食管鳞状细胞癌（共8篇）
食管鳞状细胞癌 篇1
CYFRA21-l (cytokeratin 19 fragments) 是细胞角蛋白19 (CK19) 的可溶性片段, 最早从肺癌患者血清中发现, 目前认为对肺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌, 尤其对非小细胞肺癌的诊断及预后判断具有重要价值[1,2,3]。Yamamoto等[4]于1997年首次报道了CYFRA21-l与食管鳞状细胞癌之间的关系。江苏泰兴地区为中国食管癌高发区之一, 其中90%以上为鳞状细胞癌。但目前尚未见到该地区CYFRA21-l与食管鳞状细胞癌 (食管鳞癌) 的相关研究报道。本研究通过与癌胚抗原 (CEA) 作对比, 探讨CYFRA21-1在泰兴地区食管鳞状细胞癌诊断中的应用价值。
1 对象与方法
1.1 对象
选择扬州大学第六附属医院 (泰兴人民医院) 2011年2月至2012年6月期间的食管鳞癌住院患者90例, 男57例, 女33例;年龄43~76岁, 平均63岁。排除可能影响肿瘤标志物水平的其他疾病与因素。所有患者入组时均为未经治疗的、经胃镜病理明确诊断为食管鳞癌。通过对该类患者的随访 (无论是手术、放疗、化疗) , 体检, 复查胸腹部CT、ECT等, 确认45例为淋巴结转移和 (或) 远处转移 (肝脏、骨、肾上腺转移等) 。选择本院健康体检者45例作为对照组, 其中男23例, 女22例;年龄45~70岁, 平均55岁。所有研究对象均为泰兴户籍, 在泰兴地区居住20年以上。
1.2 方法
对照组体检者, 初次诊断为食管鳞癌的患者, 体检和 (或) CT、MRI等提示淋巴结转移和 (或) 远处转移即病情进展者均空腹采集外周静脉血3 ml, 血液凝固后4 000 r·min-1离心15 min分离血清, 采用电化学发光法分别进行CYFRA21-1与CEA质量浓度检测。
1.3 仪器与试剂实验
选用罗氏ELECSYS 2010全自动电化学发光免疫分析系统, CYFRA21-1与CEA检测配套试剂由罗氏公司提供。CYFRA21-1参考临界值为3.3μg·L-1, >3.3μg·L-1为阳性。CEA参考临界值为10μg·L-1, >10μg·L-1为阳性。
1.4 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件建立数据库并进行统计分析。CYFRA21-1和CEA质量浓度在对照组与食管癌组、食管癌淋巴结转移和 (或) 远处转移组的均数比较采用t检验, 比较CYFRA21-1与CEA在初次诊断时及出现进展时阳性率的差异采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 对照组与食管癌组血清CYFRA21-1与CEA质量浓度
初次诊断为食管鳞癌的患者CYFRA21-1和CEA质量浓度明显高于对照组[分别为 (3.81±1.7) μg·L-1比 (1.15±0.68) μg·L-1, (7.36±3.5) μg·L-1比 (1.34±0.65) μg·L-1, 均P<0.05]。食管鱗癌进展组血清中CYFRA21-1和CEA质量浓度高于初次诊断时的质量浓度[分别为 (4.93±0.83) μg·L-1比 (2.04±0.29) μg·L-1, (16±2.96) μg·L-1比 (7.55±1.23) μg·L-1], 差异有统计学意义 (均P<0.05) 。
2.2 初次诊断时CYFRA21-1、CEA检测结果
90例食管鳞癌患者初次诊断时CYFRA21-1共检出51例阳性 (其中CEA阳性10例, 阴性41例) , 血清CEA共检出18例阳性 (其中CYFRA21-1阳性13例, 阴性5例) 。食管癌患者CYFRA21-1阳性率 (56.7%, 51/90) 高于CEA (20.0%, 18/90) , 差异有统计学意义 (χ2=25.59, P<0.01) 。
2.3 食管癌进展时患者的血清CYFRA21-1、CEA检测结果
45例食管癌患者出现病情进展[淋巴结转移和 (或) 远处转移]时血清CYFRA21-1共检出32例阳性 (其中CEA阳性12例, 阴性20例) , 血清CEA共检出12例阳性 (其中CYFRA21-1阳性8例, 阴性4例) 。食管癌进展组CYFRA21-1阳性率为71.1% (32/45) 高于CEA的26.7% (12/45) , 差异有统计学意义 (χ2=17.79, P<0.01) 。
3 讨论
食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤, 目前尚无统一的监测食管癌预后及疗效的肿瘤标志物。我国是食管癌高发区, 其中大部分经病理证实为食管鳞状细胞癌, 而欧美国家的食管癌大多为食管腺癌, 因此在诊断和治疗方面不能完全照搬美国国家综合癌症网络 (NCCN) 指南。食管癌在我国有明显的地理聚集现象, 高发病率及高病死率地区相对集中, 江苏泰兴地区是我国食管癌高发地之一。目前认为, CEA广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌中, 如胃癌、大肠癌、肝癌、胰腺癌等。有研究表明, CEA可作为食管癌诊断的辅助指标, 但经过本次试验临床实践检测, CEA在食管癌中的阳性比例相当低 (约20%) , 临床上一般作为联合检测的指标之一[5]。细胞角蛋白是构成上皮细胞内细胞骨架的中间纤丝类蛋白质, CYFRA21-1为CK19的可溶性片段, 在恶性上皮肿瘤中, 激活的蛋白酶加速了细胞的降解, 使大量可溶性的CK19片段释放, 造成组织液、体液中可溶性的CK19片段浓度升高。早在1997年就有报道认为, CYFRA21-1是食管鳞癌的有效的肿瘤标志物[4], 但近来研究较多的是其与非小细胞肺癌的关系[1,2,3]。
血清肿瘤标志物水平的动态变化和肿瘤病情有明显的相关性。肿瘤经过各种手段治疗后, 血液中肿瘤标志物水平下降, 是肿瘤好转的标志。本研究表明, 泰兴地区食管鳞癌患者CYFRA21-1和CEA在病情进展后明显高于初次诊断时以及对照组的水平, 且CYFRA21-1阳性表达率比CEA高得多。联合检测CYFRA21-1、CEA对食管鳞癌患者具有更好的诊断和预后判断价值[6,7]。
本研究观察到90例食管鳞癌患者初次诊断时和病情进展后血清CYFRA21-1阳性率均比CEA高, 说明血清CYFRA21-1对于食管鳞状细胞癌的诊断和预后判断都有一定的参考价值, 明显优于血清CEA。这并非我们独有的发现。Yamamoto等[4]研究了6株体外培养的食管上皮细胞和48例食管癌患者CYFRA21-1水平发现, 6个细胞株中5株的细胞质中都有细胞角蛋白19的表达, 并产生了可溶性的细胞角蛋白19片段;48例患者中有23例血清CYFRA21-1阳性, 对照发现CYFRA21-1阳性检出率明显高于鳞状细胞癌抗原 (SCCA) 、CEA, 表明其敏感性优于SCCA、CEA。在食管鳞状细胞癌患者的研究中, Kawaguchi等[8]对随访患者血清CYFRA21-1检测发现, 76.9%的肿瘤复发患者CYFRA21-1升高, 而69.2%的CYFRA21-1升高时间早于临床及X线表现1~13个月。Banki等[9]发现, CEA检测复发食管癌患者的敏感性为33%, 只有17%复发食管癌患者在有临床症状前CEA升高。本组食管癌进展组患者血清CYFRA21-1阳性率明显高于血清CEA的阳性率, 其升高越明显, 局部淋巴结转移和远处转移的发生率越高, 且进展后患者血清的CYFRA21-1水平较初次诊断时均有不同程度升高。
迄今为止, 对于食管癌的诊断、疗效评估和判断复发, 尚无标准的敏感性和特异性均优的肿瘤标志物。一方面, 我们要联合多种标志物一同检测, 提高肿瘤诊断的准确性;另一方面, 我们要通过临床实践, 寻找相对有效及敏感性高的标志物。通过本次研究, 我们发现, 在泰兴地区食管鳞癌患者中血清CYFRA21-1质量浓度高于正常者, 阳性率较CEA要高, 对于该类患者的诊断及预后判断具有重要的临床应用价值, 但是目前该地区在食管鳞癌的诊治中, 还未常规开展血清CYFRA21-1的检测。根据本次研究, 建议将血清CYFRA21-1作为食管鳞癌诊断及预后判断的标志物之一, 为CYFRA21-1的实际应用价值提供循证医学的证据, 以进一步提高食管癌的诊疗水平。另外, 食管癌分子靶向治疗是当前的研究热点[10]。本研究证实血清CYFRA21-1在食管鳞癌患者中水平随着病情进展而升高, 可进一步研究表达该蛋白的细胞信号通路, 在控制点进行阻断, 进而达到控制食管癌病情进展的目的。
摘要：目的:探讨细胞角蛋白19片段 (CYFRA21-1) 在食管鳞状细胞癌诊断中的应用价值。方法:采用电化学发光法分别检测健康对照组 (45例) 和初次诊断食管鳞状细胞癌患者 (90例) 血清中CYFRA21-1和癌胚抗原 (CEA) 质量浓度, 并对患者进行随访, 出现淋巴结转移和 (或) 远处转移者再次检测血清中CYFRA21-1和CEA质量的浓度。结果:食管磷状细胞癌组CYFRA21-1和CEA质量浓度明显高于对照组[分别为 (3.81±1.7) μg·L-1比 (1.15±0.68) μg·L-1, (7.36±3.5) μg·L-1比 (1.34±0.65) μg·L-1, 均P<0.05]。食管磷状细胞癌组出现淋巴结转移和 (或) 远处转移者CYFRA21-1和CEA质量浓度高于初次诊断时[分别为 (4.93±0.83) μg·L-1比 (2.04±0.29) μg·L-1, (16±2.96) μg·L-1比 (7.55±1.23) μg·L-1], 差异具有统计学意义 (均P<0.05) 。初次诊断食管鳞癌患者CYFRA21-1阳性率 (56.7%, 51/90) 高于CEA (20.0%, 18/90) , 差异有统计学意义 (χ2=25.59, P<0.01) ;出现淋巴结转移和远处转移的患者CYFRA21-1阳性率 (71.1%, 32/45) 高于CEA (26.7%, 12/45) , 差异有统计学意义 (χ2=17.79, P<0.01) 。结论:血清CYFRA21-1对食管鳞状细胞癌诊断和判断预后方面比CEA更优。
关键词：食管鳞状细胞癌,细胞角蛋白19片段,癌胚抗原
参考文献
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食管鳞状细胞癌 篇2
我3年前因患喉部鳞状细胞癌做了手术及相关治疗。经定期复查，未发现其他病变。目前主要症状是口干舌燥，浓痰特别多，有时堵在喉咙里喘不过气来；还有肺部一直感染，靠定期注射抗生素控制症状，牙齿也掉得差不多了，吃东西一不小心就掉进气管，只能吃稀饭、汤汁，致身体非常消瘦。请问：我这些症状还能治好吗？
泰和县 易××
易××同志：
你因喉部鳞状细胞癌手术切除病灶已3年了，经定期复查未发现其他病变，这说明治疗效果甚佳，目前无复发迹象。你来信诉说的几种症状，如口干舌燥、多黏稠浓痰、气喘不上来、吃东西进入气管、牙齿脱落等症都是手术及相关治疗的副反应，也可说是并发症。这些并发症是病灶术后喉内组织缺损引起的。从你所陈述的并发症来看还是较轻的，不应过于忧心。最严重的并发症甚至是出血。我现就你目前的情况，提供以下几点供你参考：
1.你应到医院五官科进一步检查，要复诊喉镜和CT照片检查，监测患部变化。
2.注意饮食。先保持流体进食，吃软食物，不要吃油炸、煎烤的食物，多吃绿叶蔬菜。我还要强调一下，由于此病的发生与吸烟、空气污染、病毒感染、雄激素升高、微量元素等密切相关，因此你在这些方面同样还应多加注意，防止加重病情。
3.预防和控制气管感染，进食要防止掉入气管。要保持和锻炼吞咽功能。
4.保持良好的心態，树立战胜疾病的信心。
教 授主任医师 陈声波
食管鳞状细胞癌 篇3
1 材料与方法
1.1 材料来源
在内蒙古医科大学第一附属医院病理科收集2010年~2012年ESCC石蜡包埋组织样本49例及正常食管黏膜组织45例。所有患者全部经手术治疗切除癌组织, 并经术后临床病理确诊。49例ESCC患者中, 男37例, 女12例;年龄40~74岁, 平均年龄59.3岁;按组织学分级, 低分化11例, 中分化25例, 高分化13例;按国际抗癌联盟 (UICC) /美国癌症联合委员会 (AJCC) 食管癌TNM分期标准进行临床病理分期, Ⅰ期加Ⅱ期18例, Ⅲ期加Ⅳ期31例。
1.2 免疫组织化学法
Pim-3抗体购于北京博奥森生物技术公司;Bax抗体购于武汉博士德生物技术公司;DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术公司。按照免疫组织化学SABC法进行操作, 实验步骤严格按照试剂盒要求进行。用已知阳性切片作为阳性对照, 用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定
阳性细胞表现为细胞质或细胞核出现了棕黄色或棕褐色颗粒。阳性分级标准根据细胞染色强度及阳性细胞百分比综合判断。染色强度评分:0分为无色, 1分为淡黄色, 2分为棕黄色, 3分为棕褐色。阳性细胞所占的百分比评分:0分为阴性, l分为阳性细胞≤10%, 2分为>10%且≤50%, 3分为>50%且≤75%, 4分为>75%。染色强度与阳性细胞百分比的乘积≤3分为阴性表达 (-) , >3且≤7分为弱阳性表达 (+) , >7且≤10分为中阳性表达 (++) , >10分为强阳性表达 (+++) 。
1.4 统计学方法
数据采用SPSS 13.0统计软件。各构成比化验采用卡方检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 Pim-3的免疫组织化学结果
2.1.1 Pim-3在ESCC与正常食管黏膜中的表达
Pim-3阳性表达显示为细胞质或细胞核染成棕黄色或棕褐色。Pim-3蛋白在ESCC与正常食管黏膜中的阳性表达率分别为77.6%与13.3%, Pim-3在ESCC中的表达较正常食管黏膜为高, 差异显著, 具有统计学意义 (P<0.05) 。 (见表1及附图1)
注:与正常组比较, *P<0.05。
2.1.2 Pim-3在ESCC中的表达与ESCC临床病理特征的关系
按照组织学分级与临床病理分期对49例ESCC进行统计分析, 结果显示:Pim-3蛋白在低分化、中分化、高分化与Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期中的阳性表达均无统计学意义 (P>0.05) 。 (见表2, 表3)
2.2 Bax的免疫组织化学结果
2.2.1 Bax在ESCC与正常食管黏膜中的表达
Bax阳性表达显示为细胞质染成棕黄色或棕褐色。Bax蛋白在ESCC与正常食管黏膜中的阳性表达率分别为67.4%与91.1%。Bax在正常食管黏膜呈现高表达, 与在ESCC中的表达相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。 (见表4及附图2)
注:与正常组比较, *P<0.05。
2.2.2 Bax在ESCC中的表达与ESCC临床病理特征的关系
按照组织学分级与临床病理分期对49例ESCC进行统计分析, 结果显示:Bax蛋白在低分化、中分化、高分化和Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期临床病理分期中的阳性表达差异无统计学意义 (P>0.05) 。 (见表5、表6)
3 讨论
Pim蛋白家族是编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的原癌基因, 包括Pim-1, Pim-2和Pim-3, 各成员因序列与结构具有同源性, 其生物学功能也明显重叠。在人体不同组织器官中分布较为广泛, 对其正常生长发育、分化等发挥重要作用。Pim蛋白家族具有促进细胞增殖和凋亡、诱导细胞周期进程、抑制细胞粘附及迁移等作用, 因此在肿瘤的发生发展中极其重要。研究显示用RT-PCR和免疫组织化学法检测到Pim-3在胃癌中的表达明显增高[2];人参皂苷Rg3的抗癌活性与其调节Pim-3以及磷酸化Bad蛋白的表达有关, Pim激酶可磷酸化Bad凋亡蛋白, 使其112位丝氨酸磷酸化而失活, 最终抑制胃癌细胞的凋亡[3]。Pim-3蛋白在肝癌组织中表达较高, 在高、中分化的结肠腺癌组织中呈高表达[4]。用免疫荧光法检测Pim-3蛋白在胰腺癌患者的腺上皮中表达阳性率达100%[5]。本研究结果显示Pim-3蛋白在ESCC中的表达明显增高, 提示Pim-3与ESCC的发生具有相关性;Pim-3蛋白的表达与ESCC的组织学分级和临床病理分期无关, 可能与样本量不足有关。
Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白成员, 由BH1、BH2和BH3 3个结构域构成[6]。正常情况下, Bcl-2和Bax在细胞内保持平衡, 如Bcl-2蛋白增多, 细胞长期存活, 如Bax蛋白增多, 细胞进入凋亡[7]。Bax基因突变的发生过程多在肿瘤中晚期, 突变的Bax基因所表达的Bax蛋白对肿瘤的形成和演进发挥一定作用。Bax可能通过以下途径发挥作用: (1) 在多种凋亡因子的调控下, Bax由胞浆迁移至线粒体, 其BH3结构域能够识别线粒体膜上的Bcl-2蛋白, 并与之结合形成Bax-Bcl-2异二聚体, 进而抑制Bcl-2的抗凋亡作用。 (2) 游离的Bax可直接在线粒体膜上形成Bax-Bax同二聚体, 改变线粒体膜的渗透性, 释放细胞色素C至胞浆, 启动细胞凋亡过程, 因此Bax是线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡的重要调节因子[8]。 (3) 线粒体途径或死亡受体途径可以传递凋亡信号。诱导细胞内Caspase活化, 活化的Caspase-3引起一系列级联反应, 最终引起细胞凋亡[9]。Bax蛋白则可以直接通过激活caspase信号转导途径发挥促凋亡作用。本研究提示Bax在正常食管黏膜中的表达明显高于ESCC, 这一结果说明Bax与ESCC的发生具有关联性, 参与食管鳞癌的形成与演化。Bax与ESCC的组织学分级和临床病理分期无相关性, 需进一步研究证实。
综上所述, Pim-3和Bax与ESCC的形成均具有关联性, 二者可能存在相互协同的作用, 共同参与ESCC的发生与发展, 但Pim-3和Bax与ESCC的组织学分级和临床病理分期的关系, 有待于深入研究, 以便进一步揭示二者在ESCC转归过程中的相关性。
摘要：目的:探讨Pim-3与Bax在食管鳞癌中的表达及其与食管鳞癌的相关性。方法:采用免疫组织化学SABC法检测Pim-3与Bax在食管鳞癌与正常食管黏膜中的表达。结果:Pim-3蛋白在食管鳞癌中的表达高于正常食管黏膜 (P<0.05) ;Bax蛋白在正常食管黏膜中的表达高于食管鳞癌 (P<0.05) 。Pim-3与Bax蛋白的表达与食管鳞癌的组织学分级与临床病理分期无关。结论:Pim-3及Bax与食管鳞癌的发生发展密切相关, 可能对食管鳞癌的转归有一定的临床意义;Pim-3及Bax与食管鳞癌的组织学分级和临床病理分期的关系有待进一步探讨。
关键词：Pim-3,Bax,食管鳞状细胞癌,免疫组织化学
参考文献
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食管鳞状细胞癌 篇4
关键词：芹菜素,食管鳞状细胞癌,顺铂,敏感性
食管癌是世界排名第6 位的致死性肿瘤[1],在我国则表现为第4 位致死性的肿瘤,在高发的省份如河南、河北和四川,其致死性居肿瘤第1 位[2]。 食管癌主要包括食管鳞状细胞癌(以下简称“食管鳞癌”)和食管腺癌两大类型,在我国食管癌病例中90%为食管鳞癌[3]。 相当多的食管癌患者在确诊时已经无法单纯通过外科手术根治,即使术前予以新辅助化疗,联合手术治疗的预后仍不佳,5 年存活率仅为20%[4]。 因此,如何提高食管癌放化疗有效性成为近年来食管癌的研究热点之一。 顺铂是食管鳞癌化疗方案中的一种重要化疗药物,其抗肿瘤作用在多年临床应用中已得到了较好的验证,但常规顺铂化疗剂量亦常常会导致消化道不良反应、过敏反应、肾毒性、骨髓抑制、神经毒性、耳毒性,使得顺铂的临床应用受到了一定的影响。如何降低顺铂的不良反应,同时保留其杀伤肿瘤的有效性,成为临床医务工作者和科研人员所关注的重要问题。
芹菜素(Apigenin)是一种广泛存在于水果和蔬菜当中的植物黄酮,食用安全性较好。 近年来已有多项研究报道,芹菜素具有抗感染、抗氧化和抗肿瘤等生物学活性[5]。 并且,芹菜素已被报道对多种肿瘤如乳腺癌、胃癌、结肠癌、皮肤癌、前列腺癌和血液系统等肿瘤细胞的生长具有抑制作用或引起肿瘤细胞的凋亡[5,6,7,8,9,10,11]。 但是芹菜素对食管鳞癌顺铂敏感性影响的研究国内外鲜有报道。 如果芹菜素可以增强食管鳞癌细胞对顺铂的敏感性,则有可能在临床中作为一种有效的辅助用药可以减少顺铂的用量,进而减少药物不良反应的发生。 因此,本研究使用芹菜素联合顺铂对食管鳞癌TE-1 细胞进行干预,采用体外药敏实验和细胞凋亡等实验观察联合芹菜素干预前后食管鳞癌TE-1 细胞对顺铂的敏感性改变, 初步阐明芹菜素在食管鳞癌细胞对顺铂药物敏感性中的作用和机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SDS -PAGE凝胶配制试剂盒、RIPA裂解液、PMSF、5X蛋白上样缓冲液、丽春红染色液、CCK-8 试剂盒和结晶紫(自碧云天生物技术研究所);RPMI 1640培养基和Hyclone胎牛血清(Hyclone公司);NC膜和ECL (Millipore);Hoechst染色试剂盒( 碧云天生物技术研究所);anti-β-actin一抗(sc-47778)和anti-GRP78一抗(sc-166490)(Santa Cruz Biotechnology);辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠和山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);cisplatin和pigenin(SIGMA-ALDRICH公司); 人食管鳞癌TE-1 细胞购自中科院上海细胞库。
1.2 实验方法
1.2.1细胞培养
培养TE-1细胞使用添加有10%胎牛血清和加入青霉素/链霉素的RPMI 1640。细胞置于含5%CO2的恒温培养箱内37℃培养。用于实验的细胞均处于对数生长期。
1.2.2 CCK-8生长曲线和药敏实验
使用胰酶消化细胞,培养液重悬,以5×103个/孔(生长曲线实验中为1×103个/孔)接种于96孔板,每孔加培养液200μL,细胞贴壁16 h后加入适当浓度药物进行体外药物敏感性检测,同时设置调零孔和对照孔,继续孵育72 h(生长曲线实验培养1~7 d);72 h以后(生长曲线实验则每天取出)取出96孔板,每孔加入CCK-8 20μL,孵育4 h;酶标仪检测吸光度并分析。1设置5、10、20μmol/L芹菜素干预组,仅加入同等浓度溶媒DMSO的细胞组作为对照组,观察不同浓度芹菜素对TE-1细胞的生长抑制作用。2设置加入0.000、0.008、0.040、0.200μg/m L顺铂的4个TE-1细胞组,每组细胞还分为加入0、5、10、20μmol/L的芹菜素,观察不同浓度芹菜素联合顺铂对TE-1细胞的杀伤作用。
1.2.3克隆形成实验
使用胰酶消化细胞,培养液重悬,以1×103个/孔的密度接种于24孔板,细胞贴壁16 h后加入适当浓度的药物进行体外药物敏感性检测,每隔3 d更换培养液,共培养14 d;之后,弃培养液,PBS洗3次;甲醇固定10 min,弃固定液,加入含0.5%结晶紫甲醇染色10 min,PBS洗3次;晾干培养板,用数码相机拍照,使用Photoshop CS3软件进行图像分析。设置1个加入0μg/m L顺铂TE-1细胞组和3个加入0.04μg/m L顺铂的TE-1细胞组,后3个组分别加入0、5、10μmol/L的芹菜素,通过克隆形成实验观察芹菜素联合顺铂对TE-1细胞克隆形成的影响。
1.2.4 Hoechst核染色凋亡检测
使用胰酶消化细胞,按1×106个/孔的密度接种于6孔板,细胞贴壁16 h后加入适当浓度药物,置于培养箱中孵育36 h诱导凋亡,弃培养液,固定液固定20 min,弃固定液,PBS洗2次,加0.5 m L Hoechst 33258染色液,避光染色5 min,弃染色液,PBS避光洗2次,抗荧光淬灭液封片,荧光显微镜观察并拍照。凋亡的判断方法:正常细胞的细胞核呈正常的蓝色,而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,颜色发白。凋亡率的计算方法:随机选择200倍镜下5个视野计算凋亡率,并取平均值。设置1个加入0μg/m L顺铂TE-1细胞组和3个加入0.2μg/m L顺铂的TE-1细胞组,后3个组分别加入0、5、10μmol/L的芹菜素,通过Hoechst 33258核染色实验观察芹菜素对TE-1细胞在顺铂作用下凋亡的影响。
1.2.5 Western blot
使用胰酶消化细胞,提取总蛋白,测定蛋白浓度,加入5X蛋白上样缓冲液加热5 min,SDS-PAGE蛋白电泳,将分离的蛋白湿转至NC膜,丽春红染色,裁剪,PBST洗膜3次,以5%脱脂牛奶PBST封闭1 h,封闭液稀释适当浓度的一抗后与条带在4℃过夜,PBST洗膜3次,用封闭液稀释适当浓度的二抗与条带室温下孵育1 h;PBST洗膜4次,加ECL溶液,暗室显影观察。设置3个加入0.2μg/m L顺铂的TE-1细胞组,分别加入0、5、10μmol/L的芹菜素,通过Western blot实验检测芹菜素对顺铂作用下TE-1细胞中GRP78蛋白表达的影响。
1.3 统计学方法
使用SPSS 17.0 统计软件进行实验数据分析,正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。 以P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 芹菜素对TE-1 细胞的抑制作用
CCK-8 实验结果提示,芹菜素对TE-1 细胞具有生长抑制的作用,且有明显的浓度依赖性。 见表1。
2.2 不同浓度芹菜素联合顺铂对TE-1 细胞的杀伤作用
使用不同浓度芹菜素联合低浓度顺铂共同作用于TE-1 细胞以后,CCK-8 药敏实验结果提示, 与单用顺铂比较,芹菜素可以显著增加食管鳞癌TE-1 细胞对顺铂的药物敏感性(P < 0.05),且这一作用随芹菜素浓度增加而增强,有浓度依赖性。 见表2。
注:与同浓度顺铂组的0.000 μmol/L芹菜素比较,*P < 0.05
2.3 芹菜素联合顺铂可显著减少TE-1 细胞的克隆形成
不同浓度芹菜素和顺铂作用于TE-1 细胞后,平板克隆实验结果提示, 与仅加入顺铂组克隆形成率(82.83%) 比较, 加入5 μmol/L的芹菜素以后,TE-1细胞克隆形成率明显减少(44.30%);进一步提高芹菜素浓度(10 μmol/L)后,TE-1 细胞克隆形成率出现进一步下降(29.77%),差异有统计学意义(P < 0.05),提示芹菜素可以增强顺铂对TE-1 细胞的杀伤作用。
2.4 芹菜素可明显增加TE-1 细胞在顺铂作用下的凋亡
Hoechst 33258 核染色结果显示, 与不加药对照组和仅加顺铂组相比,在芹菜素联合顺铂作用于TE-1 细胞后核浓染和碎裂的细胞显著增多(图1),且当加入的芹菜素浓度逐步增加后, 发生凋亡和坏死的细胞数目均进一步增多,差异有高度统计学意义(P <0.01)(图2),提示芹菜素促进了顺铂诱发的TE-1 细胞凋亡。
2.5 芹菜素可在联合顺铂作用下使TE-1 细胞GRP78的表达减少
Western blot检测结果提示,与单用顺铂组比较,TE-1 细胞在联合芹菜素作用后GRP78 蛋白的表达显著减少, 且这一作用随芹菜素浓度升高更加明显。见图3。
3 讨论
近年来,芹菜素作为天然存在于水果和蔬菜的一种植物黄酮,因其具有较强的抗炎、抗氧化和抗肿瘤等生物活性,受到了越来越多的关注。 在抗肿瘤方面,目前研究发现芹菜素可以通过多种途径抑制肿瘤的生长和促进凋亡的发生[5],提示其在抗肿瘤的临床治疗中具有较好的应用前景。 芹菜素曾被报道可以通过G2/M细胞周期阻滞和诱导凋亡而对食管鳞癌KYSE-510 细胞产生细胞毒性作用,具体机制与上调p21 和PIG3 及下调cyclin B1 有关[12]。 但是,芹菜素对食管鳞癌细胞化疗药物敏感性和应激抵抗的影响尚不清楚,芹菜素与顺铂联合在食管鳞癌治疗方面的研究也鲜有报道。
在本研究中,首先检测了芹菜素对TE-1 细胞的抑制作用,初步确定了芹菜素单独作用抑制细胞生长的能力;然后,在顺铂联合不同浓度的芹菜素干预下,发现芹菜素有助于提高顺铂对TE-1 细胞的杀伤性,且这一作用随芹菜素浓度增加而增强;进一步的凋亡检测结果提示,联合芹菜素可以增加顺铂导致的TE-1细胞凋亡;最后,在Western blot检测中还发现,芹菜素联合顺铂作用于TE-1 细胞后GRP78 的表达明显减少,提示抵抗应激能力的减弱可能也是芹菜素联合顺铂对TE-1 细胞杀伤作用增强的机制之一。
GRP78 是非折叠蛋白反应中一种重要的应激保护蛋白,也是膜蛋白和分泌蛋白正确折叠和组装的一种重要的内质网分子伴侣[13,14,15]。 诸如缺氧、营养物质缺乏和毒性物质导致的多种应激均可引起GRP78 的表达增加, 多个研究发现过表达的GRP78 存在于多种恶性肿瘤中,并可以导致肿瘤细胞对应激抵抗能力和化疗药物耐药性的增强以及促进侵袭和转移的发生[13,16,17,18,19,20]。 在本研究中发现小剂量芹菜素在联合较低浓度顺铂的作用下可以明显增强其抗肿瘤作用,并且这一作用与促进凋亡和引起应激保护蛋白GRP78 的表达减少有关,提示芹菜素很可能通过影响食管鳞癌细胞抗凋亡和对应激抵抗的能力,进而导致其对顺铂敏感性发生改变。 然而,引起这些作用的具体信号途径还有待进一步研究进行阐明。
食管鳞状细胞癌 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
入选对象标准:①术前均经纤维胃镜+活检确诊为食管鳞状细胞癌, 并且可完整切除者;②术前均没有接受针对恶性肿瘤的任何治疗;③没有其它部位癌症病史。④术后病理分期依据UICC2002年食管癌TNM分期标准。
排除标准:①术前接受过放疗、化疗等新辅助治疗;②早期病变较小, 取材受限制的患者。
2008年11月~2012年12月间河南省滑县人民医院胸外科收治的符合上述条件食管鳞状细胞癌患者167例。男性118例, 女性49例。年龄38~83岁, 平均58.6岁。167例患者均接受经左胸食管次全切、胃食管颈部吻合术。依据2002年UICC食管癌TNM分期标准:Ⅰ期5例, IIA期84例, ⅡB期21例, Ⅲ期57例。
1.2 细胞悬液制备
取新鲜肿瘤组织块 (大小约5 mm×5mm×5 mm) 及同样大小正常食管组织, 组织块置于冷藏的PBS溶液中反复洗涤去除坏死组织。机械法剪碎组织块, 然后在350目铜网挫洗并过滤, 最后通过显微镜观察将悬液细胞数调为2×106/L。 (另取少量细胞悬液滴入细胞计数池, 必要时做细胞染色, 以检查细胞数量及质量。)
1.3 流式细胞仪分析
首先用Flow-check进行光路-流路校准, 所有荧光信号及亮异系数均<2%, 以“门技术”确定淋巴细胞群, 再行阴性对照及颜色补偿, 每个样本检测5000个细胞。全部数据由流式细胞仪 (美国Bechman coulter公司, 型号为EPICSXL) 及软件SYSTEMⅡSOFTWARE V3.0获取和分析。
1.4 测量资料分析
以正常食管组织为参考, 计算DNA指数 (DI) 。DI在0.9~1.1之间为二倍体, 在此范围之外为异倍体。淋巴结转移率=发生淋巴结转移患者例数/总的患者例数×100%, 淋巴结转移度=阳性淋巴结枚数/清除淋巴结总枚数×100%。定量分析是指分析DI在食管鳞癌有无淋巴结转移两组患者间的差异;定性分析是指分析二倍体食管鳞癌与异倍体食管鳞癌淋巴结转移率和淋巴结转移度的差异。
1.5 统计学方法
经SPSS 10.0统计软件进行分析处理两样本均数的比较采用t检验、两样本率的比较采用χ2检验。检验水准取α=0.05。
2 结果
2.1 食管鳞癌患者异倍体出现率为81.44% (136/167) , 食管鳞癌在早期就已出现了DNA含量和倍体类型的改变。
2.2 有淋巴结转移组食管鳞癌DNA含量 (1.47±0.32) 明显高于无淋巴结转移组食管鳞癌 (1.34±0.34) 。 (t=2.53;P=0.012) 。
2.3 异倍体食管鳞癌淋巴结转移率和淋巴结转移度明显高于二倍体, 且异倍体食管鳞癌在早期即可出现淋巴结转移。见表1。
3 讨论
长期以来, 组织病理学诊断是肿瘤诊断的“金标准”和临床治疗的基础, 传统病理学诊断最大的弊端在于无法获得肿瘤的生物学特性。组织学类型、TNM分期都相同的肿瘤如果采取相同的治疗方案, 患者对治疗的反应和预后并不一致, 从而导致对某些肿瘤患者治疗过度, 而对某些肿瘤患者治疗不足。事实上, 恶性肿瘤是一类分子水平高度异质性的疾病, 组织学形态相同的肿瘤其生物学行为可能存在很大差异。对恶性肿瘤患者进行细胞DNA含量和倍体分析, 可以从核苷酸代谢水平上了解恶性肿瘤的生物学特性, 可以弥补病理形态学诊断的不足, 获得单纯从形态上难以得到的肿瘤生物学特征信息, 不仅为用形态学评估肿瘤生物学特征提供了有价值的补充, 反之也有助于提高对形态学的认识水平[2]。
DNA含量的变化可作为直接反映肿瘤增殖能力的重要生物学指标。细胞增殖取决于细胞核的DNA复制与细胞分裂, 细胞癌变的本质是细胞迅速无限增殖和转移, 测定细胞核DNA含量可作为恶性肿瘤指标之一[3]。胡艳萍等[1]研究发现:DNA含量高的非小细胞肺癌易出现纵隔淋巴结转移, 有淋巴结转移的DNA含量与无淋巴结转移的DNA含量有明显差异。本组研究结果显示:有淋巴结转移组食管鳞癌DNA含量明显高于无淋巴结转移组食管鳞癌, 且早期食管癌即可出现DNA含量的改变, 提示DNA含量和倍性的改变可能贯穿食管鳞状细胞癌发生发展的始终;DNA含量高的食管鳞癌增殖旺盛, 侵袭性强, 更容易发生淋巴结转移。这与国内外的相关研究结果基本一致[4,5]。更为重要的是, 由于高增殖活性的肿瘤对细胞周期特异性药物如5-FU较敏感, 检测肿瘤增殖活性可指导化疗药物的选择。因此测定食管癌患者癌细胞DNA含量, 并由此来判断癌细胞的增殖活性对食管癌术后辅助化疗亦有重要的指导意义。
非整倍体克隆的出现是恶性肿瘤侵袭的一个标记, 与肿瘤的恶性程度密切相关。王家祥等[6]认为测定肿瘤的DNA倍体等指标能了解其某些分子生物学特性, 从分子水平上了解其增殖活性, 对肿瘤的诊断及评估预后有一定的意义。本组研究结果显示:异倍体食管鳞癌淋巴结转移率和淋巴结转移度明显高于二倍体, 而且本组中2例T1期异倍体食管癌即发生淋巴结转移。提示DNA异倍体改变是判断食管鳞癌恶性程度的一个早期、客观的指标, 有助于发现那些有高度淋巴结转移倾向的食管癌患者。从这个意义上而言, 临床上对那些TNM分期较早的食管癌患者在评估预后, 指导术后合理的治疗方案时应该参考DNA分析结果等多个参考指标, 慎重考虑, 对那些DNA含量高, 增殖活性高, 分化程度较低的异倍体肿瘤患者, 由于其增殖旺盛, 容易发生转移, 建议这类患者接受合理的术后综合治疗或严密随访对减少术后复发转移的机会和改善预后有积极的意义[7]。
需要指出的是, 本组患者中共检出DNA多异倍体肿瘤12例, 即在同一个肿瘤组织中出现2个或2个以上具有不同DNA含量和增殖活性的细胞群体, 提示大家在制定术后放化疗方案时要同时考虑同一肿瘤组织可能同时存有具有不同生物学特性的细胞群体, 尽量选择联合用药或多种治疗措施相结合的综合的、个体化的治疗方案, 尽量减少某一细胞群体对某种药物或者治疗方法耐受的几率, 降低肿瘤复发和转移的可能。
摘要：目的 探讨DNA含量和倍体类型与食管鳞状细胞癌淋巴结转移的关系。方法 采用流式细胞技术对手术切除的167例食管鳞癌患者新鲜标本进行DNA分析, 计算DNA指数并判断倍体类型, 分析DNA含量和倍体类型与食管鳞癌淋巴结转移情况的关系。结果 ①食管鳞癌患者异倍体出现率为81.44%, 食管鳞癌在早期就已出现了DNA含量和倍体类型的改变;②有淋巴结转移组食管鳞癌DNA含量明显高于无淋巴结转移组食管鳞癌 (t=2.53;P=0.012) ;③异倍体食管鳞癌淋巴结转移率和淋巴结转移度明显高于二倍体 (χ2=4.06;P=0.044和χ2=7.23;P=0.007) , 且早期即可出现淋巴结转移。结论 DNA含量高的食管鳞癌和异倍体食管鳞癌更容易发生淋巴结。
关键词：食管,肿瘤,淋巴结,DNA含量,DNA倍体
参考文献
[1]胡艳萍, 贺兰湘, 于丁, 等.非小细胞肺癌细胞DNA含量与其生物学行为关系的初步研究.中华肿瘤杂志, 2003, 25 (1) :55.
[2]孙小蓉, 汪键.Alfred Boecking.DNA倍体分析系统用于宫颈癌及上皮内瘤变的诊断及预测.中华病理学杂志, 2005, 34 (7) :435.
[3]Haroske G, Baak JP, Danielsen H, et al.Fourth updated ESACP consensus report on diagnostic DNA image cytometry.Anal Cell Pathol, 2001, 23 (2) :89.
[4]李晓斌, 芳定珠, 林意, 等.食管癌DNA含量和细胞周期分析的临床意义.临床肿瘤学杂志, 2003, 8 (3) :166.
[5]Minervini A, Di Cristofano C, Collecchi P, et al.Intracapsular clear cell renal carcinoma:ploidy status improves the prognostic value of the 2002 TNM classification.J Urol, 2003, 174 (4 pt 1) :1203.
[6]王家祥, 夏宗江, 宋再, 等.肾母细胞瘤组织中DNA倍体、SPF、增殖细胞指数的测定.郑州大学学报 (医学版) , 2004, 39 (2) :222.
食管鳞状细胞癌 篇6
肿瘤的生长、浸润和转移是一个复杂的多步骤、多阶段的酶联反应过程, 涉及肿瘤细胞、宿主细胞及细胞外基质之间的一系列复杂多步骤相互作用。骨桥蛋白 (osteopontin, OPN) 是一种具有多种功能的分泌性钙结合磷酸化糖蛋白, 其中含有特异的与细胞黏附有关的RGD[精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (ArgGly-Asp) ]序列, 能与整合素, CD44 (cell adhesionmolecules CAM, 或者Cluster of differentiation 44, 丛集分化群第44号) , 特别是CD44拼接变异体6 (variant isoform 6 of CD44, CD44v6) 等结合来促进细胞的趋化、黏附和迁移, 在肿瘤的浸润和转移中起到一定作用[3]。本研究通过测定OPN和CD44v6在食管鳞状细胞癌中的表达情况, 探讨OPN和CD44v6与食管鳞状细胞癌的临床病理特征之间的关系, 从而为食管鳞状细胞癌的浸润、转移机制提供理论依据, 以期能成为预测、监测食管鳞状细胞癌复发、转移及判断预后的诊断指标之一。
1 材料与方法
1.1 临床资料
选取山东省青岛市中心医院2011年1月~2011年12月经手术切除并经病理证实的食管鳞状细胞癌标本54例, 入选条件为:本院首诊的食管癌患者, 所有患者取病理之前未接受过化疗和放疗;均具有完整的临床资料和病理资料。其中男性37例, 女性17例;年龄38~78岁, 中位年龄58.5岁;高分化鳞癌14例, 中分化鳞癌18例, 低分化鳞癌16例, 未分化癌6例。采用2009年国际抗癌联盟 (UICC) 食管癌TNM标准:T1癌组织浸润深度为黏膜固有层及黏膜下层14例;T2癌组织浸润固有肌层20例;T3癌组织浸润纤维膜16例;T4癌组织有远处转移4例。淋巴结转移24例, 无淋巴结转移30例。每例标本均取原发灶癌组织及距癌灶5 cm以上的食管正常组织, 同时经病理确定26例标本距离癌组织边缘3 cm以内存在不典型增生, 所有标本均用10%的福尔马林液固定, 常规石蜡包埋连续切片, 厚度4μm, 分别做HE染色和免疫组织化学染色。
1.2 试剂
兔抗人CD44v6单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;鼠抗人OPN单克隆抗体、免疫组织化学试剂盒及DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.3 实验方法
全部标本组织经10%中性福尔马林固定, 石蜡包埋, 4μm连续切片, 采用免疫组织化学SP法 (链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法) 。PBS替代一抗做为阴性对照, 已知阳性切片做为阳性对照。严格按照实验试剂盒说明书步骤进行。
1.4 结果判定
OPN主要在细胞胞浆内表达, 呈棕黄色或棕褐色颗粒, 胞膜时有表达;CD44v6染色主要分布于细胞膜, 呈棕黄色为阳性。观察阳性反应采用双盲法, 并由2位高年资病理科医师独立观察每张切片后一起做出判断。判断标准:每张切片随机选取5个高倍视野, 每个视野计数100个细胞观察阳性细胞染色强度, 计数阳性细胞百分数。按着色细胞百分数计分:着色细胞<10%为0分, ≥10%但<40%为1分, ≥40%但<70%为2分, ≥70%为3分。按着色强度计分:无着色为0分, 淡黄色为1分, 棕黄色为2分。将着色细胞百分数计分与着色强度计分相乘做为总计分。总计分0分为阴性 (-) , 1~3分为阳性 (+) , 4分以上为强阳性 (++) 。统计时以 (-) 判定为阴性, (+) 和 (++) 判定为阳性。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析, 免疫组织化学结果用χ2检验, 相关性分析用Spearman等级相关分析, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 OPN、CD44v6在正常食管组织、食管不典型增生组织及食管鳞状细胞癌中的表达
54例正常食管组织中OPN阳性表达11例, 强阳性表达7例, 阳性表达率33.33% (18/54) ;26例食管不典型增生组织中OPN阳性表达8例, 强阳性表达7例, 阳性表达率57.69% (15/26) ;54例食管鳞状细胞癌组织中OPN阳性表达27例, 强阳性表达10例, 阳性表达率68.52% (37/54) 。OPN在正常食管组织、食管不典型增生组织及食管鳞状细胞癌组织中表达逐渐增强, 其比较差异有统计学意义 (χ2=13.782, P<0.05) 。OPN在食管不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中表达均高于正常食管组织 (χ2=4.297, 13.375, P<0.05) , 但在食管不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中的表达差异无统计学意义 (χ2=0.094, P>0.05) 。54例正常食管组织中CD44v6阳性表达9例, 强阳性表达5例, 阳性表达率25.93% (14/54) ;26例食管不典型增生组织中CD44v6阳性表达8例, 强阳性表达5例, 阳性表达率50.00% (13/26) ;54例食管鳞状细胞癌组织中CD44v6阳性表达23例, 强阳性表达10例, 阳性表达率61.11% (33/54) 。CD44v6在正常食管组织、食管不典型增生组织及食管鳞状细胞癌组织中表达逐渐增强, 其比较差异有统计学意义 (χ2=13.874, P<0.05) 。CD44v6在食管不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中的表达均高于正常食管组织 (χ2=4.549, 13.599, 均P<0.05) , CD44v6在食管不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中的表达差异无统计学意义 (χ2=0.887, P>0.05) 。见表1。OPN、CD44v6在各组织中的表达见图1~6。
注:OPN、CD44v6在各组组织中的表达比较:1) 与正常食管组织比较, P<0.05;2) 与食管鳞状细胞癌比较, P>0.05
2.2 OPN和CD44v6的表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系
在食管鳞状细胞癌中, OPN和CD44v6的表达与患者的性别无关 (χ2=0.167, 0.697, 均P>0.05) , OPN和CD44v6的表达与患者的组织学类型、TNM分期和淋巴结转移有关。OPN和CD44v6在未分化-低分化食管鳞状细胞癌中的表达较中-高分化食管鳞状细胞癌中的表达明显升高, 差异有统计学意义 (χ2=5.902, 9.155, 均P<0.05) ;在食管鳞状细胞癌的TNM分期中, 随着浸润深度的增加OPN和CD44v6的表达也随之升高, 其差异有统计学意义 (χ2=7.840, P=0.049<0.05, χ2=10.480, P=0.015<0.05) ;有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌中OPN和CD44v6的表达较没有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌明显升高, 差异有统计学意义 (χ2=7.972, 11.627, 均P<0.05) 。见表2。
例
例
2.3 食管鳞状细胞癌中OPN和CD44v6表达的相关性分析
配对资料的Spearman相关分析显示, OPN和CD44v6在54例食管鳞状细胞癌中的表达呈正相关关系 (r=0.304, P=0.025<0.05) 。见表3。
3 讨论
OPN最早由SENGER等[4]从骨基质中分离出来的一种分泌型钙结合磷酸化糖蛋白, 具有广泛的生物学功能, 如细胞粘附、迁移、促血管生长作用、抑制细胞凋亡作用等。近年来, OPN与肿瘤的发生、发展, 特别是它与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注。KIM等[5]研究认为OPN通过与整合素和CD44受体结合调节细胞-基质间的分子信号传导参与肿瘤进展的各环节。ZHENG等[6]通过转染下调前列腺癌PC-3细胞中OPN的表达, 发现出现细胞生长停滞, S期阻滞及细胞凋亡。在乳腺癌细胞中, 过度表达的OPN能够刺激上皮-间质转变转录因子表达, 从而使乳腺癌细胞更具有侵袭性[7]。COPPOLA等[8]对一组包括头颈、食管、乳腺、肺、肝、胃肠、膀胱、子宫等全身实体肿瘤组织大宗病例OPN表达研究比较发现, OPN表达普遍增强, 尤其在胃肠、泌尿生殖和妇科系统, 且其表达程度与临床分期有关, 并与肿瘤病理分级密切相关。WU等[9]研究OPN在食管癌组织中的表达时, 运用低聚核苷酸微点阵技术和RT-PCR方法, 发现OPN在食管癌组织中的表达大约是正常组织的2倍, OPN m RNA的表达与临床分期密切相关, 分期越晚OPN m RNA的表达越高。本实验结果显示, OPN在正常食管组织、食管不典型增生组织及食管鳞状细胞癌的阳性表达率呈现上升的趋势, 其差异具有统计学意义, 同时, OPN在食管不典型增生组织及食管鳞状细胞癌的阳性表达均高于正常食管组织, 且差异具有统计学意义, 而在食管不典型增生组织和食管鳞状细胞癌组织中虽然OPN的表达升高, 但差异无统计学意义, 表明OPN的过度表达可能参与食管鳞状细胞癌的发生, 而且其参与过程可能在食管不典型增生阶段就已经发生, 因此, 推测早期检测, 特别是在食管不典型增生阶段同时检测组织中OPN水平, 有可能对患者的预后有一定参考意义。进一步的实验结果显示, 食管鳞状细胞癌中OPN的阳性表达与患者的性别无关, 随着组织分化程度的降低, OPN的阳性表达率升高;随着浸润深度的增加, OPN的阳性表达也随之升高;OPN在有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌中的阳性表达率显著高于无淋巴结转移者。说明OPN的表达与食管鳞癌的组织学分级、浸润深度、淋巴结转移均有关系, 提示OPN在食管鳞状细胞癌的浸润转移中扮演重要角色。
CD44v6是一种存在于细胞表面整合的跨膜糖蛋白, 是黏附分子家族成员之一, 许多研究证实, CD44v6在胰腺癌、胃癌以及膀胱移行细胞癌中表达升高, 可能参与肿瘤的浸润及转移过程[10,11,12]。另有研究表明[13], CD44v6的过度表达可使肿瘤细胞牢固地锚定在宿主细胞基底膜及细胞外间质中, 形成稳定的侵袭或转移。本研究发现, 与OPN类似, CD44v6在正常食管组织、食管不典型增生组织及食管鳞状细胞癌的阳性表达率呈现上升的趋势, 其差异具有统计学意义, 进一步的实验结果显示, 食管鳞状细胞癌中CD44v6的阳性表达与其组织分化、浸润深度及淋巴结转移有关。因此提示, CD44v6可能与食管鳞状细胞癌的发生发展密切相关。
在恶性肿瘤发生机制的癌基因研究中, 许多学者提出了基因协同作用假说, 认为在恶性肿瘤发生、发展和转移的各阶段, 至少有2个或2个以上功能不同的异常激活的基因各自发挥不同作用, 并在时问和空间上相互配合, 协同促进了细胞的癌变。GAO等[14]采用Western blotting方法检测Hep G2肝癌细胞株中OPN对CD44v6的影响, 结果发现OPN能上调CD44v6蛋白的表达, 这种调节表现为浓度依赖性和时间依赖性, 同时随着CD44v6的升高, Hep G2细胞粘附基质的能力增强。OUARINO等[15]通过免疫组织化学方法检测乳头状甲状腺肿瘤中OPN和CD44v6的表达, 研究发现OPN在甲状腺癌中呈高表达, OPN过表达促进甲状腺细胞的侵袭、转移, 用抗CD44抗体能阻断这一反应, 表明OPN和CD44v6表达可能具有一致性, OPN表达增强可能使CD44v6表达上调。本研究中发现, OPN和CD44v6在食管鳞状细胞癌中均有很高的阳性表达率, 且OPN与CD44v6呈高度正相关 (r=0.304, P=0.025<0.05) , 由此可推测OPN与CD44v6可能在食管鳞状细胞癌中通过协同作用在肿瘤的转录调控阶段, 激活某种信号传导途径, 使得CD44v6表达上调, 引起恶性细胞的趋化粘附和浸润迁移, 同时两者结合后可能使肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的识别和杀伤功能, 从而导致肿瘤的发生、发展和转移, 但具体机制尚不确定, 还待进一步研究发现。
综上所述, 本研究中发现在食管鳞状细胞癌中CD44v6和OPN均高表达, 且两者成正相关, 推测在食管鳞状细胞癌中两者通过协同作用在肿瘤的转录调控阶段通过某些相同的激活通道, OPN表达增强可能使CD44v6表达上调, 从而促进肿瘤的发生和转移, 且CD44v6与OPN高表达与食管鳞状细胞癌的组织学类型、浸润深度及淋巴结转移有关, 为临床上对肿瘤的监测及预后判断等提供了参考指标。进一步深入了解OPN与CD44v6在食管鳞状细胞癌浸润、转移过程中所发生的基因和分子变化的关系, 对开创肿瘤诊断和治疗的新局面非常必要。在治疗方面, 针对其受体从基因启动到信号传导途径的成功干预, 将有效地降低肿瘤的生物学恶性程度, 延长患者的生存时间, 提高其生存质量。
摘要：目的 检测骨桥蛋白 (OPN) 和CD44v6在食管鳞状细胞癌中的表达情况, 探讨OPN和CD44v6在食管鳞状细胞癌中的表达及其与食管鳞状细胞癌临床病理特征之间的关系。方法 采用免疫组织化学SP法 (链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法) , 对54例食管鳞状细胞癌组织、26例食管不典型增生组织及54例正常食管组织中OPN和CD44v6的表达进行检测, 探讨二者的表达与临床病理特征的关系, 并进行相关分析。结果 ①OPN和CD44v6在正常食管组织、食管不典型增生组织及食管鳞状细胞癌中表达逐渐增强, 比较其差异有统计学意义 (χ2=13.782, P<0.05;χ2=13.874, P<0.05) 。②在食管鳞状细胞癌中, OPN和CD44v6的表达与患者的性别无关 (χ2=0.167, 0.697, 均P>0.05) , 与患者的组织学类型、TNM分期和淋巴结转移有关 (χ2=5.902, 9.155, 均P<0.05;χ2=7.840, 10.480, 均P<0.05;χ2=7.972, 11.627, 均P<0.05) 。③OPN和CD44v6在54例食管鳞状细胞癌组织中的表达呈正相关关系 (r=0.304, P=0.025<0.05) 。结论 OPN和CD44v6在食管不典型增生组织、食管鳞状细胞癌中的高表达与肿瘤的发生及浸润性生长相关, 且两者在肿瘤侵袭性改变中可能起协同作用。二者联合检测可能为临床上对肿瘤的监测及预后判断等提供参考指标。
食管鳞状细胞癌 篇7
多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物耐药后,同时对多种结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药。研究表明:MDR-1基因编码的P-gp与CD44共同表达于MDR细胞膜上,P-gp与CD44之间有非常密切的关系,它们共同影响着肿瘤的多药耐药及侵袭[4]。目前,关于CD44与P-gp在肿瘤侵袭与多药耐药中所起作用的研究尚处于初期阶段,大量的工作有待进一步深入。
1 材料与方法
1.1 材料
收集我院及连云港市第二人民医院2000~2010年普外科收治的62例成人食管鳞状上皮细胞癌患者的术后标本。其中男性37例,女性25例,年龄42~75岁,所有的病人均未接受术前放化疗,术后病理诊断均为鳞状上皮细胞癌;其中高中分化48例,低分化14例;T1期9例,T2期20例,T3期22例,T4期11例;有淋巴结转移者36例,无淋巴转移者26例。
1.2 方法
1.2.1 标本切片用40g/L福尔马林液固定后用石蜡包埋。
将每例组织蜡块用3μm连续切片8张,其中1张用于HE染色行光学显微镜镜下诊断复查,另2张切片作P-gp和CD44免疫组化染色,其余备用。
1.2.2 试剂CD44,P-gp单克隆鼠抗人抗体购自e Bioscience公司,DAB显色试剂盒购invitrogen公司。
1.2.3 实验方法常规脱蜡,梯度酒精脱二甲苯,过氧化氢阻断
内源性过氧化物酶,PBS洗3次,小牛血清预处理,Ⅰ抗室温孵育1h,PBS洗3次,滴加二抗室温孵育30min,PBS洗3次,DAB显色。HE复染,梯度酒精脱水,二甲苯处理,封片,观察。PBS液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判断
CD44及P-gp阳性为棕黄色,均表达于细胞膜,每片随机选择4个高倍视野(100个肿瘤细胞/高倍视野),阳性细胞相加再除以400,得到肿瘤细胞阳性率。阳性细胞小于25%为阴性(-),25%~50%为阳性(+),50%~75%中等阳性(++),大于75%强阳性(+++)。
1.4 统计学处理
采用统计软件SPSS11.5进行统计学分析,进行两样本率比较的χ2检验及Spearman等级相关分析,P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 食管癌组织中CD44蛋白与P-gp表达情况
食管癌及癌旁正常上皮中CD44蛋白与P-gp表达的差异有统计学意义(P<0.001)(表1)。两者的表达存在联系(P=0.035)(表2)。
2.2 食管癌组织中CD44蛋白和P-gp表达与临床参数之间的关系
CD44蛋白的表达与患者的性别年龄无关,与肿瘤的分化程度,浸润深度,淋巴结转移相关。P-gp表达与患者的性别,年龄,分化程度无关,与肿瘤的浸润深度,淋巴结转移相关(表1)。在CD44蛋白和P-gp蛋白同时表达的17例患者,淋巴结转移率高达70.1%(12/17),而CD44蛋白和P-gp蛋白同时不表达的患者中只有15.7%(3/19)的病人发生淋巴结转移,两组差别有统计学意义(P=0.001)(表4)。
3 讨论
恶性肿瘤浸润及转移涉及肿瘤细胞之间及肿瘤与宿主之间的一系列复杂相互作用过程。肿瘤细胞之以能发生远处转移和扩散,浸润是前提和关键。CD44是一种广泛分布于细胞表面的黏附分子,它参与人体很多的病理生理学过程,与肿瘤侵袭,耐药,及预后具有密切关系[5~7]。Ranuncolo S等[8]在胶质瘤中发现CD44s在不同级别胶质瘤中均有表达,并且与肿瘤组织学分级有关。Toshiyuki M等[9]在发现透明质酸可以促使CD44在恶性瘤细胞表面脱落,并相互聚结。这种过程极有可能与恶性瘤细胞侵润和转移有密切关系。Kim H等[10]认为:透明质酸对于结肠癌细胞的侵袭是至为重要的,而且这种侵袭能力是需要透明质酸与CD44的相互作用。我们既往的研究揭示了CD44st的过表达促进了基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的分泌,进而增加乳腺癌细胞株MCF-7的侵袭能力[11,12]。
近年来有研究报道,CD44分子参与肿瘤的多药耐药,与肿瘤的耐药具有密切关系[12]。Miletti-Gonzalez KE[13]通过免疫共沉淀实验和共聚焦显微镜发现P-gp及CD44共同表达于多药耐药的MCF-7/Adr细胞株的细胞膜上;并且CD44s转染进CD44阴性的MCF-7细胞中导致了P-gp的表达。干扰HA-CD44结合所介导的信号传导,可以使肿瘤细胞对常用的化疗药物产生更好的治疗反应。
猕猴上皮鳞状细胞癌的诊断 篇8
1 材料与方法
1.1 临床观察
观察患猴的临床表现并做详细记录，用数码相机对该动物病变部位拍照。
1.2 病理组织学观察
活体采取该患猴臀部的增生组织块(直径约1 cm)，以10%中性福尔马林固定液固定，脱水，石蜡包埋，切片，HE常规染色，显微镜下观察并记录病理组织学变化，并用Nicon数码显微摄相机照相。
2 结果
2.1 临床观察
2010年6月底发现该猴臀部经常出血，遂隔离至检疫舍单独饲养;最初用双氧水、碘酊进行外伤清洗消毒，并用青霉素等药物做抗菌消炎处理，但治疗无效。2011年2月份左右，患猴精神、食欲尚佳，每天能正常采食约180 g饲料，随病程发展，患猴采食量渐减，身体逐渐消瘦，精神萎靡，被毛粗乱，腹泻。臀部皮肤增生呈凹凸不平的结节状，呈肉红色，蹲坐后易出血，且不易止血。增生范围几乎波及整个无毛区，用手触摸不易推动。当切除一小块病变区域后，生长速度急速。
2.2 病理形态学观察
增生组织表面有大量蓝染的细菌团块附着，皮肤正常结构不可见，被大量来源于棘细胞层的肿瘤细胞占据摧毁，形成不规则的巢状或条索状肿瘤细胞团块，间质中富含小静脉和毛细血管，少量巢状的癌细胞中央见有单个不全角化的细胞，肿瘤组织中见有坏死灶。在肿瘤细胞生长区域未见有毛囊、皮脂腺及汗腺等皮肤附属结构。肿瘤细胞异型性明显，细胞体积大小不等，并多见瘤巨细胞和多核瘤巨细胞，肿瘤细胞中的核仁肥大或见有多个核仁;病理性核分裂相多见，表现为双极不对称分裂、三极核分裂、或奇异型核分裂。瘤细胞连接较松散，部分区域可见细胞间桥。
3 讨论及分析
在病例中，猕猴的臀部皮肤恶性增生，组织的生长速度迅速，并伴有出血、坏死和溃疡的发生，抗菌抗炎治疗无效，结合其进行性消瘦的体征特点，初步推断其患有肿瘤性疾病，后经病理学诊断确诊为上皮鳞癌。
资料报道，根据癌细胞分化程度将皮肤鳞癌分为4级：Ⅰ级为分化成熟的鳞形细胞，具有细胞间桥和癌珠;Ⅱ级以棘细胞为主要成分，并具有明显的异型性，包括细胞体积增大、核大小不等，染色深浅不一、核分裂相多见，癌珠少见，且其中央有角化不全;Ⅲ级细胞分化差，表皮层大部分细胞排列紊乱，细胞体积增大，核大且异型明显，核分裂相多见，无癌珠，但有个别细胞呈角化不良;Ⅳ级为未分化型，无棘细胞，也无细胞间桥和癌珠，癌细胞小而呈梭形，核细长而染色深，伴有坏死和假腺样结构。
此次诊断中，病理组织学观察发现肿瘤细胞分化程度低，组织异型性和细胞异型性均明显，表现为与原发组织的形态差异大，细胞呈巢状分布，癌珠少见;细胞大小不等，瘤巨细胞多见，病理性核分裂相较多，具备恶性上皮鳞状细胞癌的特征。根据上皮鳞癌分级标准，恶性度应为Ⅱ级。