新生儿心脏病（精选6篇）
新生儿心脏病 篇1
摘要：目的 探讨新生儿先天性心脏病的筛查情况。方法 对我所2010年1月至2011年12月对2908例新生儿进行CHD筛查, 共筛查出26例CHD患儿的临床资料进行回顾性分析。结果 不同性别先天性心脏病发生率相比差异具有显著性 (P<0.05) 。房间隔缺损16例 (61.54%) , 室间隔缺损4例 (15.38%) , 动脉导管未闭3例 (11.54%) , 法洛四联征2例 (7.69%) , 右心双出口1例 (3.85%) 。结论 开展新生儿CHD筛查对于CHD早发现、早治疗、提高治疗效果具有重要意义。
关键词：新生儿先天性心脏病,筛查,临床分析
在我国, 一个严重影响国民整体素质提高的病种就是先天性心脏病, 因此, 在患儿出现其他更加严重的并发症之前, 如何尽早的发现患儿的心脏疾病并且及早的进行治疗成为当前临床需要解决的相当紧要的问题, 而且这对提高治疗的成效、减少患儿的死亡率也有很重要的意义。所以, 对新生儿先天性心脏病进行筛查具有很重要的价值。现对2010年1月至2011年12月对2908例新生儿进行CHD筛查, 共筛查出26例CHD患儿的临床资料进行回顾性分析报导如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
我所于2010年1月至2011年12月对2908例新生儿进行CHD筛查, 共筛查出26例CHD患儿。
1.2 方法
新生儿在出生以后直至出所之前由主治医师进行筛查, 如果发现疑似心脏病的患儿应该及时送到省级或以上医院进行超声心动图检测确认, 或者可以利用其他的检查方式进行确认。如果确诊患儿还有CHD则要纳入体弱儿管理中, 每个月要进行全面体检一次, 每年进行一到两次的心脏彩超检查, 在体检的过程中如果发现患儿的心脏杂音已经消失则通过心脏彩超进行复查。
1.3 筛查指标
青紫 (心源性) , 病理性心脏杂音, 原因不明的心衰, 与先心有关的综合征, X线胸片心脏异常。
2 结果
2.1 新生儿先心病发生率
2010年1月至2011年12月我所行新生儿CHD筛查2908例, 检出CHD26例 (0.89%) 。其中男性先天性心脏病10例 (0.34%) , 女性先天性心脏病16例 (0.55%) , 不同性别先天性心脏病发生率相比差异具有显著性 (P<0.05) 。其中2010年筛查1079例, 检出CHD 11例 (1.02%) , 2011年筛查1829例, 检出CHD 15例 (0.82%) , CHD的发生率无明显下降趋势 (P>0.05) 。
2.2 先天性心脏病类型
26例CHD患儿中, 房间隔缺损16例 (61.54%) , 室间隔缺损4例 (15.38%) , 动脉导管未闭3例 (11.54%) , 法洛四联征2例 (7.69%) , 右心双出口1例 (3.85%) 。
2.3 CHD患儿随访和治疗
筛查检出的26例CHD患儿, 根据病情, 选择最佳时期手术矫治。新生儿期手术治愈2例 (7.69%) , 婴幼儿期手术治愈12例 (46.15%) , 自愈4例 (15.38%) , 放弃治疗1例 (3.85%) , 现随诊7例 (26.92%) 。
3 讨论
3.1 对新生儿先天性心脏病进行筛查的意义
5岁以下儿童死亡的首要原因就是先天性心脏病, 该病的危害要远远高于其他的筛查新生儿疾病, 如果让先天性心脏病进行自然的转归, 大约会出现1/3～1/2的新生儿或者是婴幼儿时期具有严重的生命危险, 如果不能及时的对其进行手术治疗, 大多数患儿很可能会出现其他并发症例如肺炎合并心力衰竭、酸中毒或者是出现严重的缺氧情况导致患儿早死亡[1]。即便患儿能够度够婴幼儿时期, 也会由于继续发病导致手术治疗的机会渺茫, 虽然能够进行继续治疗, 但是此时会出现很多并发症, 死亡概率大大提高。一般大都会用超声心动图来对一部分患有先天性心脏病的胎儿进行前期的检查和发现, 不过四腔心加流出道观察却是检查胎儿是否患有CHD的首选办法, 但是该方法需要很高的技术水平, 目前还不能进行普及, 而且也无法检查出100%的胎儿心脏畸形状态, 因此在对胎儿的心脏进行检查的过程中只有在新生儿期进行严密的系统的跟踪随访才是最有效的措施。所以对新生儿进行CHD筛查能够尽早的发现病情并且治疗该病。
3.2 对新生儿进行CHD筛查的主要办法
当前在对新生儿的听力进行筛查时, 其筛查的覆盖率已经达到了100%, 所以可以在筛查听力的过程中进行新生儿的先天性心脏病筛查, 在初期可以通过利用临床体格检查或者是脉搏血氧的临床检测等, 如发现可疑先天性心脏病的新生儿则要立即通过超声心动图进行筛查。这样做能够有效的提高诊断出CHD的概率, 避免出现漏诊的现象[2]。在本研究中还可以看出, 跟其他的新生儿筛查疾病相比较, CHD的发病率更大、死亡率也更高, 具有很重要的筛查意义, 将CHD筛查归入到新生儿疾病筛查中, 将会对新生儿产生更大的益处。
3.3 如何预防新生儿的CHD
新生儿出现CHD病状主要与在胎儿时期接触的环境以及母体的遗传具有很大的关系, 在本研究中能够看出, 妇女怀孕期间如果受到感染、服用药物、长期处于辐射的环境中等将会加大新生儿患有CHD的概率。在本研究中, 通过搜集国内外的相关CHD研究成果, 利用流行病学对CHD进行调查和研究总结出造成新生儿患有CHD疾病的各种危险因素后, 对孕妇开展相关的教学, 对CHD的预防以及怀孕期间应该注意事项等进行普及和教育, 降低新生儿患有CHD的概率。通过研究发现新生儿患有CHD的概率有一定的下降, 不过没有太大的差异显著性。分析其主要的原因主要有: (1) 对引发CHD的危险因素的研究过程是一个持续时间长并且复杂多变的一项工程, 目前还需要对其他的因素进行不断的研究。 (2) 妇女还怀孕前期没有得到正规的教育和指导, 婚前检查没有做到位, 婚前没有做细致的保健方面的指导, 这也导致新生儿患有CHD的主要原因之一。
3.4 如何治疗新生儿的CHD
由于CHD的预后效果并不是很好, 因此很多相关的医疗学者在CHD病症上提倡尽早发现、及时诊断、尽早手术的观念。除了比较严重的CHD需要进行手术治疗以外, 一些相对来说比较简单的先天性心脏病也需要尽早的进行手术治疗, 例如动脉导管没有闭合可能会对新生儿正常的生长和发育造成不良的影响, 而且容易发生呼吸道感染症状、心力衰竭等并发症[3]。一旦确诊, 不管年龄和分流量的大小如何, 一定要进行尽早的矫正和治疗。在本研究中可以看出, 对CHD尽早发现及时治疗有很好的治疗效果, 明显的提高了新生儿的生存概率。近几年来, 医疗设备的更新以及医疗技术的改进能够很好的对CHD进行有效的前期治疗。对新生儿先天性心脏病进行筛查和随诊, 能够及时的发现新生儿的CHD病状, 并且尽早的对患儿进行治疗和手术, 所以越来越多的先天性心脏病患儿已经得到了及早的治疗, 一定程度上减少了由于CHD病状的新生儿死亡率, CHD的治愈率也逐渐提高, 我国人口的素质也会有显著的提高。
参考文献
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新生儿心脏病 篇2
1.先天性心脏病的种类很多，也很复杂，严重的先天性心脏病不及时治疗，早期死亡率较高。一般先天性心脏病中仅有少数类型的先天性心脏病可以自然恢复，有的则随着年龄的增大，并发症会渐渐增多，病情也逐渐加重。先天性心脏病的治疗方法有手术治疗、介入治疗和药物治疗等多种。另外，什么时候适宜手术应根据病情，请心脏专科医生针对患儿的具体情况提出建议，如孩子的病有无自愈的可能性，将来的病情演变趋势如何，指导合理用药，科学的护理，从而提高患儿的生存能力。先天性心脏病患儿抵抗力一般较差，容易生病，所以法定的预防接种也应按时进行。
2.目前超声心动图及彩色多普勒的应用，使近90%的先天性心脏病可以得到明确诊断，而免于导管及选择性心脏病造影的检查。但仅仅依靠超声心动图而忽视体检及其他资料的综合分析，亦可造成错误诊断。
导管及心脏病造影检查用于其他诊断手段难以确诊的心脏疾病，或伴严重并发症如重度肺动脉高压等为明确诊断及确定手术适应症，亦是必不可少的心脏病检查。
核磁共振、三维成像等技术亦是目前发展起来的新的心脏病检查手段。核磁共振对主动脉缩窄及大动脉疾病的诊断有重要价值。总之，如发现自己的孩子患了先天性心脏病，或可疑心脏病，在基层医院未能得到确切诊断，应到心脏病专科医院就诊。小儿心脏内科是专门对儿童及青少年时期先天性及后天性心脏病进行诊治的专业，不但可诊断心脏疾患，且可以指导您的治疗，包括外科手术的最佳时间及方法的选择。
新生儿心脏病 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
资料来源于2009年1月-2013年12月我院收治的60例先心病患儿的临床资料和彩超探查结果,其中,男性患儿37例,女性患儿23例;胎龄分布:胎龄≤37周10例,占16.7%,37周<胎龄≤42周42例,占70.0%,胎龄>42周8例,占13.3%;就诊时间:<1周35例,占58.3%,≥1周25例,占41.7%;本组60例患儿均经X线检查证实存在心血管畸形,且经手术治疗确诊为先心病。
1.2 临床表现
新生儿先心病的临床表现比较复杂,易合并多种并发症。本组60例患儿中,持续性紫绀17例,占28.3%,心脏扩大28例,占46.7%,心脏杂音43例,占71.7%,心力衰竭13例,占21.7%,呼吸衰竭5例,占8.3%,肺炎26例,占43.3%,21-三体综合征5例,占8.3%。
1.3 治疗方法
对本组60例患儿行常规抗感染治疗和洋地黄抗心衰治疗,对呼吸困难严重患儿及时行呼吸机辅助通气治疗。
1.4 仪器及方法
采用飞利浦HD11彩色多普勒超声检查仪进行彩超探查,探头频率在3.5-5MHz之间。指导患儿取侧卧位或在睡眠状况下进行,不需使用镇静药物,在心尖四腔心、五腔心及胸骨长轴切面进行探查,观察患儿各心室、血管的位置和形态以及各组织之间的相互关系。
1.5 统计学方法
采用统计学软件SPSS18.0对本次研究数据进行统计学分析;计数资料用χ2检验;P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 先心病患儿临床分型
本组60例患儿经X线检查和彩超检查,最终确定患儿的临床分型:(1)非复杂型41例,占68.3%。其中,室间隔缺损13例,房间隔缺损12例,动脉导管未闭12例,冠状静脉窦扩张4例;(2)复合型19例,占31.7%。其中,房间隔缺损合并动脉导管未闭14例,室间隔缺损合并血管转位2例,肺动脉狭窄合并房间隔缺损1例,肺动脉狭窄合并室间隔缺损1例,肺动脉狭窄合并右心发育不良1例。结果见表1。
2.2 非复杂型彩超探查结果
从上述临床分型中可以看出,41例非复杂型先心病患儿中,室间隔缺损发病率最高,其次依次为动脉导管未闭、房间隔缺损、冠状静窦脉扩张。非复杂型心脏病的分布情况:动脉导管未闭合并肺炎16例、动脉导管未闭合并湿肺11例、动脉导管未闭合并缺血性脑病5例、重症肺动脉狭窄4例、三尖瓣下移3例、弹力纤维增生2例。
2.3 复合型彩超探查结果
19例复合型先心病患儿均合并两个以上畸形。(1)完全性大动脉转位9例,占47.4%,男女比例为2:1.1,完全性大动脉畸形合并房间隔缺损2例、动脉导管未闭1例、单纯室间隔缺损1例、肺动脉瓣狭窄1例、完全性房室共道1例、右位心1例、肺动脉闭锁1例、无脾综合征1例,对其中5例进行手术治疗,结果与彩超检查一致;(2)肺动脉闭锁5例,占26.3%,男女比例为1.2:1,肺动脉闭锁合并单纯室间隔缺损3例、动脉导管未闭1例、房间隔缺损1例,对其中3例进行手术治疗,结果与彩超检查一致;(3)危重型法洛四联症3例,占15.8%,男女比例为1.2:1,动脉导管未闭1例、右室流出道狭窄1例(右室流出道内径2.5-5mm)、左右肺动脉发育不良1例(左肺动脉平均内径2.5mm、右肺动脉平均内径3mm),对3例进行手术治疗,结果与彩超检查一致;(4)完全性肺静脉异位引流2例,占10.5%,男女比例为1.1:1,完全性肺静脉异位引流合并单纯室间隔缺损1例、动脉导管未闭1例,对2例进行手术治疗,结果与彩超检查一致。
3 讨论
3.1 新生儿先心病的病因和临床诊治
临床研究表明,新生儿先心病的诱因主要是环境影响和遗传因素,妊娠早期用药不当会导致胎儿畸形,大部分药物被母体吸收后都可以经胎盘进入胎儿体内,影响胎儿的正常生长发育[4]。叶酸可有效防止胎儿神经血管畸形,孕妇应当摄入适当叶酸提高新生儿质量。此外,具有先心病家族遗传病史的孕妇或高龄产妇都会导致新生儿患有先心病,为此,可以通过羊水培养、超声心动图等产前检查项目及早发现胎儿先心病[5]。新生儿先心病是导致新生儿死亡的主要原因之一,如能对该病作出及时的诊断,则有利于降低病死率。新生儿先心病的诊断需要结合其临床体征、彩超检查、X线检查等进行综合诊断分析。对于新入院的新生儿,如在检查中发现其口唇发绀、喂养困难、呼吸困难等症状,除了考虑感染性疾病和窒息之外,还需考虑先心病的可能性,部分新生儿会伴随不同程度的心脏杂音,因此,应当及时进行彩超检查和X线检查等辅助检查项目[6]。
3.2 彩超探查筛查新生儿先心病的临床价值
新生儿大血管解剖结构的变化、心脏大小和位置变化等为新生儿的彩超诊断提供了检查基础[7]。对本次研究所选取的60例先心病新生儿行彩超检查,发现41例为非复杂型先心病、19例为复合型先心病,非复杂型以室间隔缺损发病率最高、复杂性为危重病型,以完全性大动脉转位为主,其余依次为肺动脉闭锁、完全性肺静脉异位引流,检查结果与手术治疗结果一致,说明彩超检查在新生儿先心病方面的诊断正确率较高,具有较高的诊断价值,值得临床推广。
参考文献
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新生婴儿心脏有杂音的原因有哪些 篇4
2、心脏杂音一般在孩子发热、哭闹、剧烈运动时较明显，安静时就减弱，这种心脏杂音不是心脏病、我们称其为“功能性杂音”或“无害性杂音”，对小孩的生长发育不会有影响。小儿生理性杂音一般最早出现在乳儿期，2～3岁的儿童增多，3～7岁最多。
3、患有先天性心脏病的小孩，其生长发育是和普通孩子不一样的，有的稍一活动，就心跳气喘，有的缺氧发绀。发现孩子心脏有杂音，父母不要过分紧张，否则会造成孩子一些精神上、心理上的负担，应该带孩子到医院进行检查
新生儿心脏病 篇5
1 资料与方法
1.1 资料来源
收集2005-2008年绍兴市5家出生缺陷监测医院出生缺陷监测资料。5家医院为绍兴市妇幼保健院、上虞市人民医院、上虞市妇幼保健院、上虞市第二医院、新昌县人民医院。
1.2 方法
根据《中国出生缺陷医院监测方案》,对上述监测医院内出生的妊娠满28周至出生后7天的围产儿,包括活产儿、死胎、死产进行监测,发现出生缺陷,填写《出生缺陷儿登记卡》上报。如诊断为先天性心脏病,要求填写其类型。先天性心脏病包括心腔和心连接的先天性畸形、心间隔先天性畸形、肺动脉瓣和三尖瓣先天性畸形、主动脉瓣和二尖瓣先天性畸形等。动脉导管未闭畸形不包括早产儿单纯动脉导管未闭和前列腺素治疗下的动脉导管未闭。
1.3 先天性心脏病类型
是根据“国际疾病分类ICD—10”分类统计。
2 结果
2.1 先天性心脏病的发生率。
2005年1月至2008年12月,5家医院共有围产儿数44 971例,发生出生缺陷1 053例,其中先天性心脏病390例,出生缺陷发生率234.15/万,先天性心脏病发生率86.72/万。在所有的出生缺陷中,先天性心脏病发生数位列第一。
2.2 该组母亲平均年龄27.97岁,先天性心脏病母亲年龄分组见表1。
<20岁组与20岁～组比较P≥0.05,无显著性差异。35岁～组与<35岁比较,χ2≈5.32,0.01
2.3 先天性心脏病发生的类型与伴发畸形。
390例病例中,有10例未经超声检查,或虽经超声检查,报告者不能提供相关资料,无法根据ICD-10分类。余下380例中,单一畸形217例,心脏复合畸形163例。380例先天性心脏病缺陷各类型发生情况统计见表2(复合畸形重复计数)。
本组资料390例先天性心脏病有25例合并有其他系统出生缺陷,占6.41%。伴发单种畸形的有20例:尿道下裂3例,小耳2例,马蹄内翻足2例,先天性脑积水2例,其他如腭裂、多指、双下肢胫骨骨折、右肺缺如、膈膨升、右侧室管膜下囊肿、皮肤血管瘤、小头畸形、十二指肠闭锁、肾囊肿、阴茎头囊肿各1例。伴发2种及2种以上畸形的5例:脑积水+腭裂1例,18三体+外耳其他畸形1例,右侧脉络膜囊肿+右肾发育不良1例,腭裂+染色体畸形+右肾缺如1例,直肠肛门闭锁+胸廓脊柱畸形+隐睾1例。
2.4 孕期相关因素。
2.4.1 孕早期患病史:
孕早期有疾病史的31例,占7.95%。其中上呼吸道感染20例,发热(>38℃)2例,乙肝(表面抗原阳性、e抗原阳性、核心抗体阳性)2例,泌尿系统感染2例,血小板减少1例,高血压合并肌无力1例,甲亢1例,口唇周围疱疹1例,双子宫1例。
2.4.2 孕早期用药史:
16例,占4.10%。其中青霉素4例,黄体酮和板兰根各3例,百服宁、小柴胡冲剂、抗甲亢药物、头孢类各1例,红花油外涂1例,另有1例因上感静脉输液,药名不详。
2.4.3 其他接触史:
试管婴儿1例,孕早期胸透2例,孕4个月X线脊柱摄片1例,孕早期频繁接触洗洁精、煤气各1例。
2.4.4 缺陷儿生育史:
在生育本次之前,生育过先天性心脏病2例、先天性鸡胸1例、无脑儿1例、脑瘫1例、腭裂合并脑积水1例。
2.5 产前诊断与围产儿转归。
产前诊断46例,占11.79%,产后七天内诊断344例,占88.21%。产前确诊时间最早为孕27周,最迟为孕40周,平均确诊孕周为33.9周。产前确诊病例中35例作治疗性引产,平均孕周为33.1周,另355例非治疗性引产(包括产后7天内诊断的)平均孕周为37.9周。
围产儿转归:死胎40例(包括治疗性引产35例),死产2例,7天内新生儿死亡8例,7天内存活340例。
3 讨论
3.1 据朱军等[1]报道,1996-2000年全国围产期先天性心脏病从6.15/万上升到11.40/万,升幅达85.37%;浙江省5年平均发生率为42.15/万,南方发生率明显高于北方,东部地区明显高于中部和西部。刘凯波等[2]分析了北京市10年出生缺陷监测资料,得出北京市围产儿先天性心脏病2.04‰。本组资料先天性心脏病发生率为86.72/万,高于上述报道,在国外资料显示的人群总体先天性心脏病发生率0.5%～1.25%[1]的范围内。由于围产期内一些小的心脏畸形暂时没有被发现,而有些发现的心脏缺陷可能在婴儿期自愈,消涨相抵,围产期先天性心脏病与人群总体先天性心脏病应该有相近的发生率。从理论上讲,围产期先天性心脏病数应该大于人群先天性心脏病发生数。如果某地区两者数据接近,或者前者超过后者,则可能表明围产期的检出水平是比较高的。
3.2 先天性心脏病主要是由于胎儿时期心脏发育的障碍所引起,已明确的主要致畸因素为遗传因素和环境因素两大类。遗传因素有单一基因突变、染色体畸变、多基因病变、先天性代谢紊乱等。环境因素如母亲妊娠3个月内病毒感染,妊娠早期应用某些药物,孕妇患糖尿病、酗酒、接受过量辐射等[3]。袁雪等[4]研究发现先天性心脏病相关的危险因素有妊娠早期居住在装修一年内的居室、妊娠早期居室距马路<50米、父亲饮酒。其实,绝大多数先天性心脏病至今仍找不到确切的致畸原因,所以先天性心脏病的一级预防还没能发挥最大的作用。但先天性心脏病的产前诊断技术正在迅速成长,只是限于技术的难度,普及面目前尚不够广,受益面也不够大。对于一级预防还不成熟的条件下,产前超声检查胎儿心脏是对先天性心脏病预防的最好补充。另外,本组资料显示,产妇年龄≥35岁组其分娩先天性心脏病儿的可能性增加,这可能与高龄孕产妇出现遗传问题的概率高一些有关,建议超声检查胎儿心脏作为对≥35岁的孕妇的常规检查内容。
3.3 先天性心脏病约有20%伴有心脏以外其他系统畸形[5],以染色体畸形为首位[2]。而本组资料显示先心伴发其他畸形的仅占6.41%,只有2例是伴有染色体异常的。分析监测医院可能存在着全面查体不够、出生缺陷诊断流程不熟悉、对综合征及联合征掌握不全等问题,导致合并的其他畸形漏诊。2001年至2004年大连市区围产儿先天性心脏病调查,含2种及2种以上心脏复合畸形的占41.6%[6],本组资料显示心脏复合畸形比例为42.9%,两者比较接近。在类型方面,本组前3位排位为房间隔缺损、动脉导管未闭、室间隔缺损,与大多数报道[2,6]第一位是室间隔缺损,第二位或第三位才是房间隔缺损不同,估计不同地区不同类别的发病率是有差别的。
摘要：目的:探讨围生儿先天性心脏病的发病情况与发病相关因素。方法:收集绍兴市5家出生缺陷监测医院在2005-2008年监测到的390例围生儿先天性心脏病资料进行分析。结果:围生儿先天性心脏病发生率为86.72/万,位于所有出生缺陷的首位,其类型前3位是房间隔缺损、动脉导管未闭、室间隔缺损。产妇年龄≥35岁组比<35岁组围生儿先天性心脏病发生率高(P<0.05)。结论:产前超声检查胎儿心脏是对先天性心脏病预防的最好补充,建议对≥35岁的孕妇把胎儿心脏超声作为常规检查内容。
关键词：围生儿,先天性心脏病,出生缺陷监测,发生率
参考文献
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新生儿心脏病 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
3d内的Wistar新生大鼠,雌雄不拘。由天津市山川红实验动物科技有限公司提供(合格证号:0004036)。
1.2主要试剂和仪器
胰蛋白酶(sigma),Ⅱ型胶原(gibco),DMEM-F12(hyclone),胎牛血清(bioind),肝素钠,内皮细胞生长因子(ECGF,sigma),第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京博奥森)及免疫组化SABC染色试剂盒(北京索莱宝)。恒温二氧化碳培养箱(Thermo),倒置相差光学显微镜(Leica),新颖立式小容量恒温摇床(上海世平实验设备有限公司),高速冷冻离心机。
1.3 实验方法
1.3.1 CMEC的原代培养
取1d~3d龄Wistar大鼠,于含75%酒精的无菌小烧杯中浸泡5s~6s后迅速取出置于无菌培养皿中,无菌开胸,暴露心脏,于心脏收缩期剪下心脏,放于预冷的盛有PBS缓冲液和少量1%双抗的培养皿中,清洗三次,去除残留血液,第二次清洗时去掉结缔组织、心房组织及部分血管。三遍清洗后,将其转移至锥形瓶瓶口中,将心室肌剪为1mm3碎块,加入0.1%胶原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶5mL,新颖立式小容量恒温摇床37℃,转速110次/分,震荡5min,吸取第一次消化后的上清液,弃去,因其含有残留血细胞和部分坏死心肌细胞碎片等,于第二次消化时收集上清液,200目细胞筛过滤至预冷的盛有5mL完全培养基的50mL离心管里,反复消化4次~5次,至组织消化成半透明状时终止继续消化,1 000r/min,10min离心后倒掉上清,加入适量完全培养基小心轻柔重悬细胞沉淀,将混匀的细胞悬液转入75cm2培养瓶中,放入恒温二氧化碳培养箱内,差速培养1h30min后取出,去除未贴壁细胞,重新加入完全培养基(90%DMEM/F12培养基,10%胎牛血清以及1%双抗,1%ECGF,1%肝素)培养,隔日换液,直到长至单层细胞铺满80%以上的瓶底即可传代。根据实验目的,调整细胞密度至合适浓度,轻柔吹打均匀后种板或加入培养瓶培养,首次2d换液1次,以后隔天换液。本次实验取1mL加入12孔板内,板内含有预先用多聚赖氨酸包被的圆形盖玻片,用于免疫组化纯度鉴定。
1.3.2 CMEC的传代培养
传代时,弃去旧培养液,PBS清洗3次后,以适量的0.25%胰酶-EDTA消化液消化约2min(镜下观察细胞状态以控制消化时间),并轻轻吹打制成细胞悬液,离心800rm/min,8min,再以完全培养基重悬细胞,转种于培养瓶中,此为第一代细胞,等细胞生长至铺满大部分培养瓶底部,约80%融合时即可进行下一次传代。
1.3.3 CMEC生长曲线绘制
以适量细胞密度接种于24孔培养板中培养,共21孔,每24h取3孔细胞进行细胞计数,求其平均值作为指标数值,连续7d绘制生长曲线。
1.4 CMEC的形态学观察
原代培养3d后,无菌条件下取出经多聚赖氨酸包被的细胞玻片,4%多聚甲醛固定30min,PBS清洗2次,0.5%TritonX-100通透20min。室温5%BSA封闭30min,用SABC法检测Ⅷ因子相关抗原的表达。兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体浓度为1∶100,4℃孵育过夜,37℃下二抗孵育20min,DAB显色。
2 结果
2.1 CMEC生长曲线
通过细胞计数法所绘制的细胞生长曲线大致成倒S形,说明生长过程分三个时期,潜伏期、指数生长期、平台期。
2.2 倒置显微镜下观察细胞形态
原代培养乳鼠CMEC最初分离时为贴壁圆形,细胞形态不明显;2d~3d时呈短梭形、多边形,之后迅速增长至融合状态,呈铺路石样。
2.3 CMEC鉴定
通过免疫细胞化学SABC法检测Ⅷ因子相关抗原,胞浆中有棕黄褐色着色,即呈阳性反应。
3 讨论
不同管径、组织的血管内皮细胞在结构、功能、表面分子等方面具有不同的功能特性,因此,研究某一器官或组织的微血管病变,应采用该器官组织的微血管内皮细胞[1,2]。在缺血性心血管疾病中,微血管内皮细胞是重要的靶细胞,而市面出售的微血管内皮细胞株价格较贵且传代次数有限,因此,建立CMEC离体培养模型,对于细胞损伤的分子机制及药物保护等的研究有重要意义。由于在微血管内皮细胞的分离过程中不可避免地会伴随有非血管内皮细胞的污染,因此,微血管内皮细胞的纯化是决定微血管内皮细胞培养成功与否的关键。本实验采用胰酶和胶原酶等体积混合消化,两种酶共同作用,能促使纤维母细胞等非内皮细胞的破坏,提高内皮细胞的纯度[3]。CMEC与大血管内皮细胞不同,需要在培养基中添加生长因子,这种生长因子提供了CMEC生长所需的成分,同时可抑制其他细胞的生长,促进CMEC优势生长,为体外培养该细胞的生长增殖创造特定的微环境。CD31是很好的内皮细胞标记物,但在培养过程中只有HUVEC和肺内皮细胞能将其保留下来,其他类型的细胞常丢失[4],故本实验选用另一经典特征第Ⅷ因子相关抗原作为鉴定指标。在整个取材、分离、剪碎的过程中,要注意始终保持低温操作,以保证细胞活性。尽量缩短取下心脏至剪成碎块时间。消化过程尽量控制在半小时至一小时内。整个操作流程必须严格遵循无菌原则。
本实验提供了体外培养乳鼠CMEC的简便方法,为进一步探讨心脏微环境的生理及病理生理改变的研究提供了实验基础。
摘要：目的 建立乳鼠心脏微血管内皮细胞(CMEC)体外培养研究模型。方法 采用混合酶(0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合)消化法和差速贴壁法纯化细胞,倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察,以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法进行细胞鉴定。结果 通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度乳鼠心脏微血管内皮细胞。结论 利用混合酶消化法成功分离并培养乳鼠的CMEC,该方法简单易行,可用于进一步的科学研究。
关键词：心脏微血管内皮细胞,原代培养,乳鼠
参考文献
[1]Aird WC.Phenotypic heterogeneity of the endothelium:I Struc-ture,function,and mechanisms[J].Circ Res,2007,100(2):158-173.
[2]Ryzhov S,Solenkova NV,Goldstein AE.Adenosine receptor-medi-ated adhesion of endothelial progenitors to cardiac microvascularendothelial cells[J].Circ Res,2008,102(3):356-363.
[3]柳爱华,杨向红,王延林,等.大鼠心脏微血管内皮细胞的培养[J].中国医科大学学报,2009,38(1):55-73.