波长为260 nm。黄连解毒汤经大孔树脂50%醇洗脱后能使方中主要成分含量增加。本实验为黄连解毒汤新药研究提供参考。

拆方研究 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性新西兰白兔42 只, 体重 (2.5±0.2) kg, 由青岛康大生物科技有限公司提供, 实验动物合格证号:scxk (3) 20110001。

1.1.2 药物组成及制备 ①全方:由垂盆草、大黄、昆布、丹参、牡蛎等12味药物组成;②软坚方:由昆布、海藻等4味药物组成;③活血方:由丹参、蒲黄等4味药物组成;④清法方:由垂盆草、大黄等5味药物组成;⑤西药:辛伐他汀片, 20mg/片。以上中药饮片由宁夏古方医院提供, 经传统方法煎煮、过滤、浓缩至140mL/剂。西药 (辛伐他汀片) 由普济大药房提供。

1.1.3 主要试剂及仪器RNA提取试剂盒 (美国Inti-trogen公司) ;cDNA第一链合成试剂盒 (由Fermentas公司提供) ;荧光定量试剂盒 (SYBR GreenPCR Master Mix, ABI4309155) ;引物由北京嘉美生物公司合成。荧光定量PCR仪 (ABI7900型) , 高速离心机 (SIGMA, 1-13) 。

1.2 方法

1.2.1 模型制备参照文献[4]建立ASO动物模型。造模方法[5]:每天给予100g高脂饲料;在第3天用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉白兔 (40mg/kg) , 暴露右侧股动脉, 用7号手术线结扎无血管分支处股动脉 (注意不可完全结扎) , 缝合切口;术后给予肌注青霉素 (20万U) ;第7天, 静脉注射牛血清白蛋白 (250mg/kg) , 喂养高脂饲料12周 (造模成功) 后改为普通饲料喂养8周后处死, 取血及相关组织, 实验持续共计20周。空白组:全程喂养普通饲料, 20周后处死取材。

1.2.2 实验分组及给药将42只SPF级雄性白兔随机分为空白组、模型组、全方组、软坚组、活血组、清法组、西药组各6只, 实验组建立动脉粥样硬化闭塞症动物模型 (持续12周) , 自第13周起, 全方组、软坚组、活血组、清法组白兔给予相应中药浓缩液灌胃, 西药组予以辛伐他汀水溶液灌胃。模型组予以蒸馏水灌胃, 共8周, 白兔日灌胃液体用量为10mL· (kg·d) -1。按体型系数换算法[6]中人兔等效药量换算方法给药, 生药量为:全方组14g· (kg·d) -1, 软坚方组5g· (kg·d) -1, 活血方组4.07g· (kg·d) -1, 清法方组5.14g· (kg·d) -1, 辛伐他汀组9.33mg· (kg·d) -1。

1.2.3 标本取材经耳缘静脉取血约5mL, 分别快速注入含抗凝剂 (10%EDTA二钠30μL抑肤酶40μL) 试管和普通试管中, 体积各半 (含抗凝剂的试管需轻轻混匀) , 在4℃条件下, 以3 000rpm/min速度离心10min, 分离血浆、血清, 分装, 冻存于-20℃。经耳缘静脉注射空气处死, 取升主动脉至主动脉弓部位, 保存于冻存管, 存储于液氮罐内速冻, 留待做mRNA检测。

1.2.4 逆转录- 聚合酶链反应技术 (RT-PCR) 检测以TRIzol提取总RNA, 逆转录成互补脱氧核糖核酸 (cD-NA) , 以此为模板进行PCR扩增。①eNOS-F:5-CAGCCT-CACTCCTGTCTTCC-3, eNOS-R:5-GTGGCCT-TCACTCTCTTTGC-3, β-actin-F:5-TGCTGTCCCTC-TATGCCTCT, β-actin-R:5-GAAGGAATAGCCACGCT-CAG-3;②脂联素-F:5-AACCACTATGACAGCACCACG-3, 脂联素-R:5-AGAGAAGGAAGCCAGTGGAGA-3, β-actin-F:5-TGCTGTCCCTCTATGCCTCT-3, β-actin-R:5-GAAGGAATAGCCACGCTCAG-3。采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计学分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析, 组间比较方差齐时采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 兔胸主动脉HE染色形态

空白组:主动脉内膜平整、致密、光滑, 见图1。模型组:内膜增厚、隆起, 内膜下有含脂质泡沫细胞大量增生, 中膜平滑肌层存在断裂, 提示造模成功。见图2。

2.2 兔主动脉组织中eNOS mRNA、脂联素mRNA表达

与空白组比较, 模型组、全方组、软坚组、活血组白兔的eNOS mRNA及脂联素mRNA表达均有所降低 (P<0.05或P<0.01) , 清法组、西药组白兔的eNOS mRNA及脂联素mRNA的表达均显著增高 (P<0.01) ;与模型组比较, 全方组、软坚组、活血组、清法组、西药组白兔的eNOS mRNA及脂联素mRNA的表达均明显增高 (P<0.01) ;清法组、与西药组白兔的eNOS mRNA及脂联素mRNA的表达均明显高于全方组、软坚组、活血组 (P<0.01) 。

(±s, n=6)

注:与空白组比较, ☆P<0.05, ☆☆P<0.01;与模型组比较, △P<0.05, △△P<0.01;与全方组比较, ●●P<0.01;与软坚组比较, ▲▲P<0.01;与活血组比较, **P<0.01。

3 讨论

动脉粥样硬化闭塞症属于中医“脉痹”“脱疽”的范畴。ASO的中医病机可以归结为脾肾已虚, 水湿精微运化失调, 湿聚成痰, 痰与血瘀结, 阻于脉道而成瘀;或痰湿郁久化热、热灼血结而成瘀[7]。湿、热、痰三邪为ASO至瘀之主邪, 也可单独至邪, 所谓 “无因不成瘀”, 其发病机制环节可概括为:因虚招邪、因邪致淤、因邪致损, 即ASO是“邪是标, 瘀是变, 损是果, 虚是机体的本质”的慢性病变过程。现代中医治疗ASO多采用活血化瘀之法, 往往忽略“邪”为主因, 《内经》有云:“有一脉生数十病者, 或痛, 或热, 或寒, 或痹……变化无穷, 此皆邪气之所生也。”故赵凯教授在奚九一教授验方软坚清脉方加减治疗ASO[8]的基础上, 以“祛邪为先, 整体调节”原则, 采用清法为主的中药清脉饮方治疗ASO, 并在临床取得了理想的效果。

氧化应激所引起的内皮损伤可导致血管不正常收缩、内皮通透性增加、低密度脂蛋白转移至内膜, 进而引发炎症反应、平滑肌细胞增殖和迁移, 促进AS的进展。NO可舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖、抗血栓形成[9], 同时NO可抑制LDL的氧化、内皮细胞VCAM-1的表达和氧自由基介导的组织损伤。eNOS是催化NO产生的主要合成酶, 其表达可促进NO的生成。脂联素可通过促进磷酸化, 提高NO合成及活性, 从而抑制氧化应激、保护血管内皮细胞[10]。研究[11]发现, 在脂联素基因过表达的情况下, 动脉血管内脂联素和eNOS的mRNA表达量增加。因此, 脂联素与eNOS可协同抑制氧化应激, 减少内皮损伤, 阻断动脉粥样硬化和斑块形成。

实验研究发现, 动脉粥样硬化闭塞后兔主动脉组织eNOSmRNA、脂联素mRNA的表达明显降低, 进行药物干预后其表达均有所增高, 其中清法组、西药组eNOSmRNA、脂联素mRNA的表达明显高于全方组、软坚组、活血组, 提示清法组、西药组促进eNOS、脂联素mRNA的合成作用优于全方组、软坚组、活血组, 从而诱导产生更多的NO, 进而提高抗氧化应激的能力, 减轻动脉粥样硬化。

综上所述, 清脉饮及其拆方可通过提高eNOSmRNA、脂联素mRNA的表达促进NO的产生, 从而抑制氧化应激, 减轻内皮细胞损伤, 减缓动脉粥样硬化, 达到抗ASO的效果。在清脉饮及3组拆方中, 以清法组为最优, 其余各组间无明显差异, 现代医学中阿托伐他汀类药物普遍用于降低血浆低胆固醇和脂蛋白水平, 减少低密度脂蛋白的生产, 对防治动脉粥样硬化有明显的疗效, 证实了清法组药物在抑制氧化应激方面的效果极为显著。清法组药物优势明显, 以整体调节为原则, 从根本上治疗 “本虚”, 同时以 “祛邪”为先, 为中医清法治疗ASO提供了客观的实验依据。

参考文献

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拆方研究 篇4

1 材料和方法

1. 1实验动物

SPF级C57BL /6小鼠90只,雄性6 ~ 8周龄,体质重18 ~ 22 g,初进动物时间: 2013年7月26日,由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供,动物合格证号: SCXK( 军) 2012-0004。其中10只用于移植瘤细胞传代,70只建立小鼠皮下移植瘤动物模型,另外10只小鼠作为空白组,用于一般情况观察、对比及排除小鼠非正常死亡情况。

1. 2 瘤株

Lewis Lung Cancer瘤株由军事医学科学院六所馈赠。

1. 3 试剂及仪器

顺氯氨铂,齐鲁制药 公司生产 ( 批号:2030111DB) ,核糖核酸 酶 ( RNase A ) ( 批号:SLBD3952V) 由Sigma公司生产; 流式细胞仪 ( Cy-tomics FC 500,Beckman Coulter) 。

1. 4 分组及小鼠 Lewis 肺癌移植瘤模型制备

SPF级C57BL /6小鼠90只,其中10只用于移植瘤细胞传代,其余80只随机分为: 空白组、模型组、顺氯氨铂组、益气扶正组( 简称扶正组) 、化痰散结组( 简称化痰组) 、活血化瘀组( 简称活血组) 、清热解毒组( 简称解毒组) 、中药联合组 ( 简称联用组) ,每组10只。按照文献方法制备小鼠Lewis移植瘤模型[2]。复苏Lewis肺癌瘤株,在无菌条件下接种于2只C57BL/6小鼠右腋窝皮下,10天后按无菌操作程序,脱颈处死小鼠,取生长良好肿瘤组织,用生理盐水洗净剪碎后加生理盐水用匀浆器研磨,台盼蓝染色计算活细胞数 > 95% ,调整肿瘤细胞悬液浓度为1×107/ m L瘤细胞继续皮下接种4只小鼠,每只接种0. l m L,如此传代3次。除空白组外,其余组小鼠按同样方法接种传代完成后的肺癌移植瘤细胞。

1. 5 药品及制备

将扶正散结汤按配伍拆分为益气扶正( 简称扶正,由生黄芪25 g、女贞子15 g组成) ,化痰散结( 简称化痰,由半夏15 g、天南星10 g组成) ,活血化瘀( 简称活血,由莪术15 g、郁金15 g组成) ,清热解毒( 简称解毒,由白花蛇舌草15 g、半枝莲15 g组成) ,四法联用( 简称联用,由生黄芪25 g、女贞子15 g、半夏15 g、天南星10 g、莪术15 g、郁金15 g、白花蛇舌草15 g、半枝莲15 g组成) 5个组分,以上药物均由解放军总医院中药房提供,经鉴定后,传统方法水煎、过滤、60℃浓缩,参照文献[3]计算各中药组给药量,分别配制成含生药浓度为0. 8 g /m L、0. 4 g /m L、0. 6 g / m L、0. 6 g / m L、2. 45 g / m L的药液,置4℃保存备用。

1. 6 给药

于接种后的第2天开始,各中药组分别给予相应中药煎剂0. 2 m L /d,空白组、模型组、顺氯氨铂组给予等体积的蒸馏水,连续灌胃14天; 顺氯氨铂组在接种的第2天开始予以腹腔注射顺氯氨铂2 mg / ( kg·d) ,1次 /2天,共7次,其余各组同时腹腔注射生理盐水10 m L/kg。

1. 7 观察项目

一般情况观察: 每日观察各组小鼠体态、毛色、进食、活动等情况。

抑瘤率: 于给药后第14天脱颈处死小鼠,剥取瘤块,天平称重,计算抑瘤率: 抑瘤率 = ( 1 - 实验组平均瘤重/模型组平均瘤重) ×100%

病理HE染色: 取各组移植瘤用10% 甲醛固定,常规石蜡包埋,应用组织切片苏木素—伊红染色法,光镜下观察。观察肿瘤细胞的分布、生长状态、核固缩、核碎裂和坏死,以及瘤组织内微血管分布情况。

流式细胞术检测瘤组织细胞周期: 将小鼠瘤体剥离称重后,每组取小块瘤组织,并分别浸泡在含有PBS的平皿中,用眼科剪将瘤组织剪碎、匀浆,制成瘤细胞悬液,100目不锈钢网过滤,PBS洗2次,每次1000 r/min离心5分钟,75% 乙醇固定,置于4℃冰箱内过夜。次日离心,PBS洗1次调整细胞浓度为1×107/ m L后离心,小心弃上清液,用含有终浓度为1 mg /m L RNase A酶加100μL后混匀,之后加PI染液0. 4 m L避光染色30分钟,上流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化[4],结果以细胞周期各时相细胞百分比表示。

1. 8 统计学方法

采用SPSS 13. 0统计软件进行统计学处理。瘤重数据符合正态性检验及方差齐情况,以均数±标准差( x±s) 表示,采用单因素方差分析; 抑瘤率数据符合正态性检验但方差不齐,采用Kruskal-Wallis法秩和检验,平均等级间的两两比较; 细胞周期及凋亡率数据均采用单因素方差分析,以均数±标准差( x±s) 表示,两组之间采用均数两两比较( Dun-nett法) 。以P < 0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组 Lewis 肺癌小鼠一般情况观察

接种后第六天,小鼠右前肢腋下可触及黄豆大小瘤块,造模后第7天,小鼠瘤体生长明显加快。与空白组相比,造模后小鼠逐渐出现反应迟钝、动作迟缓、毛发无光泽,模型组小鼠出现拱背、喜静、蜷缩抱团的现象,顺氯氨铂组小鼠出现体温降低、体重增长缓慢,各中药组大部分小鼠行动较灵活,精神状态一般,饮食尚可,体重增长较模型组及顺氯氨铂组快。除空白组和顺氯氨铂组外,其余组小鼠出现少量死亡,多由于肿瘤增长较快压迫肺组织导致呼吸困难,以及后期出现消瘦、不进食饮水等肿瘤恶病质现象,个别小鼠因皮下肿瘤溃烂出血后,被同笼小鼠撕咬所致。

2. 2 扶正散结拆方对 Lewis 肺癌移植瘤的瘤重及抑瘤率的影响

尽管各组有死亡,但其生存率各组无统计学差异。各组瘤重经单因素方差分析比较,差异有统计学意义( F = 10. 98,P < 0. 05) 。两两比较经Dunnett法,与模型相比,其余各组瘤重均显著降低,各中药组以联用组抑瘤作用最为明显,其次为扶正组和解毒组; 各中药组瘤重及抑瘤率独立比较差异也具有统计学意义( P < 0. 05) ,其中联用组抑瘤率最高,为63. 63% ,化痰组和活血组与联用组相比,差异具有统计学意义( P < 0. 05) 。见表1。

注: 与模型组比较,aP < 0. 05,bP < 0. 01; 与顺氯氨铂组 比较cP <0. 05,dP < 0. 01; 与联合组比较,eP < 0. 05,fP < 0. 01。

2. 3 扶正散结拆方对肿瘤组织病理学变化的影响

光镜下观察,肿瘤细胞形态多样,核不对称分裂明显。模型组肿瘤组织中细胞生长旺盛,数量丰富排列紧密,形状不规则,呈片状分布,肿瘤实质和间质分界不清,病理性核分裂相多见,细胞坏死较少; 顺氯氨铂组及各中药组细胞数目较模型组稀疏,呈散在、条索状分布,均可见不同程度的片状坏死区及核固缩、核破碎溶解的现象。见图1。

2. 4 扶正散结拆方对 Lewis 肺癌移植瘤细胞周期及凋亡率的影响

细胞周期及凋亡率的比较采用单因素方差分析。G0/ G1期比例各组间差异有统计学意义( F =14. 13,P < 0. 05) ,两两比较经Dunnett法,各治疗组均较模型组增高; 凋亡率各组间差异有统计学意义( F = 19. 41,P < 0. 01) ,两两比较经Dunnett法,各治疗组均较模型组显著增加。除扶正组及活血组外,其余各组肿瘤细胞在G2/ M期的比例 明显减少( P < 0. 05) ; 化痰组及解毒组在G0/ G1期比例高于顺氯氨铂组及联用组,其余拆方组尽管未显示显著性差异,但趋势清晰; 扶正散结各拆方组凋亡率独立比较具有统计学差异( P < 0. 01) ,以联用组凋亡率最高,其次为解毒组、化痰组、活血组、扶正组。见表2。

3 讨论

研究表明,细胞周期调控紊乱是细胞增殖失控从而导致癌变的重要原因[5]。细胞周期不同时相( G1、S、G2、M) 与细胞周期的关键调控点密切相关,由于细胞的周期长短主要决定于G1期时间长短,所以最重要的调控点是G1/ S调控点,细胞在该点分析细胞内、外的各种复杂信号以及DNA损伤情况,将信号传递、整合、汇集到细胞核,以决定细胞周期的长短、细胞处于静止的G0期或诱发其凋亡。因此,影响和调控肿瘤的细胞周期在肿瘤的治疗中具有重要意义。

A 模型组; B 顺氯氨铂组; C 扶正组; D 化痰组; E 活血组; F 解毒组; G 联合组

(x ± s,% )

注: 与模型组比较,aP < 0. 05,bP < 0. 01; 与顺氯氨铂组比较cP < 0. 05,dP < 0. 01; 与联合组比较,eP < 0. 05,fP < 0. 01。

拆方研究 篇5

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养

60只200 g±10 g的32周龄雄性自发性高血压大鼠 (SHR) , 5只1笼, 饲养在恒温 (22±2) ℃, 恒湿 (55±5) %、人工光照明暗各12 h的饲养室内, 标准饲料和自来水随机取食。

1.2 试验药物

健心颗粒按2.7 g/ (kg·d) 给药, 健心颗粒根据中医不同治法拆方为益气组 (生黄芪、红参、白术) 、活血组 (生蒲黄、丹参) 、温阳组 (桂枝) 、利水组 (葶苈子、猪苓) , 各拆方组中药物根据健心颗粒实际药物含量, 采用全成分颗粒剂, 即:设2.7 g健心颗粒中含有生黄芪Xg, 则益气组中生黄芪给药量为Xg/ (kg·d) 。健心颗粒及全成分颗粒剂由福建中医药大学附属第二人民医院提供。

1.3 分组及给药方法

60只SHR随机分成6组, 空白对照组, 健心颗粒全方组、益气组、活血组、温阳组、利水组, 每组10只。各组分别予以相应药物, 药物溶解在2 mL蒸馏水中以灌胃法给予, 空白对照组予2 mL蒸馏水灌胃。各组每日均灌胃1次, 干预时间为4周。

1.4 主要仪器与试剂

美国BIOPAC多导生理信号采集分析系统, 低温超速离心机 (ALLERGRAGR型, 美国贝克曼) , γ-放射免疫计数器 (FJ-2008PS型, 西安262厂) , 电子天平 (FA2004型, 上海天平仪器厂) , 3%戊巴比妥钠溶液, 0.5%肝素溶液。脑钠肽 (BNP) 试剂盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供, 试剂的批内和批间变异系数分别为<6%和<15%。BNP最低检测值为 (10~30) pg/mL。

1.5 指标检测

1.5.1 评价心功能指标

采用左室压力上升和下降最大速率 (±dp/dtmax) 和血清脑钠肽浓度作为评价心功能指标。大鼠称体重 (BW) 后, 用3%戊巴比妥钠 (30 mg/kg) 腹腔注射麻醉, 分离左颈总动脉, 将内充肝素溶液的导管逆行插入左心室, 稳定10 min后, 用多导生理信号采集分析系统描记±dp/dtmax。采集腹主动脉血, 采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定血清BNP浓度。

1.5.2 评价左室重构指标

以左心室重量指数 (LVWI) 作为评价左室肥厚的指标。取出大鼠心脏去除心房、大血管及右心室游离壁, 保留左心室及室间隔, 用滤纸吸干水分, 称左室质量 (LVM) , LVWI=LVM/BW。

1.6 统计学处理

应用SPSS 15.0统计软件, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组治疗后±dp/dtmax、BNP比较

与对照组比较, 健心颗粒全方组、益气组、活血组、利水组的±dp/dtmax均有升高, BNP下降 (P<0.05或P<0.01) , 其中全方组、益气组、利水组改善更为显著 (P<0.01) , 温阳组的±dp/dtmax、BNP稍有改善, 但无统计学意义 (P>0.05) 。健心颗粒全方组在改善±dp/dtmax、BNP作用方面优于拆方各组 (P<0.0 5或P<0.01) 。各拆方组间比较, 益气组、利水组改善±dp/dtmax、BNP作用优于温阳组、活血组 (P<0.05) 。详见表1。

与对照组比较, 1) P<0.05, 2) P<0.01;与全方组比较, 3) P<0.05, 4) P<0.01;与益气组、利水组比较, 5) P<0.05。

2.2 各组治疗后LVM、LVMI比较

与对照组比较, 健心颗粒全方组、拆方各组的LVM、LVMI下降 (P<0.05或P<0.01) , 其中全方组、益气组、活血组改善更为显著 (P<0.01) 。健心颗粒全方组在降低LVM、LVMI方面优于拆方各组 (P<0.05) 。各拆方组间比较, 益气组、活血组作用优于温阳组、利水组 (P<0.05) 。详见表2。

与对照组比较, 1) P<0.05, 2) P<0.01;与全方组比较, 3) P<0.05;与益气组、活血组比较, 4) P<0.05。

3 讨论

CHF多归属中医学“喘证”“痰饮”“心悸”“积聚”等病范畴, 在其综合治疗体系里中医药具有一定的特色和优势。CHF主要病理生理基础是气虚血瘀, 尤以心之阳气亏虚, 温煦、气化、行血之功失司为发病的关键, 基本病机是气虚血瘀、水湿内停, 故治疗CHF的基本治法是益气、活血、温阳、利水。

健心颗粒是经福建省药监局审批的福建省第二人民医院院内制剂 (药品批号:20020112) , 由生黄芪、红参、生蒲黄、丹参、猪苓、白术、桂枝、葶苈子组成, 正是基于CHF的基本病机, 立法于益气、活血、温阳、利水, 生黄芪、红参、白术益气;生蒲黄、丹参活血化瘀;桂枝温阳;猪苓、葶苈子利水, 诸药相伍, 共奏益气活血、温阳利水之功。健心颗粒治疗CHF有明显疗效, 能改善神经内分泌功能和细胞因子水平, 抗心肌纤维化, 抑制心室重构, 改善血流动力学, 改善心脏收缩与舒张功能能[]。。

±±ddpp//ddttmmaaxx等等血血流流动动力力学学指指标标与与血血清清BBNNPP浓度均均是是评评价价心心功功能能的的敏敏感感与与客客观观指指标标[[66]]。。衰衰老老的的雄性SSHHRR随随着着周周龄龄延延长长, , 心心脏脏负负荷荷逐逐渐渐加加重重, , 出出现现心心室重构构、、CCHHFF高高龄龄SSHHRR作作为为心心力力衰衰竭竭实实验验模模型型对对高高血血压致CCHHFF的的防防治治有有现现实实意意义义[[77]]。。

本研究显示, 在改善心功能与抑制左室重构方面, 健心颗粒全方作用最显著, 说明益气、温阳、活血、利水四种治法相辅相成, 有协同作用, 其中益气组在改善心功能、抑制左室重构均较优, 支持主司益气之功的生黄芪、红参为健心颗粒方剂的君药。拆方组中益气组、利水组在降低BNP、改善±dp/dtmax等血流动力学指标, 改善心功能作用优于温阳组、活血组, 提示益气、利水治法在改善CHF心功能方面有较强作用, 若CHF急性期可在辨证论治基础上加强益气、利水。拆方组中益气组、活血组在改善高血压所致CHF心室重构方面有较强作用, 提示益气、活血治法能够抑制左室重构, 对CHF长期预后有获益。

摘要：目的 探讨健心颗粒及拆方对心力衰竭 (CAF) 大鼠心功能和左室重构的影响, 分析中医药组方原理, 以期为临床应用提供实验依据。方法 以老龄雄性自发性高血压大鼠 (SHR) 的CHF模型作为研究对象, 观察全方及拆方对CHF大鼠左室压力上升和下降最大速率 (±dp/dtmax) 、脑钠肽 (BNP) 和左心室重量指数 (LVWI) 的影响。结果健心颗粒全方及拆方均可以明显改善CHF大鼠心功能或抑制左心室重构 (P<0.05或P<0.01) , 且全方组优于各拆方组;各拆方组间比较, 益气组、利水组改善±dp/dtmax、BNP作用优于温阳组、活血组 (P<0.05) ;益气组、活血组降低LVMI作用优于温阳组、利水组 (P<0.05) 。结论 在改善心功能与抑制左室重构方面, 健心颗粒益气药、温阳药、活血药、利水药作用各有侧重, 而健心颗粒全方作用最全面、显著, 说明益气、温阳、活血、利水四种治法配伍有协同作用。

关键词：心力衰竭,健心颗粒,拆方,心功能,左室重构

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拆方研究 篇6

1 材料和方法

1. 1 实验动物与瘤株

实验动物: C57BL/6小鼠,SPF级,雄性6 ~ 8周龄,体质量18 ~ 22 g,由中国人民解放军军事医学科学院动物中心提供,实验动物合格证号: SCXK( 军)2012-0004。

瘤株: Lewis Lung Cancer瘤株由军事医学科学院提供。

1. 2 试剂及仪器

顺铂( 顺氯氨铂,cisplatin,DDP) ( 齐鲁制药公司,批号: 2030111DB) 、小鼠VEGF试剂盒 ( Andy-gene,批号: HTAC017) 、AS试剂盒( Andygene,批号:HTAC017 ) 、ES试剂盒 ( Andygene, 批号:HTAC017) 、Elisa试剂盒、旋转蒸发器 ( RE53CS,上海亚荣生化仪器厂) 、酶标仪、台式冷冻离心机( 1-15K,SIGMA) 、DHG-9240A电热恒温箱( 北京陆希科技有限公司) 。

1. 3 药品及制备

扶正散结汤主要配伍组份拆分为益气扶正( 简称扶正,由生黄芪25 g、女贞子15 g组成) 、化痰散结( 简称化痰,由半夏15 g、天南星10 g组成) 、活血化瘀( 简称活血,由莪术15 g、郁金15 g组成) ; 清热解毒( 简称解毒,由白花蛇舌草15 g、半枝莲15 g组成) ; 四组联用( 简称联用,由生黄芪25 g、女贞子15 g、半夏15 g、天南星10 g、莪术15 g、郁金15 g、白花蛇舌草15 g、半枝莲15 g组成) 。以上药物均由中国人民解放军总医院中药房提供,经鉴定后,传统方法水煎、过滤、60℃浓缩,分别制成含生药浓度为0. 8 g / m L、0. 4 g / m L、0. 6 g / m L、0. 6 g / m L、2. 45 g / m L的药液,置4℃保存备用。

1. 4 小鼠 Lewis 肺癌移植瘤制备

参考文献方法[1]复制小鼠Lewis移植瘤模型。液氮中取出Lewis肺癌瘤株于37℃温水中复苏,离心后调整浓度至1×107/ m L,在无菌条件下接种于2只C57BL /6小鼠右腋皮下,10天后脱颈处死小鼠,取生长良好肿瘤组织,用生理盐水洗净剪碎后加生理盐水匀浆器研磨,台盼蓝染色计算活细胞数> 95% ,调整肿瘤细胞悬液浓度为1×107/ m L。于每只小鼠右腋皮下接种0. 1 m L,方法同上,传代3次后接种于70只小鼠。

1. 5 动物分组

C57BL /6小鼠80只,随机分为8组: 空白组、模型组、DDP组、扶正组、化痰组、活血组、解毒组、联用组,每组10只。除空白组外,其余各组小鼠接种肺癌移植瘤细胞,于接种第2天开始各中药组给予相应中药煎剂0. 2 m L/d,给药剂量参照文献[2]计算方法给药; 空白组、模型组、DDP组给予等体积的蒸馏水,连续灌胃14天。同时DDP组在接种第2天开始予以腹腔注射DDP 2 mg /( kg·d) ,1次/2天,共注射7次,其余各组 予以腹腔 注射生理 盐水10 m L / kg。给药第14天小鼠称重后,固定小鼠股骨动脉取血,静置0. 5小时后,放入离心 机中,2000 r / min离心15分钟取上清液,- 20℃低温冰箱保存。

1. 6 观察指标及检测方法

1. 6. 1小鼠体质量变化的测定从灌胃第1天起,每两天在灌胃前称取小鼠体质量。

1. 6. 2肿瘤生长情况的测定接种成瘤后,每2天测量1次荷瘤小鼠肿瘤最长径( a) 和最短径( b) ,以肿瘤体积 = ab2/2( 肿瘤最长径 = a,最短径 = b) 表示肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。

1. 6. 3血清VEGF、AS、ES的测定采用双夹心ELISA法,按试剂盒说明步骤测定VEGF、AS、ES的含量。以空白孔调零,450 nm波长酶标仪测定吸光度( optical density,OD) ,测定在加终止液后15分钟以内进行。

1. 7 数据处理与统计分析

采用SPSS 17. 0统计软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(±s) 表示,小鼠体质量比较采用单因素方差分析,组间采用SNK法两两比较,肿瘤体积及血清比较因方差不齐或非正态分布采用Kruskal-Wallis法秩和检验,组间两两比较采用Bonferroni法,以P < 0. 05为有统计学意义。

( ± s,g)

注: 与空白组比较,aP< 0. 05,bP < 0. 01; 与模型组比较cP < 0. 05,dP< 0. 01; 与 DDP 组比较,eP < 0. 05,fP < 0. 01

( ± s,cm3)

注: 与模型组比较aP < 0. 05,bP < 0. 01; 与 DDP 组比较,cP < 0. 05,dP < 0. 01

2 结果

2. 1 小鼠体质量的变化

自灌胃第1天开始,隔日称取小鼠体质量,空白组小鼠体质量增长较快; 模型组小鼠体质量有所增长,但增长缓慢; DDP组小鼠注射DDP后体质量增长不明显,几乎无明显变化; 各中药组大部分小鼠体质量增长较模型组及DDP组快( P < 0. 05) 。

2. 2 肿瘤生长曲线的变化

皮下接种第7天,皮下可以触及大小约25 mm3肿块,所有造模小鼠均出现肿块,成瘤率100% ,药物干预的初始阶段,各组肿瘤生长速度差别不大,移植瘤体积无明显差异( P > 0. 05) 。随着观察时间的延长,各组肿瘤均逐渐增大,生长速度也逐渐加快。造模后13天,模型组肿瘤的平均体积最大,其次为活血组( P < 0. 05) ,其余各组肿瘤体积均较小( P < 0. 01) ; 与DDP组比较,以联用组生长最慢,与DDP组无明显差异,其余各配伍组体积增长较快( P < 0. 01) 。从生长曲线可以看出各个药物干预组生长速度较模型组减低,其中顺铂组生长速度最慢、联用组次之,生长速度从慢到快依次排列为顺铂组、联用组、解毒组、化痰组、扶正组、活血组、模型组。见图1。

2. 3 ELISA 检测血清 VEGF、AS、ES 结果

VEGF含量: 与空白组比较,模型组、DDP组及各配伍组分组VEGF含量均明显升高( P < 0. 01) ,联用组升高较少( P < 0. 05) ; 与模型组比较,DDP组、各中药组含量均显著降低( P < 0. 01) ,以联用组、DDP组和活血组尤为明显; 与DDP组比较,联用组含量降低( P < 0. 05) ,活血组与DDP组含量无明显差异,其余中药组含量较高( P < 0. 01) 。

AS含量: 与空白组比较,各组含量均下降( P <0. 05) ,模型组尤为显著( P < 0. 01) ,DDP组及联用组降低程度最低; 与模型组比较,各组血清AS含量下降程度均较轻( P < 0. 01) ,以顺铂组和联用组尤轻; 联用组与DDP组比较AS含量无显著性差异,其中以联用组AS含量为各中药组最高,其次为活血组,其余各中药组含量较低,差异有显著性意义( P < 0. 05) 。

ES含量: 与空白组比较,各组ES含量均明显降低( P < 0. 01) ,以模型组最著; 与模型组比较,各组血清ES含量下降程度均较轻( P < 0. 01) ,以顺铂组和联用组尤轻; 联用组及扶正组与DDP组最接近,差异无统计学意义( P > 0. 05) ,化痰组、活血组和解毒组ES含量则较低( P < 0. 01) 。

( ± s)

注: 与 空 白 组 比 较,aP < 0. 05,bP < 0. 01; 与 模 型 组 比 较,cP <0. 05,dP< 0. 01; 与 DDP 组比较,eP < 0. 05,fP < 0. 01

3 讨论

血管生成促进因子主要包括VEGF、碱性成纤维细胞生长因子等,其中VEGF为主要的促血管生成因子,主要通过影响血管内皮细胞的PI3K等信号通路而发挥调控作用[3]; 血管生成抑制因子主要包括AS、ES、凝血栓蛋白( TSP-1) 等[4],AS主要通过抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖、迁移来发挥其抗肿瘤的作用[5],而ES具有广泛的抗癌活性,能干扰新的血管生成,是最有效的内源性血管生长抑制剂之一[6,7,8]。中医药在抑制肿瘤生长、稳定和控制病灶、延缓复发转移方面,已得到广泛认可。自拟扶正散结汤是临床经验方,根据不同情况采用益气扶正、化痰散结、活血化瘀和清热解毒法等治法联合加减,不仅可以提高放化疗的效果、减轻放化疗副反应,并且可作为肿瘤病人长期维持治疗的方药。课题组实验研究表明该方及其各配伍组份均可抑制肿瘤生长,其机制与抑制肿瘤细胞分裂、促进肿瘤细胞凋亡及对机体免疫调节等方面的作用有关[9],同时课题组也发现该方配伍组份能降低肿瘤组织中VEGF、升高ES的表达,表明该方不同配伍组份可通过对不同因子的影响而抑制肿瘤血管生成,进而发挥抑瘤作用。

本实验通过测量小鼠体质量、绘制肿瘤生长曲线可以看出,各组中药对肿瘤生长均有抑制作用,其中以顺铂组效果最好,联用组与之相当,其他中药组较弱,但在体质量增长方面,各中药组体质量均优于顺铂组,说明中药组可改善生存质量,综合抑瘤效果和体质量增长评价,以中药联用组为最优。血清检测结果显示,各组VEGF、AS及ES血清含量变化与组织学检测的结果一致,且与肿瘤生长体积的变化相吻合。和顺铂组一样,各拆方配伍组及联用组可以抑制VEGF升高的趋势,减轻AS、ES的降低程度; 而在抑制VEGF方面联用组优于顺铂组,活血组与顺铂组相当,在上调AS、ES水平方面以联用组效果最好,与顺铂组相当,扶正组次之。表明该方各配伍中药在抑制VEGF、促进AS、ES的表达方面具有各自不同的特点,而以四法联用效果最优,可以通过影响血管生成来抑制肿瘤生长。

拆方研究 篇7

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 日本大耳兔60只,体重1.8 kg~2.2 kg,雄雌各半,由湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号:湘医动字2001-003。

1.1.2 实验药物 血府逐瘀汤组方[3]:桃仁12 g,红花9 g,当归9 g,生地黄9 g,川芎5 g,赤芍6 g,牛膝9 g,柴胡3 g,桔梗5 g,枳壳6 g,甘草3 g。根据血府逐瘀汤以上药物的组成及剂量,对其进行治法拆方。桃红四物汤加减:桃仁12 g,红花9 g,当归9 g,生地黄9 g,川芎5 g,赤芍6 g,牛膝9 g;四逆散加减:柴胡3 g,赤芍6 g,枳壳6 g,桔梗5 g,甘草3 g。全方各药物先加冷水浸泡30 min,水漫过药面3 cm左右,沸腾后煎40 min,过滤取汁,再进行第2次煎煮,两煎所得滤液混合后浓缩,分别含生药0.71 g/mL、0.55 g/mL、0.21g/mL,4 ℃冰箱保存。以70 kg成人体表面积换算给药剂量,按2倍剂量给药,分别为7.1 g/mL、5.5 g/mL、2.1 g/kg。胆固醇由上海试剂一厂生产(编号:试-2007-06-01)。蛋黄粉由大连绿雪蛋品发展有限公司生产(编号:1010301)。

1.1.3 主要实验仪器 Motic B3双目生物摄影显微镜(麦克奥迪实业集团公司生产),MIASE医学图像分析管理系统(北航公司生产),Finesse 325切片机(英国Thermo ShanDon公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及造模[4] 将60只兔随机分为空白组、模型组、血府逐瘀汤组(血府组)、桃红四物汤组(桃红组)、四逆散组(四逆组),共5组,每组12只。空白组每日给予普通饲料,其余各组每天给予高脂饲料100 g(含胆固醇1 g,猪油5 g,蛋黄粉7.5 g),待全部吃完后补充足量普通饲料;造模同时灌胃给药10 mL/(kg·d),按上述生药量给药,相当于成人每日用药量的2倍;空白组和模型组给予等体积凉开水。连续12周。

1.2.2 标本采集与处理 造模后,动物体质量逐步增加,但中途灌死、病死较多,剔除后,每组为7只。实验至第12周末,空腹禁食8 h(不禁水)后,处死动物,速取主动脉组织,去除上面附着组织,将标本浸入4%多聚甲醛溶液中,固定48 h,取石蜡块包埋。

1.2.3 指标检测方法 原位杂交法。ERK2 mRNA原位杂交检测试剂盒(编号:MK2078),盒中内容包括:胃蛋白酶(10;Pepin) 2 mL;预杂交液 2 mL;MKP-1寡核甘酸探针预杂交液 2 mL;封闭液 5 mL;生物素化鼠抗地高辛 5 mL;SABC-POD 5 mL;生物素过氧化物酶 5 mL。实验步骤按试剂盒操作进行。

1) 为湖南省教育厅科研基金项目(No.07C484),湖南省教育厅青年科研基金项目(No.05B034)

1.2.4 结果判断 细胞质呈棕黄色颗粒为阳性反应。苏木素复染,胞核为蓝色。每张切片在40倍物镜下随机选取5个视野,采用MIAS医学图像分析系统测定ERK2 mRNA阳性表达颗粒的总数(单位面积记数,面积为38887.21 μm2)。

1.3 统计学处理 所有数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,组间比较方差齐时用方差分析,方差不齐时用秩和检验,采用SPSS 13.0软件包进行分析。

2 结 果

主动脉ERK2 mRNA阳性表达颗粒为棕黄色,主要存在于主动脉平滑肌细胞质中。模型组与空白组比较,模型组阳性颗粒显著多于空白组(P<0.01);各药物组与模型组比较,血府组和桃红组主动脉ERK2mRNA阳性颗粒的表达降低(P<0.01),四逆组差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

3 讨 论

在所有MAPK中,ERK是最早被认识、研究得最多最透彻的蛋白激酶。ERK属于丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)蛋白激酶,在某些丝裂原刺激后ERK能向细胞核转位,并且具有调控转录活性的能力。许多对于细胞的刺激,例如能导致一些转录因子及其他一些细胞增殖、分化、细胞周期调节和细胞存活有关的丝氨酸或苏氨酸激酶激活的刺激,都能激活ERK。因此,ERK具有促进细胞分裂、增殖、分化的作用,它在动脉粥样硬化中对血管平滑肌细胞增殖效应起到了关键的作用[5]。ERK的催化区在第Ⅷ区三肽基Thr(p)-Glu-Tyr(p)中,可通过苏氨酸残基(Thr-185)和酪氨酸(Tyr-187)残基磷酸化而激活。

本研究通过高脂饲养实验兔,复制了动脉粥样硬化的血瘀证模型,以原位杂交实验检测,发现模型组较空白组的ERK2在平滑肌细胞中有显著增多(P<0.01)。模型组内膜增厚、VSMC向内膜层迁移增生、大量泡沫细胞出现。这可能是高胆固醇的血液中,低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、三酰甘油(TG)等物质可以作为细胞外信号不断而强烈地刺激平滑肌细胞,从而激活了ERK的信号传导通路,即:LDL、TG→Ras→MEK1/2→ERK2→有丝分裂、增殖。与模型组相比较,在使用了血府逐瘀汤、桃红四物汤、四逆散干预后,血府逐瘀汤和桃红四物汤可以使ERK2在细胞中的阳性颗粒有不同程度的减少(P<0.01),这说明血府逐瘀汤及其活血拆方对抗动脉粥样硬化的机制之一可能是抑制了ERK2的活化。究其原因,可能与血府逐瘀汤及其活血拆方发挥了以下的作用有关:与血府逐瘀汤增加了MKP-1mRNA在细胞中表达有关;可能与血府逐瘀汤药物的有效部位对ERK2的空间构象产生破坏作用有关。ERK双磷酸化位点的三肽基为Thr(p)-Glu-Tyr(p)活化基团,三肽基位于蛋白激酶第Ⅶ和Ⅷ区之间Loop12环状结构内,该环位于分子表面并邻近活性位点,其中部分残基形成一种唇状结构,被称为“磷酸唇”(phosphory lation)。这一区域被认为是包括MAPK在内的多种蛋白激酶活化的关键结构[2]。血府逐瘀汤有可能对ERK2的磷酸唇产生空间构象的突变,使ERK2无法发生磷酸化而失去活性。另外,ERK2的底物结合口袋的氨基酸残基相当保守,稍有改变即会影响ERK2的功能和活性,在未受到刺激时,ERK2的底物结合口袋被精氨酸Arg192占据,当ERK2被磷酸化后,Arg192则转离原来的位置,从而暴露底物结合口袋来进行底物的结合[2]。假设血府逐瘀汤中众多的化学成分中某一种,有可能代替了Arg192占据ERK2的底物结合口袋,致使ERK2即使磷酸化也不能充分暴露出底物结合口袋来进底物的结合,从而使信号转导中断,无法产生细胞增殖的效应。③可能是血府逐瘀汤对ERK2上的苏氨酸或酪氨酸的磷酸化过程产生影响造成的。ERK的酪氨酸残基先于苏氨酸残磷酸化[6,7],仅有酪氨酸磷酸化的ERK是不具有活性的,必须聚集起来才能使苏氨酸磷酸化。一旦达到聚集的域限值,则苏氨酸被磷酸化。血府逐瘀汤及其拆方如若对酪氨酸的磷酸化造成阻碍,则苏氨酸无法聚集到域限值,这样ERK2就无法转变为活性状态,信号转导将中止。这种推测还有待今后进一步的研究证实。④可能与血府逐瘀汤降低血管平滑肌细胞血小板衍生生长因子(PDGF)有关。在血管平滑肌细胞中PDGF可以选择性活化ERK。而嵇波等[8]研究血府逐瘀汤对PDGF的影响,发现血府逐瘀汤可使PDGF降低,这有可能是血府逐瘀汤降低了PDGF而导致细胞内ERK2 mRNA表达降低。血府逐瘀汤治法拆方实验研究,发现血府逐瘀汤及其活血拆方桃红四物汤对平滑肌细胞ERK2 均有降低的作用,说明在抗动脉粥样硬化治疗过程中,两者具有共同的作用靶点,同时也可能存在共同的物质基础。但是就作用强度,血府逐瘀汤全方强于桃红四物汤拆方,尽管行气的四逆散对ERK2并未显现功效,但是当活血与行气配伍时,可能会促使血府逐瘀汤全方降低ERK2的功效进一步增强,从而出现血府逐瘀汤全方功效强于拆方组的特点。

摘要：目的探讨血府逐瘀汤及其拆方对血管平滑肌细胞丝裂原活化蛋白激酶调节因子ERK2 mRNA表达的影响。方法采用高脂饲料复制动脉粥样硬化模型,原位杂交法检测主动脉ERK2 mRNA的表达。结果模型组与空白组比较,模型组阳性颗粒为(150.57±25.90)个显著增高(P<0.01);各药物组与模型组比较,血府组和桃红组ERK2 mRNA分别为(45.29±22.27)个和(95.86±95.86±19.85)个表达降低(P<0.01);四逆组为(128.71±40.90)个差异无统计学意义(P>0.05)。结论血府逐瘀汤可以有效降低血管平滑肌ERK2 mRNA阳性颗粒的表达,可能是其抗动脉粥样硬化血管平滑肌细胞增殖的机制之一。

关键词：血府逐瘀汤,拆方,血管平滑肌细胞,细胞外信号调节激酶,原位杂交

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