脑缺血预处理（共7篇）
脑缺血预处理 篇1
脑缺血预处理 (cerebal ischemic preconditioning, CIP) 是指脑组织采用机械刺激, 如一次或多次短暂性脑缺血再灌注后, 诱导脑组织产生内源性保护机制, 使其对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受。这种现象又称为脑缺血耐受 (ischemic tolerance, IT) 。脑缺血耐受是近年的研究热点, 耐受的机制涉及兴奋性氨基酸、炎症、腺苷、凋亡、信号传导通路等。根据缺血预处理机制, 通过药物激发或模拟机体内源性物质也可对脑缺血发挥保护作用, 是神经保护的新途径, 为缺血性脑损伤的预防提供了一个新思路。本文就近年有关药物预处理的脑保护作用方面的研究综述如下。
1 KATP通道开放剂预处理
随着对缺血预处理机制的逐步认识, 许多学者除了用KATP通道开放剂模拟缺血预处理之外, 药物预处理也是近年来研究的热点, 具有重要的临床意义。Lauritzen等[1]发现KATP通道开放剂cromakalim具有防止谷氨酸盐所致的海马神经元凋亡的作用。Shimizu等[2]在大脑中动脉阻断前15 min, 将线粒体特异性KATP通道开放剂diazoxide注入大鼠右侧脑室, 24 h后与注入生理盐水组比较神经学评分及梗死面积, 发现其具有明显的保护作用, 且特异性KATP通道开放剂5-hydroxydecanote可完全消除其保护作用。不同神经细胞上的KATP通道对能量消耗和特异性KATP通道开放剂的反应不同, 用海马片膜片钳技术研究发现能量消耗或diazoxide均可激活锥体细胞和神经间质细胞的KATP通道, 但在神经间质细胞上记录的电流明显大于锥体细胞[3]。腺苷受体或KATP通道的激活均可诱发延迟性神经保护作用。Blondeau等[4]报道在致死性缺血3 d前用腺苷受体激动剂R-phenylisopropylad- enosine或cromakalim预处理可诱导热休克蛋白 (HSP70) 在脑内的表达。
2 腺苷受体激动剂
由于缺血时腺苷大量释放和选择性腺苷A1受体激动剂有神经保护作用, 有必要验证CIP引起内源性保护机制是否可用活化的腺苷A1受体激发。Heurteaux等[5]在大鼠脑缺血预处理实验中发现, 缺血预处理前15 min给予受体抑制剂82环戊21, 32二丙基黄嘌呤 (DPCPX) 腹腔注射可以完全阻断CIP的神经保护作用, 而在致死性缺血前15 min或1 h给予受体激动剂氮62环戊基腺苷 (CPA) 腹腔注射则可以模拟CIP, 因此认为CIP是通过腺苷受体介导的。然而, 其保护作用只相当于CIP的70%, 说明还激活了其他保护机制。
3 神经营养因子
NTF是一组能支持神经元发育和存活的小分子多肽, 包括神经生长因子 (NGF) 、脑源性神经营养因子 (BDNF) 和胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF) 等。Koketsu等[6]实验表明, 短暂性 (45 min) 局灶性脑缺血前3 d每天静推1.2 μg NTF预处理, 缺血后再灌24 h可使脑梗死面积缩小25%。同样, NGF预处理可减轻全脑缺血引起的海马损伤或神经元凋亡[7,8]。Zhu等[9]发现在大鼠MCAO前腹腔注射双氯醇胺, 可缩小脑缺血7 d后皮质梗死灶, 提示药物刺激β受体诱导产生的NGF可能成为引发机体内部神经元保护机制的一种方法。NGF为大分子肽, 难以通过血-脑屏障, 因此充分有效的利用并促进内源性NGF的表达, 可能是治疗缺血性神经损伤的新途径。
4 3-硝基丙酸
3-硝基丙酸 (3-nitropropionic acid, 3-NPA) 是从植物或真菌中提取的一种细胞毒性物质, 能不可逆地抑制琥珀酸脱氢酶, 大剂量重复使用可导致神经细胞变性和凋亡, 但单次小剂量应用不会引起任何出血、坏死或凋亡, 动物也不会发生行为学改变, 反而能诱导对组织的保护作用。作为一种细胞毒素, NPA主要抑制线粒体呼吸链复合物。它可通过影响能量代谢而引起缺血耐受, 体外实验也证实了3-NPA的作用[10]。沙土鼠腹腔注射3-NPA (4 mg/kg) 后, 间隔3 h和24 h制作海马脑片, 并将脑片缺氧8 min。结果显示经过预处理的脑片可抵抗缺氧损伤, 并且与突触后兴奋性电位有关。脑组织的保护时限具有发生早 (应用3-NPA后3 h即产生) 、持续时间长 (至少3 d) 的特点[11,12]。
5 麻醉药物吸入
近年发现吸入麻醉药也具有KATP通道开放剂的作用, 如氟烷、恩氟烷、异氟烷 (ISO) 对心肌的I/R损害均有显著的保护作用。ISO通过减少三磷腺苷 (ATP) 分解, 消除I/R期间心肌细胞间隙内腺苷、肌苷和次黄嘌呤的增加, 与缺血预处理或用KATP通道激动剂一样, 可增加ATP的存储。Wise-Faberowski等[13]首次报道ISO或氟烷处理可减少缺氧和无糖所致的培养神经细胞凋亡。在体实验也发现, 地氟醚对脑的I/R损伤的保护作用强于芬太尼[14]。Kapinya等[15]报道1% ISO预处理3 h对鼠局灶性脑缺血损伤有保护作用。沈洁等[16]也发现ISO预处理对沙土鼠脑I/R的保护作用可能就是通过激活线粒体ATP敏感性钾通道 (mitoKATP) 通道, 稳定了线粒体而发挥细胞保护作用。
6 红霉素等抗生素
红霉素等抗生素对缺氧损伤也会产生耐受作用。Huber等[17]发现, 动物预先腹腔注射红霉素或卡那霉素, 或以氨苄西林预处理缺氧损伤海马脑片, 可明显改善缺血15 min引起的海马CA1区神经元电位紊乱, 并认为这可能与抗生素影响了神经细胞的能量代谢有关, 显示出以抗生素为化学预处理的方法在人体脑缺血疾病的预防和治疗中应用的可能性。
7 阿司匹林
阿司匹林是一种非甾体抗炎药, 近年来发现其有直接的神经保护作用。Grilli等[18]发现, 培养的小脑颗粒细胞在加入谷氨酸前5 min加入阿司匹林, 可减轻谷氨酸诱导的细胞死亡。Khayyam等[19]用大鼠颈总动脉联合大脑中动脉结扎制作大鼠局灶性脑缺血模型, 结扎前2 h或30 min腹腔注射阿司匹林, 8d后处死动物, 发现阿司匹林15 mg/kg及以上剂量能缩小脑梗死体积, 减轻缺血性脑损伤。而王倩等[20]认为小剂量阿司匹林 (5 mg/kg) 预处理对大鼠MCAO模型缺血性脑损伤神经具有保护作用。
除上述药物外, 还有许多药物, 如钙离子拮抗剂、NMDA受体拮抗剂、蛋白合成抑制剂、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1抑制剂、血红蛋白氧化酶拮抗剂等可用于预处理。
8 中医药预处理
中医药预处理也是近年来研究的热点, 取得了一定的成果。如周俊英等[21,22]采用二次线栓法制备大鼠脑缺血耐受模型, 缺血预处理10 min, 腹腔注射地龙和水蛭复方制剂, 结果发现其可通过下调基质金属蛋白酶9表达, 上调NGF的表达, 与缺血预处理具有协同作用, 减轻再缺血后脑损伤。刘小利等[23]用同样的方法, 以乐脉颗粒 (丹参、川芎、赤芍、红花等组成) 预处理, 发现其有效中药成分能稳定内环境, 减缓急性期反应性胶质细胞对脑组织的损伤, 上调了其对神经元修复的保护作用。魏江磊[24]通过制作大鼠脑缺血预适应和脑缺血再灌注模型, 发现脑宁康颗粒 (川芎、蚤休、海藻等组成) 对脑缺血再灌注和脑缺血预适应状态下的CD62P表达均有良性效应, 其强度略高于阿司匹林, 说明其通过干扰血小板活化, 抑制其聚集、改善脑局部微循环而保护脑神经元。谭琥等[25]采用钳夹双侧颈总动脉建立沙土鼠脑缺血模型, 以脑泰方提取物 (黄芪、川芎、地龙等组成) 预处理, 结果显示其能够减轻血脑屏障破坏, 减轻细胞毒性脑水肿, 保护易损区海马CA1区神经元免遭延迟性死亡。唐伟等[26,27,28,29]发现针刺预处理可能通过上调全脑缺血大鼠海马Bc1-2、B细胞淋巴瘤、热休克蛋白和即刻早期基因c-fos的表达而减轻严重缺血后细胞凋亡并促成脑缺血耐受的产生。谷巍等[30]观察急性脑梗死患者80例, 在常规治疗基础上加用针刺风池、完骨、天柱穴可诱导脑细胞缺血耐受, 改善微循环, 促进侧支循环建立, 减轻脑组织损伤。赵宇辉等[31]发现艾灸预处理能通过上调Bcl-2蛋白表达而抑制缺血脑组织神经细胞凋亡, 认为艾灸可以作为一种脑缺血预处理手段, 对全脑缺血大鼠大脑皮层神经细胞具有保护作用。
9 展 望
药物预处理被认为是比较适于临床缺血性脑血管疾病的预防和改善预后的方法, 在确认安全性的前提下, 对缺血性脑血管疾病高危人群有相当的实用价值。在某种意义上, 无论将来的临床应用前景如何, 关于缺血耐受性的研究都十分重要, 通过有关非致死短时间脑缺血、化学药物等诱发缺血耐受性的研究, 发现了多种缺血耐受的产生机制, 这对被认为对缺血非常脆弱的脑来讲, 是令人惊喜的发现。总结这些机制, 通过进一步的研究, 今后有可能开发出新的脑缺血疾病的预防方法和药物。
脑缺血预处理 篇2
肢体缺血预处理 (LIP) , 即给予肢体一次或者多次短暂的缺血再灌注, 可对随后的组织或器官 (脑) 缺血有保护作用。大量研究显示, 缺血预处理对脑灌注损伤有保护作用, 但具体机制涉及N-甲基-D-天冬氨酸 (NMDA) 受体[1], 活性氧 (ROS) [2]、细胞内磷脂酰肌醇3激酶 (PI3K) -Akt[3]、蛋白激酶C[4]等。对于血管再生是否参与LIP诱导的脑保护作用尚不清楚。本实验以大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型为研究对象, 观察LIP与血管新生的关系。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠 (山西医科大学生理实验室提供) 60只, 体重200g~220g。
1.1.2 试剂与仪器
兔抗大鼠血管内皮生长因子 (VEGF) 抗体、小鼠抗大鼠α-SMA抗体、兔抗大鼠CD31抗体和免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。兔抗血小板源生长因子 (PDGF) -B抗体由北京博奥森生物技术有限公司提供。图像分析系统 (Media Cybemetics Ine, USA, 41N5i00-44800) 为美国BIORAD生产。
1.2 实验方法
1.2.1 分组
大鼠随机分为MCAO组、LIP+MCAO组。MCAO组:缺血2h后进行再灌注, 依据再灌注的时间点分5个亚组 (6h、24h、3d、7d、14d) , 每个亚组处死6只, 留取脑组织标本, 制备石蜡切片。LIP+MCAO组:制备LIP模型后即刻进行MCAO模型的制备, 依据MCAO模型缺血2h后再灌注的时间分5个亚组 (6h、24h、3d、7d、14d) , 每个亚组处死6只, 留取脑组织标本, 制备石蜡切片。
1.2.2 LIP和MCAO大鼠模型的制备
MCAO模型的制备:用改良Longa法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。大鼠术前禁食12h, 不禁水, 室温条件下称重, 将大鼠腹腔麻醉 (10%水合氯醛3 mL/kg) , 固定, 备皮, 切口 (颈正中右侧旁开0.5cm~1cm) , 钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉, 结扎颈外动脉、颈总动脉近心端, 血管夹夹闭颈内动脉, 在颈总动脉距离分岔口大约5cm处用眼科剪剪开一小口, 将直径0.24mm~0.26mm的渔线插入, 松开血管夹, 以分岔口开始测量距离, 插入1.8cm~2cm后固定渔线, 缝合。缺血2h后将线栓拉出1cm, 形成再灌注。待动物苏醒评估神经功能后放回笼中, 自由饮食。
LIP模型的制备:大鼠用10%水合氯醛 (0.3mL/100g) 腹腔注射麻醉, 以改良的动物无创血压测试仪自制套管套住大鼠左后肢根部, 加压使脉搏消失、肢体远端体温下降、皮肤发绀, 即为阻断股动脉标志, 持续5min;减压, 脉搏出现、体温回升、皮肤潮红, 为再灌注标志, 持续5min, 共3个循环。
1.2.3 神经行为评分
各实验组大鼠分别于再灌后6h、1d、3d、7d、1 4d时, 采用改良的国际上公认的神经功能损伤程度评分 (modified neurological severity score, mNSS) 进行神经功能缺损评定。大鼠神经功能缺损评分体系, 主要包括运动实验及平衡木实验。运动实验:尾巴提起大鼠:前肢屈曲 (1分) , 后肢屈曲 (1分) , 30s内头转动偏离中轴大于10° (1分) ;将大鼠放于地上:正常运动 (0分) , 不能走直线 (1分) , 向偏瘫侧转圈 (2分) , 身体倒向偏瘫侧 (3分) 。平衡木实验:保持平衡稳定状态 (0分) , 抓紧平衡木的边 (1分) , 抓住平衡木但是一只脚从平衡木掉下 (2分) , 抓紧平衡木但两只脚从平衡木上掉下或在木上旋转 (大于60s) (3分) , 试图保持平衡但还是掉下 (大于40s) (4分) , 试图保持平衡但还是掉下 (大于20s) (5分) , 不能保持平衡迅速掉下 (6分) 。总分为12分, 1分~3分为轻度损害, 4分~7分为中度损害, 8分~12分为重度损害。
1.2.4 取材及HE染色观察梗死部位组织学改变
各组大鼠在规定的时间点取材。采用乌拉坦对大鼠进行腹腔注射麻醉, 依次给予0.9%生理盐水、4%多聚甲醛各200mL经心脏灌注。剥取脑组织, 以视交叉到枕叶处两点冠状切片, 常规固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片厚5μm。每组取1张做常规HE染色, 即将石蜡切片脱蜡、乙醇梯度脱水、苏木素-伊红染色、二甲苯透明、中性树胶封片, 光镜下观察。
1.2.5 免疫组织化学染色
常规脱蜡水化, 0.3%H2O2水溶液10min, 灭活内源性过氧化物酶。抗原修复 (pH=6.0的柠檬酸盐抗原修复液高压修复2 min) 。5%BSA室温封闭20min。分别加兔抗CD31 (1∶100) , 小鼠抗新生的成熟血管 (α-SMA) (1∶100) , 兔抗VEGF (1∶200) , 兔抗PDGF-B (1∶100) 稀释, 4℃过夜, PBS洗3次。分别滴加对应的小鼠抗IgG或兔抗IgG, 37℃, 30min, PBS洗3次。DAB显色后, 蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染, 盐酸酒精分化。脱水、透明, 中性树胶封片。
免疫组化阳性细胞计数方法:取相应时间点VEGF、PDGF-B、α-SMA、CD31两张免疫组化染色切片, 在高倍镜下 (200×) 于缺血半暗带部位随机观察5个不重叠高倍视野, 计数阳性细胞数。1.3统计学处理应用SPSS16.0统计分析软件进行分析。计量资料用均数±标准差 (x±s) 表示, 两组间比较采用t检验, 多组数据比较采用单因素方差分析。当方差分析有显著性差异时, 进一步用SNK-q检验作两两比较。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
在模型制备过程中, 死亡大鼠19只, 其中过量麻醉致死4只, 蛛网膜下腔出血6只, 大脑中动脉阻塞 (MCAO) 后24h内死亡9只 (包括LIP+MCAO组5只, MCAO组4只) 。
2.1 神经功能评分
对各组大鼠在处死前进行神经行为功能评分, LIP+MCAO组与MCAO组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示经过LIP预处理后大鼠的神经行为得到改善。详见表1。
2.2 梗死灶HE染色结果
MCAO24h组可见较多肿胀的神经元, 细胞核呈固缩、碎裂、深染, 核仁不清楚, 细胞周围空泡变。LIP+MCAO24h组仅部分胞核固缩, 核仁欠清楚, 细胞周围空泡变略少。LIP+MCAO 7d组与MCAO 7d组相比, 水肿减轻, 半暗带区域出现新生的毛细血管及较多内皮细胞。
2.3 各组大鼠新生内皮细胞 (CD31) 、α-SMA蛋白表达
取梗死周边区域观察CD31及α-SMA。CD31阳性细胞呈棕褐色, 与MCAO组比较, LIP+MCAO组有较多新生内皮细胞, 差异有统计学意义 (P<0.01) , LIP+MCAO组内3d、7d、14d亚组比较有统计学意义 (P<0.01) , 且7d亚组高于3d、14d亚组。α-SMA作为成熟血管的标记, 在时间上滞后于新生内皮细胞, 与MCAO组相比, LIP+MCAO组有较多的成熟血管, 差异有统计学意义 (P<0.01) , LIP+MCAO组内3d、7d、14d亚组比较有统计学意义 (P<0.01) , 且14d亚组高于3d、7d亚组。详见表2、表3。
2.4 各组大鼠VEGF、PDGF-B蛋白表达
取梗死周边区域观察VEGF、PDGF-B蛋白表达, 与MCAO组比较, LIP+MCAO组有较多VEGF、PDGF-B表达, 差异有统计学意义 (P<0.01) , LIP+MCAO组内6h、24h、3d亚组比较有统计学意义 (P<0.01) , 且24h亚组高于6h、3d亚组。详见表4、表5。
3 讨论
近年来, 由预处理诱导的内源性脑保护作用已成为研究热点, 预处理包括缺血、低氧、吸入性麻醉药等。在美国神经科学2007年会上, 美国斯坦福大学Zhao实验室率先报道了在远端大脑中动脉闭塞 (dMCAO) 模型上建立远隔预处理局灶性脑缺血模型的方法, 并于2008年在Neuroscience上详细报道了该项研究成果[5], 首次证实单肢缺血再灌注同样可以在局灶性脑缺血模型上诱导脑保护。有研究证实, 肢体缺血预适应可以减少海马CA1区神经元的死亡等[6]。因肢体缺血预处理为安全无创简单易行的操作, 对脑血管病的治疗具有潜在的临床应用价值, 受到生命科学界的广泛关注。本实验中, 经过对肢体进行3个循环的无创性缺血预处理, 观察其对随后的脑缺血再灌注损伤的神经功能缺损评分及半暗带区VEGF、PDGF-B、CD31及α-SMA表达的影响, 从血管再生方面探讨其可能的机制。
本研究结果显示, 与MCAO组相比, LIP+MCAO组大鼠神经功能缺损症状有明显改善, 提示LIP对脑缺血再灌注损伤有保护作用。CD31是在脊髓单核细胞分化过程中表达的一种糖蛋白, 存在于内皮细胞, 用来检测脑内新生的内皮细胞, 标记新生血管。α-SMA是血管平滑肌抗体, 标记新生成熟血管。LIP+MCAO组3d、7d、14d亚组大鼠缺血半暗带区的CD31、α-SMA表达均高于MCAO组, 差异有统计学意义, 提示LIP对脑缺血再灌注损伤的保护作用与新生血管有关。LIP+MCAO组12h、24h、3d亚组大鼠缺血半暗带区VEGF、PDGF-B表达均高于MCAO组, 差异有统计学意义, 考虑LIP对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与早期VEGF、PDGF-B表达的增多有关。血管新生包括内皮细胞增殖和血管壁形成, VEGF是与血管新生关系最为密切的生长因子, PDGF-B在血管壁形成过程中期重要作用。而脑缺血发生时, 缺氧[7]、缺血、促红细胞生成素[8]都可诱导VEGF的生成。VEGF的化学趋化活性使大量单核细胞聚集, 促进MCA-1、淋巴细胞功能相关分子 (LFA-1) 表达, 有助于侧支血管的建立。VEGF与血管内皮受体flt-1和KDR即flk-1结合, 促进血管内皮细胞增殖、迁移, 使血管通透性增加。PDGF是一种分泌性蛋白, 与受体PDGFR-β结合, 发生生物效应如细胞增殖、迁移、趋化、装配血管壁[9]及成管作用等, 调节血管壁形成, 促进血管成熟。有研究发现, 经过延迟缺血预处理 (DIPC) 后心肌缺血区VEGF、PDGF-B蛋白表达明显增高, 提示细胞因子表达增加与有功能的血管新生有关, 表明DIPC可促进缺血边缘区小动脉再生, 使缺血区心肌获得血液供应[10]。
综上所述, 安全无创的肢体缺血预处理可诱导脑保护, VEGF、PDGF-B的表达上调可能是LIP诱导的脑保护机制之一, 同时血管形成可能在其中发挥了重要作用。
参考文献
[1]Lin CH, Chen PS, Gean PW.Glutamate preconditioning preventsneuronal death induced by combined oxygen-glucose deprivation incultured cortical neurons[J].Eur J Pharmocol, 2008, 589 (1/3) :85-93.
[2]Busija DW, Gaspar T, Domoki F, et al.Mitochondrial-mediatedsuppression of ROS production upon exposure of neurons to lethalstress:Mitochondrial targeted preconditioning[J].Adv Drug DelivRev, 2008, 60 (13/14) :1471-1477.
[3]Zhao H, Sapolsky RM, Steinberg GK.Interrupting reperfusion as astroke therapy:Ischemic postconditioning reduces infarct size afterfocal isehemia in rats[J].J Cereb Blood F1ow Metab, 2006, 26:1114-1121.
[4]Gao X, Zhang H, Takahashi T, et al.The Akt signaling pathwaycontributes to postconditionin’s protection against stroke, the pro-tection is associated with the MAPK and PKC pathways[J].JNeurochem, 2008, 105:943-955.
[5]Ren C, Gao X, Steinberg GK, et al.Limb remote-preconditioningprotects against focal ischemia in rats and contradicts the dogma ofthera peutic time windows for preconditioning[J].Neuroscience, 2007, 151:1099-1103.
[6]Steiger HJ, Hanggi D.Ischaemic preconditioning of the brain, mechanisms and applications[J].Acta Neurochir, 2007, 149 (1) :1-10.
[7]Laudenbach V, Fontaine RH, Medja F, et al.Neonatal hypoxicpreconditioning involves vascular endothelial growth factor[J].Neurobiol Dis, 2007, 26:243-252.
[8]Li Y, Lu ZY, Ogle M, et al.Erythropoietin prevents blood brainbarier damage induced by focal cerebral ischemia in mice[J].Neu-rochem Res, 2007, 32 (12) :2132-2141.
[9]Armulik A, Abramsson A, Betsholtz C.Endothelial/pericyte inter-actions[J].Circ Res, 2005, 97 (6) :512-523.
脑缺血预处理 篇3
1 材料与方法
1.1 一般资料
选取2008年6月至2010年6月在我院治疗的63例短暂性脑缺血发作患者,入选患者均符合全国第4届脑血管病会议制订的TIA诊断标准,并随机分为观察组和对照组,观察组31例,其中男18例,女13例,平均年龄(57.3±11.6)岁,合并高血压者11例,合并糖尿病者5例;对照组32例,其中男20例,女12例,平均年龄(56.7±12.3)岁,合并高血压者12例,糖尿病者3例。两组患者在性别组成、年龄、病史、基础疾病及疾病严重程度方面无显著差异,具有可比性(P>0.05)。
1.2 方法
两组患者在入院后,均按照神经内科疾病常规进行护理,嘱咐患者卧床休息、低脂饮食,并按照短暂性脑缺血发作常规治疗方式进行治疗,即给予阿司匹林肠溶片50~100mg/d,口服,合并高血压者给予血管紧张素转化酶抑制剂类降压药和噻嗪类利尿剂,合并糖尿病者给予药物或胰岛素控制血糖。观察组在此基础上给予0.4m L低分子肝素钠腹部皮下注射,2次/日。连续治疗两周,观察两组疗效及复发情况。
1.3 评价标准
有效:患者经治疗后临床症状明显好转,24h内不再复发,随访1年内复发次数≤1次。无效:患者经治疗后临床症状好转,7d之内复发少于2次,随访1年内复发次数≤2次。恶化:患者临床症状无好转甚至加重,随访1年内出现脑卒中或死亡者[2]。
1.4 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析,计量资料采取t检验;计数资料采取χ2检验,检验指标设为0.05,当P<0.05时说明差异有统计学意义。
2 结果
两组患者经治疗后,观察组有效28例,无效或死亡3例,有效率90.32%,对照组有效19例,无效或恶化11例,其中1例因脑血管意外猝死,有效率59.38%。观察组有效率显著高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
3 讨论
TIA是由于脑或者视网膜出现暂时性局灶性的缺血而引起的神经功能障碍,虽然持续时间短,症状不甚严重,但是有报道[3]称短暂性脑缺血发作后如果不予以积极有效的治疗,患者在3年内发展成为脑梗死的概率将会超过50%,甚至有猝死的危险,所以,一旦发现TIA要及时治疗,否则发展成为脑梗死就会对患者家庭甚至整个社会都会带来不良影响和后果。有研究表明[4]对于TIA患者,长期预防比短期治疗更为重要,积极重视高血压、高血脂、糖尿病、冠状动脉粥样硬化等慢性病的预防,纠正不良的生活习惯,戒烟戒酒,适量运动,如此能显著减少TIA再发的风险,而且也有利于脑卒中的预防。秦永福,王雪芝等[5]利用阿司匹林联合噻氯匹定治疗TIA患者29例,有效率达92.76%,显著高于单纯用阿司匹林治疗TIA患者的有效率57.14%(P<0.001),证明阿司匹林联合噻氯匹定对控制短暂性脑缺血发作及其复发有良好疗效,对防止TIA恶化成为脑梗死也有明显效果。陈进军等发现[6]中药半夏白术天麻汤也能有效缓解TIA患者的发病情况,在西医常规基础上利用此药治疗21例TIA患者,缓解率达61.76%,并利用CT脑灌注成像证实利用中医理论治疗TIA也能取得良好疗效。
TIA是脑卒中的发生的重要预警信号,它的发生原因和机制主要包括3个方面:(1)血栓形成,由于高血脂引起的血液高凝状态以及动脉粥样斑块,引起血管壁上血栓缓慢形成最终引起血管闭塞,血流中断导致TIA;(2)栓子脱落,由于左心系统及心房内血栓形成,由于某种原因脱落后形成小栓子,在脑及视网膜血管处阻断血流引起TIA;(3)血管变形,在动脉粥样硬化和血流动力学改变的基础上,血管壁逐渐增厚,最终狭窄闭塞,导致TIA[7]。本研究以抗血小板联合扩容抗凝来治疗TIA患者为观察组,单纯用抗血小板治疗TIA患者作对照组,在临床疗效方面,观察组患者的有效人数为28例,有效率为90.32%,对照组患者有效人数为19,有效率为59.38%,而且有1例在随访1年内因脑血管意外而死亡,观察组有效率明显高于对照组(P<0.05),表明在治疗TIA患者时,抗血小板治疗联合扩容抗凝治疗优于单纯的抗血小板治疗。
总之,及时发现TIA并予以高度重视是降低人群脑卒中发生率的前提,广泛的健康教育和疾病预防是预防脑卒中发生的基础。最后积极有效的抗血小板联合扩容抗凝治疗能使有效缓解TIA患者发作症状,减少复发次数,有利于推迟脑卒中发生,值得临床推广应用。
摘要：目的 总结和探讨短暂性脑缺血发作(TIA)患者在不同治疗方式下的疗效比较。方法 将2008年6月至2010年6月在我院住院的63例短暂性脑缺血发作患者随机分为两组,观察组和对照组,两组均给予抗血小板药物阿司匹林治疗,观察组加用低分子肝素钠治疗,治疗2周后随访1年观察两组疗效。结果 观察组患者有效率为90.32%,对照组患者有效率为59.38%,观察组有效率明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 抗血小板治疗联合扩容抗凝治疗比单独抗血小板治疗对短暂性脑缺血发作患者疗效更好,值得临床推广应用。
关键词：短暂性脑缺血发作,抗血小板治疗,扩容抗凝治疗
参考文献
[1]Solenski NJ.Transient ischemic attacks:diagnosis and evaluation[J].Am Fam Physician,2004,69(7):1665.
[2]刘福仁.200例短暂性脑缺血发作临床分析与治疗策略[J].中国医学工程,2011,19(10):153.
[3]王文忠.短暂性脑缺血发作的临床分析[J].中国现代药物应用,2011,5(2):78-79.
[4]吴秋枫,闫瑞芬.老年短暂性脑缺血发作患者的诊治分析[J].实用心脑肺血管病杂志,2012,20(1):115-116.
[5]秦永福,王雪芝.阿司匹林联合噻氯匹定治疗短暂性脑缺血发作疗效观察[J].中外医疗,2011,29(2):140.
[6]陈进军,易咏希,宁景春.中西医结合治疗短暂性脑缺血发作临床疗效及CT脑灌注成像分析[J].中国中医急症,2010,19(2):191-193.
脑缺血预处理 篇4
1材料与方法
1.1模型制造将100只健康成年雄性SD大鼠(河北医科大学实验动物中心提供)按随机数值表法分为5组,每组20只。A组:假手术组,B组:脑缺血再灌注组,假手术3d后给予2h大脑中动脉闭塞(MCAO),再灌注22h后处死。C组:脑缺血预处理组,缺血预处理10min,3d后给予2hMCAO,再灌注22h后处死。D组:ASA预处理组,阿司匹林粉剂(河南华利药业有限责任公司 提供,批号:0780633)以60 mg/kg剂量溶于2mL生理盐水 中 ,灌胃3次 ,3d后给予2h MCAO,再灌注22h后处死。E组:Ply预处理组,大黄素甲醚 (山东新华 制药股份 有限公司 提供,批号: 0506338;以40mg/kg剂量溶于2mL生理盐水中,灌胃3次,3d后给予2h MCAO,再灌注22h后处死。 给予A、B、C组等量生理盐水灌胃。
实验动物用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后,用Zea-longa等[5]的大脑中动脉线栓法制作大鼠左侧大脑中动脉缺血灌注模型。采用颈部正中切口,结扎并切断左侧颈外动脉,在颈外动脉残端剪一小口,并插入一根顶端粘有石蜡的尼龙丝线,向上深入至分叉以上(19~21)mm,结扎颈外动脉近心端,缺血(以插渔线成功开始计时)后2h实施再灌注,外拉渔线约20 mm恢复MCA供血,完成缺血预处理。假手术组除不插入渔线外,其余操作相同。造模成功标志:大鼠不能伸展右侧前肢(即提尾时右前肢内收屈曲)、行走时向向右转圈(追尾现象)或行走时向右侧倾倒,出现上述三者之一即为造模成功。再灌注3d后用相同方法再次造成MCAO 2h,于处死前进行神经功能缺失评分,心脏取血,后断头处死。
1.2神经功能缺失评分按Zea Long5分制[5]标准评分,0分:无功能障碍;1分:不能完全伸展对侧前爪; 2分:向右侧转圈;3分:向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。
1.3脑梗死体积测定再灌注22h每组随机选取10只动物断头取脑,去除嗅球、小脑和低位脑干,沿冠状面用排刀切成5片,每片厚约2mm,置于2%TTC溶液中,避光染色30min,用10%甲醛缓冲液固定24h后用数码相机照相,正常脑组织呈红色,梗死组织呈白色,利用图像分析法计算各个脑片梗死面积,并计算梗死体积。
1.4脑组织白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)含量测定再灌注22h后取每组另10只动物用10%的水合氯醛麻醉后处死,取出鼠脑剥离左侧皮质 ,制成100g/L的脑组织 匀浆 ,低温离心1 5min (3 000r/min)。取上清液采用FFDFr-晶体闪烁计数仪, 用放射免疫法测定各组动物脑组织IL-1β和TNF-α的含量 。具体操作按大连生物工程公司生 产的试剂 盒进行。
1.5统计学处理计量资料以均数±标准差( ±s ) 表示,用SPSS13.0统计软件处理,多组比较进行单因素方差分析及两两比较q检验,两组间比较采用t检验。
2结果
2.1神经功能缺失评分假手术组无神经功能障碍表现。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组神经功 能缺失评 分与缺血 再灌注组 比较明显 降低 (P <0.01)。Ply预处理组神经功能缺失评分明显降低,与ASA预处理组比较明显降低(P <0.05)。详见表1。
2.2血清NSE含量脑缺血再灌注组血清NSE含量与假手术组比较明显升高 (P <0.05)。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较血清NSE含量降低(P <0.01)。Ply预处理组血清NSE含量与ASA预处理组 比较明显 降低 (P <0.05)。详见表1。
2.3脑梗死体积假手术组无肉眼可见的梗死灶形成。脑缺血再灌注组大鼠均表现不同程度的梗死灶形成。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较梗死体积缩小(P <0.01)。Ply预处理组 梗死体积 与ASA预处理组 比较明显 缩小 (P <0.05)。详见表1。
2.4脑组织IL-1β和TNF-α含量脑缺血再灌注组脑组织IL-1β和TNF-α含量与假手术组比较明显升高(P <0.01)。 缺血预处 理组、ASA预处理组 及Ply预处理组 与脑缺血 再灌注组 比较病变 侧脑组织IL-1β和TNF-α含量降低 (P <0.05)。Ply预处理组脑组织IL-1β和TNF-α含量与ASA预处理组比较明显降低 (P <0.05)。详见表2。
ng/mL
3讨论
BIP是指对脑组织采用机械刺激,如一次或多次短暂性脑缺血再灌注后,使其对以后较长时间的缺血性损伤产生IT[1]。其机制之一为抑制缺血后的炎症反应,诱导脑组织产生内源性保护作用,减轻缺血再灌注所致的神经损伤。本实验发现,提前给予BIP可以使再次缺血时神经功能缺失减轻,梗死体积缩小,血清NSE含量下降,均较缺血再灌注损伤组有统计学意义 (P <0.01)。近年来发现预先给予一些药物也可诱导IT,此现象称为药物预处理[2],研究表明ASA具有这种作用。提前给予ASA预处理可同样使再次缺血时神经功能缺失减轻,梗死体积缩小,血清NSE含量下降,均较缺血再灌注损伤组有统计学意义(P <0.01)。
炎症反应可能在缺血再灌注损伤及脑IT中具有重要意义,抗炎治疗可减轻缺血再灌注所致的神经损伤[6]。Ply属蓼科植物大黄的根及根茎所含的蒽醌衍生物之一,可通过血脑屏障,并具有很强的抗炎作用。 已有前期研究证明Ply通过抗炎机制而起到脑保护作用[4],但对IT的影响报道尚少见。本实验发现,提前给予Ply预处理可以使再次缺 血时神经功能缺 失减轻,梗死体积缩小,血清NSE含量下降,均较ASA预处理组有统计学意义(P <0.01),中药Ply亦可诱导IT产生脑保护作用,效果优于ASA。
脑缺血后的再灌注损伤是一系列复杂的病理过程,主要与氧化应激反应、能量代谢障碍、炎性反应、兴奋性氨基酸释放、细胞凋亡及突触传递受阻等有关[7]。 其中炎性级联反应是一个重要的损伤机制,各种炎症因子的释放在损伤机制中起着重要作用,一方面促进炎性细胞黏附于微血管内皮细胞,机械性堵塞微循环通道,影响组织的血流供应;另一方面促进相关炎性因子释放,导致白细胞在缺血区浸润和聚集,活化的白细胞在缺血区可释放大量毒性氧自由基、蛋白水解酶等物质而进一步损伤局部组织血管,导致血管通透性增加而致组织水肿,加重组织损伤[8]。在炎性级联反应中以炎性细胞因子(如IL-1β、TNF-α)表达上调为首发特征,IL-1β、TNF-α作为炎症反应的起始因子,检测其含量对衡量脑缺血再灌注损伤有重要意义[9]。本实验采用放射免疫分析法动态观察了不同预处理方式对大鼠脑缺血再灌注侧脑组织IL-1β和TNF-α含量的变化。结果发现,缺血再灌 注脑组织 中IL-1β和TNF-α含量明显 升高 ,且均高于 假手术组 (P < 0.01)。缺血预处理组、ASA预处理组及Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较病变侧脑组织IL-1β和TNF-α 含量降低 (P <0.05)。该结果与相关 报道一致[10]。 表明IL-1β、TNF-α参与了脑缺血再灌注损伤的发生, 在脑缺血性疾病的发生、发展和转归中起一定的作用。 而不同方式的预 处理可能 通过降低IL-1β和TNF-α 在病灶侧的过度表达,并对随后发生的脑缺血再灌注损伤起保护性作用。
通过对不同方式预处理的比较,药物预处理具有相对安全、方便、易于控制剂量的优点,且中药Ply具有更加广阔的发展前景。本实验有可能对临床缺血性脑血管病的防治提供新的依据。
摘要：目的 探讨不同预处理方式,即缺血预处理及药物预处理(阿司匹林及中药大黄素甲醚)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及可能的作用机制。方法 SD大鼠随机分为5组,分别为假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组、阿司匹林预处理组及中药大黄素甲醚预处理组。各组以线栓法建立大鼠左侧大脑中动脉缺血再灌注损伤及缺血预处理实验动物模型,给予各组大鼠不同预处理方式,比较各组神经功能缺失评分、脑梗死体积、血清神经无特异性烯醇化酶(NSE)含量及脑组织白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果 脑缺血预处理、药物预处理均可使神经功能缺损减轻、脑梗死体积缩小、血清NSE含量降低,且药物预处理中大黄素甲醚预处理较阿司匹林预处理效果更为明显,同时脑组织IL-1β和TNF-α含量降低亦更为明显。结论药物预处理与缺血预处理同样可诱导脑缺血耐受现象,对局灶性脑缺血再灌注损伤起到保护作用,且中药大黄素甲醚效果更加明显,其机制可能与下调脑组织再灌注损伤时IL-1β和TNF-α的表达有关。
脑缺血预处理 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
本研究通过本院伦理委员会批准, 患者均签署知情同意书。选择桂东人民医院2012年行胸腔镜体外循环心脏手术的患者36例, 其中男17例, 女19例;平均年龄 (39.5±12.3) 岁;平均体质量 (56.4±11.5) kg;美国麻醉医师协会分级 (ASA) Ⅱ~Ⅲ级;手术方式:房间隔缺损修补术8例, 室间隔缺损修补术2例, 右房室瓣成形术6例, 左房室瓣成形术2例, 左房室瓣置换术15例, 左房黏液瘤摘除术3例。采用随机数字表法将患者分为试验组和对照组, 每组18例。试验组中男8例, 女10例;平均年龄 (39.8±12.4) 岁;平均体质量 (56.7±12.5) kg。对照组中男9例, 女9例;平均年龄 (40.5±13.6) 岁;平均体质量 (55.9±11.9) kg。两组患者的一般资料比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 方法
试验组给予肢体远隔缺血预处理, 具体方法为[1]:在体外循环前将止血带缠于右上臂靠近腋窝处, 充气至200mm Hg (1mm Hg=0.133k Pa) , 持续5min, 阻断右上肢血供, 持续放气5min, 恢复右上肢血供, 如此循环3次。对照组不给予肢体远隔缺血预处理。两组患者麻醉、手术和体外循环方法相同。监测桡动脉压、中心静脉压、心电图、脉搏血氧饱和度、呼气末二氧化碳分压、鼻咽和直肠温度。采用咪达唑仑、芬太尼、丙泊酚、顺式阿曲库铵进行麻醉诱导, 左侧双腔气管插管机械通气, 以芬太尼、丙泊酚、顺式阿曲库铵维持麻醉。经右侧颈内静脉插管至上腔静脉、经右侧股动静脉插管建立外周体外循环, 手术完成后松开升主动脉阻断钳, 心脏复跳后行左侧单肺通气。术中常规监测中心静脉压、心电图、静脉血氧饱和度、尿量、血气分析指标、电解质、平均动脉压等。
1.3 观察指标
分别在体外循环开始前 (T1) 、体外循环开始后30min (T2) 、体外循环结束后2h (T3) 、体外循环结束后24h (T4) 、体外循环结束后48h (T5) 等时间点抽取颈内静脉血2ml, 5000r/min离心10min, 取上清液置于EP管, 置于-80℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 测定血清S100B蛋白、NSE水平, 试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供。检测方法严格按照试剂盒使用说明书, 反应完毕后在波长492nm处读取吸光度值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理, 计量资料以±s表示, 重复测量数据的比较采用重复测量方差分析;计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
两组患者T1时点S100B蛋白和NSE水平比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) ;试验组T2、T3、T4、T5时间点S100B蛋白、NSE水平低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。与T1比较, 两组患者T2、T3、T4、T5时间点S100B蛋白、NSE水平均升高, 差异有统计学意义 (P<0.01, 见表1) 。
注:与同组内T1比较, *P<0.01;与对照组比较, △P<0.01
3 讨论
S100B蛋白具有高度神经元特异性, 由于其主要存在于脑组织中, 因而被认为是脑特异性蛋白, 可应用于心脏手术围术期神经系统损害的监测, NSE是神经元和神经内分泌细胞内一种糖酵解酶, 特异性定位在神经元和神经内分泌细胞内, 在正常体液中S100B和NSE波动范围小, 呈相对稳定性, 神经元损伤和血-脑脊液屏障完整性被破坏后, S100B蛋白、NSE释放到脑脊液, 随后进入血液循环, 导致血中浓度升高[3]。研究表明, 血清S100B蛋白、NSE水平与在脑脊液中的水平存在高度相关性, 可确切反映脑组织损伤的程度, 因此联合检测S100B蛋白水平和NSE水平是判断围术期脑损伤程度的一种较好的方法[3]。
本研究结果显示, 从T2开始, 患者血浆中S100B蛋白水平、NSE水平即升高并呈上升趋势, 提示体外循环早期已造成患者的神经系统一定程度的损伤, 并且这种神经元缺氧性损伤是持续性的、进行性的。其原因可能是因为体外循环是一个非生理性的体外氧合和循环过程, 可造成脑部缺血再灌注损伤;另外血栓、气栓、炎性反应、氧自由基的产生等可导致微循环障碍, 加重脑组织缺血缺氧[4]。
有学者对需行心脏手术的先天性心脏病患儿在术前5~10min实施了远隔缺血预处理, 结果患儿心脏功能、肺功能和全身炎性反应等多项指标均显著优于对照组[5]。本研究也显示采用远隔缺血预处理患者S100B、NSE水平升高的幅度显著降低, 提示远隔缺血预处理对血清S100B蛋白、NSE水平的升高具有明显的抑制作用。目前远隔缺血预处理的脑保护确切机制尚不清楚, 有学者认为, 可能有神经、体液及免疫等多种机制共同参与[6]。
总之, 肢体远隔缺血预处理临床可行性、可控性高, 创伤风险小, 对改善胸腔镜体外循环心脏手术后的肺功能、进一步提高微创心脏手术的效果具有一定的价值。
摘要：目的 探讨肢体远隔缺血预处理对胸腔镜体外循环心脏手术的脑保护作用。方法 选择桂东人民医院2012年行胸腔镜体外循环心脏手术的患者36例, 随机分成试验组和对照组, 每组18例。试验组给予肢体远隔缺血预处理, 对照组不给予特殊处理。分别在体外循环开始前 (T1) 、体外循环开始后30min (T2) 、体外循环结束后2h (T3) 、体外循环结束后24h (T4) 、体外循环结束后48h (T5) 等时间点抽取颈内静脉血测定血清S100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶 (NSE) 水平。结果 与T1比较, 两组患者T2、T3、T4、T5时间点S100B、NSE水平均升高, 差异均有统计学意义 (P<0.01) ;试验组T2、T3、T4、T5时间点S100B、NSE水平低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。结论 肢体远隔缺血预处理对胸腔镜体外循环心脏手术具有一定的脑保护作用, 是一种简单、有效的脑保护方法。
关键词：体外循环,胸腔镜检查,远隔缺血预处理
参考文献
[1] 雷迁, 曾庆诗, 罗沙, 等.肢体远隔缺血预处理对胸腔镜体外循环心脏手术的肺保护作用[J].实用医学杂志, 2013, 29 (11) :1754-1756.
[2] 王颖, 罗玉敏, 朱榆红, 等.远隔器官缺血预处理对脑缺血的保护作用[J].国际脑血管病杂志, 2009, 17 (3) :215-219.
[3] 谷兴华, 张供, 张希全, 等.清蛋白B亚型和神经元特异性烯醇化酶对早期判断体外循环术后脑损伤的意义[J].中华医学杂志, 2007, 87 (14) :975-977.
[4] 景桂霞, 郑兰兰.远程缺血预适应对体外循环心脏瓣膜置换术患者脑损伤的保护作用[J].西安交通大学学报:医学版, 2011, 32 (4) :473-476.
[5] Dave KR, Saul I, Prado R, et al.Remote organ ischemic preconditioning protect brain from ischemic damage following asphyxia cardiac arrest[J].Neurosci Lett, 2006, 404 (1-2) :170-175.
脑缺血预处理 篇6
1 材料与方法
1.1 实验材料
Wistar健康雄性大鼠体重200~250 g;抗大鼠HSP70抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;SOD和MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 模型制备方法
1.2.1 实验组模型制备
大鼠实验前禁食12 h, 自由饮水, 10%乌拉坦腹腔注射麻醉, 麻醉后, 将数字温度计的温度传感探头插入大鼠直肠内约6 cm, 其后将大鼠置于电热恒温培养箱中加热, 监测其直肠温度在 (42±0.5) ℃, 维持15 min后停止加热。动物恢复12 h后, 再次用10%乌拉坦腹腔注射麻醉, 手术刀切开颈正中皮肤, 分离并用无损伤血管夹夹闭左侧颈总动脉10 min, 再灌注12 h后迅速断头取脑。
1.2.2 对照组模型制备
动物饲育条件及处理过程同前, 但不进行加热。其后进行脑缺血再灌注模型制备 (过程同前) 。
1.3 观察指标
1.3.1 脑组织HSP70表达的测定
采用链酶亲和素-生物素-酶复合物 (SABC) 法。阴性对照采用PBS代替一抗。
1.3.2脑组织SOD活性、MDA含量的测定
采用黄嘌呤氧化酶法测定脑组织SOD活力;硫代巴比妥酸法测定脑MDA含量。具体操作按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒内操作指南进行。
1.4 统计学处理
使用SPSS 11.0软件进行分析, 计量资料以 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠脑组织HSP70的表达
脑组织切片经免疫组化染色后, HSP70阳性反应产物呈棕黄色颗粒, 胞浆和胞核均有表达。显微图像分析其光密度值发现, 热处理组HSP70表达显著高于对照组, 其平均光密度值为 (126.4±7.2) , 对照组为 (75.5±3.6) , 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 大鼠脑SOD活性和MDA含量的变化
两组动物脑组织的SOD活性均于缺血再灌注后降低, 热处理组SOD平均活力值为 (12.05±0.05) U/mg蛋白, 显著高于对照组 (6.73±0.99) U/mg蛋白 (P<0.05) , 而MDA平均含量值为 (0.28±0.17) mmol/mg蛋白, 显著低于对照组 (2.39±0.12) mmol/mg蛋白。两组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
脑缺血再灌注损伤在神经内科是一种常见病[5,6]。发生脑缺血再灌注后往往会通过增加血脑屏障通透性等而引起严重临床病理过程[7]。已有研究表明, 热处理可以预防和减少此类病理过程的进程和转归[8,9]。由于热处理过程本身操作简单且副作用小, 故此方法已经受到越来越到的临床工作者的重视。
热处理后机体发生的最显著的反应是产生HSP70。HSP70可能会通过与新合成的蛋白质结合, 保证蛋白质进行正确的折叠和聚集, 并作为辅助蛋白促进蛋白质的组装与运输。当机体受到应激等伤害性刺激而引起蛋白质变性、受损时, HSP70蛋白质又可通过促进SOD的合成来发挥其清道夫作用, 清除脑组织多余的自由基, HSP70甚至可以对轻微损伤的蛋白质进行修复并恢复其正常功能[10]。在本实验研究中发现, 经过热处理的脑组织, 其HSP70表达增多的同时SOD活力亦增加, 两者在时间上呈现同步性;而MDA的变化与前两者的变化方向正好相反, 且MDA可以反映组织细胞的受损程度, 即热处理后脑缺血再灌注损伤程度降低。由此提示, 热处理可能是首先通过促进细胞表达HSP70, 增多的HSP70可以进一步增加SOD的合成和释放, 两者共同通过清除氧自由基和修复损伤受损的细胞而实现其保护作用的。
综上所述, 热处理可以诱导脑细胞产生HSP70, 产生的HSP70可能会通过促进SOD的产生和修复损伤受损的脑细胞, 进而达到降低脑缺血再灌注损伤的作用。
参考文献
[1]Lindquist S, Craig E A.The heat-shock proteins[J].Annu Rev Genet, 1988, 125 (22) :631-677.
[2]Gilby K L, Armstrong J N, Currie R W, et al.The effects of hypoxiaischemia on expression of c-Fos, c-Jun and Hsp70 in the young rat hippocampus[J].Brain Res Mol Brain Res, 1997, 48 (1) :87-96.
[3]Yellon D M, Latchman D S, Marber M S.Stress proteins--an endogenous route to myocardial protection:fact or fiction?[J].Cardiovasc Res, 1993, 27 (2) :158-161.
[4]孙永建, 王前, 裴国献, 等.热应激预处理对大鼠肢体缺血后血清丙二醛、超氧化物歧化酶的影响[J].第一军医大学学报, 2002, 22 (6) :506-508.
[5]夏强, 钱令波.心脑缺血再灌注损伤的机制及防治策略研究进展[J].浙江大学学报 (医学版) , 2010, 45 (6) :551-558.
[6]乜全民, 张世明.大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬的初步研究[J].中国临床神经科学, 2010, 18 (1) :14-18.
[7]赵雅宁, 吴晓光, 李建民, 等.中药补阳还五汤对沙鼠脑缺血再灌注损伤及微循环障碍的治疗作用[J].四川大学学报 (医学版) , 2010, 41 (1) :53-56.
[8]Wang J L, Ke D S, Lin M T.Heat shock pretreatment may protect against heatstroke-induced circulatory shock and cerebral ischemia by reducing oxidative stress and energy depletion[J].Shock, 2005, 23 (2) :161-167.
[9]Zeeuw S, Lameris T W, Duncker D J, et al.Cardioprotection in pigs by exogenous norepinephrine but not by cerebral ischemia-in-duced release of endogenous norepinephrine[J].Stroke, 2001, 32 (3) :767-774.
脑缺血预处理 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物来源
SPF级健康 SD 大鼠 126 只,体重(250±50)g,广西医科大学实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK桂2003-0003,使用许可证号:SYXK桂2003-0005。
1.1.2 试剂来源
RNAprep pure(DP431)动物组织总RNA提取试剂盒(离心柱型)、TIANScript mRNA第一链合成试剂盒(KR104)、RNAstore样本保存液(DP408-01)均购自天根生化科技(北京)有限公司;EB溴化乙淀(M1421-1)购自上海凯博生物有限公司;西班牙琼脂糖(111860)购自上海川翔生物科技有限公司;MAP1B及β-actin引物均由生工生物工程(上海)有限公司设计合成,大小分别为292bp、432bp。
1.2 方法
1.2.1 药物制备
清热化瘀Ⅱ号方(水牛角、水蛭、赤芍、地龙、石菖蒲等 12 味中药组成) 单味中药浓缩颗粒剂,江苏省江阴市江阴天江药业有限公司生产,批号:0904099。给药容积为 14 mL/kg,其等效剂量按体表面积折算为 14 g/(kg·d)。
1.2.2 动物模型的制备
采用大脑中动脉二次线栓法[7]制备大鼠脑缺血预处理模型,结扎大鼠左颈外动脉远端和颈总动脉近端,将前端用火焰烧圆的尼龙线从颈总动脉残端插入,进线约18 mm～20 mm,大脑中动脉栓塞 (middle cerebral artery occlusion,MCAO) 后10 min抽出线栓,完成预缺血。3 d 后再次行 MCAO 2 h,规定时间点处死动物取脑。
1.2.3 分组及处理
SPF级健康 SD 大鼠 126 只,随机分为正常对照组、假手术组、脑缺血再灌注组、脑缺血预处理组、清热化瘀Ⅱ号方组。除正常对照组外每组按照再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 5个时间点平均分为5个亚组,每组6只,分别作如下处理。正常对照组不作任何处理,正常饲养。脑缺血预处理组MCAO 10 min 后抽出栓线,完成预缺血,3 d后再次行 MCAO 2 h,再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h处死大鼠。清热化瘀Ⅱ号方组:缺血预处理10 min 后,在大鼠麻醉清醒后 1 h 灌胃清热化瘀Ⅱ号方溶液,连续 3 d,每天上午、下午各 1 次。3 d后给予 2 h MCAO,大鼠手术醒后继续灌胃中药直至再灌注后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h处死大鼠。假手术组:以假手术代替预缺血及缺血再灌注,线栓只插入颈内动脉9 mm。脑缺血再灌注组:以假手术代替预缺血,线栓只插入颈内动脉 9 mm,其余步骤同脑缺血预处理组。
1.2.4 神经功能缺损评分
全部MCAO大鼠于缺血3 h后按时间点由1名不知情的实验观察员按Longa’s的5级神经功能缺损评分法进行评分。评分标准:正常,未见任何神经功能缺损表现为0分,垂直提起时前爪不能伸直为1分,行走时身体向右倾,向右侧旋转为2分,行走时身体向右侧跌倒为3分,不能自发行走或有意识障碍为4分。积分越高,动物行为障碍越严重。阻塞2 h后,评分1分以上方视为MCAO阻塞成功,即评分为1分～3分者纳入试验组,0分和4分者均被剔除,同时按要求及时补充大鼠入组。
1.2.5 取材及处理
实验前所有器械经0.1%DEPC水过夜浸泡,按照时间点将大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100g)腹腔注射麻醉,迅速断头取脑,取出后放置生理盐水中漂洗残血,取海马后用无RNase的手术刀片切成任何一边的最大厚度都小于0.5 cm的小块,放置在已放有10倍组织体积的 RNAstore样本保存液的无RNase离心管中,4 ℃静置过夜渗透,然后将组织从RNAstore中取出后放入-80 ℃保存备用。
1.3 RT-PCR法检测大鼠海马区神经细胞MAP1B表达
1.3.1 提取总RNA
按照动物组织总RNA提取试剂盒提取RNA,得到RNA溶液50 μL于-70 ℃保存。
1.3.2 引物和内参选择
反应中MAP1B上游引物为5′-TCCAACCTTGACAGACACAATC-3′,下游引物5′-TCCAGAAGCAGGACTTTCTTTC-3′,扩增产物为292bp。内参β-actin上游引物序列为5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′,下游引物序列为5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′扩增产物为432bp。
1.3.3 PCR反应步骤
分别以正常对照组及各实验组总RNA为模板进行反转录反应,反应体系及步骤参考试剂盒说明,反应结束后取反应液进行PCR,PCR反应体系20 μL,配制同试剂说明。反应步骤为:加入Taq酶1 μL,然后94 ℃30 s, 55 ℃30 s, 72 ℃60 s,循环30次,末次循环后均于72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物5 μL,15 g/L琼脂糖凝胶,于0.5×TBE缓冲液中, 70 V电压电泳, 溴化乙啶染色,凝胶成像仪成象并保存结果。用图像分析系统扫描定量并数码成像,使用AlphaVIEW SA软件测量各条带灰度值。
1.3.4 基因表达强度及其计算
采用目的基因灰度值与内参基因灰度值的相对比来表示目标基因的表达强度,即相对比=目的基因条带灰度值/β-actin条带灰度值,灰度值直接反映目的基因和内参条带的亮度,亮度与基因的量相对应。
1.4 统计学处理
对于RT-PCR凝胶条带灰度值的相对比经方差分析,在符合方差齐性的条件下,进行两因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 神经功能缺损评分
2.1.1 神经功能评价剔除例数
对实验造模各时间点后大鼠进行评分后,有4只评分不符合标准未纳入实验。解剖原因显示有2只为蛛网膜下腔出血,1只没有明显神经功能缺损,1只为未知原因死亡,考虑和感染或动物个体差异有关。
2.1.2 神经功能缺损评估结果
大鼠左侧大脑中动脉阻塞2 h再灌注后各时间点,正常对照组和假手术组均无明显神经功能缺损症状,评分为0分,差异无统计学意义(P>0.05);其余3组均出现神经损伤症状,表现为左侧Honer’s征,右前肢屈曲、内收;身体向偏瘫侧划圈,脑缺血再灌注组尤为显著(P<0.01)。缺血预处理组和清热化瘀Ⅱ方组与脑缺血再灌注组相比差异有统计学意义(P<0.01),其行为评分说明缺血预处理和清热化瘀Ⅱ方能改善大鼠神经损伤症状。详见表1。
2.2 MAP1B蛋白表达变化
RT-PCR分析结果显示,正常对照组和假手术组均有MAP1B mRNA表达,但差异无统计学意义(P>0.05),脑缺血再灌注组在12 h时缺血侧海马区MAP1B mRNA表达至高峰,随再灌注时间延长其表达逐渐下降,但与仍明显高于正常对照组(P<0.01);与脑缺血再灌注组相比,脑缺血预处理组在12 h、24 h、48 h时表达均有明显升高(P<0.01);与脑缺血预处理组相比,清热化瘀Ⅱ方组在48 h时表达水平进一步增高(P<0.05)。说明清热化瘀Ⅱ号方联合BIP有进一步上调MAP1B从而起到脑保护的作用。详见表2。
3 讨 论
神经再生是神经科学研究中的一项重要课题,也是临床医学上亟待解决的问题之一。探讨促进脑神经元突起的侧支再生与功能重塑的手段,以争取最佳的康复机会,是缺血性脑损伤康复研究领域的崭新课题,如能通过药物激发机体内源性物质对脑缺血发挥保护作用,则是神经保护的新途径,药物预处理被认为是比较适用于临床缺血性脑血管疾病的预防和改善预后的方法,在确认安全性的前提下,对缺血性脑血管疾病高危人群有相当的实用价值。西医在药物预处理研究取得了一定的进展,但尚未找到理想的预处理药物。而中药以其疗效明显、副反应小、多靶点的作用途径而成为缺血预处理研究的热点。
清热化瘀Ⅱ号方是以清热解毒,化瘀通络立法来治疗缺血性中风,解毒以对抗损害因素是为祛邪,通络以畅行气血是为扶正。方中水牛角清热化瘀、解毒,加之水蛭善破血逐瘀,地龙搜风通络,石菖蒲醒脑开窍。现代药理研究水牛角与犀角角蛋白中氨基酸种类含量相近,故方中用水牛角代替犀角,具有强心、镇静、解热等作用,可使血小板计数增加,凝血时间缩短。水蛭中含有的水蛭素抗血栓素、肝素样物质,能激活纤溶系统,促使已形成的纤维蛋白溶解而与抗血栓形成一致,石菖蒲对脑缺血再灌注损伤具有降低细胞凋亡率、抑制脑电活动和降低脑水肿的作用[8,9]。本方经临床实验证实是对脑梗死急性期有确切治疗作用的中药复方制剂[10,11,12],但其神经保护机制有待于进一步阐明。
微管相关蛋白(microtubule associatedproteins,MAPs)又称微管协同蛋白、微管维系蛋白,与微管网状结构的聚合、稳定及动力学特性相关。其中成员之一微管相关蛋白1B是微管间“桥”的主要成分,参与微管蛋白聚合成微管的过程,并使微管稳定聚合成束,从胞体延伸到轴突末端[13],而且对Schwann 细胞在轴突再生时形态的改变起一定的支持作用,即促进轴突的再髓鞘化等[14]。MAP1B在神经系统中的主要作用包括以下几个方面[1,2,4,5,6]:在神经系统发育阶段影响神经元的塑形和迁移;促进生长轴突的延长;引导轴突生长锥的生长方向;促进再生轴突的再髓鞘化等。目前国内外对MAP1B蛋白在神经损伤、脊髓损伤及脑缺血损伤等方面都有研究,MAP1B在神经系统的生长发育、再生中的功能有了一定的阐述,但其促进神经再生的具体机制仍不清楚。一般认为MAP1B主要通过磷酸化和非磷酸化形式的相互转化来调节轴突的生长。
本研究利用RT-PCR方法检测神经细胞轴突特异蛋白MAP1B mRNA表达量,了解MAP1B在大鼠脑神经细胞缺血及预处理过程中的表达情况,通过其表达量反映出细胞损伤及修复过程中神经突起的生长和增生状态,从而推断出清热化瘀Ⅱ号方对细胞突起的延伸和神经元生长的影响和促进作用。实验发现,脑缺血2 h再灌注12 h缺血侧海马区MAP1B mRNA表达至高峰,随再灌注时间延长其表达逐渐下降,而BIP干预后其表达在12 h、24 h、48 h时均有明显的升高,提示BIP可能通过影响MAP1B的表达而保护神经细胞,而联合清热化瘀Ⅱ号方预处理后MAP1B的表达进一步升高,提示清热化瘀Ⅱ号方联合BIP通过上调MAP1B的表达有可能通过促进突触再生和重塑而发挥缺血后脑保护的作用。这些结果可能为I/R损伤的治疗提供新靶点和新思路。
摘要：目的 观察清热化瘀Ⅱ号方对脑缺血预处理再灌注后大鼠脑内微管相关蛋白1B(MAP1B)的影响,探讨其对缺血性脑损伤神经元的保护作用机制。方法 SPF级SD大鼠126只,随机分为正常对照组(6只)、假手术组(30只)、脑缺血再灌注组(30只)、脑缺血预处理组(30只)、清热化瘀Ⅱ号方组(30只),除正常对照组外每组按照再灌注后3h、6h、12h、24h、48h5个时间点平均分为5个亚组,采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用RT-PCR法检测各时间点MAP1B蛋白表达变化。结果 正常对照组和假手术组均有MAP1BmRNA表达,但差异无统计学意义(P>0.05);脑缺血再灌注组在12h时缺血侧海马区MAP1BmRNA表达至高峰,随再灌注时间延长其表达逐渐下降,但与正常对照组相比仍明显升高(P<0.01);与脑缺血再灌注组相比,脑缺血预处理组在12h、24h、48h时表达均有明显的升高(P<0.01);与脑缺血预处理组相比,清热化瘀Ⅱ方组在48h时表达水平进一步增高(P<0.05)。结论 缺血预处理可能通过上调MAP1B的表达发挥神经保护的作用,而清热化瘀Ⅱ号联合缺血预处理进一步增强其保护作用。