肾小管/药物作用（通用7篇）
肾小管/药物作用 篇1
摘要：采用体外培养的人肾小球系膜细胞技术, 观察具有降逆泄浊、益气活血功效的中药肾康注射液及苯那普利对ECM不同成分的影响。肾康注射液具有抑制ECM成分中纤维连接蛋白 (FN) 、层粘连蛋白 (LN) 和Ⅳ型胶原 (ColⅣ) 的作用, 该抑制作用具有一定的量效关系。苯那普利对ECM中FN、ColⅣ也有一定的抑制作用, 但不及肾康注射液作用明显。结论, 肾康注射液对ECM的抑制作用优于苯那普利。
关键词：肾小球,药物,作用,对比
近年来, 随着对肾小球硬化机制认识的不断深入, 肾小球系膜细胞 (MC) 、细胞外基质 (ECM) 及各种细胞因子在肾功能进行性减退过程中所起的作用倍受关注。抑制MC增殖, 减少ECM的堆积, 拮抗细胞因子的不良作用, 已成为防治肾小球硬化, 延缓CRF病情进展的重要环节。
一、对比研究使用的材料选用的材料
1、肾组织来源系我校附属医院妇产科孕5月引产胎肾。
2、药物与试剂
肾康注射液 (SKI) 由大黄、丹参、红花等组成, 成都中医药大学附属医院提供, 每毫升含原生药0.3g;苯那普利 (Benayzepril) 由瑞士诺华制药有限公司生产, 批号:012200;V型胶原酶、HEPES均系Sigma产品;RPMI 1640、胰蛋白酶、胰岛素均为美国GIBCO产品;小鼠抗人单克隆FN抗体、兔抗人FN多抗、羊抗兔Ig G-HRP均购于北京中山生物技术有限公司;LN、ColⅣ放射免疫分析试剂盒, 均购于上海海研医学生物技术中心。
3、主要仪器
CO2孵箱 (TYPE4型) 德国HERAEUS公司生产;倒置显微镜 (TOKYO) 日本OLYMPUS公司生产;洁净工作台 (月坛牌) 北京半导体设备一厂生产;酶标分析仪 (MODEL2550) 美国BTO-RAD公司生产;FT-613自动计数125 I放免测量仪, 北京核仪器厂生产。
二、研究采用的方法
1、MC培养与鉴定
无菌取胎肾, 分离提取肾皮质小球组织, 按照于力方等方法 (1) 取去掉包囊的单个肾小球进行原代和继代培养, 实验中使用传代5代的MC。培养的细胞经免疫病理鉴定证实为单纯的MC, 无上皮细胞、肾小管细胞及成纤维细胞污染。
2、分组及MC上清的收集
吸取培养的第5代MC培养瓶中液体, 加胰酶1ml, 置孵箱 (5%CO2、37℃) 中消化3min, 加10%FCS 1640终止液2ml, 抽吸于离心管中, 800rpm, 离心3min, 弃上清, 加15%FCS 1640培养液于离心管中, 吹打, 混匀。用计数板计数后, 倾入加样槽中, 用8导加样枪, 按每孔200μl, 密度4000/孔铺板。将96孔板按列从左至右依次分为空白对照组 (简称组Ⅰ) 、苯那普利组 (简称组Ⅱ) 、肾康注射液高浓度组1、2 (简称组Ⅲ、组Ⅳ) 、肾康注射液中浓度组1、2 (简称组Ⅴ、组Ⅵ) 、肾康注射液低浓度组1、2 (简称组Ⅶ、组Ⅷ) , 共8组 (列) , 每列6孔, 待细胞贴壁24h后, 每孔加无血清1640培养液200μl同步24h。除空白对照组外, 其余各组分别依次加入苯那普利10-3mmol/L及肾康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml, 待刺激48h后依次收集上清待测。
3、测定ECM中FN的含量
用双抗体夹心ELISA法, 0.5mg/ml鼠抗人FN抗体原液用包被缓冲液稀释1000倍。取96孔板, 50μl/孔铺板, 4℃过夜, 甩去。用PBS-吐温20洗涤液洗板3次, 每次3min, 间隔2min, 控干。每孔加1%BSA封闭液100μl, 37℃, 1h后甩去, 控干。依次按组各孔分别加入待测上清50μl, 37℃, 3h后甩去, 洗板4次后, 加兔抗人FN抗血清 (原液用0.1%BSA·PBS1∶1000稀释) 50μl/孔, 室温放置60min。加HRP羊抗兔Ig G (用0.1%BSA·PBS1∶1000稀释) 50μl/孔, 室温放置50min。再洗板4次后, 每孔加入OPD显色液50μl, 预热酶标仪, 用2M H2SO4终止液50μl/孔终止, 立即在492nm波长读数, 并记录OD值。
4、ECM中LN、ColⅣ含量的放射免疫法 (RIA) 测定
采用竞争法, 将缓冲液稀释10倍, 分别将125I-LN、抗LN血清、125I-ColⅣ、抗ColⅣ血清及二抗用缓冲液稀释, 将待测上清分别与125 I-LN、125 I-ColⅣ及相应的抗血清混匀, 4℃过夜反应, 加二抗4℃反应60min, 离心3500r/min 10min弃上清, 125 I放射免疫测量仪计数。
5、统计学处理数据均采用SDAS软件进行统计处理, 结果用 (±s) 表示。
三、研究的结果
肾康注射液与苯那普利对ECM成分含量的影响, 在对ECM中FN含量影响方面, 肾康注射液组 (Ⅲ~Ⅶ组) 与空白对照组 (Ⅰ组) 相比, 均有显著性差异 (P<0.05~0.01) ;说明肾康注射液除低浓度组2 (Ⅷ组) 外, 其余各组对FN均有明显的抑制作用, 而且随着浓度的递增此作用更加明显, 并表现出一定的量效关系。实验还发现肾康注射液即使在极小浓度时对ECM中LN及ColⅣ的含量也有明显的抑制作用, 该抑制作用也呈现出一定的量效关系。苯那普利组 (Ⅱ组) 在对FN、ColⅣ含量影响方面, 与空白对照组相比也有显著性差异 (P<0.01~0.05) ;但对LN影响方面, 两者比较无显著性差异 (P>0.05) ;说明苯那普利对ECM中FN、ColⅣ也有一定的抑制作用, 但对LN其抑制作用不明显。另外, 从表中还可看出, 肾康注射液各浓度组 (Ⅲ~Ⅷ组) 与苯那普利组相比, 在抑制LN方面也均有极显著性差异 (P<0.01) ;除肾康注射液低浓度组2 (Ⅷ组) 外, 其余各组与苯那普利组相比, 在抑制ColⅣ方面也有显著性差异 (P<0.01~0.05) ;肾康注射液高浓度组 (Ⅲ组) 与苯那普利组相比, 在抑制FN方面也有显著性差异 (P<0.05) ;说明肾康注射液在抑制ECM中FN、LN、ColⅣ含量方面优于苯那普利。
四、讨论
肾小球硬化时ECM的改变是近年来国内外肾脏病学者研究的热点之一, ECM在肾小球内的蓄积, 是肾小球硬化的主要特征性变化。
苯那普利是第四代血管紧张素转化酶抑制剂 (ACEI) 。现已证实, 肾脏具有独立的肾素-血管紧张素系统 (RAS) , 血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 是该系统最具有生物活性的因子。目前研究证实AngⅡ受体 (A-TR) 至少有Ⅰ和Ⅱ两种亚型, 其中Ⅰ型受体 (ATR1) 意义最大。该受体分布在肾小球MC上, 与AngⅡ、AngⅢ有高度的亲和力。进一步的研究还发现ATR1占肾内ATR亚型分布的90%以上, Osborne等在10余年前就报道动脉内注射3H标记的AngⅡ, 发现3H-AngⅡ只结合在肾小球系膜区, 而不与肾血管、肾小管等部位结合。用125 I-AngⅡ进一步实验发现光镜下125 I-AngⅡ位于肾小球上, 电镜下125 I-AngⅡ颗粒在MC浆中。血管紧张素转化酶是RAS中最后一级酶促反应的关键酶, 用ACEI能够抑制AngⅡ的形成, 可使循环和组织中的AngⅡ水平下降, 且可直接降低肾内AngⅡ的生成量, 从而对抗AngⅡ对肾脏的不良反应, 减轻肾小球硬化的发生。大量的研究还证实, ACEI除减轻肾小球的高灌注和高滤过作用外, 还可通过阻断肾小球基底膜 (GBM) 上AngⅡ的特异作用的结合点, 可使GBM固有的负电荷增多, 并抑制GBM的进一步增厚, 从而直接改善GBM的通透性。目前体内外动物实验还证实, ACEI亦有抑制肾小球MC和系膜基质增生的作用, 从而直接阻止肾小球硬化的形成。近年来, 临床上已成功地将ACEI用于各类肾脏病的治疗, 发现在降低蛋白尿, 阻止肾小球硬化方面具有一定的作用。
本实验结果表明, 肾康注射液对ECM中FN、LN、ColⅣ的含量具有明显的降低作用, 并呈现出一定的量效关系。苯那普利虽对FN、ColⅣ也有一定的抑制作用, 但此抑制作用远不及肾康注射液明显。从而提示MC是肾康注射液发挥治疗作用的重要靶细胞, 减轻ECM的积聚可能是肾康注射液延缓肾小球硬化的重要作用机制之一。值得注意的是, 苯那普利主要是通过抑制AngⅡ的形成, 减轻其对肾脏的损害, 从而在阻止肾小球硬化方面发挥着重要作用, 而肾康注射液是否对AngⅡ的形成也有一定的抑制作用, 值得进一步深入探讨。
肾小管/药物作用 篇2
4.2 疾病改变了机体电解质平衡影响药物的排泄，如代谢性酸中毒并发感染就不宜使用磺胺类药物，以免磺胺结晶及乙酰化物在尿道形成结晶析出，造成机体的损害。
4.3 疾病影响药物在肾小管的被动扩散以及肾小管的分泌而使药物的排泄受到影响，如急慢性肾炎，肾功能衰竭患者。
4.4 疾病影响药物从胆汁排泄，如慢性胆囊炎，胆石症均影响到胆汁的排泄，从而影响到从胆汁排泄的药物。
综上所述：疾病对药物的作用的影响，必须进一步研究及了解诸疾病对诸药物作用的影响，在临床用药过程中必须考虑和注意疾病对药物作用的影响，以便更好地指导临床用药，合理用药，最大限度提高疗效，尽量减少或避免不良反应，确保用药准确、安全、可靠。
参考文献
[1] 冯富兰，等.简明临床药物手册.第2版.人民卫生出版社：228.
[2] 刘华钢.临床实用药物手册.第1版.人民卫生出版社：466.
[3] 李学玲，秦红兵，邹浩军.常用药物新编.人民卫生出版社：565.
[4] 冯富兰，等.简明临床药物手册.第2版.人民卫生出版社：23.
[5] 刘华钢.临床实用药物手册.第1版.人民卫生出版社：299.
原发性肾小球疾病的药物治疗进展 篇3
原发性肾小球疾病的临床分型: (1) 急性肾小球肾炎; (2) 急进性肾小球肾炎; (3) 慢性肾小球肾炎; (4) 隐匿性肾小球肾炎; (5) 肾病综合征。原发性肾小球肾炎的病理分型: (1) 轻微病变性肾小球肾炎。 (2) 局灶性节段性病变, 包括局灶性肾小球肾炎。 (3) 弥漫性肾小球肾炎: (1) 膜性肾病; (2) 增生性肾炎:a.系膜增生性肾小球肾炎;b.毛细血管内增生性肾小球肾炎;c.系膜毛细血管性肾小球肾炎;d.新月体和坏死性肾小球肾炎。 (3) 硬化性肾小球肾炎。 (4) 未分类的肾小球肾炎。多数肾小球肾炎是免疫介导性炎症疾病。一般认为, 免疫机制是肾小球病的始发机制, 在此基础上炎症介质 (如补体、白细胞介素、活性氧等) 参与下, 最终导致肾小球损伤和产生临床症状[1]。因此, 激素等其他免疫抑制药物在肾小球疾病的治疗中占有十分重要的地位。许多研究表明, 合理应用激素等免疫抑制剂对肾小球疾病进行规范化治疗, 可以有效控制肾小球疾病的进展, 减少终末期肾脏疾病 (end stage renal disease, ESRD) 的发生[2]。除糖皮质激素外常用的免疫抑制剂主要有细胞毒类药物 (如环磷酰胺) 和抗代谢药 (如霉酚酸酯、来氟米特) 以及对骨髓无抑制作用的免疫抑制剂, 如环孢素A及他克莫司 (FK506) 。国内外对原发性肾小球疾病的分型和治疗方面一直存在很大争议, 随着经皮肾活检穿刺术的广泛开展, 对原发性肾小球疾病的诊断更早、更特异、更安全。但目前各国家, 各地区对同种病理类型的肾小球疾病治疗方法不尽相同。现针对以上提到的药物治疗机制及现状进行综合阐述。
1 糖皮质激素
糖皮质激素 (corticostiroid) 是临床应用最广泛的免疫抑制药物, 能抑制感染性和非感染性炎症, 抑制炎症介质如激肽类、组织胺、慢反应物质等发生反应, 阻止补体参与炎症反应。可以抑制免疫反应的多个环节;抑制巨噬细胞的吞噬功能;可使淋巴细胞溶解, 以致淋巴结、脾及胸腺中淋巴细胞耗竭, 上述作用对T细胞较明显, 其中辅助性T细胞减少更为显著。还可降低自身免疫性抗体水平。在许多肾小球疾病的治疗中常作为一线药物应用。根据6个保证质量的有效实验进行的荟萃分析表明皮质激素疗法在减少蛋白尿、降低ESRD的风险方面有效, 对肾功能保护的影响还不清楚。意大利进行的大规模的皮质激素研究证明, 皮质激素在减少蛋白尿、阻止ESRD的治疗中获得了巨大的益处[3]。对于新月体性IgAN患者或伴有血管炎改变、抗中性粒细胞胞浆抗体阳性者, 激素联合环磷酰胺静脉冲击可减缓增生性病变、降低尿蛋白、稳定肾功能。
2 环磷酰胺 (cyclophosphamide, CTX)
目前应用的各种免疫抑制剂中作用最强的药物之一, 也是烷化剂中作为免疫抑制剂应用最多的药物[4]。作为细胞周期非特异性药物, 即对增殖周期中各期细胞均有杀伤作用, 主要阻断Go期细胞。可通过杀伤T、B淋巴细胞阻止繁殖而抑制免疫反应, 对细胞免疫及体液免疫均有抑制作用。与其他细胞毒药物相比, 其免疫抑制作用强而持久。在肾小球疾病的治疗中常作为二线药物使用。环磷酰胺可用于各种自身免疫性疾病, 对于严重类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮大部分病例有效;对儿童肾病综合征其疗效较硫唑嘌呤为好, 可长期缓解。可以单独用药, 但与糖皮质激素联合应用疗效会更好, 且不良反应相对较少[5]。
3 麦考酚酸酯 (Mycophenolate Mofetil, MMF) (骁悉)
MMF是一种新型免疫抑制剂, 经口服后在体内迅速水解为具有免疫活性的霉酚酸 (MPA) 。其可选择性地抑制T、B淋巴细胞的增殖, 抑制细胞毒T细胞的分化B细胞抗体形成。对其他细胞仅有轻度抑制作用;MPA可以减少黏附分子糖基化, 抑制细胞粘附分子的合成, 抑制白细胞与内皮细胞的粘附, 从而阻止炎症细胞在局部的聚集, 发挥抗炎作用;MPA能够抑制血管平滑肌细胞和肾小球系膜细胞增殖, 减少细胞外基质沉积[6～7]。还可以选择性抑制诱导型一氧化氮合酶 (NOS) , 诱导活性T细胞的调亡。MMF还可抑制动脉平滑肌、纤维母细胞、内皮细胞的增生, 对于减轻肾实质的损害, 改善肾功能及防治肾小球硬化具有重要作用[8]。由于MMF的以上作用, 与肾上腺皮质激素作用机制有所不同, 因此与皮质激素联用具有协同的作用, 同时又能减少副作用。
4 来氟米特 (Leflunomide) 来氟米特通过多种环节抑制体液和细胞介导的免疫反应
抑制二氢乳酸脱氢酶 (DHODH) 的作用, 从而抑制嘧啶核苷酸合成;抑制蛋白酪氨酸激酶活性, 阻断早期阶段抗原识别的信号传导, 从而抑制T淋巴细胞内TNF2α依赖的NF2κB活性, 进一步阻断多种细胞因子 (如IL22、IL26等) 介导的信号传导, 抑制Th1细胞的活化、促进Th2细胞的分化, 使T、B淋巴细胞的活化受到抑制;下调内皮和单核细胞黏附分子的表达, 从而抑制外周血单核细胞的跨内皮游走, 减少单核细胞在炎症部位聚积, 抑制炎性反应[9～10]。LEF作为一种新型免疫抑制剂, 在风湿病及器官移植中已被广泛采用。但有关LEF治疗原发性肾小球疾病的临床报道仍然很少。另外, 有研究证明[11], LEF配合小剂量强的松治疗慢性肾小球疾病有较好疗效, 对已经多种药物治疗无效的难治性肾病仍可有一定疗效, 不良反应轻微, 价格相对较低, 可较长期服用, 从而减少复发, 值得临床推广应用。
5 环孢素 (Cyclosporin)
环孢素的作用机制分为免疫介导和非免疫介导两方面。免疫抑制作用机制:环孢素可以与T细胞胞浆中的环啡啉 (Cyclosphilin) 结合, 形成环孢素-啡啉复合物, 可以抑制钙敏感性钙调神经磷酸酶的活性, 主要抑制T细胞的功能。在分子水平上环孢素可以干扰转录因子与IL-2助催化剂的结合, 选择性抑制IL-2、T-干扰素受体的产生。由于B细胞的活化需要来自Th细胞的信号刺激, 故在体内可间接抑制B细胞的抗体产生, 使炎症反应减轻或消失[12]。本品作用于T淋巴细胞的早期阶段:抑制核内RNA包装蛋白质所必须的一种酶, 从而抑制T细胞内淋巴因子基因转录的活性, 这一作用是通过抑制因子所介导的。抑制辅助/诱导性T细胞及细胞毒性T细胞的活性, 而对抑制性T细胞无影响。有报道认为[13], 此药是局灶性节段性肾小球硬化 (FSGS) 患者存在类固醇毒性高危性时的首选, 而且使用12个月不会产生依赖性。
6 克莫司 (Tacrolims) 又称他克罗姆、普乐可复
从放射菌Streptomyces tsukubaeasis的代谢产物中提取的新型大环内酯类物质, 其作用机理与环孢素类似, 通过与细胞浆内的蛋白 (FKBP212) 结合形成复合物, 竞争性地与钙调磷酸酶 (CN) 结合并抑制其活性, 阻止钙离子依赖性T细胞的信号传导, 从而抑制免疫应答过程中多种细胞因子的表达, 并能直接抑制IL22基因的转录, 同时抑制IL22、IL27受体的表达, 还可以直接抑制B细胞的激活和B细胞抗体的产生。主要用于治疗器官移植排斥反应, 20世纪90年代后期用于治疗肾小球疾病。
7 雷公藤多甙
自1997年首次证实雷公藤多甙对肾小球肾炎有减少蛋白尿作用以来[14～15], 用雷公藤提取物雷公藤多甙治疗肾小球肾炎已有众多报道, 雷公藤多甙治疗肾小球肾炎机制目前现认为与雷公藤具有多种免疫抑制作用有关, 其含有的雷公藤内酯醇能诱导T细胞凋亡, 抑制活化T细胞的增殖, 抑制IL-2的产生, 从而发挥其治疗与免疫功能失调有关的肾小球肾炎的作用[16～17]。有研究表明[18]使用雷公藤多甙长程治疗, 对IgA肾病、系膜增生性肾炎、紫癜性肾炎具有良好的疗效, 即使对临床上难治的局灶节段性肾小球硬化也有59%的患者取得临床缓解和改善。
综上, 免疫抑制剂在肾小球疾病的治疗中应用非常广泛, 但最大的问题即是随治疗效果同时出现的严重副作用的产生。如大剂量、长期或不合理使用糖皮质激素可并发或加重感染, 引起消化性溃疡、骨质疏松、病理性骨折及无菌性股骨头坏死等;环磷酰胺最常见的是骨髓抑制和严重感染, 还可引起出血性膀胱炎, 尤其是冲击治疗时;麦考酚酸酯可引起恶心、呕吐等胃肠道症状, 细菌或病毒感染的发生率增加及骨髓抑制等;环孢素常见有震颤、厌食、恶心、呕吐等不良反应, 用药剂量过大、时间过长有可逆性肝肾损伤;他克莫司可引起肾毒性、神经毒性以及高血压、高血钾、低血镁、高血糖等;来氟米特的胃肠道反应, 还有高血压、皮疹、贫血、致畸胎等;雷公藤多甙可引起白细胞减少, 月经紊乱, 肝功能损害, 其中最大的危险就是出现骨髓抑制而导致严重感染及出血等严重危及生命的并发症。但乐观的是新型免疫抑制剂不断涌现, 并且在肾小球疾病的治疗中显示出较好的疗效, 同时明显减少了不良反应。同时, 又有人提出肾小球疾病免疫抑制剂治疗的新方向-多靶点免疫抑制治疗[19], 对于国内外文献公认的虽已显示了其独特的疗效, 但是对Ⅳ+Ⅴ型狼疮性治疗效果不佳的Ⅳ+Ⅴ、Ⅲ+Ⅴ型狼疮性肾炎取得了较好的疗效, 所用药物均是原来已经在难治性肾炎病例中应用过的免疫抑制剂药物[20～21], 所不同的是采用了联合用药的方法, 联合用药中每种药物的剂量减少了, 不良反应明显减少, 但疗效却大大提高。这是一个非常引人瞩目的尝试, 既为难治性狼疮性肾炎开辟了一条新路, 也为今后在肾小球疾病的免疫抑制剂治疗的方向上提供了参考。但是, 在应用免疫抑制剂治疗肾小球疾病的过程中仍存在许多问题, 任重道远, 有待于进一步研究及创新。
摘要：肾小球病系指一组有相似的临床表现 (如血尿、蛋白尿、高血压等) , 但病因、发病机制、病理改变、病程和预后不尽相同, 病变主要累及双肾肾小球的疾病。本文阐述了运用药物治疗本病的药物治疗机制及现状。
肾小管/药物作用 篇4
1资料与方法
1.1 一般资料
选取2009年04月至2011年11月就诊于我院的128例慢性肾小球肾炎患者作为研究对象, 随机分为观察组65例 (来氟米特联合ACEI类药物治疗) , 其中男35例, 女30例, 年龄16～72岁, 平均年龄 (46.9±6.7) 岁, 平均病程 (14.4±1.8) 月, 对照组63例 (常规药物治疗) , 其中男34例, 女29例, 年龄15～74岁, 平均年龄 (47.6±6.4) 岁, 平均病程 (14.6±1.5) 月, 两组患者的性别、年龄、身体状态以及疾病严重程度, 经统计分析, P>0.05, 不具有显著性差异。两组患者就符合文献报道的慢性肾小球肾炎的诊断标准[1], 并且排除其他严重基础疾病, 无心肺功能异常。
1.2 治疗方法
观察组采用来氟米特联合ACEI类药物治疗:①ACEI类药物治疗:所用药品为瑞士诺华制药有限公司生产的洛丁新, 每日10 mg, 口服。②来氟米特:美国欣凯公司生产, 规格10 rag/片) , 每日50 mg, 口服, 连续服用3d后, 改为维持量:每日20 mg。③常规治疗:抗凝、抗炎以及对症治疗。对照组采用常规治疗:①每日口服瑞士诺华制药有限公司生产的洛丁新10 mg;②口服天津同仁堂集团股份有限公司生产的肾炎康复片, 每次5粒, 3次/d。③常规治疗。连续治疗6个月为一个疗程。
1.3 评价指标
随访6个月, 两组患者分别在治疗前以及治疗完成后进行肝肾功能检测, 分析比较临床治疗情况。参照相关文献报道[1]评价临床疗效:①基本痊愈:肝肾功能无异常, 24 h尿蛋白定量不超过200 mg, 未见红细胞;②缓解:肝肾功能无异常, 24 h尿蛋白定量减少超过25%, 红细胞数目<5个;③无效:未见好转或加重。总有效率=基本痊愈+缓解。
1.4 统计学方法 SPSS
17.0版本统计学分析软件包进行分析数据, 应用χ2检验计数资料, P<0.05, 差异有显著性。
2结果
两组患者治疗前疾病情况无显著差异 (P>0.05) , 治疗后观察组患者基本痊愈37例, 所占比例为56.9%, 缓解20例, 所占比例为30.8%, 无效8例, 所占比例为12.3%, 总有效率为87.7%;对照组患者基本痊愈26例, 所占比例为41.3%, 缓解19例, 所占比例为30.1%, 无效18例, 所占比例为28.6%, 总有效率为71.4%, 两组患者的总有效率, 经χ2检验, 差异具有显著性 (P<0.05) 。
3讨论
慢性肾小球肾炎是临床常见疾病, 中青年为本病的高发人群, 临床以蛋白尿、血尿以及水肿为主要表现。目前主要以抑制肾功能衰竭、降低尿蛋白以及降低并发症为主要治疗目的[1]。ACEI类药物贝那普利, 商品名洛丁新, 是临床常用的治疗慢性肾小球肾炎的药物, 能够通过降低高肾小球内压、促进改善滤过膜通透性有效控制尿蛋白, 改善肾功能[2]。来氟米特新型小分子免疫抑制剂之一, 能够抑制体液及细胞介导的免疫反应, 降低二氢乳酸脱氢酶以及酪氨酸激酶活性, 有效降低抗体作用[3]。综上所述, 来氟米特联合ACEI类药物能够有效降低尿蛋白, 改善肾功能, 是治疗慢性肾小球肾炎较为理想的方法。
参考文献
[1]俞小凤.贝那普利联合不同药物治疗慢性肾小球肾炎疗效观察.现代中西医结合杂志, 2011, 20 (10) :1204-1205.
[2]王红月, 顾春梅, 陈燕, 等.来氟米特联合中小剂量泼尼松治疗老年慢性肾小球肾炎的疗效观察.中国老年学杂志, 2010, 30 (18) :2576-2578.
肾小管/药物作用 篇5
右美托咪啶(Dexmedetomidine,Dex)是一种新型的、特异性、高选择性α2肾上腺素能受体激动剂,具有镇静、镇痛、抗交感、稳定血流动力学和利尿作用[2,3],目前主要用于ICU镇静和临床麻醉。本实验通过观察Dex注射对受损肾小管的保护作用及其机制,旨在为临床围手术期防治AKI发生提供新的理论和应用依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物
昆明小鼠60只,清洁级,体重20~25 g,由徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂
兔抗免疫组织化学染色测定低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),β-Tubulin(美国Santa Cruz公司),兔抗单核细胞趋化蛋白1(mononuclear macrophage antigen 1,MCP1)单克隆抗体(Boster Biotechnology公司)。
1.2 方法
1.2.1 模型制备与分组
将60只小鼠随机分为对照组、IR模型组和Dex组,每组20只。对照组:不做任何处理;IR模型组:用1.5%异氟烷诱导麻醉小鼠后将其放置于变温毯上,维持体温(36.0±0.1)℃。常规备皮、消毒。沿腹部正中剪开皮肤,暴露腹白线,沿之剪开后暴露腹腔。轻轻推移肾周组织后分别用微血管夹夹闭左、右侧肾蒂,可以看到两侧肾脏颜色由鲜红变成暗红。然后将肾周组织归位,开放的腹腔用湿纱布覆盖。待双侧肾脏缺血25 min后,移除微血管夹,让肾脏重获血液灌注,可以看到肾脏颜色由暗红变成鲜红。缝合关闭腹腔。24 h后处死小鼠,取出肾组织备检。Dex组:在IR模型组中肾脏获得再灌注后立即给予腹腔注射Dex 25.0μg/kg。
1.2.2 肾组织形态学检查
常规石蜡包埋,组织切片进行苏木素-伊红(hematoxylin-esosin,HE)染色,光学显微镜观察。肾小管损伤程度分析:每个标本随机选取10个视野,每个视野分别测量肾小管间质相对面积,按照DJUDJAJ等[4]方法,按肾小管损伤程度将组织学评分分为0~3:0=正常肾组织;1=中等程度损伤;3=肾小管坏死病变。进行组织学评分。
1.2.3 HIF-1α及MCP1的表达
标本石蜡包埋,连续切片,厚度3μm。贴附于载玻片上,60℃烤箱烘烤3 h。常规脱蜡至水后,分别经3%过氧化氢H2O2封闭,消除内源性过氧化物酶的活性。一抗:兔抗HIF-1α多克隆抗体(1∶100)、兔抗MCP1单克隆抗体(1∶100);二抗:Ig G即用型M.0.M.TM免疫组织化学试剂盒,按ABC法进行染色,DAB显色。均采用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。每张切片随机选取5个高倍视野(×400),利用Image-Pro Plus 6.0软件计算其积分光密度值(integral optical density,IOD),取其平均值。
1.2.4 Western blot检测HIF-1α表达
取新鲜肾组织加裂解液后匀浆、离心、取上清液测蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭,加一抗、二抗,显色剂显色处理。以β-Tubulin为参照,测定HIF-1α蛋白的相对表达量,即各组HIF-1α/β-Tubulin ratio值之间比较。
1.2.5 肾功能变化
在处死小鼠同时每只取静脉血2 ml,在高速离心机上离心,吸取血清,在全自动生化分析仪上检测BUN及Scr。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)描述;组间均数比较采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准,当P<0.05时,差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾脏形态学变化
各组小鼠肾组织HE染色显示:对照组小鼠肾组织结构形态正常;IR模型组出现不同程度的肾小管扩张萎缩、空泡变性,肾小管上皮细胞扁平、核染色缺失、炎症细胞浸润;Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组明显减轻。见图1。
各组小鼠肾脏组织组织学评分结果显示:对照组(0.23±0.01),IR模型组(4.46±0.11),Dex组(1.51±0.04),3组间比较差异有统计学意义。见图2。
2.2 肾组织HIF-1α免疫组织化学染色
对照组肾小管上皮细胞基本正常,HIF-1α表达微弱。IR模型组肾小管上皮细胞低氧严重,HIF-1α表达显著增多。Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组明显减轻,HIF-1α表达较IR模型组显著减少。见图3。
各组小鼠肾组织HIF-1α染色IOD值比较,IR模型组肾小管HIF-1α大量表达,而Dex组HIF-1α较IR模型组表达显著减少。3组标本IOD值间比较差异有统计学意义。见图4。
2.3 肾组织MCP1免疫组织化学染色
对照组肾小管上皮细胞基本正常,MCP1表达微弱。IR模型组肾小管损伤严重,炎症细胞浸润,MCP1表达显著增多。Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组显著减轻,MCP1表达较IR模型组显著减少。见图5。
与对照组比较,IR模型组肾小管MCP1大量表达(P=0.042)。而Dex组MCP1较IR模型组表达显著减少(P=0.031)。3组标本IOD值间比较差异有统计学意义。见图6,表1。
A:对照组;B:IR模型组;C:Dex组
1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05
2.4 HIF-1α蛋白表达
对照组HIF-1α蛋白表达微弱,IR模型组HIF-1α蛋白大量表达,而Dex组HIF-1α蛋白表达水平较IR模型组显著降低。见图7。
A:对照组;B:IR模型组;C:Dex组
1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05
A:对照组;B:IR模型组;C:Dex组
1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05
各组HIF-1α/β-Tubulin ratio值之间比较:对照组HIF-1α蛋白表达微弱,HIF-1α/β-Tubulin ratio值小,IR模型组HIF-1α蛋白大量表达,HIF-1α/β-Tubulin ratio值显著增加,而Dex组HIF-1α蛋白表达水平较IR模型组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。见图8。
2.5 肾功能变化
双肾缺血25 min再灌注24 h后,血浆肌酐水平从(30.62±2.55)μmol/L升高至(78.34±5.17)μmol/L(P=0.004),血尿素氮水平从(6.26±0.34)mmol/L升高至(23.39±4.15)mmol/L(P=0.006)。缺血再灌注后应用Dex 25μg/kg,可显著改善IR之后的肾功能,肌酐(54.09±3.27)μmol/L(P=0.035);尿素氮(18.33±4.07)mmol/L(P=0.023)。见表2。
注:1)与同期对照组比较,P<0.05;2)与同期IR模型组比较,P<0.05
1)与对照组比较,P<0.05;2)与IR模型组比较,P<0.05
注:1)与同期对照组比较,P<0.05;2)与同期IR模型组比较,P<0.05
3 讨论
肾脏缺血再灌注损伤是一个复杂的过程,休克、体外循环术后、围产期窒息等过程常发生肾缺血性损伤,严重者将导致急性肾功能衰竭的发生,也是患者入住ICU的主要原因。肾IR损伤病变的本质包括肾小管可逆性非致死性功能障碍和致死性损伤[5]。近年来,研究认为,凋亡和炎症反应在肾IRI的病理生理过程中占有核心地位[6]。HUANG等[7]认为,炎症反应是IRI最为主要的特征之一。而剧烈的炎症反应导致急性肾小管坏死,坏死后的小管碎屑作为一种危险信号在循环中进一步激发炎症反应,使肾小管上皮细胞处于缺氧状态。因此,针对急性肾损伤的早期抗炎治疗具有重要的价值[8]。
Dex是新一代α2AR激动剂,分布半衰期为约5 min,消除半衰期约2 h,不良反应相对轻且少。临床上主要作为手术麻醉辅助药和ICU镇静。此外,Dex还具有镇痛、抑制交感兴奋、抗焦虑、稳定血流动力学和利尿效应[3]。BILLINGS等[9]研究发现,Dex可以维持小鼠肾髓质血流从而防止造影剂肾病发生。KOCOGLU等[2]在肾缺血再灌注损伤大鼠研究中发现,Dex预处理可降低肾缺血再灌注损伤,提高肾脏对缺血的耐受性。因此,笔者推测,Dex能够通过减轻肾损伤后炎症反应、阻止肾小管上皮细胞凋亡加剧从而降低缺血再灌注后肾损伤的程度。
本实验通过HE染色发现,对照组小鼠肾组织结构形态正常,而IR模型组出现不同程度的肾小管扩张、萎缩、空泡变性,肾小管上皮细胞扁平、核染色缺失、炎症细胞浸润。但Dex组小鼠肾脏组织病理改变较IR模型组明显减轻。说明Dex本身对肾脏不会造成损伤,Dex能够减轻IR后受损肾脏的病变程度,从一定程度上维持肾脏结构与形态的稳定,进而改善肾脏功能。
HIF-1α是迄今为止发现的唯一一个在缺氧状态下发挥活性的特异性转录因子,是细胞低氧的可靠标记物,是反映低氧状态的一个敏感指标[10]。HAUCK等[11]认为,缺氧导致细胞死亡的主要方式是通过诱导细胞凋亡来实现的。细胞内氧浓度对HIF-1α的表达进行着精细的调节,随着氧浓度的下降,其表达增加。本研究发现,对照组HIF-1α表达较微弱,IR模型组HIF-1α大量表达,而Dex组HIF-1α较IR模型组表达显著减少。说明Dex能够减轻肾IR后受损肾小管上皮细胞低氧状态,从而减轻肾脏损害。
MCP1是趋化因子CC亚家族中的一员,在正常情况下肾组织中仅有少量表达。然而,在病理状态下,MCP1在肾小管间质中可广泛表达。刘雷等[5]认为,MCP1启动并放大炎症反应过程,在肾IRI中发挥重要作用。本实验通过研究发现,对照组MCP1表达较微弱,IR模型组MCP1大量表达,而Dex组MCP1蛋白表达水平较IR模型组显著减少。说明Dex能够通过减轻IR后肾组织炎症反应,从而保护肾脏功能。从表2可以看出,Dex组小鼠肾功能较IR模型组明显改善。
IR的炎症反应始于缺血阶段,再灌注之后补体系统被激活,引发后天免疫系统的级联反应,促进炎症的发展[8],炎症反应的发展可能会导致肾小管上皮细胞处于缺氧状态加剧。因此,针对ARF/AKI的早期抗炎治疗具有重要的价值。通过以上研究结果,笔者推测Dex参与肾脏IRI后的病理生理过程,主要通过下调MCP1和HIF-1α的表达,从而减轻肾脏炎症反应,降低肾小管上皮细胞缺氧程度,进而保护肾脏功能。希望能够为临床早期防治IR后肾损伤及其他脏器损伤提供新的治疗思路。
摘要：目的 缺血再灌注肾损伤(IR)是围手术期常见的疾病,本研究通过构建缺血再灌注肾损伤模型,观察右美托咪啶(Dex)注射对受损肾小管的保护作用及机制。方法 将60只小鼠随机分为对照组、IR模型组和IR+Dex组(简称Dex组),制备IR模型后24 h分别处死3组小鼠取肾组织。用全自动生化分析仪测定血肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)。采用HE染色观察各组小鼠肾组织的形态,评定肾小管损伤程度;免疫组织化学染色测定低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达。结果 对照组的肾小管结构与形态均正常。IR模型组肾小管损害明显、HIF-1α及MCP-1表达均增高。而Dex组肾小管损害程度较轻,HIF-1α及MCP-1表达均较IR模型组减低,肾小管上皮细胞低氧程度及炎症反应均较IR模型组明显减轻。Dex组小鼠的血肌酐及尿素氮水平较IR模型组明显降低。结论 Dex可以通过抑制炎症反应、减轻肾小管上皮细胞低氧程度从而减轻IR小鼠肾小管的损害,保护肾脏功能。
关键词：缺血再灌注损伤,肾小管上皮细胞,右美托咪啶
参考文献
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[2]KOCOGLU H,OZTURK H,OZTURK H,et al.Effect of dexmedetomidine on ischemia-reperfusion injury in rat kidney:a histopathologic study[J].Ren Fail,2009,31(1):70-74.
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[7]HUANG Y,RABB H,WOMER K L.Ischemia-reperfusion and immediate T cell responses[J].Cell Immunol,2007,248(1):4-11.
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肾小管/药物作用 篇6
1 材料与方法
1.1 主要试剂
小鼠近曲小管上皮细胞系 (m Prox) 由滋贺医科大学肾内科实验室建立;PPARδ受体激动剂L165041 (英国Tocris) ;重组TNF-α、棕榈酸钠和胎牛血清白蛋白 (FBS, 美国Sigma) ;PPARδsi RNA (美国Ambion) ;Lipofectamin 2000 (美国Invitrogen) ;兔抗PPARδ多克隆抗体 (美国Santa Cruz) ;PCR引物设计在Primer 5.0引物设计辅助软件上进行, 日本Ta Ka Ra生物技术有限公司合成。
1.2 小鼠近曲小管上皮细胞的复苏、传代和培养
永生的小鼠近曲小管细胞m Prox的建立参考以前文献[10], 保存在-80℃冰箱。复苏时, 将装有m Prox的冻存管迅速放入37℃水浴锅, 使其在3 min内融化, 然后快速转移至无菌超净台中, 酒精灯消毒。用吸管将冻存管中的细胞液吸到装有15 m L完全培养基 (含10%FBS的DMEM) 的离心管中, 吹打均匀, 250 g离心5 min, 弃去上清, 加5 m L预热的完全培养基轻轻吹匀, 以不同浓度接种于Ⅳ型胶原覆盖的10 cm培养皿中, 加入完全培养基并摇匀, 在37℃和5%CO2的恒温箱中进行培养。24 h后更换含有100u/m L青霉素和100μg/m L链霉素的完全培养基, 待细胞生长良好, 达到80%~90%融合时, 进行传代, 用0.25%胰蛋白酶消化后, 按1︰3进行传代, 加入含有抗生素的完全培养基, 细胞复苏后传代2、3次, 待细胞生长良好时开始实验。细胞取5×105个/孔均匀接种于6孔板中, 待贴壁生长至70%~80%融合时, 用含有0.2%FBS的DMEM培养液替代完全培养液同步化9 h后, 进行实验。
1.3 L165041对棕榈酸钠诱导的m Prox炎症反应的作用
将细胞分为4组:对照组、L165041对照组 (10μmol L165041) 、棕榈酸钠组 (150μmol棕榈酸钠) 和L165041干预组 (10μmol L165041预处理3 h后加入150μmol棕榈酸钠) 。L165041对照组和L165041干预组分别加入10μmol L165041预孵3 h, 对照组和棕榈酸组同时加入0.5%DMSO为对照, 之后分别在棕榈酸钠组和L165041干预组加入150μmol棕榈酸钠, 对照两组中加入含有0.2%FBS的DMEM培养液。12 h后收集细胞, 用RT-PCR方法测定各组细胞中MCP-1 m RNA的表达水平, 并进行比较。
1.4 L165041对TNF-α诱导的m Prox炎症反应的作用
将细胞分为4组:对照组、L165041对照组 (10μmol L165041) 、TNF-α组 (10 nmol TNF-α) 和L165041干预组 (10μmol L165041预处理3 h后加10 nmol TNF-α) 。实验方法同步骤1.3, TNF-α组和L165041干预组加入10 nmol TNF-α代替150μmol棕榈酸, 12 h后收集细胞, 用RT-PCR方法测定各组细胞中MCP-1 m RNA的表达水平, 并进行比较。
1.5 PPARδsi RNA的转染
细胞取2×105个/孔均匀接种于6孔板中, 待贴壁生长至50%~60%融合, 开始转染。用Lipofect amin 2000进行PPARδsi RNA的瞬时转染, 具体方法参照说明书, 预实验确定PPARδsi RNA的最佳浓度是5 nmol, 脂质体的最佳浓度是10 nmol。将含有血清和抗生素的培养液换成不含有血清和抗生素的DMEM培养液加入细胞, 同时配制含有5 nmol PPARδsi RNA的DMEM溶液和含有10 nmol脂质体的DMEM溶液, 室温下放置5 min后将两种溶液充分混合, 静置20 min后加入细胞中。在37℃恒温箱中培养4 h后, 加入含有10%FBS的培养液继续培养8~12 h。待细胞生长至70%~80%融合后, 加入含有0.2%FBS的培养液同步化9~12 h。阴性对照组用scramble代替PPARδsi RNA进行同样实验。在转染24 h用RT-PCR和Western blotting方法检测转染PPARδsi RNA细胞中PPARδ在蛋白和m RNA水平的表达, 并与scramble组对照。
1.6 PPARδ基因沉默对L165041抗炎作用的影响
转染后的近曲小管上皮细胞同步化9~12 h后, 分为8组, PPARδsi RNA转染4组, 分别为对照组、L165041对照组 (10μmol L165040) 、棕榈酸钠组 (150μmol棕榈酸钠) 或TNF-α组 (10 nmol TNF-α) 和L165041干预组 (10μmol L165041预孵3 h后加入150μmol棕榈酸钠或10 nmol TNF-α) 。scramble转染4组, 分组方法相同。实验方法同步骤1.3和1.4。
1.7 实时定量PCR反应过程
Trizols试剂提取近曲小管上皮细胞总RNA, 取1μg RNA逆转录合成c DNA, 以10倍稀释的c DNA为模板进行实时定量PCR。利用ABI PrismTM7500序列检测系统 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 分析数据, 用标准曲线法来测定m RNA的表达水平。以GAPDH为内参, 分别计算目的基因与GAPDH的比值。引物的序列见附表。
1.8 统计学方法
采用Statview 5.0软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 所有细胞实验重复3、4次, 组间比较用ANOVA中的Scheffe检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 L165041能抑制棕榈酸钠和TNF-α诱导的m Prox炎症反应
与对照组相比, 150μmol的棕榈酸钠和10 nmol TNF-α刺激12 h能引起小鼠近曲小管上皮细胞MCP-1 m RNA表达增强 (P<0.01) , 而在L165041干预组, 10 nmol的L165041能分别抑制棕榈酸和TNF-α诱导的MCP-1 m RNA表达的增强, 差异有统计学意义 (P<0.05和P<0.01) 。见图1、2。
2.2 PPARδsi RNA转染使m Prox内PPARδ表达下降
与scramble转染组相比, PPARδsi RNA转染组PPARδ受体的表达无论在蛋白水平还是基因水平都明显减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图3、4。
2.3 L165041的抗炎作用不依赖于PPARδ受体
在转染scramble的4组中, 与对照组相比, 150μmol棕榈酸钠和10 nmol TNF-α刺激12 h增加MCP-1 m RNA的表达 (P<0.01) , 10 nmol L165041能分别抑制棕榈酸和TNF-α诱导的MCP-1 m RNA表达的增强 (P<0.01) 。而在PPARδsi RNA转染组L165041仍然能够发挥类似的作用, 分别抑制棕榈酸钠和TNF-α诱导的细胞MCP-1 m RNA表达水平的增强 (P<0.01) 。说明L165041的抗炎作用并非依赖于PPARδ受体。见图5、6。
2.4 PPARδ受体自身在m Prox炎症过程中的作用
与scramble转染组相比, PPARδsi RNA转染组在150μmol棕榈酸的作用下, MCP-1表达的增加更明显, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。而在其他各对应组中, 差异无统计学意义。见图5、6。
3 讨论
过氧化物增殖体激活物受体δ (PPARδ) 是核激素受体家族的成员, 与PPARα和PPARγ特定的组织分布不同, 它几乎在全身所有的组织都有分布, 包括心血管系统、泌尿系统、消化系统、内分泌系统、造血系统、骨骼肌肉系统、感觉和生殖系统等[11]。因此它最早被认为是一种管家基因。随着受体过表达和受体敲除转基因动物的研究和高选择性配体的出现, 人们发现它在许多组织中显示出对脂肪酸氧化、能量解耦连、动脉粥样硬化等重要代谢过程的调节作用[12,13,14]。目前第一个高选择性的PPARδ受体激动剂GW501516在进行调脂作用的2期临床试验, 结果显示它能提高正常健康志愿者的三酰甘油的清除率, 增加循环中HDL-胆固醇水平[15]。近来人们发现它在炎症过程中发挥重要的作用, PPARδ配体显示出了抗炎作用[16,17,18]。本研究显示L165041、选择性的PPARδ受体激动剂在肾小管上皮细胞中发挥抗炎作用, 它能抑制棕榈酸钠和TNF-α在肾小管上皮细胞中诱导的炎症反应。在笔者以前的实验中已经证明了两种选择性的PPARδ受体激动剂GW501516和GW0742都能在肾小管上皮细胞中发挥抗炎作用。本研究的结果结合以往的结果证明了选择性的PPARδ受体激动剂具有抗炎作用, 这种抗炎作用是该类药物所共有的。这些结果表明PPARδ受体激动剂可能是一种潜在的能延缓肾小管间质炎症反应的新选择。
PPARδ受体激动剂的抗炎作用在不同的细胞机制不同。关于其抗炎作用是否依赖于PPARδ受体本身还不十分明确, 但是有实验证明一些PPARδ受体激动剂的抗炎作用, 是通过直接抑制细胞内信号传导通路来实现的, 而不是通过激活受体, 上调靶基因来实现[5,19]本实验利用si RNA技术导致PPARδ受体基因表达下调, 结果显示转染si RNA的近曲小管上皮细胞的PPARδ受体在蛋白和基因水平都明显受到抑制, 但是其抗炎作用不受影响。因此本研究得出结论, L165041对肾近曲小管上皮细胞发挥的抗炎作用是不依赖于PPARδ受体的。笔者既往的实验证明, TAK1-NF-κB信号通路参与GW501516和GW0742在肾小管的炎症反应, L165041也可能是通过这一信号通路发挥作用。下一步将通过实验进一步证明这一假设。
本研究结果显示, PPARδ受体自身在棕榈酸钠诱导的肾小管上皮细胞的炎症反应中发挥作用。与scramble组相比, 在PPARδsi RNA转染细胞中, 棕榈酸钠能引起更显著的炎症反应, 说明在肾小管上皮细胞中PPARδ受体的存在对于以棕榈酸钠为代表的饱和脂肪酸诱导的炎症反应十分重要, 受体的缺失或功能减少能降低细胞对饱和脂肪酸刺激的耐受性。而PPARδ受体在TNF-α诱导的炎症反应中的作用不明显, 在si RNA导致PPARδ受体基因沉默的细胞中, TNF-α诱导的炎症反应的程度与对照组没有明显的差异。说明不同的炎症刺激因子可能通过不同的通路诱导炎症反应。既往实验证明, PPARδ受体缺陷小鼠表现皮肤炎症反应的异常和伤口愈合的延迟, 也证实了PPARδ受体自身在炎症反应中的作用[14]。但是笔者的实验结果证明, L165041的抗炎作用是不依赖于PPARδ受体的。这看似自相矛盾的结果正说明了受体与配体之间相互作用的复杂性。既往的实验也证实了PPARδ受体激动剂的抗炎作用有多种机制, 具有细胞特异性和配体特异性。因此, 需要更多的实验来证明PPARδ受体激动剂在不同种肾脏固有细胞及不同的肾脏疾病模型中是否都具有抗炎作用。
摘要：目的 研究PPAR δ受体激动剂L165041在肾小管上皮细胞中是否能发挥抗炎作用并探讨其作用机制。方法 体外培养小鼠近曲小管上皮细胞 (mProx) 分为4组:对照组、L165041对照组 (10μmol L165041, PPARδ受体激动剂) 、棕榈酸钠组 (150μmol棕榈酸钠) 或TNF-α组 (10 nmol TNF-α) 和L165041干预组 (10μmol L165041预处理3 h后加入150μmol棕榈酸钠或10 nmol TNF-α) , 作用12 h。用RT-PCR方法 检测各组MCP-1 mRNA水平。利用PPARδ干扰RNA (siRNA) 转染mProx, 以scramble为对照, 在转染细胞中重复以上实验。结果 与对照组相比, 棕榈酸钠和TNF-α刺激使MCP-1 mRNA的表达增强 (P<0.05) , 而L165041下调棕榈酸钠和TNF-α诱导的MCP-1 mRNA表达 (P<0.05) 。与scramble组相比, 转染PPARδsiRNA的肾小管上皮细胞PPAR δ受体在蛋白和mRNA水平表达均明显下降 (P<0.05) 。在PPARδsiRNA转染细胞中, 棕榈酸和TNF-α使MCP-1 mRNA的表达明显增强 (P<0.05) , L165041仍能显著抑制棕榈酸钠和TNF-α诱导的炎症反应 (P<0.05) 。另外, 与scramble组相比, PPARδsiRNA转染细胞在棕榈酸钠的作用下, 使MCP-1表达增强更显著 (P<0.05) 。结论 PPARδ受体激动剂L165041能抑制小鼠近曲小管上皮细胞的炎症反应, 其抗炎作用不依赖于PPARδ受体, 而PPARδ受体本身对维持细胞对饱和脂肪酸诱导的炎症反应发挥作用。
肾小管/药物作用 篇7
积雪草甙和大黄素是国家名老中医、肾病专家王永钧教授用以延缓肾功能衰竭 (CRF) 的经验方“复方积雪草”[1]的主要成分, 本研究通过其对小鼠肾小管上皮细胞C3基因和蛋白水平影响的观察进一步探讨该方对肾局部免疫的作用与机理。
1 材料和方法
1.1 小鼠原代肾小管上皮细胞 (mTEC) 的培养与鉴定
无菌条件下取清洁级BALB/C小鼠 (雌雄各半, 6～8周龄, 体重16～20g, 本院动物室提供) 肾脏, 剥离肾包膜, 除去肾髓质, 肾皮质剪碎后加入0.1%Ⅱ型胶原酶10ml, 震荡消化20分钟, 置80目不锈钢网筛上研磨, 收集过筛悬液, 经过200目及40μm尼龙网筛, 网下收集肾小管并移置15ml塑料离心管中, 4℃ 1500r/min离心5分钟, 去上清液, 加入DMEM/F12液10ml, 混匀, 以4℃ 1500r/min离心5分钟, 洗涤2次, 加入含2%FCS的DMEM/F12培养液5ml, 混匀, 置50ml培养瓶中, 在倒置显微镜下观察, 可见肾小管节段, 将细胞培养瓶置37℃、5%CO2培养箱中孵育, 3天后肾小管上皮细胞长出, 更换细胞培养液, 7天后细胞长到70%融合时即用于实验。并在倒置显微镜下观察细胞形态, 并用免疫组化检测其标志蛋白的表达。
1.2 实验分组
正常组:2%牛血清+DMEM/F12培养液, 模型组:2%牛血清+DMEM/F12培养液+TNFα (R&DSystems公司) 5ng/ml, 治疗1组:2%牛血清+DMEM/F12培养液+TNFα5ng/ml+积雪草甙1μg/ml合大黄素0.1μg/ml, 治疗2组:2%牛血清+DMEM/F12培养液+TNFα5ng/ml+积雪草甙2μg/ml合大黄素0.2μg/ml, 治疗3组:2%牛血清+DMEM/F12培养液+TNFα5ng/ml+积雪草甙4μg/ml合大黄素0.4μg/ml, 共孵育24小时。
1.3 肾小管上皮细胞C3mRNA测定
RT-PCR。用Trizol试剂 (深圳晶美生物工程有限公司) 从培养的mTEC中提取总RNA, PCR按Promage试剂盒说明书进行。从Genbank中查到小鼠C3、β-actin序列号, 用Primer 5软件设计引物。C3 (序列号NM-009778, C3扩增产物388bp) 上游引物为5′-TCACACACCGAAGAAGACTGC-3′, 下游引物为5′-GTGGCTGATGAACTTGCGTTG-3′;β-actin (序列号NM-007393, β-actin扩增产物647bp) 上游引物为5′-GAGCAAGAGAGGTATCCTGACC-3′, 下游引物为5′-GGATGACACAGGATTCCATACC-3′;C3 PCR反应条件为:94℃预变性5分钟, 94℃变性1分钟, 65℃淬火1分钟, 72℃延伸1分钟, 30个循环后72℃延伸7分钟。各组样品同时扩增β-actin作内参。取PCR扩增产物5μl, 1.2%琼脂凝胶电泳, 溴化乙锭染色, Bio-Rad紫外凝胶成像仪扫描, Quanity One软件进行半定量图像分析。
1.4 肾小管上皮细胞C3蛋白表达的测定
ELISA。取培养的mTEC上清, 采用BD公司试剂盒, 具体操作步骤、方法按试剂盒说明进行, 检测mTEC培养上清液C3蛋白浓度。显色后在Labsystems型酶联免疫检测仪450nm读OD值, 根据标准曲线计算出各血清样品的C3浓度。
1.5 统计学处理
数据用均数±标准差表示, 显著性检验采用SPSS10.0软件, 多组间采用One-Way ANOVA检验, 两组间在方差齐性的前提下采用LSD法比较。
2 结果
2.1 mTEC鉴定
mTEC在倒置显微镜下观察细胞形态呈方形或多角形, 具有典型的上皮细胞鹅卵石样形态特征, 见图1A;免疫细胞化学检测上皮细胞标志蛋白Keratin呈阳性表达, Vimentin和α-SMA均呈阴性表达, 见图1 (B, C, D) 。
A.mTEC B.mTEC Keratin C.mTEC Vimentin D.mTEC α-SMA
2.2 积雪草甙合大黄素对TNFα诱导的mTEC C3 mRNA和蛋白表达的影响
结果见表1。
与模型组比较*P<0.05, **P<0.01
3 讨论
已知的三条补体激活途径都要通过活化C3才能得以实现, 因此, C3起着中枢性作用。当补体活化时, 可引起各种肾脏免疫疾病, 如循环免疫复合物形成过多所致的系统性红斑狼疮、慢性感染性肾小球病变;还可引起各种肾脏非免疫疾病, 如近端小管刷状缘上的补体活化所致的非选择性蛋白尿, 老年及糖尿病肾病时肾小球、间质和血管中出现膜攻击复合物C5b～9 (MAC) 沉积。由此可见, 补体活化是补体系统发挥生物学效应的前提, 而C3是三条活化途径的核心, 最终使补体系统终末成分活化, 并形成具有溶解细胞效应的MAC。
TNFα可由肾脏固有细胞分泌, 能激活许多信号传导途径, 使多种转录因子、细胞因子、黏附分子表达增强, 并可介导中性粒细胞、单核细胞与内皮细胞结合, 刺激系膜细胞增生、成纤维细胞生长和局部胶原的增加, 在肾损伤的纤维化中发挥作用[2,3]。
本研究通过TNFα诱导肾小管上皮细胞C3mRNA表达增加, 采用肾病专家王永钧教授的经验方“复方积雪草”中的主要成份积雪草甙和大黄素对C3的基因和蛋白表达水平进行干预。在既往的研究中发现积雪草总甙具有消肿止痛、活血化瘀、抗炎及抑制成纤维细胞增殖作用, 通过降低转酰胺酶活性, 减少酸性黏多糖和胶原含量, 使结缔组织的基质和纤维成分的过度增生受到抑制, 通过抑制转化生长因子β1及金属蛋白酶组织抑制因子1的表达, 增加转化生长因子β3的表达, 使成纤维细胞增殖受阻而发挥作用[4,5], 并可抑制免疫炎症因子诱导的肾小管上皮细胞表型转化, 从而防治肾小管间质纤维化[6]。大黄则具有通腑泄浊、凉血解毒之功效, 为中医治疗“关格”、“溺毒”之要药, 大黄素是其主要成份之一。有研究证实大黄能有效地防止CRF的进展;明显抑制狼疮性肾炎肾成纤维细胞分裂增殖, 并通过促使c-myc蛋白高水平表达诱导细胞凋亡, 从而减轻肾间质纤维化病变, 改善患者预后[7]。进一步动物实验揭示大黄素可通过丝裂原激活的蛋白激酶p38及白介素1β途径抑制肾小球系膜细胞增生、细胞外基质积聚[8,9], 从而防止粘连发生、缓解粘连形成;在笔者既往对复方积雪草 (含积雪草、大黄) 的实验中也得到了证实[1]。本文结果发现3种不同浓度的积雪草甙合大黄素均能下调肾小管上皮细胞C3mRNA及蛋白表达水平, 呈一定的剂量依赖关系。从免疫抑制机理提示积雪草甙合大黄素通过抑制TNFα诱导的肾小管上皮细胞C3的过度产生, 减轻肾脏局部的免疫反应, 从而保护肾功能、延缓病程的进展。本实验为其进一步的临床应用提供理论依据。
摘要：目的:探讨积雪草甙合大黄素对肿瘤坏死因子α (TNFα) 诱导的BALB/C小鼠肾小管上皮细胞 (mTEC) 补体核心成分C3mRNA及蛋白表达的干预作用。方法:采用BALB/C原代mTCE, 模型组TNFα5ng/ml诱导24小时, 治疗组在TNFα诱导的同时, 分别以积雪草甙1、2、4μg/ml合大黄素0.1、0.2、0.4μg/ml进行干预, 于24小时后分别提取细胞上清及RNA, 应用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 和酶联免疫方法 (ELISA) 分别检测mTEC C3mRNA和蛋白的表达水平。结果:正常BALB/C小鼠肾小管上皮细胞具有一定的C3mRNA和蛋白表达, 经TNFα诱导后, C3mRNA和蛋白表达均明显上调, 积雪草甙合大黄素干预后, mTEC C3mRNA及蛋白表达水平均出现不同程度的下调, 呈一定的剂量依赖关系。结论:积雪草甙合大黄素能够抑制炎性细胞因子TNFα所致的肾局部C3过度产生, 具有一定的免疫抑制作用。
关键词：积雪草甙/药理学,大黄素/药理学,补体3/药物作用,体外研究
参考文献
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