牙周炎动物模型的建立

牙周炎动物模型的建立（共7篇）

牙周炎动物模型的建立 篇1

骨折延迟愈合或骨不连的治疗一直是骨科研究的热点和难点, 临床上有许多问题尚未解决, 治疗相当棘手, 而在临床上骨折延迟愈合是骨不连的前奏, 积极治疗骨折延迟愈合将有效减少骨不连的发生。骨不连动物模型相对较多, 但骨折延迟愈合模型相对较少。本实验旨在通过动物实验方法, 为研究骨折延迟愈合建立一个客观的动物模型, 为临床治疗提供实验支持。

1 资料与方法

1.1 骨折延迟愈合动物模型的制作

选取纯种新西兰大白兔30只 (普通级, 新疆维吾尔自治区实验动物中心提供) , 体重 (2.25±0.31) kg, 雌雄各半, 术前12 h禁食水, 备右下肢皮肤, 术晨用3%戊巴比妥钠按1 mL/kg剂量耳缘静脉注射麻醉。麻醉后取左侧卧位, 常规消毒右下肢, 铺巾。实验组15只, 在右小腿前外侧做长约4 cm直切口, 显露胫骨, 在距胫腓骨联合处以远1 cm处截骨, 再向远近端1 cm切除外骨膜、刮除骨髓及内骨膜, 同时以钢板固定, 断端间距1 mm。彻底止血, 依次缝合各层组织, 肌注青霉素8万单位, 连续3 d, 不做外固定, 放入笼内喂养, 对照组15只为不去除骨膜与骨髓截断后即行内固定。术后4、8、12周分别取5只动物进行X线检查后, 取大体标本观察并经病理组织学检查骨折愈合情况。

1.2 检测方法

1.2.1 大体观察

术后4、8、12周分别取标本观察骨折连接情况, 骨端骨痂增生情况。

1.2.2 病理组织学检查

术后4、8、12周分别取10只动物 (实验组与对照组各5只) 进行X线检查后, 麻醉后取出患侧胫骨, 取材包括骨折双侧正常骨端0.3 cm, 行常规脱钙、脱水、透明及石蜡包埋, 5 μm连续切片, HE染色, 光镜下观察。

1.2.3 放射学检查

于术后4、8、12周各取10只 (实验组与对照组各5只) 大白兔进行X线检查, 观察骨折线变化情况。

2 结 果

2.1 大体标本肉眼观察

术后4周, 实验组骨折区形成纤维连接, 无骨性连接, 两侧断端有少量骨痂形成;对照组已达骨性愈合。术后8周, 骨折区形成纤维连接, 少数骨折断端形成骨性连接, 两侧断端有较多骨痂形成;术后12周骨折绝大部分达到愈合, 只有1只实验动物未达骨性愈合。

2.2 病理组织学检查

术后4周, 实验组光镜下骨断端髓腔封闭, 有软骨细胞及骨细胞, 细胞呈无序排列, 纤维膜覆盖, 缺损区为纤维瘢痕组织 (见图1) ;对照组骨折断端连接良好。术后8周, 光镜下骨折断端可见较多骨痂形成, 排列有序, 缺损处可见骨痂连接 (见图2) ;术后12周, 骨折断端连接良好, 骨小梁已塑形 (见图3) 。

2.3 放射学检查

术后4周, 实验组所有试验动物均可见骨折线清晰, 有少量骨痂形成 (见图4) ;对照组骨折线已消失。术后8周, 骨折线模糊, 可见较多骨痂形成 (见图5) ;术后12周, 绝大多数已达骨性愈合 (见图6) , 仅1只实验动物未达骨性愈合。

3 讨 论

骨折愈合是一个复杂的组织学、生物学、内分泌学及生物力学的动态过程, 影响骨折愈合的因素众多[1], 主要在各种细胞的功能活动及多种生长因子的作用下, 诱导骨基质形成和钙盐沉积, 最后使骨折愈合。通常分为3个阶段:a) 血肿机化演进期;b) 原始骨痂形成期;c) 骨板形成塑形期。尽管骨愈合的能力很强, 但仍有5%～10%的骨折愈合受到干扰, 导致延迟愈合和骨不连。因此, 骨折延迟愈合的问题仍是当前骨科应重视的问题[2]。

一般来说, 骨折在3个月左右就能愈合, 超过3个月为延迟愈合。目前常用的标准为骨折9个月未愈合, 且3个月以上无愈合的迹象为骨不连。此标准适用于人类, 而对于动物模型则不适用。我们正常对照组研究表明兔胫骨正常愈合时间在4周左右。

骨延迟愈合是可以给予人为干预后避免骨不连发生的阶段, 因此研究骨折延迟愈合将具有重要意义。

治疗骨折延迟愈合, 近年无论是手术或非手术治疗都有明显进步, 前者包括游离植骨术, 带血管蒂肌骨瓣移植, 加压内固定或外固定术;后者包括体外冲击波治疗、经皮注射疗法、电刺激、骨诱导治疗、局部自体骨髓移植或注射金葡液, 机械刺激、震动波、生物因子治疗等。无论哪种方法均需首先通过大量的动物实验阶段, 从而进入临床试验阶段, 而建立贴近临床环境的骨折动物模型是研究骨折发生机制和新治疗方法的基础[3]。

目前, 对于骨不连动物模型研究及报道较多[4,5,6,7], 而骨延迟愈合动物模型则未见报道。Brownlow等[8]将新西兰大白兔胫骨截断, 去除相当于胫骨干直径长度的骨折端骨膜, 刮除相当于胫骨干直径长度的髓腔内组织, 用外固定架固定骨折端, 使骨折端保持2 mm的间隙。术后8周, 影像学和组织学表明骨折端类似于临床萎缩性骨不连的表现, 大量纤维组织填充。Eckardt等[9]改良上述方法, 用钢板取代外固定架固定骨折端, 成功制作出萎缩性骨不连模型。我们对Eckardt方法进行改进, 成功制备出骨折延迟愈合模型。

本实验选取新西兰大白兔作为骨延迟愈合实验对象, 分别在4、8、12周后处死动物, X线、大体标本、组织学检查以证明本造模方法的可靠性。本实验所选手术部位位于胫骨中下段, 解剖部位上肌肉覆盖较少, 红骨髓含量少, 临床上为易发生骨折延迟愈合或骨不连的部位。在骨折愈合过程中, 骨膜具有重要作用。外骨痂的形成取决于骨膜的成活与完整性, 骨膜的广泛撕裂会造成骨膜坏死, 加重骨端缺血坏死, 影响骨愈合。骨膜的完整性也有利于膜内成骨。临床工作中常常因操作不当导致骨折端过度骨膜剥离和扩髓而削弱骨愈合能力, 造成骨折延迟愈合。因此, 本模型在截骨时去除远近端各1 cm外骨膜、骨髓及内骨膜, 消除了骨外膜成骨及骨髓腔成骨因素;在骨折断端保留1 mm间隙, 增加骨愈合难度。这种模型比较接近临床环境。术后8周, X线片仍可见骨折线, 光镜下骨折断端可见较多骨痂形成, 排列有序, 缺损处可见骨痂连接;术后12周绝大部分骨折达骨性愈合。本实验表明, 所建立的动物模型具有骨延迟愈合的大体标本、影像、病理学改变, 又没有出现骨不连, 符合骨折延迟愈合的要求, 反映了骨折延迟愈合的一般特征, 是一种可靠而实用的实验性骨延迟愈合动物模型。

参考文献

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[8]Brownlow HC, Simpson AHRW.Metabolic activityof a new atrophic nonunion model in rabbits[J].JOrthop Res, 2000, 18 (3) :438-442.

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牙周炎动物模型的建立 篇2

家兔对高脂饲料的敏感性高, 易造成高脂血症和AS, 且不同的饮食结构可产生不同类型的AS斑块。饲喂法制造的家兔AS模型, 停喂高脂饲料15周内未恢复正常, 说明家兔AS模型在一定时间内是稳定的[1], 因而, 已成为建立高脂血症及AS模型应用最广泛的动物之一。

但是, 在建立兔AS模型时, 高脂饲养配方、喂饲方法并未达成一致, 且建模所用时间也不相同, 效果也有差异。张勇等[2]用高脂饲料 (30%胆固醇, 10%猪油, 2%脱氧胆酸钠, 2%丙基硫氧嘧啶) 灌胃于日本大耳白兔, 其中脱氧胆酸钠能促进脂类的消化吸收, 丙基硫氧嘧啶抑制甲状腺素的合成, 从而降低兔的新陈代谢, 减少脂类消耗, 该配方更能增高血脂含量吸收更可靠, 更完全。同时注射异体蛋白质 (牛血清白蛋白) 可缩短造模时间, 并使家兔高脂血症模型和AS斑块类似于人类病变。近年来研究表明[3], 内皮损伤加上同时存在的高脂血症 (甚至血脂正常) 可诱发家兔的AS病变。该方法具有建立模型快、易于饲养、与人类早期脂肪斑块相似、经济便宜及存活率高的特点。

评价:兔是最早用于建立AS模型的动物, 但兔属草食动物, 不易自发性产生AS, 其病变特点亦与人体不同, 病变倾向发生于主动脉弓及胸主动脉, 冠状动脉病变亦与人体的不同, 病变主要在心肌内支, 大支较少被累及。肺血管可被累及, 但在人体, 仅在并发肺动脉高压时才出现。兔不会发生人体的并发症, 产生的损伤更类似于黄瘤病而不像人的AS。另外, 兔抵抗力差, 易继发感染而死亡, 并且用药量大, 形成典型的AS病理学改变需8～12周。

2 大鼠动脉粥样硬化模型的建立及评价

大鼠不仅具有AS的特性, 而且饲养方便、生存能力强、死亡率低、成本低廉、获取容易、经济效益比较高, 所以大鼠AS模型得到了广泛使用。

目前已形成多种建立大鼠AS模型的方法。包括喂养法、内膜损伤法、免疫刺激法等。郭延松等[4]在高脂饲料加维生素D (VD) 粉剂喂养大鼠, 胸主动脉管壁明显增厚, 形成增生性AS斑块。王禄增等[5]用3～4月龄Wistar大鼠每日灌胃450 mg L-蛋氨酸 (L-met) , 连续8周后在主动脉弓见到局部内膜细胞收缩及内膜下水肿病理改变。Joen等[6]应用高胆固醇饮食加球囊导管损伤血管内膜的方法, 8周后可出现明显AS表现。

目前建立AS模型最常用的鼠类是大鼠, 模型制作经济、容易获取、便于饲养且手术耐受性好。但大鼠具有抗自发性和实验性AS特性, 复制AS模型要求条件严格, 病变不恒定, 且与人体的不同, 体形及动脉小。大鼠等啮齿类动物虽不易形成AS, 但经过适当的干预, 也可产生典型的斑块[21]。

3 小鼠动脉粥样硬化模型的建立及评价

小鼠有经济、易得、耗药量少、饲养和给药方便的优点, 但是小鼠有一套与人类截然不同的脂类处理体系, 不易形成病理模型。Johnson等[7]喂以高脂饮食12个月的ApoE基因敲除小鼠在头臂动脉可有闭塞性血栓形成。Rosenfeld等[8]发现ApoE基因敲除小鼠饲以高脂饮食15个月, 在42～54周时可观察到头臂动脉有高发的不稳定斑块。Bristol等[9]使用一种少见的C57BL6/129SvJ混合基因背景的ApoE基因敲除型小鼠为动物模型, 饲以高脂饮食14个月后在头臂动脉和右颈总动脉的交界处出现管腔内血栓。

由于小鼠缺乏CETP, 病变与人体不同, 且病变不恒定, 体形及动脉过小, 因此已很少用于诱发AS动物模型。但近来许多研究表明ApoE基因敲除小鼠饲以高脂饮食, 较易产生AS斑块, 且在AS损伤的发展、分类、分布及表现上与人类的AS损伤具有某些相似的特点。因此认为目前用于研究AS较理想的鼠模型是ApoE基因敲除小鼠模型。

4 小型猪动脉粥样硬化模型的建立及评价

近年来, 小型猪的AS研究已成为最有用而且易得的AS动物模型之一。在正常饮食下小型猪也会产生AS, 当饲以高胆固醇饮食时, 其血浆胆固醇水平升高, 而且会发生与人类相同的AS病变[10]。

刘录山等[11]以高脂饮食喂养贵州小香猪12个月, 病理形态学结果显示, 冠状动脉和腹主动脉病变最为明显, 这与人类AS病变的分布特点也是一致的。近年来, 越来越多研究者应用高脂饲料加球囊损伤技术来促进AS的形成, 毕建忠等[12]对颈总动脉、管耘园等[13]对冠状动脉、黄先勇等[14]对髂动脉进行球囊定位损伤, 小型猪局部AS病变在3～6月可诱发。因此该动物模型可以作为一个很好的研究AS的工具。

评价:小型猪的饮食结构以及心血管系统在解剖结构、生理功能、脂蛋白结构与组成与脂质代谢机制等方面近似人类, 且随着年龄增长, 猪可自发产生AS, 高胆固醇饮食可加速AS的形成[15]。因此, 可以制作成和人类相似的动脉硬化和狭窄的模型, 是AS模型的理想实验动物, 但长期喂胆固醇食导致很严重的病变, 这种病变消退缓慢, 且购买和饲养费用昂贵, 饲养难度大, 还容易发生猝死。

5 非人灵长类动脉粥样硬化模型的建立及评价

非人灵长类种系 (如鹌鹑、鸽) 系统发育和饮食结构与人类最接近, 且能自发形成AS, 又具有个体小, 实验消耗的药品少, 饲养、给药方便等优点是研究人体脂类代谢过程、药物抗AS的预防作用的理想动物模型。

目前, 实验多采用高脂喂养法建立AS模型。田卉等[16]以高脂饲料喂养鹌鹑11周即出现典型的AS的病理形态学改变。鸽对食源性诱发的高血脂极为敏感, 少量的高脂饲料即可引起血脂升高并明显加剧动脉病变[17]。有研究显示[18], 鹌鹑停高胆固醇饲料喂养4～6周后, 病变减轻, 这可能干扰药物对AS的治疗作用的研究结果。

非人灵长类种系发生上与人类接近, 其AS病变特征与人体也相似。但个体及其动脉较小, 动态观察血脂变化难度较大, 大体标本难以制作, 且该实验动物购买和饲养费用昂贵, 且供应较困难, 较难满足实验需要。

结语:建立AS的实验动物模型是评价抗动脉粥样硬化药物的关键技术。采用各种方法诱发实验动物的高血脂和AS, 建立稳定、可靠的实验模型, 对于新型抗动脉粥样硬化药物的发现和发展研究具有很高的实用价值。从AS的发病机制出发, 建立各种AS动物模型可获得成功, 根据模型形成的方法和特征不同, 可分别用于不同的研究目的。

摘要：动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 是冠心病的基本病理基础, 但AS的发病机制仍不明确, 因此建立一种脂质代谢和斑块与人类相似的实验性AS整体动物模型是评价抗AS药物的关键。据报道不同种的动物主动脉胆固醇酯酶活性不同, 本文就各种实验动物动脉粥样硬化模型建立的情况进行综述。

牙周炎动物模型的建立 篇3

关键词：大肠癌,小鼠,中药干预,加味痛泻要方

大肠癌属于临床最常见的消化道肿瘤之一[1]。这些年,通过对我院病例研究发现,其发病率有着上升的趋势。相关研究[2]表明,大肠癌形成属于多个原癌基因激活及抑癌基因失活且不断累积造成。其中,影响最为突出的便是突变型P53蛋白表达,其与大肠癌形成密切相关。本院通过对小鼠模型进行相关研究,在建立动物模型基础上,观察了突变型P53蛋白表达引发的癌变结果,进而采用了中药(加味痛泻要方)进行干预,同时观察记录了相关防治效果。现将相关结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

药方:加味痛泻要方,简称JW,用陈皮11.88g、防风14.94g、白芍19.79g、姜黄29.77g、白术14.59g等进行传统方法煎煮,最后制成浸膏便于实验,其中浸膏中生药含量为4.3g生药/mL;DMH,即2-二甲肼,美国研制,使用前用0.9%氯化钠溶液新鲜配制0.4%DMH注射液,并用碳酸氢钠将其pH值调到6.5~7.0。

动物:100只健康小鼠,由广西医科大学实验动物中心提供,全部拥有合格证号。

1.2 方法

100只小鼠随机分成四组,其中三组加不同剂量加味痛泻要方(高:77.68g生药/kg;中:38.59g生药/kg;低:19.13g生药/kg),第四组为对照组。分组完成后,每组都要注射DMH(按20mg/kg剂量),一周一次,需要持续约22周。当DMH诱发癌变之后,需根据不同分组进行灌胃给药,每天一次,每周5d,并且每周都需要称重一次,以便调节药用量。给药之后约3.5、4、4.5、5个月,分别取出组里动物处理(前三次每次5只,第四次处理完剩余全部小鼠),取肛门及以上大肠约7cm长进行解剖观察及分析。其中,采用免疫组化法染色基因,进行相关P53检查。

1.3 评价标准

采用免疫组化法对动物模型标本进行观察分析,其中P53蛋白的细胞核着色成棕黄色为阳性细胞。

1.4 统计学分析

本次实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析,其中细胞中阳性细胞数计为P53,对其组间数据资料采用t检验、卡方检验,并进行相关比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组小鼠在实验中的相关数据如表1~3所示,由此可知加味痛泻要方组发癌率等明显低于对照组,并且中药干预能明显降低突变型P53蛋白表达。

3 讨论

在大肠癌患者中,其中溃疡性肠炎癌变占有十分重要的地位,有关资料显示[3],大约有5%~10%的溃疡性结肠炎患者可能引发癌变。因此,在我院临床上,治疗溃疡性结肠炎的主要措施就是防治其癌变。加味痛泻要方属于我国传统型的中药,并且是有效治疗肠道疾病的处方之一,用此药方治疗溃疡性结肠炎,目前在我国已经取得了认可。在这个基础之上,本院结合了肿瘤及相关基因学理论,通过肿瘤药物研究作为切入点,将动物模型(小鼠)加入了研究中,本院四个小组分别进行处理与干预,通过对小鼠进行相关研究分析,探究其大肠癌癌变过程,同时给予中药干预,取得的结果显示,加味痛泻要方为有效防治溃疡性结肠炎癌变提供了可能,同时相关研究也显示其对大肠癌有着一定的治疗效果。

本研究中,采用DMH喂养的方式诱发小鼠癌变,由于各组情况不同,因此具体的癌变效果也就不同,在采用中药干预的时候,应注意药剂的量,同时也要注意入药时间的把握。当然,由于各组情况的差异,它们对于加味痛泻要方的表现效果就有所不同,但都对诱导性大肠癌的发生有着一定的对抗作用。通过解剖研究与分析显示,加味痛泻要方的组别中,癌变的瘤体数明显要低于对照组,并且瘤体较小,进一步分析可知加了加味痛泻要方的组别中的肿瘤发生率、浸润癌数等都要优于对照组。由此可见,加味痛泻要方对DMH诱发小鼠大肠癌有着十分明显的保护作用。

注:与对照组比较,#P<0.05

此外,突变性P53蛋白基因属于一种与大肠癌十分密切的癌蛋白,在大部分的大肠癌患者中,突变性P53基因往往都呈现出一种高表达的趋势。本研究中,全程观察P53突变在大肠癌形成过程中的效果与作用,同时进行研究分析,得知加了加味痛泻要方的组别中,P53蛋白的表达效果明显产生不同程度的降低,其中JW剂量浓度最高组的效果最为明显,其对P53的表达有着非常高的控制能力。随着剂量降低,控制效果下降,因此P53的表达效果会相应升高,而对照组中表达效果最高,而其产生的癌变最明显。

本研究通过动物模型建立及中药干预,取得了非常理想的效果。当前,大多数专业人士认为,诱导肿瘤细胞的凋亡以及阻断肿瘤信号,能有效治疗肿瘤。因此,抗肿瘤药物的研究与探索便成为了一个新的方向与出路,而动物模型的建立在这个环节中也不可或缺。

参考文献

[1]吕仙梅.中药干预治疗对大肠癌生存期影响的研究[D].上海:上海中医药大学,2010.

[2]廉南,曹均告,严清明,等.中药加味痛泻要方对实验性大肠癌EGFr、P53蛋白表达的干预作用[J].成都中医药大学学报,2004,27(2):17-19.

牙周炎动物模型的建立 篇4

1 材料及方法

1.1 实验动物与试剂

Wistar大鼠55只, 雌雄各半, 体重180～200g, 由佳木斯大学实验动物中心提供。CD4+、CD8+免疫组化试剂盒 (博士德公司) 、完全弗氏佐剂 (SIGMA公司) 、淋巴细胞分离液 (北京中杉) 。

1.2 方法

将15只Wistar大鼠麻醉后剥取口腔黏膜, 加入0.1mol/L, pH7.4的PBS缓冲液制成组织匀浆, -60℃低温冰箱保存备用。免疫动物时, 将上述组织匀浆与弗氏佐剂等比例混合, 按佐剂说明书操作制成抗原乳化剂 (放置后不分层) 。将20只大鼠 (雌雄各半) 脊柱两侧剪去鼠毛, 碘伏消毒后每侧皮下注射0.1mL抗原乳化剂, 每周注射1次, 共注射6次。观察大鼠口腔粘膜变化[1,2]。另20只未注射抗原大鼠为正常对照组。待大鼠出现口腔溃疡时从这两组实验大鼠眼眶取血 (取血前将试管在肝素中浸泡, 自然干燥) , 免疫组化试剂盒染色。同时切取大鼠口腔溃疡进行组织学观察。所有大鼠同室分笼饲养, 自然光照, 自由饮水进食, 饲养温度18～24℃, 相对湿度50%～60%。

1.3 细胞计数

普通光学显微镜下计数100个淋巴细胞, 计算出CD4+T细胞、CD8+T细胞的百分率及CD4+/CD8+细胞的比值。

1.4 统计学分析

采用SPSS10.0统计学分析。两组间比较用t检验, 检验水准P<0.05。

2 结果

实验大鼠于最后一次注射后第2天口腔黏膜开始局部充血, 注射后第6天所有实验大鼠均出现了溃疡, 溃疡多发生在唇、颊黏膜、口底, 溃疡呈椭圆形或圆形, 边缘整齐, 表面有灰黄色假膜, 直径1～2mm, 一般3～5d自行愈合, 后又复发。溃疡活体组织切片镜下见, 黏膜上皮层坏死、脱落, 溃疡底部及上皮下伴有中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞浸润, 上皮内疱形成。模型组及正常组大鼠外周血CD4+、CD8+细胞数量, 结果见表1, 模型组CD4+、CD4+/CD8+较正常组均降低, 有显著性差异 (P<0.05) ;CD8+细胞数较正常组无统计学意义 (P>0.05) 。

注:*与对照组比较, P<0.05, **与对照组比较, P>0.05。

3 讨论

已有大量研究证实, RAU患者存在T淋巴细胞亚群的失衡。虽然不能认为T淋巴细胞亚群的失衡是RAU的发病原因, 但可以肯定的是, T淋巴细胞亚群异常在复发性口疮的发生、发展中起重要的作用。本实验根据苗爱群、陶学金等学者的造模方法[1,2], 其结果与RAU的临床表现、病理、免疫指标基本相同。引起实验大鼠发生溃疡的机理可能是特异性蛋白作为抗原进入机体后, 产生了特异性抗体而引发口腔粘膜的免疫反应。本实验并没有检测实验大鼠的体液免疫情况, 而是从另一个角度—细胞免疫, 来观察RAU大鼠的免疫状态, 实验显示大鼠CD4+T细胞数降低, CD8+T细胞数虽有变化但无统计学意义, 二者的比值降低。这与Pederson[3]等学者的检测结果是一致的。说明本实验的动物模型可以作为一个免疫失衡的动物模型, 结合临床表现即复发性口腔溃疡动物模型。

淋巴细胞是构成机体免疫系统的主要细胞群体, 占外周血白细胞总数的20%～45%。T淋巴细胞在机体防御初期起到非常重要的作用。对T细胞亚群及其功能的研究, 在理论和实践中均有重要意义。机体维持正常免疫功能状态, 有赖于各种免疫细胞 (特别是各类T细胞亚群) 间相互协作或相互制约, 以产生适度的免疫应答, 使之既能清除异物抗原, 又不致损伤机体自身组织。正常情况下, T细胞及其亚群的数目在周围组织中相对稳定, 若T细胞总数或CD4+/CD8+T细胞比之发生改变, 即可视为免疫调节异常, 此与临床某些疾病的发生发展有关[4]。所以, 通过本实验结果可以推测, 由于大鼠的T淋巴细胞亚群失衡, 从而造成大鼠对致病物敏感引发局部的或全身的免疫紊乱, 导致大鼠溃疡形成。

摘要：目的:探讨T淋巴细胞亚群与RAU发病机制的关系。方法:用大鼠口腔黏膜抗原乳化液注射方法建立复发性口腔溃疡大鼠动物模型。大鼠眼眶采血, 免疫组化染色, CD4+、CD8+细胞计数并计算其比值。结果:实验大鼠于最后一次抗原注射6d后开始出现口腔溃疡。溃疡大鼠CD4+、CD4+/CD8+较正常大鼠降低 (P<0.05) 。结论:RAU的发病与T淋巴细胞亚群的失衡有关。

关键词：复发性阿弗他溃疡,大鼠动物模型,T淋巴细胞亚群

参考文献

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牙周炎动物模型的建立 篇5

1 材料

试验动物为SD大鼠 (17只雄鼠、16只雌鼠) , 购自中国科学院上海实验动物中心。试验前进行常规医学观察, 并检测血清HEV IgG及丙氨酸转氨酶 (ALT) 、谷草转氨酶 (AST) 、碱性磷酸酶 (ALKP) 、总胆红素 (TBIL) , 结果均为阴性, 试验期间分笼饲养。

接种材料为猪HEV阳性粪便悬浮液上清液, 由上海交通大学农业与生物学院预防兽医实验室从上海郊区猪场分离, 每只静脉接种1 mL。

2 方法

每天观察SD大鼠的日常活动情况, 试验组SD大鼠于攻毒后的第4, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 60天处死, 采集肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结, 用于冰冻切片及10%甲醛固定, 石蜡包埋, 备用。采集新鲜血液及粪样, 分离血清, 冻存, 备用。

血清样本用于检测AST、ALT、ALKP、TBIL;用双抗原夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA) 法检测HEV IgG抗体;用荧光RT-PCR法检测血清及粪便中的 HEV RNA;各脏器的HEV抗原的分布及石蜡包埋组织用常规PE染色。

3 结果与分析

3.1 SD大鼠血清AST、ALT、ALKP的动态变化

SD大鼠接种HEV 4型前后, TBIL均处于正常水平, 接种前ALT、AST、ALKP水平正常, 接种后雌鼠 ALT、AST、ALKP水平均升高, 其中ALT水平于第38天上升至107 U/L (最高值) , AST水平上升至271 U/L, 同期ALKP水平上升至285 U/L, 持续到第60天恢复正常水平 (见图1) 。雄鼠ALT水平变化不大, 于第28天上升至79 U/L (最高值) , 同期ALKP水平上升至336 U/L (最高值) , 持续到第38天恢复正常水平。而AST水平于第18天上升至349 U/L (最高值) , 持续38 d恢复正常水平 (见图2) 。

3.2 血清抗HEV IgG的动态变化

试验动物于接种HEV 4型的第55天, 抗IgG出现阳性, 抗HEV IgG持续约56 d转阴, 见图3。

3.3 血清及粪便HEV RNA (Taq Man探针荧光定量PCR) 检测结果

于接种后第6天, 在SD大鼠粪便和血清中HEV RNA 均检测出阳性, 血清持续约23 d, 而粪便持续约18 d, 见188页彩图4。

3.4 各脏器HEV抗原的分布

SD大鼠的肝脏、脾脏和淋巴结于接种后第5天即可发现病毒, 肝脏持续约13 d恢复正常, 而脾脏和淋巴结持续约38 d恢复正常, 见188页彩图5 A、B、C。

3.5 SD大鼠组织恢复正常的病理变化

接种第5天, 脾脏多核巨噬细胞增多、淋巴细胞稀少, 肝细胞水肿、变性、肝细胞索排列紊乱、血管淤血, 肝窦狭窄。第28天各种病变均有好转, 第60天SD大鼠病变完全恢复正常水平, 见188页彩图6 A、B、C。

4 讨论

研究用HEV 4型接种SD大鼠后, 症状较明显, 感染后血液生化动态变化较明显。从SD大鼠粪便及血清中检测出HEV RNA病毒, 组织学也出现不同程度的病理改变, 在部分组织中能观察到HEV抗原及抗HEV抗体水平增加等现象, 这些结果对于研究HEV的复制机理和致病原因都是非常有用的。SD大鼠感染HEV后, 粪便及血清中HEV RNA病毒的检出、HEV抗原表达、组织病理变化等与非人类灵长类动物感染相似。试验过程中TBIL一直处于正常水平, 说明SD大鼠HEV感染不影响TBIL水平。但雌鼠和雄鼠的ALT活性没有一致性提升, 即雌鼠肝组织病变好转时, ALT并没有下降, 活性一直很高。推测是由于试验所用的SD大鼠对ALT的活性不敏感。

SD大鼠感染HEV 4型后的第5天, 肝脏、脾脏、淋巴结都能检测到HEV抗原, 其中脾脏最丰富, 其次是肝脏和淋巴结。同时各组织病理变化较明显:肝细胞水肿、变性, 肝细胞索排列紊乱, 血管淤血, 肝窦狭窄;脾脏多核巨噬细胞增多, 红骨髓水肿, 淋巴细胞稀少;淋巴细胞密度增加、轻度变性等。

有研究报道, SD大鼠攻毒后4天能检测到HEV RNA。本研究中SD大鼠攻毒后第6天在粪便及血清中检测到HEV RNA, 与之前的报道一致。

Y.V.Karetnyi等[9]报道, SD大鼠感染HEV后的第57天能检测到血清IgG抗体, 上海交通大学农业与生物学院预防兽医实验室大鼠感染HEV 4型后于第55天出现血清IgG抗体, 这与之前的报道一致。

HEV大鼠模型可以作为非人类灵长类动物的替代模型, 用于研究HEV的致病原因及HEV候选疫苗的安全性和功效。相对于非人类灵长类动物模型或者猪模型, SD大鼠模型的一个优点是更容易处理、操作和饲养;另一个优点是SD大鼠可以用于更大数量的试验, 以提高统计准确性, 这是影响安全性和功效研究的重要因素。

参考文献

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牙周炎动物模型的建立 篇6

然而EMs产生的具体机制尚不明确。目前有关EMs的机制主要有以下6种学说:异位种植学说、体腔上皮化生学说、诱导学说、遗传因素、免疫与炎症因素、其他因素,但均不能完全解释EMs的发病、进展及预后问题,而且就目前诊治原则看来,手术及药物治疗虽有一定疗效,但是复发率仍然较高[5,6]。据文献统计,术后1年的复发率为8%~10%,术后2年的复发率约20%[7],术后5年复发率高达36%~57%[8]。而且手术治疗可造成有功能的卵巢组织减少,怀孕概率也明显降低[9];内分泌药物由于其严重的不良反应而不能长期使用。EMs导致盆腔组织纤维化,是造成女性盆腔疼痛、不孕的主要原因,因此成功构建出EMs的动物模型,将从分子层面揭示EMs纤维化的机制,为将来发现更有效的诊治方式提供很大帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择BALB/c雌性裸鼠20只[合格证号:scxk(京)2014-0004],6~8周龄,体重17~21 g,由中国医学科学院肿瘤医院动物实验室提供无菌环境饲养(温度22~24℃,湿度:45%~70%,12 h白天,12 h黑夜),分5笼饲养(每4只裸鼠放入1笼中),采用SPF级条件饲养。本动物实验遵循北京市所制订的有关实验动物保护和使用指南,并经首都医科大学附属北京妇产医院(以下简称“我院”)实验动物伦理委员会批准。

1.2 标本来源

所用子宫内膜均来自就诊于首都医科大学附属北京妇产医院因EMs行卵巢囊肿剔除术的5名患者,平均年龄为(35±4)岁,无生育要求,术前6个月内未经任何激素治疗,且均月经周期规律,无子宫内膜相关疾病。行腹腔镜手术切除卵巢子宫内膜异位囊肿的同时,麻醉下采用诊刮的方式获得子宫内膜(即严格消毒外阴、阴道及宫颈口,减少污染,刮取子宫内膜1~2 g),刮出后立即放入含4 m L DMEM培养液无菌瓶中。同时留取部分内膜组织用福尔马林浸泡,所有病例术后病理提示为3名患者子宫内膜为增殖期,2名患者子宫内膜为分泌期。该研究方案经过我院伦理委员会批准,并根据伦理学要求,所有患者均签署相关知情同意书。

1.3 标本处理

子宫内膜组织离体后立即置入含4 m L DMEM培养液无菌瓶后,冰盒低温运输,快速送于实验室进行接种(接种时间应在离体后1 h内,否则影响接种成功率)。接种前标本用冷的0.1 mol/L的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗去血块和黏液。冲洗至少三遍,然后于无菌培养皿内用无菌组织剪将冲洗好的子宫内膜组织剪成2 mm×3 mm~3 mm×3 mm碎块,每8~10小块为一组,分别置入PBS中,准备接种。

1.4 模型建立

裸鼠采用腹腔注射麻醉,质量分数为0.5%的戊巴比妥15~18 ml/kg。麻醉后固定,取下腹正中横切口长约1 cm,将上述处理的人子宫内膜碎块8~10块随机置入盆腹腔不同部位,采用无菌针缝合切口。每份子宫内膜种植4只裸鼠(经病理证实为增殖期的子宫内膜组织种植于12只裸鼠盆腹腔,编号为1~12;分泌期子宫内膜组织种植于8只裸鼠盆腹腔,编号为13~20),待裸鼠麻醉清醒后,置于温度22~26℃,相对湿度50%~60%、无菌净化屏障系统内饲养。当日起给予裸鼠雌激素(苯甲酸雌二醇30μg/kg,1次/3 d,腿部肌内注射)。术后3 d,每日腹腔注射青霉素钠100μL/(只·次)(内含200 000 U青霉素钠)预防感染。根据文献造模成功的标志:肉眼可见种植呈隆起透明的结节状、囊状,移植物被结缔组织覆盖,并有血管形成,病理提示为子宫内膜样组织,见内膜样基质和腺上皮结构[10]。

1.5 观察与取材

每日观察裸鼠活动情况及裸鼠腹部结节的变化,包括大小、位置、质地、与腹壁的关系及与周围组织的关系,并分别于种植后的第7、14天开腹探查,0.5%的戊巴比妥15~18 m L/kg麻醉下,采用下腹正中切口,大小约2 cm,打开裸鼠盆腹腔,观察盆腹腔内病灶的生长情况,包括位置、大小、数目及其与周围脏器的关系、颜色、周围血管生成情况,各自取材部分病灶标本,分别放入10%福尔马林溶液中浸泡,常规石蜡包埋,分别进行苏木精-伊红(HE)染色、免疫组化,显微镜下观察。

2 结果

2.1 种植成功率

经大体分析和病理分析,所有裸鼠模型均种植成功,即建模成功率为100%。

2.2 大体分析

种植后约7 d,部分移植内膜可从裸鼠腹部肉眼可见,移植物有增大,可呈隆起的小包状的透明结节或囊肿(图1)。分别于种植后的第7、14天打开裸鼠的盆腹腔,观察病灶,发现病灶以腹壁生长为主(55%),切口处常见,另膀胱旁(45%)、肠管附近(15%)可见小块病灶。种植第7天可见移植内膜与裸鼠组织牢固黏附,形成异位结节,质韧,病灶边缘血管生成明显,裸鼠病灶与周围组织轻度粘连,尚能分离(图2)。种植第14天可见移植病灶变硬,与裸鼠组织连接致密,难以分离(图2)。

2.3 显微镜下分析

在光镜下可见子宫内膜样腺体增生,腺上皮细胞增生活跃,散在间质细胞,类似于子宫内膜样腺上皮及基质围绕囊泡生长;腺体细胞呈立方形或扁平状,腺体边缘较多炎性细胞(如淋巴细胞、巨噬细胞等)浸润(图3)。采用DAPI做荧光染料,在荧光显微镜下观察免疫组化的结果,可见EMs内膜组织中纤维化相关蛋白如CTGF、α-SMA、CollagenⅠ等表达明显增加(图4)。

箭头所指为凸出于动物模型腹壁表面的异位结节

A、B为种植第7天后异位病灶的生长情况;C、D为种植第14天后异位病灶的生长情况;箭头所指为生长的子宫内膜异位病灶

3 讨论

EMs是一种常见的妇科良性疾病,发病率逐年上升,主要影响生育期女性[11,12,13]。就目前而言,导致EMs患者盆腔疼痛和不孕的发病机制比较复杂,涉及免疫、激素、基因和环境等因素[14],分子生物学专家认为纤维化是导致盆腔疼痛及不孕的关键。与其他疾病一样,对于EMs纤维化发生、发展的动态研究以及探索有效的诊断策略,动物模型是理想的研究对象。本实验采用裸鼠所建的人EMs模型中,病理显示原有组织的形态及生化特征,实验结果临床观察意义较大,可作为探索EMs纤维化的发病机制及有效诊治策略的理想模型。

构建EMs动物模型的动物选择,现主要采用的动物包括灵长类动物、大鼠、裸鼠等[10,14,15]。但是灵长类动物比较珍贵,且受到伦理学的限制而不能被用来科学研究[1];大鼠、兔子有自身的免疫功能,可以经过自体内膜移植,但是其内膜与人的内膜在种属及生化方面存在很大差异,因此此类动物所见模型存在诸多局限[16,17]。然而因为裸鼠属于免疫缺陷小鼠,不会发生异种异体移植免疫排斥反应,种植后成活率较高,模型构建成功率较大,可重复性好,因此裸鼠模型比较常用。而且实验中发现裸鼠模型中成功生成的子宫内膜异位病灶与人类的子宫内膜异位病灶相似度高,可观察性强,因此使用裸鼠是研究EMs的很好选择。

目前EMs裸鼠模型的构建方法主要有自体移植、皮下直接种植人类子宫内膜组织法、皮内注射EMs组织碎片法、腹腔内直接种植人类子宫内膜组织法、腹腔内注射EMs细胞系法等[18,19,20]。由于裸鼠本身的子宫体积较小,取裸鼠的子宫内膜需要娴熟的实验技能及精确剥离子宫内膜的方法,可操作性较差;而皮下种植不符合EMs的好发特点;子宫内膜细胞系价格昂贵,种植入腹腔内弥散性高易被吸收,而且用人的子宫内膜可以使具有物种特异性的药物被开发,从而利于人EMs的质量。我们此次构建EMs裸鼠模型即采用的是腹腔内直接种植人子宫内膜组织的方法,这样更加符合EMs在人体中的发病特点,结果建模成功率为100%,并经病理学金标准证实。

但是实验过程中发现,在腹腔种植子宫内膜病灶存在一定的局限性:①不容易观察,由于种植于腹腔,随小肠的蠕动,种植的病灶也会移动,以至在观察时不易定位。②不易测量,因为种植位置较深,虽然有部分的病灶会突出皮肤表面,可观察到明显的结节状组织块,但是其向腹腔内延伸的大小不能明确,要测量其大小则需开腹,而裸鼠本身就免疫能力低下,容易感染,因此多次开腹可能影响裸鼠的存活能力,并增加感染机会;另外有部分种植的病灶明显突向腹腔,表面无法观察,不能确定模型种植是否成功,必须开腹探查。③给药的问题,对于皮下或腹腔给药无明显不足,但是若病灶给药则会出现问题,原因是对裸鼠表面结节块不明显的裸鼠,难以定位种植的病灶。

内膜组织来源的选择各有不同,采用正常的增殖期内膜者,认为增殖期的内膜种植成功率较高;采用正常的分泌期内膜者认为分泌期内膜种植更符合经血逆流学说[21]。而本实验中所采取的内膜组织既有增殖期内膜又有分泌期内膜,最终都种植成功,裸鼠体健且裸鼠表面均可见结节状组织块,质韧,并通过病理切片证实为子宫内膜组织。因此,在动物模型的建立过程中,所采取的内膜并无特殊要求。

从本次实验过程及结果来看,模型的建立比较成功,且最后经病理证实为子宫内膜组织,同时我们发现种植的子宫内膜异位病灶与周围组织明显粘连,免疫组化证明与纤维化关系密切,因此该动物模型可以用来研究纤维化在人EMs发生、发展及恶性生物学行为中的作用具有很大的临床价值。

另外,因为上述提到腹腔种植的问题,认为裸鼠皮下种植效果可能更好:①好观察,种植于皮下时,结节块明显,容易测量;②存活率高,种植于皮下避免了多次开腹,会减少出血量及缩短手术时间,降低感染率;③给药方便,可以皮下给药、腹腔给药,必要时也可以病灶给药。但是因为就临床研究看来,EMs患者的异位病灶多位于盆腹腔,裸鼠皮下种植的结果与腹腔内种植的结果及临床研究是否一致有待研究。

牙周炎动物模型的建立 篇7

1 材料与方法

1.1 实验动物

中国实验用成年小型猪4 头, 年龄5 个月, 体重22～27 kg, 雌雄各半。实验前圈养2 周, 标准颗粒状混合饲料喂养。实验动物编号1～4。

1.2 造模方法

肌注盐酸氯胺酮10 mg/kg全麻。消毒铺巾, 于右眼外眦外侧2 cm处沿外耳道前做长约4 cm的弧形切口, 沿颧弓根部剥离咬肌附着, 显露关节囊。牵拉髁突向下, 切开关节囊, 进入关节下腔。游离关节盘的前外侧附着 (图 1a) , 切除关节盘前外侧1.5 cm2部分 (图 1b) , 进入关节上腔。自髁突关节面纵行劈骨, 形成髁突内2/3斜向下的矢状骨折。推内侧骨折块顶端向内移位, 造成“楔形”创面朝上 (图 1c) 底部尚有接触的矢状骨折。保留内侧骨折块表面的关节盘。在对应于关节盘缺损区的关节窝和髁突关节面, 用裂钻切割出深2 mm的网格状损伤面。再于颞骨基部和髁突基部分别钻孔, 用钢丝8字结扎 (图 1d) , 但保持开口度40 mm。保留关节内的切骨骨屑, 不冲洗。关闭切口。待动物清醒后送回圈养, 饲养方法同术前。

a:游离关节盘及其前外侧附着; b:切除关节盘前外侧部分, 大小约1.5 cm2; c:纵行劈开髁突, 推内侧骨折块向内, 造成“楔形”向上张开状骨创面; d:用钢丝8字结扎颞骨基部和髁突基部

-a:surgicalfreeofdiscanditsattachment;b:dissectionoftheanterior-lateralpartofthedisc, sizing 1.5cm 2;c:artificialsplitof condyleinobliquelinefrom thetopsurfaceoflateral 1/3ofhead runningmediallydownwardandthenpushfragmentinwardtoform anopeningboneinjurysurfaceof“V”shape;d:wireligatureof temporalfossatocondylarbase

1.3 术后临床及影像学检查

分别于术后1 周、1、2、3、4 个月观察小型猪的进食方式、进食量、测量体重。术后2 周和4 个月时拍摄关节区CT (荷兰飞利浦公司Mx-8000多层螺旋CT扫描机) 。轴位断层, 层厚1.3 mm。轴位、冠状位成像, 三维重建。图像数据转录至光盘, 利用计算机Marconi图像软件进行连续观察。

1.4 组织学检查

术后4 个月时将实验动物通过注射过量麻醉药予以处死。完整切取双侧颞下颌关节。以健侧为对照, 肉眼观察目标区骨痂形成, 手术侧关节窝和髁突的形态、表面光滑度、是否有骨赘生成, 以及关节间隙和关节盘的改变。测量被动开口时的张口度。将标本浸泡于4%中性甲醛溶液, 4 ℃下, 48 h。14% EDTA溶液脱钙3 个月。常规石蜡包埋, 制备4～5 μm厚的正中矢状面切片。HE和Masson染色。

2 结 果

1号和3号动物术后进食方式以舔食为主, 张口度逐渐减小, 至第4 个月时分别为32 mm和35 mm。2号和4号先为舔食, 后为切咬和研磨, 张口度无明显变化。所有动物体重均有所增加, 但2号和4号增加较多 (表 1) 。

CT显示, 与术后2 周CT相比, 术后4 个月的2 号和4 号动物的髁突呈分叉状畸形愈合, 但畸形髁突和关节窝的表面相对平滑, 表层皮质化改变。1 号动物的髁突与关节窝之间可见骨痂形成, 关节窝和髁突表面呈不规则凹陷状吸收 (图 2a) 。3 号动物关节窝出现骨赘, 突向关节内, 外侧隐见骨痂形成 (图 2b) 。

大体标本肉眼观察, 术后4 个月时, 1 号和3 号动物实验侧关节形成纤维骨痂融合 (图 3a) 。离体标本 (图 3b) 剖面发现, 1 号标本的骨痂内有明显的骨样组织, 探之呈沙砾样 (图 3c) 。内髁处隐约可见关节间隙, 但较正常侧明显缩窄, 内髁上方的关节盘已发生纤维性变。

HE染色观察, 术后4 个月时, 1 号和3 号标本的颞骨与髁突之间形成大量的致密纤维组织, 散在新生骨岛, 个别区域可见新生骨桥连接 (图 4a) 。颞骨表面和髁突表面成骨细胞和成软骨细胞生长活跃, 新骨沉积, 在新旧骨之间有骨粘合线。骨痂中血管丰富, 围绕新生血管可见成软骨细胞、成骨细胞和骨细胞, 以及不全钙化的骨质。在血管组织外还可见软骨细胞群, 部分软骨细胞出现不同程度肥大和软骨组织骨化迹象。Masson染色更清楚地显示新生骨桥 (图 4b) , 骨痂中可见绿色的纤维组织内间杂少量红染的新生骨质连接颞骨与髁突。

a:HE染色 (4×) ; b:Masson染色 (4×) ;图中T:颞骨, C:髁突

a:HE staining (4×) ; b:Masson staining (4×) showing irregularly distributed ossified tissue in the involved area; T: temporal bone; C: condylar processus

3 讨 论

选择适宜的实验动物造成颞下颌关节强直模型对于研究颞下颌关节强直的发病过程和发生机制具有重要的意义。猪与人类同属杂食动物, 乳恒牙交替, 磨牙形态与人类近似, 咀嚼运动包括切咬和研磨。研究发现, 小型猪颞下颌关节在解剖结构、生理功能、血流分布和肌肉动力等方面都与人近似[1,2]。并且小型猪价格便宜, 易于饲养、便于实验操作。因此, 本文选择小型猪作为模型动物。

关于颞下颌关节强直动物模型的研究, Miyamoto等[3,4,5,6]通过去除髁突和关节窝表面的关节软骨、切除部分关节盘建立了羊颞下颌关节强直的动物模型。然而, 在他的模型中, 只观察到关节间隙内有大量的纤维性组织, 虽然也报告有少量散在的骨岛, 但并不十分确实, 更未达到骨性强直。羊的咀嚼运动以研磨为主, 颞骨关节窝和髁突较平坦, 关节盘附着较松弛。在功能运动过程中, 关节承受的力主要为滑动力, 垂直方向的压力很小, 这一点与人类明显不同。本实验选用小型猪作为实验动物, 完全模拟髁突矢状骨折继发关节强直的临界损伤条件, 包括去除部分关节盘, 破坏颞骨和髁突的关节面, 限制关节运动等, 术后4 个月CT和组织学观察均证实强直骨桥的形成。

但4 个动物中, 只有2 个发生纤维骨性强直。考虑到4 个动物完全采用了同样的饲养方式和造模方法, 且术者也为同一人, 除认为个体差异外, 本文尚不能做出别的更合理的解释。而这样情况的发生似乎更类似于临床。同时也说明, 本实验所建立的髁突骨折继发颞下颌关节强直的动物模型只是取得初步成功, 模型的可重复性还有待于进一步完善。

本研究发现, 在实验目标部位的不同区域可以同时见到纤维性骨痂、纤维骨性骨痂和骨性骨痂, 说明关节损伤的修复是一个动态过程。在TMJA中同时存在膜内成骨和软骨内化骨, 所以它是混合性成骨。以往研究认为成纤维细胞具有成骨潜能, 表现为骨小梁内成纤维细胞变性死亡时为骨组织代替或直接演变为成骨样细胞。成纤维细胞能合成钙化的胶原纤维, 产生基质小泡并引起小泡内钙盐的沉积。但成纤维细胞需要在特殊环境和特殊诱导因素参与的条件下方能发挥成骨活性。在本实验中, 纤维骨性骨痂内可见不规则骨质, 认为可能是骨痂内纤维组织中的成纤维细胞发挥成骨细胞的功能, 分泌类骨质并诱导钙化;有些区域软骨细胞和骨细胞直接包埋于纤维组织中, 认为可能为成纤维细胞直接分化为软骨细胞和骨细胞, 参与成骨过程。

Masson三色染色主要应用于胶原染色。成熟骨组织中的胶原为I型胶原, 在Masson染色中呈鲜红着色。幼稚骨组织的胶原主要着绿色, 在新骨成熟过程中着绿色至红绿相间。软骨胶原是II型胶原, Masson染色中呈绿色。本实验发现在成骨细胞和骨细胞分泌的胶原为I型胶原, 染色却呈绿色, 不同于外围红染的成熟骨质, 考虑染色反应可能与胶原的成熟程度有关, 而与胶原类型无直接关系。在软骨内成骨区, 软骨基质逐渐呈红绿混合着色, 其中是否发生胶原类型的转变, 钙盐沉积是否影响染色反应, 还有待于进一步研究。

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